KR19990034024A

KR19990034024A - 한국산 겨우살이로부터 분리된 lectin 성분을 함유하는면역증강용 의약조성물

Info

Publication number: KR19990034024A
Application number: KR1019970055486A
Authority: KR
Inventors: 김종배; 송성규; 곽진환; 윤택준; 강태봉; 박춘호; 서병선; 이관희; 도명술; 유영춘
Original assignee: 이영덕; 학교법인 현동학원
Priority date: 1997-10-28
Filing date: 1997-10-28
Publication date: 1999-05-15
Also published as: KR100259231B1

Abstract

본 발명은 한국산 겨우살이로부터 KML-C를 분리하고, KML-C에 존재하는 두 개의 단백질 KML-ⅡU와 KML-ⅡL을 함유하여 생체의 면역기전을 증강시키는 면역증강용 의약조성물에 관한 것이다.

본 발명의 한국산 겨우살이 추출물에서 얻은 lectin 성분은 유럽산 겨우살이로부터 추출한 lectin 성분과 명백한 차이를 나타냈다. 또한, 본 발명의 KML-ⅡU은 성숙된 숙주의 면역담당세포들이 효과적인 면역반응을 위한 일련의 세포성 반응성이 증진되는 효과를 가지고 있으며, 외부로부터의 항원에 노출되었을 경우 유도되는 항원특이적 면역반응을 위한 작동세포의 수를 증폭시킴으로서 항원에 대한 효과적인 면역반응을 유도할 수 있는 효과가 있다. 이밖에도, 본 발명의 KML-ⅡU는 Th1 또는 Th2의 어떠한 types의 CD⁺T세포에 모두 작용을 함으로서 이후의 면역작용이 체액성 뿐만 아니라 세포성 면역능도 상승시킬 수 있을 것으로 사료되고 지연성과민반응을 증진시키는 면역증강효과를 유도할 수 있다.

Description

한국산 겨우살이로부터 분리된 ｌｅｃｔｉｎ 성분을 함유하는 면역증강용 의약조성물

본 발명은 한국산 겨우살이(Viscum album, Coloratum) 식물로부터 분리된 lectin 성분을 함유하는 면역증강용 의약조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 한국산 겨우살이로부터 KML-C를 분리하고, KML-C에 존재하는 두 개의 단백질 KML-ⅡU와 KML-ⅡL을 함유하여 생체의 면역기전을 증강시키는 면역증강용 의약조성물에 관한 것이다.

겨우살이(mistletoe. Viscum album)는 여러 종류의 나무를 숙주로 하여 생장하는 반기생식물로서 세계 전역에는 30속 1,500종의 식물이 있는 것으로 알려져 있다. 여러종류의 겨우살이 중에 현재 약재로 사용되고 있는 겨우살이는 Viscum 속(genus)의 겨우살이로서, 주로 유럽지역에서 서식되는 유럽산 겨우살이(Viscum album Loranthacea)이다. 유럽의 loranthacea과에 속하는 겨우살이는 오래전부터 민간요법으로서 고혈압, 동맥경화증, 암 등에 대하여 효과가 있는 신비의 약제로 사용되다가, 1921년부터 항암활성을 인정받아 종양에 대한 치료 및 그 보조제로 사용되고 있다. 따라서, 겨우살이의 생물학적 활성에 대한 연구는 주로 유럽에서 유럽지역에 서식하는 겨우살이에 대하여 수행되어 왔다.

유럽지역에 서식하는 겨우살이는 체액성 및 세포성 면역체계를 자극하는 면역증강 효과가 있는 것으로 보고되었고, 또한 동물 및 인간에 대한 임상 실험결과 종양 세포에 대하여 직접, 간접적으로 대응하는 대식세포 및 자연살해세포의 활성을 증가시킴으로서 종양세포의 성장을 억제하여 암환자의 생존율을 높이는 효과가 있음이 보고되었다(USP 5547674). 이러한 효과는 겨우살이의 면역증강 작용 및 종양세포에 대한 직접적인 세포독성 효과에 의한 것으로 알려져 있으며, 대표적인 활성물질로는 렉틴 성분들로 당쇄부분의 특이성 및 분자량에 따라 렉틴Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ의 3종류로 구별하고 있으며 주로 렉틴 Ⅰ에 대한 면역학적, 생화학적 연구가 진행되고 있다.

