KR100423117B1

KR100423117B1 - 한국산 겨우살이의 신규한 항암성 렉틴 및 그 유전자와 렉틴의 분리방법

Info

Publication number: KR100423117B1
Application number: KR10-2000-0083383A
Authority: KR
Inventors: 박원봉; 정호권; 유수연; 안유미
Original assignee: 주식회사 참 존; 박원봉
Priority date: 2000-07-18
Filing date: 2000-12-27
Publication date: 2004-03-18
Also published as: KR20020007958A

Abstract

본 발명은 한국산 겨우살이 (Viscum albumL. var.coloratum)의 신규한 항암성 렉틴 및 그 유전자와 렉틴의 분리방법에 관한 것으로, 한국산 겨우살이의 genomic DNA를 유럽산 겨우살이 유전자로부터 디자인한 프라이머로 PCR하여 획득한 항암활성이 있는 렉틴 단백질 코딩 유전자 DNA 및 아미노산의 서열을 분석하고 유럽산 렉틴과의 상동성을 비교한 결과, 본 발명 한국산 겨우살이 렉틴은 유럽산 렉틴과 명백한 차이를 나타내는 신물질 (新物質)임을 알 수 있고, 한국산 겨우살이의 미정제 단백질 용액을 아시알로페투인-세파로스 4B를 리간드로 사용한 컬럼으로 크로마토그래피하여 정제한 결과, 한국산 겨우살이 렉틴을 순도높게 분리할 수 있으며, polyclonal anti-VCA antibody로 표지한 ELLA 및 Molt-4 세포주를 이용한 세포 독성도를 측정한 결과, 생물학적 활성이 있는 렉틴의 함유량을 정량적으로 표준화할 수 있으므로, 본 발명은 암세포에 대한 직접적인 항암활성과 생체 면역을 증강시키고 세포 면역능을 유도하여 항암활성을 나타내는 신물질인 한국산 겨우살이 렉틴, 이 신규한 렉틴을 효율적으로 분리하는 방법 및 렉틴 함유 조성물중의 신규한 렉틴 함량의 정량적 표준을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

한국산 겨우살이의 신규한 항암성 렉틴 및 그 유전자와 렉틴의 분리방법 {Novel anticancer lectin, corresponding gene and isolation method of korean mistletoe lectin}

본 발명은 한국산 겨우살이의 신규한 항암성 렉틴 및 그 유전자와 렉틴의 분리방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 한국산 겨우살이 (Viscum albumL. var.coloratum,Korean mistletoe)로부터 생체 면역을 증강시키고 세포 면역능을 유도하며 암세포의 증식을 저해하는 물질인 렉틴 단백질을 코딩하는 유전자를 분리하여 그 염기서열을 분석하고 이를 유럽산과 상동성을 비교하여 본 발명 한국산 겨우살이 렉틴이 유럽산과 구별되는 신물질임을 규명하고, 겨우살이의 미정제 단백질 용액을 아시알로페투인-세파로스 (asialofetuin-Sepharose) 4B 컬럼 크로마토그래피하여 한국산 겨우살이 렉틴을 극히 순수하고 효율적으로 정제 및 분리하는 방법에 관한 것이다.

겨우살이 (mistletoe,Viscum album)는 참나무, 밤나무를 숙주로 하여 생장하는 상록관목 반기생 식물로서 그 숙주 식물에 따라 여러 과와 종으로 나누어지며, 세계적으로 30속 1,500여 종의 식물이 있는 것으로 알려져 있다. 겨우살이 중 유럽산 겨우살이 (Viscum album)는 백색을 띠고, 한국에 분포하고 있는 한국산 겨우살이 (Viscum albumL. var.coloratum)는 황색을 띠고 있으며 동백나무 겨우살이과, 겨우살이과, 참나무 겨우살이과 등이 있고, 독일을 중심으로 한 유럽 지역에서 뿐 아니라, 우리나라에서도 오래 전부터 여러 가지 질병에 대한 민간 약재로 사용되어 왔다. 여러 겨우살이 중 현재 약재로 사용되고 있는 것은 비스쿰 속 (Viscum genus)의 겨우살이로서, 주로 유럽 지역에서 서식하는 비스쿰 알붐 (Viscum albumLoranthaceae)이다. 유럽의 겨우살이는 오래 전부터 민간요법에서 고혈압, 동맥경화증, 암 등에 대하여 효과가 있는 신비의 약재로 사용되다가 1920년경부터 항암 활성을 인정받아 종양에 대한 치료 및 항암요법시 보조제로 사용되고 있다. 유럽지역에 서식하는 겨우살이는 체액성 및 세포성 면역체계를 자극하는 면역증강 효과가 있는 것으로 보고되었고, 동물 및 인간에 대한 임상실험 결과 종양세포에 대하여 직접 또는 간접적으로 대응하는 대식세포 및 자연살해 (apoptotic killing) 세포의 활성을 증가시킴으로써 종양세포의 성장을 억제하고, 암 환자의 생존율을 증진시키는 효과가 있는 것으로 보고되었다 [Hajto, T.,Hostanska, K., Frei, K., Rordorf, C. and Gabius, H.J. Cancer Res. 50: 3322-3326 (1990)]. 이러한 효과는 겨우살이의 면역증강 작용 및 종양 세포에 대한 직접적인 세포 독성 효과에 관여하는 것으로 알려져 있다. 한편, 유럽산 겨우살이와 구별되는 한국산 겨우살이 (Viscum album coloratum) 역시 민간 및 한방에서 숙주나무에 따라 기생목 (寄生木), 냉청 (冷靑), 해기생, 표기생 (票奇生), 기엽 및 비상 (比桑) 등으로 불리우면서 오래전부터 암, 동맥경화, 당뇨, 동상, 심장병, 요통, 고혈압, 유산 방지, 불임증, 치통 등 각종 질병의 약재로 사용되어 왔다.

최근의 과학조사는 겨우살이가 암세포의 세포 자살 (apoptotic killing)을 유도하고 림프구의 면역 시스템을 자극하며, 화학 치료 또는 방사선 치료 시 DNA를 보호한다고 발표하였다. 암치료 효과가 있다고 보고된 생물학적 활성도와 그 상승 작용의 결과는 겨우살이의 렉틴에서뿐만 아니라, 비스코톡신, 다당체 (polysaccharides), 아미노산 및 플라보노이드를 포함하는 다른 구성 요소들에 대해서도 보고되었다 [Park, J.H., Hyun, C.K. and Shin, H.K. Cancer Lett. 126: 43-48 (1998)]. 이런 것들 사이에서도 특히 유럽산 겨우살이의 렉틴은 현대 생물 의학 연구에 있어서 주목을 받았으며, 유럽 겨우살이 조제약의 세포 독성, 면역학적 특성은 명백히 렉틴과 관계하는 것이라고 생각되었다.

