KR20030069506A

KR20030069506A - 새우 흰 반점 바이러스에 대한 난황항체

Info

Publication number: KR20030069506A
Application number: KR1020020009313A
Authority: KR
Inventors: 이종화; 박정우; 사공정; 오희경; 전진희; 문창훈
Original assignee: 주식회사 리앤조바이오텍
Priority date: 2002-02-21
Filing date: 2002-02-21
Publication date: 2003-08-27
Also published as: CN1638782A; WO2003070258A1; AU2003212661A1

Abstract

본 발명은 새우 흰 반점 바이러스에 대한 난황항체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 흰 반점 바이러스 또는 상기 바이러스의 단백질을 동물에 주입하여 면역시킨 다음 상기 동물에서 배출되어지는 난, 상기 난으로부터 분리된 난황항체 및 상기 난황항체를 포함하는 새우 흰 반점 바이러스 감염 방제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 새우 바이러스에 대한 난황 항체는 새우 흰 반점 바이러스에 작용하여 감염성을 억제하여 새우 바이러스 감염의 예방제로서 사용가능하다.

Description

새우 흰 반점 바이러스에 대한 난황항체{ANTI-WHITE SPOT SYNDROME VIRUS IGY}

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 새우 흰 반점 바이러스에 대한 난황항체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 새우 흰 반점 바이러스 또는 그의 단백질을 산란계에 주입하여 산란계를 면역화하고, 상기 면역화된 산란계가 생산한 난으로부터 수득된 난황항체에 관한 것이다.

[종래기술]

새우류의 양식 기술이 확립되면서 태국, 중국, 멕시코, 브라질 등을 비롯한 세계 각국에서 소 새우속(Penaeus monodon)을 중심으로 한 새우류의 양식이 활발하게 행해지고 있다. 하지만, 새우류 감염증에 의한 피해가 보고되면서 새우 양식업의 심각한 문제로 부각되고 있다.

새우류 감염증으로는 병원성 세균에 의한 비브리오 병 및 병원성 바이러스에 의한 바큐로바이러스 성 감염증 등이 있다. 특히, 새우의 흰 반점 바이러스(WSSV, white spot syndrome virus) 질병은 아시아지역에서 처음 발생하여 현재까지 가장치명적인 새우류의 질병으로 알려져 왔으나 최근 이 바이러스가 미국은 물론 중남미까지 확산되고 있다는 내용이 보고되었다.

1999년 초 라이트너 박사(Donald Lightner, 미국 애리조나 대학)는 중미의 태평양연안에 위치한 새우 양식 장에서 흰 반점바이러스를 확인하고 이를 국제수역기구(O.I.E., Office Internationale des Epizooties)에 통보하였다. 이 바이러스는 지난 6-7년간 아시아 각국의 새우양식산업에 심각한 타격을 가져왔는데 발병시 양식장내 90 %이상의 새우를 폐사시키는 치명적인 바이러스이다. 우리나라의 경우 1993년 처음 보고되었으며 해마다 피해가 급증하여 1996년에는 정점에 달한 후에 어느 정도 안정되었다. 하지만 여전히 흰 반점 바이러스는 새우양식에서 가장 심각한 장애요인으로 작용하고 있다.

새우 흰 반점 바이러스에 감염된 새우의 갑각에는 0.5∼2.0 mm 크기의 흰 반점들이 관찰된다. 이러한 반점들은 칼슘염의 축적에 의한 것으로, 복부 5, 6 체절과 갑각에서 시작하여 몸 전체로 확산되며, 갑각 외피와 근육과의 결합이 느슨해져 쉽게 분리된다. 감염된 새우는 색소포의 확산으로 인해서 핑크색 혹은 홍갈색을 띄며, 증상이 관찰된 후 3∼10일 이내에 거의 100 %가 폐사한다.

새우류 감염증에 대한 방제 대책으로서, 비브리오 병을 비롯한 세균 감염증에 대한 방제는 일반적으로 항균제(항생물질)가 사용되고 있다. 그러나 근래 항균제의 다량 유포로 인해 내성균의 출현이 문제시되고 있어 항균제 투여에 의한 충분한 방제 효과를 기대하기 어렵다. 또한 바이러스성 감염증에 대해서는 지금까지 유효한 약제가 개발되고 있지 않아 효과적인 방제 대책이 없는 실정이다.

사람을 비롯한 가축 등의 포유동물은 바이러스성 감염증의 방제를 위해 능동면역이 실용화되고 있다. 능동 면역이란 불활성화 또는 약독화 바이러스, 세균 등의 병원체를 사람, 가축 등의 개체에 투여하여 자가 면역력을 자극하여 생성된 해당 병원체에 대한 항체로 인해 감염증을 방어할 수 있는 면역 기능을 일컫는다. 양식 분야에서도, 감염증의 방제를 목적으로 한 능동 면역의 연구가 활발하게 진행되고 있다. 일본(특허공보 소 56-53286호, 특허공보 소 56-53287호, 특허공개 소 58-50026호)에서는 양식 어류의 비브리오 병에 대한 연구를 통해 양식류의 능동 면역을 실용화하고 있다.