한편, 유럽산 겨우살이와 구별되는 한국산 겨우살이 역시 민간 및 한방에서 요통, 고혈압, 유산방지, 치통에 대한 약재로 사용되어 왔으며, 한방에서 숙주나무에 따라 상기생, 기생목, 해기생 등의 각기 다른 이름으로 불리어진 것으로 보아 숙주나무에 따른 상이한 약효 및 그에 기인되는 성분상의 차이가 있음이 암시되었다. 실제로 유럽산 겨우살이는 숙주에 따른 렉틴성분등에서 차이가 보고된 바 있으므로 한국산 겨우살이에서 숙주등에 따른 성분의 변화가 있을 수 있다는 가능성을 배제할 수 없다. 이러한 사실에 기초하여 한국산 겨우살이(V. album, Coloratum)에 대한 과학적인 연구로서는 최초로 Khwaja 등은 한국산 겨우살이의 항종양효과 및 활성성분에 대하여 보고하였다(USP No. 5,565,200). 이 연구는 한국산 겨우살이의 항종양 효과는 유럽산의 경우와는 다르게 렉틴에 의한 것이 아니라, 강한 독성의 alkaloids에 의한 세포독성효과에 의한 것으로 보고하여 유럽산 겨우살이와 한국산 겨우살이의 항종양활성 성분 및 기작을 구별하였으나 후속 연구는 아직 없는 실정이다. 그러나, 최근의 연구결과 한국산 겨우살이 역시 macrophage를 직접 활성화 시켜서 Interleukin-1(IL-1)과 Turmor necrosis factor-α(TNF-α)를 유도하며, 이들 cytokine들을 유도하는 활성성분은 ammonium sulphate에 의해 침전되는 단백질 성분인 것으로 밝혀져 한국산 겨우살이 성분중에서도 렉틴이 존재함을 예측할 수 있었고 그후 한국산 겨우살이에서도 렉틴이 분리되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기와 같은 사실에 의거하여 안출한 것으로 한국산 경우살이로부터 렉틴 성분을 분리, 정제하고 물질의 분석 및 생물학적 활성을 조사하여 한국산 겨우살이로부터의 렉틴 성분과 유럽산 겨우살이로부터의 렉틴 성분을 비교하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 한국산 겨우사리로부터 분리된 렉틴성분의 면역증강 효과를 조사하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 한국산 겨우살이 렉틴을 크로마토그래피법으로 분리한 후 렉틴에 대한 단일클론 항체를 생산하고, 생산된 단일클론 항체의 특성을 조사하여 한국산 렉틴에 특이적으로 반응하는 항체를 이용하여 특성이 다른 두가지의 렉틴 성분(KML-ⅡU 및 KML-ⅡL)을 분리하였다. 그리고, 분리된 두 렉틴 성분과 유럽산 렉틴 성분을 비교하기 위하여 전기영동 및 gene cloning을 포함하는 아미노산 서열을 조사하여 한국산과 유럽산의 명백한 차이점을 확인하고 면역증강 효과를 조사하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 첨부한 도면과 실시예에 따라 상세히 설명한다.

도 1은 환원, 비환원 조건하에서 KML-C의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 사진이다.

도 2는 단일클론(9H7D10)을 사용한 KML-C의 Western blot 분석을 나타낸 사진이다.

도 3은 KML-C, KML-ⅡU, KML-ⅡL를 SDS-PAGE 분석한 사진이다.

도 4는 한국산 겨우살이 렉틴의 N-terminal 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 5는 재조합 플라스미드 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.

도 6은 한국산 겨우살이 렉틴 유전자, clone 1의 염기서열을 나타낸 것이다.

도 7은 한국산 겨우살이 렉틴 유전자,clone 2의 염기서열을 나타낸 것이다.

도 8은 한국산 겨우살이 렉틴과 유럽산 겨우살이 렉틴의 아미노산 서열을 비교한 것이다.

도 9는 KML-ⅡU를 주사한 쥐의 비장세포의 mitogen 첨가에 대한 감응을 나타낸 그림이다.

도 10은 대식세포의 KML-ⅡU에 의한 IL-1 유도활성을 나타낸 그림이다.

도 11은 NK-세포활성 유도에 대한 KML-ⅡU의 효과를 나타낸 그림이다.

도 12는 항원 KLH에 특이적인 항체의 유도능에 대한 KML-ⅡU의 효과를 나타낸 그림이다.

도 13은 항원 KLH 단독 또는 KML-ⅡU와 동시에 면역함으로서 유도되는 KLH에 대한 항체의 subisotypes 분석을 나타낸 그림이다.

도 14는 항원 KLH로 면역한 마우스의 비장세포의 항원 특정 분화를 나타낸 그림이다.

도 15는 KLH 항원에 감작된 마우스의 비장세포로부터 KLH에 대한 IL-2와 IL-4의 생산을 나타낸 그림이다.