렉틴 (lectin)에 대한 연구는 1888년 Stillmark가 피마자 (Ricinus communis)의 추출물이 적혈구를 응집 (hemagglutinating activity)시킨다는 사실을 발견하면서부터 시작되었으며 그 후, 여러 식물과 동물에서 비슷한 성분이 발견되면서 이들을 렉틴이라 부르게 되었다.

렉틴에는 중요한 탄수화물 결합 단백질 (carbohydrate binding protein)들이 있으며 이것은 특정한 탄수화물 부위에 가역적으로 결합되는 특징이 있다. 렉틴에는 1개의 서브유닛 (subunit)으로 구성된 타입 (type) 1과 2개의 서브유닛으로 구성된 타입 2의 두 종류가 있는데, 타입 1은 결합체인 (binding chain)이 없기 때문에 세포 자유 시스템 (cell free system)에서는 단백질 합성의 억제 능력이 크지만 실제 세포에서는 그 효능이 매우 작다. 반면에, 타입 2의 RIPs는 결합체인이 있기 때문에 실제 세포에서 억제능력이 크다. 겨우살이의 렉틴은 타입 2에 속한다. 리보솜 비활성 단백질 타입 2 (the type-2 ribosome inactivating proteins, RIPs)는 이황화 결합 (disulfide bond)으로 연결되어 있는 서로 다른 A와 B 두 개의 서브유닛으로 구성되어 있다. A체인 (active chain)은 진핵세포에서 60S의 리보솜 서브유닛을 비활성화시키는 촉매로 작용하며 단백질의 합성을 방해하는 기능을 한다. 비손상 종결 갈락토실 유닛 (terminal-galactosyl unit)을 포함하는 갈락토즈 (galactose), 사카라이드 (saccharide)와 결합하는 B체인 (binding chain)은 세포 표면에서 당매개 결합을 할 수 있고 따라서 독성 물질이 세포 내부로 들어갈 수 있도록 한다. 세포 표면의 탄수화물 사슬은 탄수화물 결합 단백질과 세포가 결합할수 있는 잠재적인 결합 공간을 제공한다. 암세포에서의 탄수화물 발현 변화는 세포의 작용 (adhesion)을 바꿀 수 있고 아마도 암 치료제의 개발을 위한 타겟으로 이용될 수 있을 것이다. 형태 변화된 세포는 렉틴에 대해 민감도가 증가하였으므로 렉틴이 암세포를 억제하는지의 여부를 실험하는 연구가 수행되었다.In vitro및in vivo상의 연구로부터 추정되는 몇몇의 증거들은 렉틴이 암세포를 타겟으로 한 치료에 있어서 강력한 지표자임을 보여준다.

A체인과 B체인으로 구성된 유럽산 겨우살이 렉틴 VAAs의 분자량은 55kDa 과 63kDa 사이이며, D-갈락토오즈 (D-galactose)와 N-아세틸-D-갈락토사민 (N-acetyl-D-galactosamine)에 대하여 당 특이성이 있다. 렉틴의 항종양 효과는 B체인이 세포의 표면에 결합하고 A체인이 단백질 합성을 저해함으로써 종양 세포에 대한 독성을 가지게 된 것으로 생각된다. 종양 세포의 글라이코실레이션은 종양세포로부터 유도된 정상 세포의 글라이코실레이션과 다를 수 있으며, 이러한 독성은 암세포에 특이적이라 할 수 있다 [Taylor-Papadimitriou J., and Epenetos A.A., TIBTECH 12, 227-233 (1994)]. 한국산 겨우살이 역시 유럽산 겨우살이와 마찬가지로 항암 활성화 효과를 가진 것으로 보고되었다 [Park W.B., Choung B.Y., Park T.S., Kim J.H., Ham S.S., Food Sci. Biotechnol. 8, 232-237 (1999)].

Franz 등은 친화적 크로마토그래피 (affinity chromatography)를 이용하여 유럽산 겨우살이로부터 3가지 주요 렉틴을 순수하게 분리하여 VAA-Ⅰ (MW=115KA, D-galactose 특이성), VAA-Ⅱ (MW=60KD, D-galactose, N-acetyl-D- galactosamine 특이성), VAA-Ⅲ (MW=50KD, N-acetyl-D-glucosamine 특이성)으로 나누었다. 이들중에서 VAA-Ⅰ은 비스코민 (viscumin)이라고도 불리우며 겨우살이 항암 활성의 주요 부분으로 밝혀졌다. VAA-Ⅰ의 A체인은 리보솜을 불활성화시킴으로써 단백질의 합성을 억제하는 작용을 하며 그 작용 메카니즘은 아직 정확히 밝혀져 있지는 않지만 A체인이 진핵 세포의 60S 리보솜에 신장 인자 2 (elogation factor 2)가 결합하는 것을 방해하여 단백질 합성을 억제한다고 알려져 있다. 이에 대한 연구에서 하나의 A체인이 많은 리보솜을 불활성화시킴을 증명하였고, 리보솜에 신장 인자 2 (elongation factor 2)나 아미노아세틸-tRNA (aminoacetyl-tRNA)가 먼저 붙어 있으면 A체인과 세포의 결합이 저해된다는 사실이 보고되었다. 그리고, A체인에 의한 불활성화가 특이한 A체인 항체를 넣으면 멈춘다는 사실로부터 A체인이 60S 리보솜에 효소적으로 직접 작용한다는 것이 증명되었다. B체인에 의한 갈락토즈와의 결합에서는 4-OH가 6-OH보다 더 많은 기여를 하며 갈락토즈보다는 Galβ2Gal 와 Galβ3Gal의 이당체가 친화력이 더 크다고 밝혀졌다. 또한, 10개 이상의 갈락토즈 잔기를 갖는 리간드가 갈락토즈보다 500배의 친화력을 갖는다고 보고되었다. 이와 같이, 겨우살이에 대한 연구는 주로 유럽을 중심으로 이루어져 왔으며 리신 (ricin), 아브린 (abrin) 등과 겨우살이 렉틴의 비교연구, B체인의 결합 특이성과 A체인의 특성을 이용한 항암 효과에 대한 연구도 많이 이루어졌다. 이는 성분과 그 구조, 구성 및 작용 등이 파악된 의약품이 아니라 임상적인 실증을 통해 치료 효과가 입증된 암 치료제라고 할 수 있으며, 기존의 서양의 방법과는 달리 예전부터 동양의 전통의학에서 사용하던 치료제로서의 전체 추출물 사용과 같은 대체 의학 (alternative medicine)에 대한 관심이 고조되고 있는 이 때에 겨우살이의 연구는주목을 받고 있다. 그러나, 한국산 겨우살이의 항종양 효과 및 활성 성분이 유럽산 겨우살이와는 상이하다는 것이 보고되었음에도 불구하고 아직 이에 대한 연구보고는 드문 편이며 렉틴의 분리 및 그 유전자의 규명 또한 한계가 있었다.