새우류 등의 무척추동물은 항체를 이용한 특이적 면역 기능이 존재하지 않는 것으로 알려져 있으나, 비브리오 페네우스의 불활성화 균체를 이용한 새우 혈구 세포의 번식 활성 촉진 작용에 의한 비브리오병 감염 방제 효과가 보고되어 있다(일본 특개평 3-204820). 무척추동물의 면역은 항체를 이용한 특이적 면역 기능이 아니라, 혈구의 번식작용에 의한 생체 방어 기능이 주는 것으로 추정되지만 상세한 기작에 대한 연구는 이루어지지 않았다.

새우류에 대한 감염증의 방제 대책으로 수동 면역이 주목받고 있다. 수동 면역은 병원체에 대한 항체를 새우가 아닌 조류와 같은 가축에게 투여하여 생성된 항체를 새우 감염증의 방제에 이용하는 것이다. 산란계의 난황 항체를 이용한 수동 면역의 공지 예로서는, 스토렙토코카스 뮤탄스 세균이 이에 부착 감염되어 일어나는 충치의 예방(J. Dent, Res., 70,162-166,1991년), 로타바이러스가 장관 표피 세포에 부착하여 감염된 로타바이러스성 설사증의 예방(Microbiol. Immunol., 34,617-629,1990년) 등이 보고되어 있다.

양식 분야에 있어서 수동 면역의 공지 예로서는 부리유결절증의 예방, 광어 치어의 장관 백탁증의 예방 등, 어류의 감염증에 대한 항체를 이용한 수동 면역의 유효성에 관하여 보고되어 있다(일본 특허공개 평1-168246호). 하지만 무척추동물이 가지는 생체 방어 기구는 척추동물의 면역 기구와는 현저하게 다르며, 새우류 등의 무척추동물의 감염증 방제에 대한 수동 면역의 유효성에 관한 구체적인 보고가 없는 실정이다.

따라서, 본 발명은 새우 흰 반점 바이러스에 대한 방제방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 새우 흰 반점 바이러스에 대한 항체를 이용한 방제방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 새우 흰 반점 바이러스에 대한 난황항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 새우 흰 반점 바이러스 난황 항체를 포함하는 새우류 감염증 방제용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 새우 흰 반점 바이러스 또는 상기 바이러스의 단백질을 동물에 주입하여 면역시킨 다음 상기 동물에서 배출되어지는 난을 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 난으로부터 분리되어진 새우 흰 반점 바이러스에 대한 항체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 난을 포함하는 새우 흰 반점 바이러스 방제용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 새우 흰 반점 바이러스 항체를 포함하는 새우 흰 반점 바이러스 방제용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 새우 흰 반점 바이러스에 대한 항체를 제조하였으며, 이를 이용하여 새우 흰 반점 바이러스에 대한 방제용 조성물을 개발하였다.

본 발명의 항체는 새우 흰 반점 바이러스에 대하여 특이적인 결합 활성을 갖는 것이다. 더욱 바람직하게 항체는 새우 흰 반점 바이러스, VP24, VP26 또는 VP18 단백질에 대하여 특이적 결합활성을 갖는 단백질이다.

본 발명의 항체는 새우 흰 반점 바이러스에 대한 항원을 동물에 주입하여 면역시킨 다음 상기 동물에서 배출되어지는 난으로부터 제조된다. 상기 동물은 조류가 바람직하고, 그 예로는 닭, 오리, 칠면조 등이며, 가장 바람직하게는 산란계이다. 동물에서 항원을 주입하고, 면역시켜 항체를 포함하는 난을 제조하는 방법은 통상의 지식을 가진 당업자에겐 용이하게 실시할 수 있는 것이다.

예를들면 항원을 동물에 근육 주사, 피하 주사, 정맥 주사, 복강 내 주사 또는 경구 투여 등의 방법으로 주입하는 것이고, 바람직한 방법은 근육주사이다. 항원의 주입량은 항원의 단백질 양으로 환산하였을 때 10 ㎍ 내지 1 ㎎이 사용가능하나, 동물의 상태나 조건에 의해 달리 적용하는 것이 더욱 바람직하다. 또한 항원의 투여는 계란의 난황 중에 나타나는 특이적 항체(대응한 항원에 대하여 특이적 결합 활성을 갖는 항체) 양의 추이를 효소 면역 측정법 등의 방법으로 조사하여 항체양이 최대치로 될 때까지 반복하여 실시한다.