도 16은 DTH 유도에 대한 KML-ⅡU의 효과를 나타낸 그림이다.

본 발명의 구체적인 구성과 작용을 첨부한 도면을 참고로 하여 설명한다.

도 1은 환원, 비환원 조건하에서 KML-C의 SDS-PAGE 분석하여 존재하는 단백질을 KML-ⅡU와 KML-ⅡL로 나타낸 사진이다. 도 2는 단일클론(9H7D10)을 사용한 KML-C의 Western blot 분석을 나타낸 사진이다. 도 3은 KML-ⅡL, KML-ⅡU, KML-C를 SDS-PAGE 분석한 사진이다. 도 4는 한국산 겨우살이 렉틴의 N-terminal amino aced 배열을 나타낸 것이다. 도 5는 재조합 플라스미드 벡터의 모식도를 나타낸 것이다. 도 6은 한국산 겨우살이 렉틴 유전자,clone 1의 염기서열을 나타낸 것이다. 도 7은 한국산 겨우살이 렉틴 유전자,clone 2의 염기서열을 나타낸 것이다. 도 8은 한국산 겨우살이 렉틴과 유럽산 겨우살이 렉틴의 서열을 비교한 것이다. 도 9는 KML-ⅡU를 주사한 쥐의 비장세포의 mitogen 첨가에 대한 감응을 나타낸 것이다. 도 10은 대식세포의 KML-ⅡU에 의한 IL-1 유도활성을 나타낸 것이다. 도 11은 NK 활성 감소에 대한 KML-ⅡU의 효과를 나타낸 것이다. 도 12는 KLH에 특이적인 항체의 유도능에 대한 KML-ⅡU의 효과를 나타낸 것이다. 도 13은 KLH 단독 또는 KML-ⅡU와 동시에 면역함으로서 유도되는 KLH에 대한 항체의 subisotypes 분석을 나타낸 것이다. 도 14는 KLH로 면역한 쥐의 비장세포의 항원 특정 분화를 나타낸 것이다. 도 15는 KLH에 감작된 마우스의 비장세포로부터 KLH에 대한 IL-2와 IL-4의 분비여부를 나타낸 것이다. 도 16은 DTH 유도에 대한 KML-ⅡU의 효과를 나타낸 것이다.

이하에는 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예를 들어 설명한다.

실시예 1. 겨우살이의 준비 및 Lectin 분리

Lectin 성분의 분리를 위해 참나무를 숙주로 하여 자라는 겨우살이를 12월~2월중에 채취하여 증류수로 3회 세척한 후 -80℃에서 동결하고 잘게 세절한 후 블렌더(blender)에서 다시 chopping한 후 5배 부피의 0.15M NaCl 용액으로 8~12시간동안 4℃에서 추출하고 10,000×g에서 20분간 원심분리 시킨후 상등액을 취하였다. 그리고 단백성분을 침전시키기 위하여 상등액에 ammonium sulfate powder를 첨가시켜 70%의 황산 암모늄 포화용액을 만들고 4℃에서 약하게 교반시켰다. 다시 10,000×g에서 20분간 원심분리시킨후 상등액은 버리고 팰렛을 취하여 최소 부피의 0.15M NaCl이 함유된 phosphate 완충용액(PBS)에 재현탁시키고 동일한 용액에서 24시간 동안 2, 3회 완충용액을 바꿔가면서 투석시켰다. 그후 10,000×g에서 원심분리 시킨후 상등액만을 취하여 0.45um membrane filter에서 여과한 후 여액을 50℃에서 3시간동안 0.2M HCl로 가수분해시킨 Sepharose 4B를 충진한 칼럼으로 통과시키고 5배 column volumn의 PBS로 세척하고 칼럼에 결합된 물질은 50mM Galactose가 함유된 PBS로 용출시켜 얻어진 부분을 KML-C로 명명하였다.

실시예 2. KML-C의 순도 및 분자량 조사

KML-C의 분자량 및 순도를 측정하기 위하여 0.1% SDS를 함유하는 13% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동을 실시하여 표준단백들과 비교하였다. 전개완료 후 단백 band들은 coomassie blue 염색시약으로 염색하였다. 실험 결과 사진도 1에서 확인되는 바와 같이 2-mercaptoethanol을 처리한 환원상태에서는 각각 33.2, 31, 28.6, 25.5 KD의 분자량을 가지는 4개의 band가 확인되었다. 따라서 KML-C에는 두 개의 subunit을 가진 두 개의 단백질이 존재하고 있음을 확인하였으며 각각의 단백질을 KML-ⅡU(61.8KD)와 KML-ⅡL(56.4KD)로 명명하였다.