본 발명자들는 한국산 겨우살이 (Viscum albumL. var.coloratum) 유래의 렉틴 단백질을 코딩하는 유전자를 분리한 후 렉틴의 A체인과 B체인 전장의 염기서열을 모두 분석하고 유럽산 겨우살이 렉틴과의 상동성을 비교하였다. 또한, 한국산 겨우살이의 단백질 용액을 아시알로페투인-세파로스 (asialofetuin- Sepharose) 4B를 리간드로 고정시킨 컬럼을 이용하여 친화적 크로마토그래피함으로써 종래의 분리방법보다 더 효율적으로 렉틴을 분리하여 그 수율을 분석하였으며, Molt-4 세포주를 사용한 세포 독성도 측정 및 ELLA 시스템의 사용으로 한국산 겨우살이 추출물의 생물학적 활성의 렉틴 함유량을 정량적으로 표준화함으로써 한국산 겨우살이 연구의 기초를 마련하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 한국산 겨우살이 유래의 신규한 렉틴 유전자 및 아미노산의 염기서열을 분석하고 그 서열을 유럽산 겨우살이 렉틴과 비교한 결과, 유럽산 겨우살이와 전혀 다른 신규한 한국산 겨우살이 렉틴을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 한국산 겨우살이로부터 생체 면역을 증강시키고 세포 면역능을 유도하며 항종양 전이 활성과 항암 활성을 나타내는 단백질인 한국산 렉틴 (lectin)의 효율적인 분리 방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 생물학적 활성이 있는 렉틴의 정량적 표준화 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 한국산 겨우살이 (Viscum albumL. var.coloratum)로부터 추출 및 정제한 genomic DNA를 유럽산 겨우살이 렉틴 유전자를 기원으로 하여 제조한 프라이머와 반응시켜 PCR 증폭한 후 이 한국산 겨우살이 렉틴 단백질 코딩 유전자를 TOPO 벡터에 삽입하여 구축한 재조합 벡터를 대장균에 도입하여 획득한 양성의 콜로니로부터 한국산 겨우살이 렉틴 유전자를 획득하고 DNA 및 아미노산의 서열을 분석하고 그를 유럽산 겨우살이 렉틴과 상동성을 비교함으로써 유럽산과 명백한 차이를 나타내는 신규한 한국산 겨우살이 유래의 렉틴 유전자를 획득하였다. 이어서, 한국산 겨우살이를 증류수 처리한 한국산 겨우살이 추출물을 SP-Sephadex C-50 양이온 교환수지 (cation exchanger) 처리하여 미정제 단백질 용액을 제조하고 이를 아시알로페투인-세파로스 (asialofetuin-Sepharose) 4B가 채워진 컬럼에 주입시켜 크로마토그래피하여 렉틴 단백질을 흡착시키고 아세트산으로 용출한 후 초여과막 (ultrafiltration membrane)으로 농축시켜 렉틴 단백질 용액을 제조한 다음, 그 렉틴의 활성을 적혈구 응집 반응으로 측정하고 Lowry법을 이용하여 단백질의 함량과 당 특이성을 측정하였다. 이어서, 아시알로페투인-세파로스 (asialofetuin- Sepharose) 4B로 채운 컬럼으로 크로마토그래피하여 한국산 겨우살이의 렉틴을 효율적으로 분리하고, 상기 정제된 렉틴을 SDS-PAGE 전기영동하고 멀티클론의 토끼 항-VCA 항체 (polyclonal rabbit anti-VCA antibody)를 탐침으로 한 웨스턴 블럿 분석을 수행하여 렉틴의 분자량과 특성을 분석한 후, 겨우살이 물 추출물을 ELLA (Enzyme-linked lectin assay) 분석하거나 Molt-4 세포주에 대한 한국산 겨우살이렉틴의 세포독성 활성도를 측정하여 생물학적 활성이 있는 겨우살이 렉틴의 함량을 정량함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

도 1은 한국산 겨우살이 (Viscum albumL. var.coloratum) 유래의 신규한 렉틴 유전자 염기서열을 나타낸다.

도 2는 한국산 겨우살이 (Viscum albumL. var.coloratum) 유래의 신규한 렉틴 유전자로부터 유추한 아미노산 서열을 나타낸다.

도 3은 한국산 겨우살이 유래의 렉틴 아미노산 서열과 유럽산 겨우살이 유래의 렉틴 아미노산 서열의 상동성 비교 결과이다. 여기서 KOREA.PRO는 본 발명 한국산 겨우살이 렉틴의 아미노산 서열을, EUROPE.PRO는 유럽산 겨우살이 렉틴의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 4는 한국산 겨우살이 (Viscum albumL. var.coloratum)에서 추출한 신규한 렉틴 용액을 락토즈-BSA-세파로스 4B, 페투인-세파로스 4B 및 아시알로페투인-세파로스 4B를 리간드로 하여 정제한 렉틴을 환원제 유무의 조건으로 처리하여 SDS-PAGE 겔에서 분석한 결과이다.

도 5는 아시알로페투인-세파로스 4B를 리간드로 하여 정제한 렉틴을 환원제유무의 조건으로 처리하여 SDS-PAGE 겔에서 분석한 결과이다.

도 6은 아시알로페투인-세파로스 4B를 리간드로 하여 정제한 유럽산 겨우살이 렉틴 VAA-Ⅰ, VAA-Ⅱ, VAA-Ⅲ 및 한국산 겨우살이 렉틴 VCA을 환원제 유무의 조건으로 처리하여 SDS-PAGE 겔에서 분석하여 나타난 결과이다.

도 7은 락토즈-세파로스 4B를 리간드로 하여 분리한 렉틴을 인식하는 멀티클론의 토끼 anti-VCA 항체 (polyclonal rabbit anti-VCA antibody)를 탐침 (probe)으로 하여 웨스턴 블럿 분석하여 정제한 렉틴을 12% SDS-PAGE 겔에서 전기영동한 결과이다.

도 8은 ELLA로 측정한 한국산 겨우살이 렉틴 VCA의 선형 계측 구도 (linear calibrating plots)이다.

도 9는 ELLA로 측정한 겨우살이 물 추출물의 렉틴 농도를 나타낸다.

도 10은 VCA와 VAA-Ⅰ의 농도에 따른 Molt-4 세포의 약물-의존성 생장 (Dose-dependent growth)의 억제 정도를 나타낸다.

도 11은 한국산 및 유럽산 겨우살이의 물 추출물의 농도에 따른 약물-의존성 암세포 생장 (Dose-dependent growth) 억제 정도를 나타낸다.