상기 새우 흰 반점 바이러스에 대한 항원은 불활성화된 새우 흰 반점 바이러스, 약독화된 새우 흰 반점 바이러스 또는 새우 흰 반점 바이러스 단백질이며, 바람직하게는 VP24(서열번호 1), VP26(서열번호 2) VP28(서열번호 3) 및 이들 각각의 단편으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질이다.

본 발명의 항체는 상기의 난으로부터 통상의 항체 분리방법으로 분리되어질 수 있다. 또한 상기 난을 분말, 건조하여 항체로 사용할 수 있으며, 전란 분말, 난황 분말, 또는 노른자위의 수용성 단백질화 분말을 더욱 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 상기의 난 또는 난황항체를 포함하는 새우 흰 반점 바이러스 방제용 조성물을 제공한다. 상기 방제용 조성물은 새우 사료나 새우를 사육하는 물에 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 새우 흰 반점 바이러스 방제용 조성물은 새우 감염증의 병원체에 대한 특이적 항체를 포함하여, 면역계의 난으로부터 얻어지는 전난 분말, 난황분말, 노른자위 수용성 단백질 분말, 계란 항체 순품 분말 등을 더욱 포함할 수 있다. 방제용 조성물내의 난 또는 난황항체의 혼합량은 통상의 함량으로 0.01 중량% 내지 10 중량%가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.1 중량% 내지 1 중량%이나 이에 한정되지 않으며, 난황항체의 역가에 맞게 조절하는 것이 가장 바람직하다.

또한 방제용 조성물은 분말상, 과립상, 펠렛상 등 통상의 제형으로 제조할 수 있으며, 새우류 유생에 대하여 경구 투여를 목적으로 한 경우, 스프레이 드라이 법 등에 의한 미립자 분말상으로 가공한 것이 바람직하다.

본 발명의 새우 흰 반점 바이러스에 대한 항체는 바이러스 단백질 중에서도 가장 병원력이 우세한 것으로 알려진 단백질의 DNA를 분리하여 재조합한 단백질을 사용함으로써 저렴한 가격으로 대량 생산이 가능하다. 또한 난황항체는 새우 흰 반점 바이러스에 대하여 특이적인 방제효과를 가지고, 식용으로 사용하는 난을 이용한 것이므로 무해할 뿐만 아니라 난에 포함된 풍부한 천연 단백질로 우수한 영양가를 갖는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 새우 흰 반점 바이러스 항원 제조

(1) 새우 흰 반점 바이러스 DNA 분리

폐사한 새우 조직을 PBS에 넣어 잘게 분쇄한 후, 1,500 rpm에서 5분간 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 침전물을 2.5 mL 용해완충액에 혼합하고, SDS(20 %) 0.2 ml와 프로테나제(proteinase) K1 mL를 첨가한 다음 1 ml의 NaCl을 넣고 완전히 혼합하였다. 혼합액에 99.9 %의 EtOH 10 ml을 첨가하여 DNA를 회수하고, 현탁완충액(genomic DNA extraction kit, BIO101) 920 ㎕를 넣어 현탁하였다. 현탁액에 RNase MIX 25 ㎕, 세포용혈완충액 50 ㎕, 프로테나제 혼합액 12 ㎕ 를 첨가하여 충분히 혼합하였다. 혼합액을 56 ℃에서 2 시간 동안 배양한 후, 솔트아웃 믹스(saltout mixture) 250 ㎕, EtOH을 순차적으로 혼합한 다음 건조시켰다. 상기 건조물을 10 mM Tris (pH 8.0)로 녹여내어 DNA를 회수하였다.

(2) VP24, VP26, VP28 유전자의 PCR

바이러스의 타입 확인과 바이러스 유전자를 세포에 형질감염시킨 후 발현을 확인하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다.

RT-PCR에 사용할 프라이머는 대상 유전자의 염기서열로부터 DNA 올리고머를 사용하였다. mRNA를 추출한 다음 올리고-dT와 역전사 효소(Moloney Murine leukemia virus)를 사용하여 cDNA를 합성하였고, 다시 cDNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.0% 아가로즈젤상에서 확이하였고, pGEM T 이지 벡터에 클로닝한 다음 그 염기서열을 확인하였다.

서열번호 1은 새우 흰 반점 바이러스의 Vp24의 염기서열이고, 서열번호 2는 Vp26의 염기서열이고, 서열번호 3은 Vp28의 염기서열로, 알려진 염기서열과 동일하였다.