실시예 3. KML-C에 대한 단일클론 항체의 생산 및 특성 조사

단일클론 항체의 생산을 위하여 Balb/c mouse에 PBS에 20μg/100μl의 수준으로 용해시킨 KML-C를 동량의 complete Freund's adjuvant에 유화시켜 복강에 면역하였다. 14일후에 다시 1회 추가 면역한 후 10일 후에 mouse의 눈으로부터 소량의 혈액을 채취하여 혈청을 얻고 항원을 고정시킨 indirect ELISA로 역가를 확인한 후 adjuvant없이 20μg의 항원을 복강에 두 번째 주사하였다. 최종 면역 1주일 후에 Balb/c 마우스의 비장세포와 P4U1 골수종을 PEG를 이용하여 융합후 HAT 배지로 hybridoma를 선별하고 KML-C에 대한 항체를 생산하는 세포를 ELISA를 통해 선택하여 96 well plate에서 클로닝한 후 다시 screening과 클로닝을 반복하여 KML-C에 대한 단일클론 항체를 생산하는 hybridoma를 선별하였다. 항체를 대량생산하기 위하여 선택된 hybridoma들을 pristane을 주입한 후 마우스의 복강으로 주사하고 ascitic fluid를 얻었으며 항체를 정제하기 위하여 이 ascitic fluid를 protein-G column에 통과시켜 항체를 분리하였다. 정제된 단일클론 항체들 중에서 KML-C와 특이적으로 반응하는 항체를 선별하기 위하여 western blotting을 실시하였다. 먼저 KML-C를 SDS존재하에서 전기영동을 실시하고 Nitrocellulose membrane로 단백부분을 transfer시키고 각각의 단일클론항체를 반응시킨후 alkaline phosphatase가 conjugate된 2차 항체를 반응시킨후 BCIP-NBT 용액으로 발색하였다. 실험 결과 사진도 2와 같이 대조군으로 사용한 유럽산 lectin에는 결합하지 않으면서 KML-ⅡU의 윗부분(33KD)의 band에 강한 specificity를 가진 단일클론(9H7D10)을 선별하였다.

실시예 4. Immuno-affinity column의 준비 및 KML-ⅡU, KML-ⅡL의 분리

KML-ⅡU와 KML-ⅡL 두 개의 단백질을 분리하기 위하여 9H7D10 항체를 제조사(Pharmacia Biotech)의 지침에 따라 activated Sepharose로 고정시킨 immuno-affinity column을 만들었으며 이를 이용하여 다음과 같은 방법에 따라 두 개의 단백질을 분리하였다. 먼저 KML-C를 PBS에서 투석하여 갈락토오스를 제거한 후 immuno affinity column으로 통과시키고 PBS로 용출되는 부분(KML-ⅡL)과 glycine-HCl buffer(pH 2.7)에 용출되는 부분을(KML-ⅡU) 각각 수집하고 전기영동을 통해 순도를 측정하고 대조군으로서 유럽산 겨우살이 lectin(EML)과 비교하였다. 실험결과는 사진도 3과 같이 KML-C로부터 KML-ⅡU와 KML-ⅡL를 각기 분리할 수 있었으며 또한 이들이 EML과는 각기 다른 분자량을 가진 단백 band들로 확인되었다.

실시예 5. KML-ⅡU와 KML-ⅡL에 대한 적혈구 응집반응실험 및 당저해반응실험

분리된 한국산 겨우살이 lectin들이 agalutinin으로서의 기능을 가지는지, 그리고 어떠한 당에 specificity를 가지는지에 대해 조사하고자 적혈구 응집반응과 당저해반응을 실시하였다. 응집반응과 저해반응 test는 U-Type 96 well microtiter plate를 이용하여 연속적인 두배 희석법으로 실시하였으며 그 과정은 다음과 같다. 먼저 B Type의 적혈구를 취하여 PBS에서 2%가 되게 현탁시킨후 정해진 농도의 lectin solution과 96 well microtiter plate에서 1시간 동안 배양하여 응집을 위해 요구되는 최소의 농도를 확인하였다(표 1). 그리고 이 농도의 lectin solution을 다양한 종류 및 다양한 농도의 당과 30분간 배양한 후 다시 적혈구 현탁액과 반응시켜 당에 의한 응집저해여부를 관찰하였다(표 2). 실험결과, KML-C와 KML-ⅡU 및 KML-ⅡL 공히 8μg/mL 수준에서 응집반응이 관찰되었고 Lactose, galactose, N-acetylgalactoseamine에 의해서 응집효과가 저해되었다. 따라서, 본 발명에서 분리된 한국산 lectin들은 Lactose, galactose, N-acetylgalactoseamine에 specipicity를 가지는 lectin으로 확인되었다.