본 발명은 강원도 대관령의 참나무를 숙주로 하여 기생하는 한국산 겨우살이 (Viscum albumL. var.coloratum)를 채취하여 그 genomic DNA를 추출하고 정제하는 단계; 정제한 상기 한국산 겨우살이의 genomic DNA와 유럽산 겨우살이 렉틴 유전자를 참고로 디자인한 프라이머를 반응시켜 PCR 증폭을 실시하는 단계; 상기 PCR 산물을 TOPO 벡터에 삽입하여 구축한 재조합 벡터를 대장균에 도입시켜 제조한 양성의 균주로부터 재추출한 렉틴 유전자의 DNA 및 아미노산의 서열을 분석하고 유럽산 겨우살이와의 상동성을 비교하여 신규한 한국산 겨우살이 렉틴을 획득하는 단계; 한국산 겨우살이 (Viscum albumL. var.coloratum)의 미정제 단백질 용액을 추출하고 그 용액을 아시알로페투인-세파로스 (asialofetuin -Sepharose) 4B가 채워진 컬럼에 주입시켜 크로마토그래피하여 흡착된 단백질을 아세트산으로 용출시킴으로서 렉틴 단백질 용액을 정제하는 단계; 렉틴의 효율적인 정제를 위하여 락토즈-BSA-세파로스 4B, 페투인-세파로스 4B 및 아시알로페투인-세파로스 4B등의 렉틴 친화적 고정 리간드 타입에 따른 한국산 및 유럽산 겨우살이 렉틴의 수율 변화를 측정하고, 페투인-세파로스 4B 및 아시알로페투인-세파로스 4B에서 나타나는 렉틴 정제 효율성을 측정하는 단계; 한국산 및 유럽산 겨우살이의 렉틴 추출물을SDS-PAGE 전기영동하고 멀티클론의 토끼 항-VCA 항체 (polyclonal rabbit anti-VCA antibody)를 탐침으로 하여 웨스턴 블럿 분석을 실시하여 한국산 겨우살이 렉틴의 특성 및 분자량을 확인하는 단계; 한국산 겨우살이의 물 추출물을 준비한 후 효소-결합 렉틴 측정법 (ELLA ; Enzyme-linked lectin assay)을 실시하여 생물학적 활성이 있는 겨우살이 렉틴의 정량을 측정하는 단계; 한국산 겨우살이 렉틴이 Molt-4 세포주에 미치는 세포 독성 활성도를 측정하여 생물학적 활성이 있는 한국산 겨우살이 렉틴의 정량을 측정하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리 범위는 이들에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 한국산 겨우살이 ( Viscum album L. var. coloratum ) 유래의 렉틴 유전자 획득

제1단계. 한국산 겨우살이의 genomic DNA 획득

한국산 겨우살이 (Viscum AlbumL. var.coloratum)의 genomic DNA를 추출하였다. 본 발명에서 사용한 한국산 겨우살이는 강원도 대관령의 참나무에서 기생하는 것을 채취한 것이다.

한국산 겨우살이 조직 2∼5g/추출물을 취하여 액체 질소로 급냉시키고 액체 질소가 증발되면 조직을 잘게 부순 후 액체 질소를 계속 첨가하는 과정을 반복하여 순수한 조직분말을 획득하고 상온에서 2분간 보관하였다. 상기 조직분말로부터 DNA를 분리하기 위하여 60℃에서 예열시킨 DNA 분리용 완충액 (isolation buffer)5㎎/g과 상기 분말을 혼합하여 가볍게 재현탁시키고 60℃에서 40분동안 가볍게 교반하면서 배양하였다. 단백질을 변성시켜 제거하기 위해 클로로포름:이소아밀알코올 =24:1 혼합용액을 1부피 (1volume) 첨가하고 4-5회 가볍게 전화시켜 5분간 상온에서 방치하였다. 상기 물질을 10분간 4℃에서 7000×g (angle rotor) 또는 1600×g (swing rotor)로 원심분리하고 수용성인 상등액을 wide-bore 피펫을 사용하여 새로운 튜브로 옮긴 후 차가운 100% 에탄올 2∼2.5부피가 들어 있는 튜브에 상기 상등액을 천천히 부어주고 상온에서 20분간 배양하였다. 글래스 훅 (glass hook)으로 DNA를 건져내고 진공상태에서 5분간 가볍게 건조시킨 후 37∼40℃에서 오리지날 조직 (original tissue)을 TE 완충액 4mL/g과 섞어 재현탁시키고 DNA 샘플의 최종농도가 20㎍/mL가 되도록 하여 리보핵산가수분해효소 (RNase A)를 넣어준 후 37℃에서 배양하였다. Tris-buffered-saturated 페놀/클로로포름 (phenol/chloroform)을 1부피 넣어 가볍게 섞어준 후 4℃에서 10분간 10,000 ×g에서 원심분리하여 그 상등액을 새로운 튜브로 옮겼다. 순수한 DNA를 얻기 위하여 상등액에 클로로포름:이소아밀알코올 = 24:1 혼합용액을 1부피 첨가하고 4℃에서 10분간 원심분리한 후 다시 그 상등액을 새로운 튜브로 옮겨주고 7.5M 암모늄 아세테이트 0.5부피를 넣고 가볍게 섞어준 후 100% 에탄올 2.5부피와 혼합하여 천천히 부드럽게 섞어주었다. 그 DNA를 글래스 훅을 사용하여 새로운 튜브로 옮기거나 또는 4℃에서 5분간 5000 ×g로 원심분리하였다. 분리된 DNA를 70%의 에탄올 4mL로 가볍게 세척한 후 15∼30분 동안 진공 건조시켰다. 최종적으로 상기 DNA를 TE로 재현탁시켜 한국산 겨우살이의 genomic DNA를 획득하였다.

제2단계. 상기 한국산 겨우살이 genomic DNA의 PCR 증폭 및 렉틴 유전자의 획득

상기 한국산 겨우살이의 genomic DNA를 PCR 증폭하기 위한 프라이머 (primer)는 유럽산 겨우살이 렉틴 (European mistletoe lectin)의 유전자를 참고로 하여 디자인하였다. 그 염기서열은 다음과 같다.

한국산 겨우살이 genomic DNA의 PCR 증폭을 위한 프라이머

SF1 : tatcttcccatcggggagtc

BF2 : tgagcaatgttcgcgacgtgat

BR1 : gattgcttgcatgcgacca

PCR의 주형 (template)인 상기 제 1단계의 한국산 겨우살이 genomic DNA 0.6㎕, 상기 프라이머 BF2 및 BR1 10pmol 1㎕, 10×PCR 완충액 5㎕, dNTP 4㎕,Taqpolymerase 1unit (0.3㎕), D.W 38.1㎕ 등 총 50㎕를 혼합하여 95℃에서 5분간 predenaturation하고, 95℃에서 1분간/62℃에서 1분 30초간/72℃에서 1분동안 35 주기를 반복하고, 3'의 아데닐레이션 (adenylation)을 위하여 72℃에서 30분간 postelongation시켜 PCR 증폭하였다. 이 PCR 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동하여 한국산 겨우살이 렉틴의 유전자 밴드 1개를 얻을 수 있었다. DNA의 정제를 위하여 상기 PCR 산물에 요오드화나트륨 (NaI) 3부피를 넣고 60℃에서 5분간 배양한 후 5㎕의 glass milk를 넣어 교반 (vortex)하고 5분 동안 RT에서 배양하였다. 불순물을 제거하기 위하여 New Wash 용액으로 펠렛을 3회 세척하고 건조시켜 준 후 DNA의 용출을 위하여 D.W 5㎕을 섞어 주었다. 이로써 한국산 겨우살이의 렉틴 유전자를 획득하였다.