KML-ⅡU와 KML-ⅡL의 적혈구 응집효과

렉틴	농도(㎍/㎖)
KML-C	8
KML-ⅡU	8
KML-ⅡL	8
EML	2
주: 농도(㎍/㎖)는 적혈구 응집에 필요한 최소농도임.

KML-ⅡU와 KML-ⅡL의 당에 의한 저해 효과

당	농도(mM)
갈락토오스	6
락토오스	3
N-acetylgalactoseamine	3
만노오스	>100
글루코오스	>100
N-acetylglucoseamine	>100
주: 농도(mM)는 적혈구 응집활성을 저해하는 몇가지 종류의 당의 최소농도임.

실시예 6. KML-ⅡU와 KML-ⅡL에 대한 아미노산 서열 결정

각각의 시료에 대한 SDS-PAGE를 실시하고 PVDF membrane로 transfer 시킨후 각각의 chain에 대한 sequencing을 amino acid sequence에서 실시한 결과는 도 4와 같다.

실시예 7. 한국산 겨우살이 lectin 유전자의 부분 클로닝

정제된 KML-ⅡU, KML-ⅡL에 대한 실시예 6에서 수행한 아미노산 서열을 기초로 하여, 2개의 올리고누클에오티드 프라이머를 설계하였다(Primer1: 5'-GTIACICATCAIACIGG-3', Primer2: 5'-ACIATICGCACIGTIGGTTC-3') 이 두 개의 프라이머를 이용하여 한국산 겨우살이의 전체 genomic DNA로부터 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 실시하였다. CTAB방법으로 추출된 genomic DNA 1㎍, 각각의 primer 100pmol, 각각 200μM 농도의 dNTP, 1.5mM의 MgCl₂, Amplitaq(Perkin-Elmer) DNA polymerase 2.5units로 조성된 PCR 반응액을 Thermal cycler(Perkin-Elmer 9600)에서 PCR을 수행하였다(denaturation at 94℃ 1mim, annealing at 45℃ 2min, primer extension at 72℃ 2min, 35회 반복). PCR 수행결과 얻어진 약 800bp의 DNA를 Promega사에서 제조 판매하는 pGEM-T vector의 EcoR V위치(3'-overhang에 T가 붙어있어 PCR 산물의 클로닝에 적합함)에 연결시켜 클로닝 하였다. 재조합 플라스미드 벡터의 모식도는 도 5와 같다.

실시예 8. 한국산 겨우살이 lectin 유전자의 부분염기서열과 추론된 아미노산 서열

클로닝된 lectin 유전자의 클론중 2개를 DNA 염기서열을 automated sequencer를 이용하여 결정한 결과는 도 6과 도 7과 같다. 종래 식물의 lectin들은 대개 여러 가지 isoform이 함께 존재하는 것으로 많이 보고되어 있는데 한국산 겨우살이의 경우에도 sequencing 결과 클론간에 염기서열의 다소간의 차이를 보여 여러 isoform이 존재할 가능성이 시사되었다. 또한 DNA 염기서열로부터 아미노산 서열을 추론하여 기존에 알려진 유럽산 겨우살이 lectin 및 연관된 다른 식물의 lectin의 서열과 비교한 결과는 도 8과 같다.

실시예 9. KML-ⅡU 및 KML-UUL의 암세포에 대한 세포독성 실험

분리한 한국산 겨우살이 렉틴의 특성조사를 위해 유럽산 겨우살이 렉틴(EML-1)을 대조군으로 하여 다양한 세포주에 대한 세포독성 효과를 in vitro에서 관찰하였다. 먼저 각각의 세포주 일정량을 96 well plate에 넣고 다양한 농도의 렉틴을 첨가하고 48시간 후에 MTT법에 의한 세포의 성장을 조사하여 각 종양세포주의 성장을 50% 억제한 시료의 농도(ED₅₀)를 표 3에 나타내었다. 실험결과, KML-ⅡU는 6-BL6 melanoma, Meth A fibrosacoma 세포주에서 비교적 높은 저항성을 나타낸 반면, 3LL carcinoma, Raji lymphoma에 대해서는 비교적 높은 감수성을 나타내어 종양세포에 대한 일부 특이성이 있는 것으로 생각되었다. 또한 대부분의 종양세포에 있어서 KML-ⅡU의 세포독성 효과는 유럽산 렉틴보다 강한 것으로 나타났으며 세포주에 따라서는 10배 이상 높은 세포독성 효과를 나타냈다. colon26-M3.1 carcinoma, B16-BL6 melanoma 및 L1210 leukemia 세포주에서 KML-ⅡU 및 KML-ⅡL의 세포독성 효과를 비교한 결과 모든 경우에서 KML-ⅡU가 비교적 높은 세포독성 효과를 나타냈다.