제3단계. 한국산 겨우살이 렉틴 유전자 DNA 및 아미노산 서열 판독 및 유럽산 겨우살이와의 상동성 비교

한국산 겨우살이 렉틴 유전자 DNA 및 아미노산의 서열을 판독하기 위하여 TOPO 클로닝 반응을 실시하였다.

이를 위하여 상기 정제된 렉틴 유전자 PCR 증폭산물 4㎕, 염류 용액 1㎕, TOPO 벡터 1㎕ 등 총 6㎕를 넣어준 후 15분 동안 RT에서 배양하였다. 상기 TOPO 클로닝 반응 산물을 50㎕의 화학 콤페턴트 세포 (chemical competent cell)에 첨가하고 15분 동안 얼음에서 방치한 후 42℃에서 30초 동안 열 충격을 가하였다. 다시 얼음에서 5분간 방치한 후 250㎕의 SOC 배지를 첨가하여 37℃에서 1시간동안 배양한 다음 앰피실린과 X-Gal을 포함하는 LB-한천배지 [앰피실린 (ampicillin) 100㎍/mL, X-Gal (40㎎/mL) 40㎕]에 세포를 도말한 후 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 그 결과 생성된 콜로니 중 흰색을 띄는 것만을 골라서 3mL의 LB배지에서 하룻밤 동안 배양한 배양세포로부터 플라스미드 DNA를 추출하고 제한효소EcoRⅠ로 처리하여 본 발명 렉틴 유전자와 같은 크기의 밴드가 나타나는 콜로니를 렉틴 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 가지는 양성 콜로니로 간주하였다. 렉틴 유전자가 삽입된 상기 재조합 벡터 pVCAF를 가지는 양성의 대장균 콜로니로부터 플라스미드를 분리한 뒤 형광물질이 부착된 ddNTP를 사용하여 자동 염기서열 분석 (automatedsequencing)을 의뢰하여 한국산 겨우살이 렉틴 단백질 A체인 및 B체인을 포함하는 전장의 유전자 DNA 및 아미노산 염기서열을 분석하고 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다. 본 발명 렉틴 유전자의 크기는 총 1873bp였으며 총 565개의 아미노산으로 구성되어 있었다.

상기 본 발명 한국산 겨우살이 렉틴의 DNA 및 아미노산 서열을 유럽산 겨우살이 렉틴 (Viscum album, European Mistletoe, GenBank A58957)의 DNA 및 아미노산 서열과 비교하여 상동성 (homology)을 분석하였다. 한국산 겨우살이 렉틴의 DNA는 유럽산 DNA와 비교하여 약 83.3% 동일하였으며, 아미노산의 경우는 85.5%의 상동성을 나타내었다. 이러한 결과는 본 발명 한국산 겨우살이 렉틴과 유럽산 겨우살이 렉틴이 상당한 차이를 보이는 것이며, 따라서, 본 발명 한국산 겨우살이 렉틴은 유럽산과 구별되는 새로운 항암활성의 신물질이라는 것을 보여주는 것이다. 그 아미노산 상동성 비교도를 도 3에 나타내었다.

실시예 2 : 아시알로페투인-세파로스 (asialofetuin-Sepharose) 4B를 이용한 한국산 겨우살이 ( Viscum album L. var. coloratum ) 렉틴의 추출 및 분리

제1단계. 한국산 겨우살이의 미정제 단백질 용액의 추출

본 발명에서 사용한 한국산 겨우살이는 강원도 대관령의 참나무를 숙주로 하여 기생하는 것이고, 참나무에 기생하는 겨우살이 (Viscum albumL.)는 스위스의 Institute Hiscia의 Dr.Grazi로부터 기증받은 것이다. 겨우살이의 잎, 과실 및1∼4년생 줄기를 분류하여 25±5℃에서 건조시키거나 -70℃에서 보관하였다. 유럽산 겨우살이 (Viscum albumLoranthaceae)의 VAA-Ⅰ, VAA-Ⅱ, VAA-Ⅲ는 독일의 University of Witten/Herdecke에서 기증받아 사용하였다.

양이온 교환수지 (cation exchanger)상에서 단백질 결합원리를 이용해 미정제 겨우살이 단백질 용액을 준비하였다. 상기 건조시킨 겨우살이 1kg을 0.1M 아세테이트 (acetate) 완충용액 (pH 4.0) 4L와 함께 저속 분쇄기로 갈고, 8,000rpm에서 30분간 냉장 원심분리한 1L의 상등액에 양이온 교환수지인 SP-세파덱스 (Sephadex) C-50 3.5g을 첨가한 후 4℃에서 교반하여 12시간 방치시켰다. 이 겔을 크로마토그래피 컬럼 (chromatography column)에 충전시킨 후 0.1M 아세테이트 완충용액 (acetate buffer, pH 4.0)으로 세척하고, 수용액 속의 단백질을 0.1M Tris-HCL 완충용액 (pH 8.0. 0.5M NaCl)으로 용출시켰다. 용출시킨 단백질 흡착물을 UV (A280??0.01)로 확인한 후 분획을 모아서 초여과막 (ultrafiltr -ation membrane, MW=10,000Da, Amicon Corp, Danvers, MA, USA)을 사용하여 농축하였다.

제2단계. 상기 한국산 겨우살이 미정제 단백질 용액으로부터 렉틴 추출

페투인-세파로스 (fetuin-Sepharose) 4B 또는 아시알로페투인-세파로스 (asialofetuin-Sepharose) 4B로 채워진 컬럼에 상기 미정제 단백질 용액을 주입시키고 컬럼을 PBS 완충용액 (pH 8.7)으로 세척하였다. 그 컬럼에 흡착된 단백질을 0.2M의 아세트산 (acetic acid)으로 용출시킨 후 용출된 흡착물을 UV (λmax=280nm)로 확인하여 피크 (peak)를 나타내는 분획을 모아 초여과막(ultrafil -tration membrane, MW=10,000, Amicon corp, Danvers, MA, USA)으로 농축하여 렉틴 농축액을 획득하였다.