KML과 EML-1의 다양한 종양세포에 대한 세포독성 효과

Cell lines Origin	ED₅₀to tumor cells(mg/mL)
Cell lines Origin	KML-ⅡU	KML-ⅡL	EML-1
Murine cells
Colon26-M3.1 Carcinoma	19.0	2.0	0.8
B16-BL6 Melanoma	125.0	100.0	310.0
3LL Carcinoma	0.08	NT	0.03
Meth A Fibrosacoma	210.0	NT	1200.0
L1210 Leukemia	10.0	0.2	2.0
L5178Y Lymphoma	5.0	NT	>100
L929 Fibroblast	2.0	NT	NT

Human cells	4	NT	50
U937 Leukemia	3	NT	NT
HL60 Leukemia	0.12	NT	NT
Raji Lymphoma	0.9	NT	NT

실시예 10. 면역관련 세포의 mitogen에 대한 반응성

6주령의 Balb/c(암컷) 마우스 3마리를 한 group으로 하여 50ng의 KML-ⅡU를 주사(i.v.)하고 2일 후에 비장세포를 분리하였다. Flatbottoned 96-well culture plate(Nunc, Denmark)에 각 비장세포를 5×10⁵/100㎕의 밀도를 각 well에 넣고, T 세포 및 B 세포의 mitogen으로 알려진 Con. A와 LPS를 각각 0.5 및 5㎍/㎖의 농도로 100㎕씩 각 well에 처리후 5% CO₂, 37℃의 조건에서 3일간 배양하였다. 배양종료 6시간 전에 0.5μCi의 [³H]-TdR을 50㎕/well로 첨가후, 배양세포를 Filter mate 196(Packard Instrument, Meriden, CT)에 의해 glass filter에 흡착시킨 뒤, Matrix 96^TMDirect Beta Counter(Packard)에서 방사선 활성을 측정하였다. 도 9에서 나타낸 바와같이 KML-ⅡU을 투여한 마우스의 비장세포는 mitogen을 첨가하지 않은 경우에서도 시료 무처리 대조군에 비하여 DNA의 합성이 증가되는 결과를 나타내어 각 시료의 투여가 마우스의 비장세포를 in vitro에서 자극한다는 것이 확인되었고 이때, mitogen을 첨가할 경우 mitogen의 반응성을 증가시키는 것으로 사료되었으며 그 반응성은 KML-ⅡU의 농도에 비례하는 결과를 나타내었다. 이상의 실험결과를 종합하여 볼 때 KML-ⅡU은 성숙된 숙주의 면역담당세포들이 효과적인 면역반응을 위한 일련의 세포적 반응성이 증진시키는 효과를 가지고 있었으며, 만약 외부로부터의 항원에 노출되었을 경우 유도되는 항원특이적 면역반응을 위한 작동세포의 수를 증폭시킴으로 항원에 대한 효과적인 면역반응이 유도될 것으로 사료되었다.

실시예 11. 대식세포로부터 cytokines의 유도

Bal/c 마우스에 1% thioglycollate를 1㎖ 복강주사하고 4일 후에 경추탈골 방법으로 마우스를 희생시킨 후, 복강에 RPMI 1640 배지 10㎖를 주입하고 복벽을 가볍게 두드려 복강내 세포를 잘 섞이게 한 후 복강내세포(peritoneal exaudative cells; PEC)를 수집하였다. 수확한 PEC을 24 well culture plate에 1.5×10⁶의 농도로 조정하여 plating하였다. 2시간 동안 배양하여 대식세포를 부착 후, 배양액으로 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하고, 시료로서 여러농도의 KML-ⅡU을 첨가하여 대식세포를 자극하였다. IL-1의 활성은 ELISA kit(ENDOGEN)를 이용하여 cytokine(IL-1)의 분비유도를 확인하였으며, TNF-α의 활성은 L929세포를 이용하는 생물학적 정량에 의하여 조사하였다. 이때, 시료의 L929세포에 대한 직접적인 영향을 배제하기 위하여 1시간 동안 대식세포를 자극후에 배양배지를 이용하여 세포를 4회 세척후, 새로운 배지를 넣고 24시간 배양하여 배양상등액을 준비하였다. TNF-α의 활성은 대식세포 배양상등액에 의한 L929세포의 증식억제로 조사하였으며, TNF-α의 분비 유도 확인은 rabbit-anti-TNF-α로서 TNF-α의 중화실험으로 실시하였다. 실험결과는 도 10에 나타내었으며 대식세포의 KML-ⅡU에 의한 IL-1 유도활성은 KML-ⅡU의 농도 50ng/mL부터 1ng/mL까지 유의하게 나타났고 KML-ⅡU 농도에 의존적인 경향을 나타냈다. TNF-α의 활성의 조사결과, KML-ⅡU으로 자극된 대식세포 배양상등액은 지극한 시료의 농도에 의존적으로 L929 세포주를 살해하였으며, 그 세포독성 효과는 rabbit anti-TNF-α에 의하여 억제됨으로서 KML-ⅡU은 대식세포를 자극하여 TNF-α를 유도하는 능력이 있는 것으로 사료되었다. In vitro에서 TNF-α를 유도하는 KML-ⅡU의 경우는 2~0.4ng/mL의 농도에서 유효하였다.