제3단계. 렉틴의 활성을 측정하기 위한 적혈구 응집반응 및 당 저해 반응에 의한 렉틴의 당 특이성 측정

상기 농축시킨 렉틴의 활성을 측정하기 위해 연속적인 두배 희석법을 이용하여 적혈구 응집 반응을 실시하였다. 사람의 혈액을 약간 취하여 10배량의 0.15M NaCl 용액으로 부유시키고 1500rpm에서 5분간 원심분리한 후 상등액은 버리고 침전한 혈구는 다시 0.15M NaCl 용액으로 부유시켰다. 이 조작을 3회 반복한 후 NaCl 용액으로 희석하여 3% 적혈구 부유액을 얻었다. Microtiter plate well에 0.15M NaCl 용액 50㎕를 넣고 상기 렉틴 단백질 시료 50㎕를 첨가하여 2배수로 단계적 희석을 한 후, 3% 적혈구 부유액 50㎕를 첨가하여 37℃ 배양기에서 1시간 배양시킨 다음, 대조 표준과 비교함으로써 응집 유무를 확인하여 각각의 혈구응집반응단위 (hemagglutination unit, HU: microtiter plate well에서 렉틴 용액을 2배수로 단계적으로 희석하였을 때 적혈구의 응집반응을 나타내는 최대 희석 배수)를 결정하였다.

소 혈청 알부민 (bovine serum albumin, BSA)을 이용한 Lowry 법으로 단백질의 함량을 정량하였으며 당 특이성을 측정하였다. 200mL 농도의 D-글루코즈 (D-glucose), D-갈락토즈 (D-galactose), 락토즈 (lactose), L-(+)-아라비노즈 (L-(+)-arabinose), 만노즈 (mannose), D-갈락토사민 (D-galactosamine), N-아세틸-D-갈락토사민 (N-actyl-D-galactosamine)을 microtiter plate well에 50㎕를 취해 2배수로 희석하고 각 well에 4HU의 활성을 나타내도록 희석한 렉틴을 50㎕씩 가하여 4℃에서 1시간 반응시킨 후, 3% 적혈구 부유액 50㎕를 가하였다. 37℃ 배양기에서 1시간동안 배양시키고 대조 표준과 비교하여 적혈구 응집력의 저해 효과를 조사하였다 (표 1). 이 때, 당에 의한 저해 효과는 적혈구 응집력을 완전히 저해시킬 수 있는 최소의 당 농도로 표시하였고 억제 농도는 활성이 4HU인 렉틴을 완전히 억제하는데 필요한 탄수화물의 양으로 나타내었다.

한국산 겨우살이 추출물의 적혈구 응집력 저해 효과에 의한 당 특이성

당	농도
D-갈락토즈	25 (μM)
N-아세틸-D-갈락토사민	3.1 (μM)
D-갈락토사민	-
D-글루코즈	-
D-(+)-만노즈	-
락토즈	12.5 (μM)
L-(+)-아라비노즈	50 (μM)
[주] 농도 (μM)는 적혈구 응집력을 완전히 저해시키는당의 최소농도임

실험결과, 본 발명에서 분리된 한국산 겨우살이 렉틴은 D-갈락토즈와 N-아세틸-D-갈락토사민에 대해 특이성을 가지는 단백질임을 알 수 있다.

제4단계. 고정 리간드 타입에 따른 한국산 및 유럽산 겨우살이 렉틴의 수율 측정 및 페투인-세파로스 4B와 아시알로페투인-세파로스 4B에 따른 정제 효율성 측정

상기의 방법으로 페투인-세파로스 4B 및 아시알로페투인-세파로스 4B를 리간드로 사용한 컬럼으로 크로마토그래피하여 분리한 렉틴의 수율과 다음의 방법으로 락토즈-BSA-세파로스 4B를 리간드로 사용하여 분리한 렉틴의 수율을 측정하고 비교하였다.

소 혈청 알부민 (BSA, 68㎍, 1㎛ol), 락토즈 (100mg, 292㎛ol), sodium cyanoborohydride (100mg, 1.59μmol)을 0.2M 인산칼륨 완충용액 (pH 7.0) 5.0mL에 녹인 후 37℃에서 10일간 반응시켰다. 0.1M 인산칼륨 완충용액 (pH 7.0)으로 미리 평형화시켜둔 세파로스 G-25 컬럼 (2.5×45㎝)에 상기 반응 혼합물을 주입한 뒤 유속을 210mL/hr로 하여 락토즈-BSA 쌍의 분리를 실시하였다. 각각의 분획들을 UV (λ_max=280㎚)에서 확인하였으며 콘쥬게이트 (conjugate)를 포함하고 있는 분획들을 모아 증류수에서 48시간 투석하고 초여과세포 (ultrafiltration cell, Amicon, M.W=10,000)를 이용하여 농축시킨 후 BCA (Bicinchoninic acid)법으로 정량하였다. 동결 건조된 CNBr-activated 세파로스 4B 분말을 coupling시킬 콘쥬게이트 (conjugate, lactose-BSA)의 BSA (spacer)를 10mg 당 2mL (1g=3.5mL)의 양이 되도록 차가운 1mM HCl에 현탁시킨 뒤 3시간동안 충분히 팽윤시켰다. 팽윤된 겔을 1mM HCl (겔 1g당 200mL의 양)로 세척하였고 완충용액을 완전히 제거시킨 뒤 겔과 콘쥬게이트를 포함하는 0.1M NaHCO₃/0.5M NaCl coupling 완충용액 (pH 8.3)의 부피비가 1대 2가 되도록 24시간동안 4℃에서 약하게 교반하면서 반응시켰다. Coupling 후 겔 상에 남아있는 활성화기를 제거하기 위해 블러킹 (blocking) 시약, 0.2M 글리신(glycine)/0.5M NaCl 용액 (pH 8.0)에 coupling 혼합물을 넣고 24시간동안 4℃에서 반응시켰다. Coupling되지 않은 과량의 콘쥬게이트를 제거하기 위해 겔을 높은 pH와 낮은 pH의 완충용액 즉, 0.1M 아세테이트/0.5M NaCl 용액 (pH 4.0)과 coupling 용액 (pH 8.3)으로 바꾸어가며 4∼5회 반복 세척하였다.

세파로스 4B를 0.15M NaCl 완충용액으로 충분히 세척한 뒤 컬럼 (3×21㎝)에 충전시키고 0.15M NaCl 완충용액으로 평형화시켰다. 물 추출물을 컬럼에 주입하고 비흡착 물질이 용출되지 않을 때까지 0.15M NaCl 용액으로 세척하고 흡착된 렉틴을 0.2M 락토즈 용액으로 용출시켰다. 분리에 사용된 모든 용액에는 0.02% 나트륨 아지드 (sodium azide)가 첨가되었다. 용출시킨 흡착물은 UV (λ_max=280nm)에서 확인하였으며 피크 (peak)를 나타내는 분획을 모아서 초여과세포 (ultrafiltration cell, Amicon, M.W=10,000)를 사용하여 농축시켰고 BCA법으로 단백질을 정량하였다.

일반적으로, 렉틴의 효율적인 정제를 위하여 당단백질이나 당잔기 형태의 탄수화물 리간드를 컬럼에 고정시킬 수 있다. 그러나, 렉틴의 정제를 위해 서로 다른 친화성 리간드를 사용하는 것은 정량적이고 정성적인 차이를 불러일으킬 수 있으므로, 친화성 리간드 비율의 결정은 최적의 렉틴 회수를 위한 필수 전제이다. 렉틴에 의한 당 결합의 인식은 글리칸 부분에 의해 조절되며 매우 복잡한 현상이다. 표 2는 겨우살이로부터 분리한 총 렉틴 수율에 있어서의 고정된 리간드 타입에 따른 효과를 보여준다.

건조시킨 겨우살이 렉틴 100g에서 분리한 총 렉틴 수율에 있어서의 고정 리간드 타입에 따른 효과

겨우살이	리간드
겨우살이	락토오즈-BSA	페투인	아시알로페투인
한국산	1.2±0.8 (㎎)	11.1±2.1 (㎎)	21.9±2.5 (㎎)
유럽산	0	5.2±1.9 (㎎)	13.5±1.8 (㎎)

한국산 겨우살이와 유럽산 겨우살이를 락토즈-BSA-세파로스 4B에 의해 정제하여 분리한 렉틴의 양과 페투인- 또는 아시알로페투인- 세파로스 4B로 분리한 렉틴의 양을 비교해 본 결과, 페투인- 또는 아시알로페투인-세파로스 4B로 분리하는 것이 효율적이었으며 아시알로페투인-세파로스 4B로 분리하는 경우가 가장 효율적이었다. 또한, 같은 방법으로 분리한 경우, 한국산 겨우살이의 렉틴이 유럽산 겨우살이의 렉틴보다 더욱 효율적으로 분리되었다 (표 2).

제5단계. 상기 분리한 한국산 및 유럽산 겨우살이 렉틴 (lectin)의 분자량과 특성을 확인하기 위한 전기영동 (SDS-PAGE) 및 웨스턴 블럿 분석

상기 친화성 크로마토그래피 (affinity chromatography)를 통해 얻어진 렉틴의 특성을 확인하기 위해 멀티클론의 토끼 항-VCA 항체 (polyclonal rabbit antibody, KOMA biotech, Korea)을 프로브로 사용한 웨스턴 블럿 분석 (Western blot analysis)을 실시하였다. 상기 정제한 단백질을 25mM 트리스 (Tris), 192 mM 글라이신 (glycine), 20% 메탄올 완충용액 (methanol buffer, pH 8.3)를 첨가한 니트로셀룰로스 막 (nitrocellulose membrane)에서 전기적으로 흡입시키고 그 막을 5%의 탈지유가 포함된 인산완충용액 (PBS)에 넣어 고정시킨 후 상온에서 멀티클론의 토끼 항-VCA 항체 (polyclonal rabbit antibody, KOMA biotech, Korea)와 함께 배양하였다. 그 막을 PBS-Tween 20 (0.5%)으로 세척하고 goat anti-rabbit IgG-HRP (horse radish peroxidase) 항체 (Biorad, California, USA)를 함께 섞어 배양하였다. 결합한 항체를 BCIP/NBT 검출 시스템 (Biorad)으로 검출하였다.

락토즈-BSA-세파로스 4B, 페투인-세파로스 4B 및 아시알로페투인-세파로스 4B를 사용한 컬럼으로 분리한 한국산 겨우살이의 렉틴을 농도 12.5%의 겔에서 SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 전기영동하여 분자량을 분석하였다 (도 4). 환원제의 존재 하에서 1-3 레인 중 Mr=34KDa과 Mr=31KDa에서 두 개의 밴드가 나타났으며, Mr=29kDa에서 또 하나의 밴드가 나타났다 (도 4, 레인 1-3). 환원제 (2-mercaptoethanol)가 결핍된 상태에서는 Mr=60kDa에서 밴드가 나타났다. 렉틴은 A, B, O, AB 등 혈액형 타입에 따른 특이성이 없었으며, 렉틴 (1mg/mL)의 혈액응고 활성도는 128 HU (hemagglutin -ation unit, microtiter plate에서 렉틴용액을 2배수로 희석하였을 때 적혈구의 응집 반응을 보이는 최대 희석 배수)였다. 도 5는 가장 높은 효율을 보인 아시알로페투인-세파로스 4B로 분리한 한국산 및 유럽산 겨우살이 렉틴의 전기영동으로서, 2번 레인에 나타난 세 개의 띠는 유럽산 렉틴이 VAAs 혼합물임을 나타내며 3번 레인은 한국산 겨우살이의 렉틴이다 (도 5, 레인 2, 레인 3). 이것은 아시알로페투인-세파로스 4B에 의해 분리된 한국산 겨우살이의 렉틴이 VCA인 반면에, 유럽산 겨우살이로부터 같은 방법으로 분리된 렉틴은 VAAs 혼합물임을 의미한다. 도 6은 정제된 유럽산 VAAs와 아시알로페투인-세파로스 4B로 분리한 VCA를 비교한 결과이다. VCA의 분자량은VAA-Ⅱ와 유사하나 (레인 3) 그 각각의 A 체인과 B 체인의 분자량은 서로 달랐다 (레인 7,8,9,10). 아시알로페투인-세파로스 4B 또는 페투인-세파로스 4B로 분리한 VCAs는 락토오즈-세파로스 (lactose-Sepharose) 4B로 분리한 VCA에 대해 저항하여 결합하는 멀티클론의 항체를 인식한다는 것을 웨스턴 블럿 분석법 (Western blot analysis)으로 알 수 있었다 (도 7, 레인 1, 레인 2).

실시예 3 : 멀티클론의 anti-VCA 항체가 표지된 효소결합 렉틴 검출법 (ELLA ; Enzyme-linked lectin assay)를 이용한 한국산 겨우살이 렉틴 VCA의 분석 및 측정

한국산 겨우살이를 4 부피 (w/w)의 증류수에 하룻밤 침지시킨 후 분쇄기로 갈아주었다. 분쇄한 식물을 무명천으로 여과하여 그 여과액을 12,000rpm에서 30분간 원심분리하였다. 식물의 물 추출용액 농도 (mg/mL)는 수용액 1mL에 들어 있는 렉틴의 양으로 나타내었다.

아시알로페투인-1 (Asialofetuin-1, 100㎕/well of 0.1mg asialofetuin- 1/mL in PBS)을 microtiter plate에서 하룻밤 배양한 후 PBS-T로 세척하여 항원 (100㎕/well of antigen in PBS)을 첨가하고 37℃에서 1시간 배양하였다. 플레이트를 PBS-Tween 20으로 세척한 후 blocking 용액 (200㎕/well of 1% BSA in PBS)을 첨가하여 배양 및 세척하였다. 1차 항체 (Primary antibody) 용액을 첨가하여 배양한 후 세척하고, 2차 항체 (Secondary antibody) 용액 (goat antirabbit IgG conjugated peroxidase solution)을 첨가한 후 배양하여 세척하였다. 모든 세척과정은 3회씩 반복하였다. 과산화효소 (Hydroperoxidase) 기질 ABTS (2,2'- Azinobis [3-ethylbenzotiazoline-6-sulfonic acid]-다이암모늄 염 (diammonium salt) [100㎕/well]) 용액을 첨가한 후 암실에서 20분간 배양하여 1% SDS 100㎕/well 로 반응을 정지시키고 405nm에서 흡광도를 측정하였다 (도 8 및 도 9).