실시예 12. NK-세포의 활성 측정

Balb/c 마우스에서 KML-ⅡU을 정맥주사하여 3일 후, 각 마우스의 비장세포와 YAC-1 세포의 비가 100:1, 50:1 및 25:1이 되도록 조종한 후 18시간 배양하였다. 배양종료 6시간전에 0.5μCi의 [³H]-TdR을 첨가후, 배양세포가 이용한 [³H]-TdR의 양을 Beta Counter를 이용하여 측정하였으며 NK 세포의 종양세포 살해능의 측정은 다음식에 의하여 구하였다.

Cytostatic activity(%)=(1-실험군의 YAC-1 세포의 총 [³H]-TdR uptake양/대조군의 YAC-1 세포의 총 [³H]-TdR uptake양)×100

실험결과는 도 11에 나타낸 것처럼 KML-ⅡU 50~10ng의 투여 사이에서 유효한 NK-세포의 종양세포 살해능을 나타내었다.

실시예 13. KML-ⅡU의 KLH 항원에 대한 항체유도의 증진효과

항원으로 KLH를 단독 혹은 KML-ⅡU와 동시에 면역한 후, KLH에 특이적인 항체의 유도능을 ELISA로 조사하였다. 도 12에 나타나 있듯이 KLH 항원 단독으로 투여한 경우보다 KML-ⅡU 20ng와 동시투여가 통계적으로 유의한 항체역가 상승효과가 일부 인정되었으나 booster 주사를 한 경우에는 그 효과가 현저하게 나타나 최초면역 5주째에는 KLH 단독투여의 항체역가에 비하여 60배 이상의 항체역가 상승효과가 있었으며 그 효과는 항원투여 10주째까지 유의성이 있었다. 따라서 KML-ⅡU은 항원에 대한 체액성 면역계를 활성화시키는 adjuvant 효과가 있었으며 이때 증진된 항체의 subisotype를 조사한 결과 도 13에 나타낸 바와 같이 주로 IgG1, IgG2a 및 IgG2b type이 상승된 결과를 나타내었다.

실시예 14. Lymphocyte 자극실험

group당 3마리의 Balb/c 마우스에 20㎍의 KLH을 PBS에 용해한 후, KLH 단독 혹은 KML-ⅡU(20ng)을 혼합하여 2주 간격으로 총 2회 피하주사(100㎕/마우스)로 면역하였다. 최종 면역 2주 후에 면역한 마우스로 혹은 정상 마우스로부터 비장을 취하고 10% FBS가 함유된 RPMI-1640 배지에 현탁하여 세포의 농도가 1.5×10⁵/well이 되도록 조정한 후 96-well culture plate에 분주하였다. 비장세포가 분주된 각 well에 항원 KLH를 40㎍/㎖부터 4배씩 희석하여 0.039㎍/㎖의 농도로 조정하여 첨가하였으며 LPS 혹은 Con-A를 최종농도가 0.2㎍/㎖가 되도록 조정하여 넣고, 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 72시간 배양하였다. 배양종료 5시간 전에 0.5μCi의 [³H]-TdR(50㎕/well)을 각 well에 넣고 각 well의 방사선 활성을 측정하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이 KML-ⅡU을 동시에 주사한 마우스의 비장세포는 KLH 단독 주사한 마우스의 비장세포에 비하여 항원으로 사용한 KLH에 대하여 유효한 세포의 분화(proliferation) 활성을 나타내었다. KLH에 대하여 감작된 비장세포의 분화 활성은 in vitro에서 재자극하는 KLH의 농도에 의존하는 경향을 나타냄으로서 KML-ⅡU의 in vitro에서의 항원에 대한 adjuvant 활성이 항원 특이적임을 나타냈다.

실시예 15. 항원 특이적인 Cytokines의 분비유도 효과

KLH 항원에 대한 adjuvant로서의 KML-ⅡU의 효과는 주로 T helper cell subunits로부터 분비되는 cytokine과 관련이 있을 것으로 사료되어 KLH에 감작된 마우스의 비장세포 배양상등액을 이용하여 Th1 및 Th2 type로부터 분비되는 IL-2 및 IL-4의 분비 여부를 ELISA Kit를 이용하여 조사한 결과는 도 15와 같다. 대조군인 PBS 투여 마우스의 경우 두 cytokines의 경우 모두에서 검출한계 이하의 cytokine 활성을 나타내었으나, 항원 KLH를 단독으로 피하주사(s.c.)한 마우스의 비장세포를 in vitro에서 항원으로 재자극한 경우 유도되는 IL-2 및 IL-4는 각각 105 및 10 pg/mL의 수준으로 유효한 분비 효과가 있었다. KLH에 adjuvant로서 KML-ⅡU을 동시에 투여한 경우는 KLH 단독의 경우에 비하여 두 cytokine 모두 2배 이상의 유도활성을 나타내었다. 이 결과는 KM-110 혹은 KML-ⅡU는 Th1 또는 Th2의 어떠한 types의 CD⁺T세포에 모두 작용을 함으로서, 이후의 면역작용이 체액성 뿐만 아니라 세포성 면역능도 상승시킬 수 있을 것으로 사료되었다.

실시예 16. 지연성과민반응에 미치는 영향

항원에 대한 지연성과민반응(delayed type hypersensitivity; DTH)은 항원에 대한 Keyhole lympet hemocyanine(KLH;20㎍) 단독 혹은 KML-ⅡU(20ng)을 2주 간격으로 총 2회 피하주사법으로 면역하였다. 최종면역 14주 후에 항원에 대하여 미리 감작된 숙주동물의 발바닥에 항원인 KLH(50㎍)을 피하주사한 후 1주일 동안 매일의 항원에 의하여 유도되는 항원주사부위의 팽창정도를 항원 무처리군에 대한 비율로서 지연성과민반응의 유도를 측정하였다. 도 16에 나타낸 바와같이 20ng의 KML-ⅡU가 동시투여된 마우스의 지연성과민반응은 항원 단독 주사의 마우스에 비하여 항원 재투여 2일후까지 유의한 증강효과가 있어 지연성과민반응을 증진시키는 면역증강효과를 유도하는 것이 인정되었다.

이상 설명한 실시예와 실험예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명 한국산 겨우살이 추출물의 lectin 성분은 유럽산 겨우살이로부터 추출한 lectin 성분과의 성분조성에 따른 그 아미노산 서열 및 렉틴 유전자의 염기서열 차이에 따른 면역증강 효과의 현저한 차이가 인정되었다. 본 발명의 KML-ⅡU은 성숙된 숙주의 면역담당세포들이 효과적인 면역반응을 위한 일련의 세포적 반응성이 증진되는 효과를 가지고 있으며, 외부로부터의 항원에 노출되었을 경우 유도되는 항원특이적 면역반응을 위한 작동세포의 수를 증폭시킴으로서 항원에 대한 효과적인 면역반응을 유도할 수 있는 효과가 있다. 이밖에도, 본 발명의 KML-ⅡU는 Th1 또는 Th2의 어떠한 types의 CD⁺T세포에 모두 작용을 함으로서 이후의 면역작용이 체액성 뿐만 아니라 세포성 면역능도 상승시킬 수 있을 것으로 사료되고 지연성과민반응을 증진시키는 면역증강효과를 유도할 수 있어 면역증강용 의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

한국산 겨우살이 비스쿰 알붐 콜로라튬(Viscum album. Coloratum) 식물의 추출물을 유효 성분으로 하는 면역증강용 의약 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물이 KML-C 분획임을 특징으로 하는 면역증강용 의약 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 추출물 KML-ⅡC 분획이 두 개의 subunit를 가진 단백질 KML-ⅡU(분자량 61.8KD) 및 KML-ⅡL(분자량 56.4KD)임을 특징으로 하는 면역증강용 의약 조성물.
한국산 겨우살이 비스쿨 알붐 콜로라툼 식물의 추출물 중 약학적으로 유효한 성분을 코드하는 렉틴(lectin) 유전자.
제 4항에 있어서, 상기 렉틴 유전자가 하기 아미노산 서열을 가지는 KML-ⅡU 유전자
제 4항에 있어서, 상기 렉틴 유전자가 하기 아미노산 서열을 가지는 KML-ⅡL 유전자