겨우살이 추출물의 렉틴의 양은 숙주 나무의 종, 수확한 계절 그리고 식물체의 부분 (줄기, 잎, 과실)에 달려 있다. 따라서, 겨우살이 추출물에서 생물학적으로 활성화된 성분이 렉틴이라면 추출물 속의 렉틴의 함유량을 규격화할 필요가 있다. 이 때, 문제점은 측정된 렉틴 성분과 표본에서의 실제 양 사이의 분석 감도와 상관관계이다. 겨우살이 추출물에 들어 있는 렉틴의 분석을 위하여 적혈구 응집 반응이 많이 이용되어 왔으나, 감도가 떨어지는 등 양의 결정을 위한 방법으로서는 적절치 않다. 당 친화적인 렉틴에 기초한 ELLA에서 아시알로페투인은 코팅 항원 (coating antigen)으로 사용되어 왔다. ELISA와 비교하여, ELLA는 활성 있는 당 결합 렉틴을 측정하는 좋은 방법이었다. 본 발명에서는 겨우살이의 렉틴을 측정하기 위해 멀티클론의 항-VCA 항체 (antibody)가 표지된 ELLA 시스템을 구축하였다. 10-100ng/mL의 VCA 범위에서 10개의 표준농도 렉틴을 사용하여 ELLA로 검출되는 최소의 렉틴 농도를 실험한 결과 약 5-10ng/mL임을 알아내었다 (도 8). 도 9는 ELLA에 의해 측정된 흡수도 (absorbance value)로부터 환원된 겨우살이 추출물의 렉틴 농도를 나타낸다. Linear한 실험 범위에서 물 추출물의 농도 범위는 1-100mg/mL이었다.

실시예 4 : In vitro 에서의 Molt-4 세포에 대한 VCA의 세포 독성 활성도 분석을 위한 MTT 분석

Molt-4 세포 (acute human T-lymphoblastic, KCLB 21582)를 한국 세포주 은행으로부터 분양받아 10%의 fetal bovine serum (FBS, Hyclone)과 페니실린-스트렙토마이신 (10,000 unit/mL, Gibco)을 첨가한 RPMI 1640에서 현탁액 상태로 5% CO₂, 95% air, 37℃하에서 보관한 후In vitro에서 세포독성효과를 MTT (dimethylthiazol tetrazolium bromide) 분석법으로 알아보았다. 세포 부유물을 96-well microtiter plate (100㎕ of cell suspension containing 1×105 cells/mL in each well)에서 정제하고 배양배지 (culture medium)로 희석시킨 렉틴 용액의 물 추출물 100㎕를 세포 현탁액에 넣어 5% CO₂, 37℃에서 72시간 동안 배양하고 마지막 단계에서 MTT용액을 첨가하여 4시간 동안 다시 배양한 후 570nm에서 ELISA plate reader로 검출하였다.

렉틴 함유 조성물 조제 과정에서 렉틴의 일부가 변성되므로, 모든 렉틴 성분이 렉틴의 생물학적 활성을 모두 포함하는 것은 아니다. 따라서, 렉틴 함유 조성물을 조제하기 위해서는 생물학적 활성 농도에 따라 렉틴 성분이 표준화되어야 한다. Molt-4 세포에 대한 VCA의 세포 독성 활성도 (IC₅₀=1.2ng/mL)는 VAA-Ⅰ의 세포 독성 활성도 (IC₅₀=0.7ng/mL)와 매우 유사하였다 (도 10). 한국산 겨우살이의 물 추출물의 세포 독성 활성도 (IC₅₀=2.5㎍/mL)는 유럽산 겨우살이의 세포 독성 활성도(IC₅₀=5㎍/mL)보다 세포 독성에 있어서 더욱 민감하였다 (도 11). 따라서, Molt-4 세포를 이용한 세포 독성도의 측정은 한국산 겨우살이 조성물 조제의 표본이 될 수 있을 것이다.

이상의 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 한국산 겨우살이 (Viscum albumL. var.coloratum) 유래의 렉틴 (lectin) 단백질의 A체인 및 B체인 전장의 유전자 및 아미노산 서열을 제공함으로써 신규한 렉틴 유전자를 유전공학의 기초물질로 사용하여 렉틴 단백질 제제를 포함한 각종 의료산업에 이용할 수 있는 효과가 있으며, 생체 면역 기능을 증강시키고 세포 면역능을 유도하며 항암 기능을 나타내는 렉틴을 아시알로페투인-세파로스 (asialofetuin-Sepharose) 4B를 리간드로 충전시킨 컬럼을 이용하여 컬럼 크로마토그래피하여 순도높게 정제함으로써 한국산 겨우살이의 렉틴을 효율적이고 순수하게 분리하여 제공함으로서 암세포의 증식을 억제하고 생체 면역 기능을 향상시키는 렉틴 단백질을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 멀티클론의 항-VCA 항체 (polyclonal anti-VCA antibody)로 표지한 ELLA를 이용하여 겨우살이 추출물로부터 생물학적 활성이 있는 렉틴의 함유량을 정량적으로 측정함으로써 겨우살이 렉틴 함유 조성물을 생화학적으로 표준화하거나 Molt-4 세포주를 사용한 세포 독성도 측정을 통하여 겨우살이 렉틴 함유 조성물을 생물학적으로 표준화함으로써 렉틴 함유 조성물의 제조에 응용할 수 있는 뛰어난효과가 있으므로 국민 건강 증진 및 의약품 제조 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

한국산 겨우살이 (Viscum albumL. var.coloratum) 유래의 항암활성 렉틴을 코딩하는 하기의 신규한 유전자 염기서열.
제 1항 기재의 한국산 겨우살이 (Viscum albumL. var.coloratum) 유래의항암활성 렉틴 유전자에 의해 코딩되는 하기의 신규한 아미노산 서열.
겨우살이 렉틴을 아시알로페투인-세파로스 (asialofetuin-Sepharose) 4B를 리간드로 고정시킨 컬럼으로 크로마토그래피하여 분리함을 특징으로 하는 항암활성 겨우살이 렉틴의 분리방법.
제 2항 기재의 아미노산 서열에 의해 코딩되고 제 3항 기재의 방법에 의해 추출되는 겨우살이 렉틴을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 한국산 겨우살이 렉틴 함유 항암활성 조성물.
한국산 겨우살이 추출물의 생물학적 활성이 있는 렉틴을 정량하기 위하여 polyclonal anti-VCA antibody로 표지한 ELLA 시스템을 이용함을 특징으로 하는 렉틴 함유 조성물의 렉틴 정량화 방법.
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