(3) VP24, VP26, VP28 단백질 유전자의 서브클로닝

유전자 은행에서는 세계 각지에서 분리된 새우 흰 반점 바이러스의 모든 유전자를 클로닝하였다. 이에 유전자 은행으로부터 제공받은 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 새우 흰 반점 바이러스의 VP24, VP26, VP28 유전자들을 세균용 발현벡터인 pET-28b(+)에 서브클로닝하고, 이를 BL21에 형질전환시켰다.

(4) VP24, VP26, VP28 단백질의 대량 생산

형질전환체를 대량 배양한 다음 원심분리하여 새우 흰 반점 바이러스 단백질, VP24, VP26, VP28 항원을 수득하였다.

LB (Luria-Bertani) 배지에 도말한 형질전환체를 37 ℃에서 6∼12 시간 배양한 후, 카나마이신이 첨가된 액체 배지 5 L로 옮겨 90 rpm로 6 시간 동안 진탕 배양하였다. 상기 배양액에 1 M IPTG를 2 ml 첨가하여 같은 조건으로 2 시간 동안 배양한 후, 원심분리(4,000 rpm, 15분, 4℃)하여 침전물을 얻고, 이를 세포 용해 완충액(lysis buffer; 20 mM Tris-HCl, pH 7.4)으로 용해하였다. 이를 3,000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 침전된 대장균 균체는 제거하고, 단백질이 존재하는 상층액만 취해 다시 초원심분리(13,500 rpm, 4℃, 30분) 하였다. 상기에서 획득한 침전물의 순도를 높이기 위해 세척 완충액로 같은 조건의 초원심분리 과정을 3회 반복하여 VP24, VP26, VP28 단백질이 함유된 최종 산물을 수득하였다.

(5) 복합 단백질 항원의 준비

재조합 단백질 VP24, VP26 및 VP28를 동량의 비율로 혼합하여 복합 단백질 백신용 항원을 준비하였다.

실시예 2: 새우 흰 반점 바이러스 난황 항체 제조

산란이 시작된 21 주령 산란계(Hy-Line Brown)의 다리 근육에 실시예 1에서 제조한 새우 흰 반점 바이러스 복합 단백질 항원체와 프레운드(Freund's, Sigma chemical Co.)를 동량으로 혼합하여 유화한 조성물을 0.3 mL(단백질양: 100 ㎍/마리)씩 1차 접종하였다. 그 후 충분한 항체가 형성될 때까지 2 주 간격으로 6 주간 총 3 회의 부스터 주입(Booster injection)을 실시하였다.

계란의 난황으로 이행된 새우 흰 반점 바이러스 항체의 역가 추이를 측정하고, 항체 역가가 높은 단계의 면역란을 수거하고, 할란하였다. 할란된 난황액을 균질화시키고, 63 ℃에서 30 분 동안 살균한 후, 분사건조하여 새우 흰 반점 바이러스에 대한 난황 항체 분말을 제조하였다.

실시예 3: 난황에서 항체 분리

상기 실시예 2에서 채취한 난황액을 필터로 여과한 후, 난황액 5 mL에 증류수 5 mL를 혼합하고, 0.15 %의 람다 카라기난 20 mL을 혼합하여 상온에서 30 분 동안 방치하였다. 상기 혼합액을 3,000 ×g, 15 분, 20 ℃의 조건으로 원심분리하여 상등액만 취하였다. 상기 상등액에 19 %의 황산나트륨을 첨가하여 완전히 녹인 후 상온에서 40 분간 방치하고, 10,000 ×g에서 15 분 동안 원심분리하여 얻어진 침전물을 인산완충액으로 녹여 정제된 면역항체 (IgY)를 수득하였다.

실시예 4: 새우 흰 반점 바이러스 항체 역가 측정

상기 실시예 3에서 수득한 면역항체의 새우 흰 반점 바이러스에 대한 항원반응 정도를 확인하기 위하여 ELISA으로 항체 역가를 측정하였다.

재조합 단백질 VP24, VP26 및 VP28을 0.5 ㎍/mL로 희석하여 96 웰 플레이트에 코팅하였다. 전체 항체를 100 ㎍/mL의 농도로 먼저 희석한 후 계속해서 2 배 희석하여 각 웰에 넣어 반응시켰다. 항 닭 염소(Goat anti-chicken) IgY-AP 컨쥬게이트로 발색시켜 종말점을 결정한 후 항체 1 ㎎당 역가를 표시하였다. 실험결과 상기 실시예 3에서 제조된 난황액의 항체역가는 각각의 단백질에서 모두 약 20,480 정도로 나타났다.

실시예 5: 방제용 조성물 제조 및 방제효과

새우 흰 반점 바이러스 면역 난황 항체의 방제 효과를 확인하였다.

새우 유생을 500 마리씩 4군으로 나누어 시험군 1은 새우 양식 장에서 일반적으로 투여되는 배합 사료를 처리하여 대조군으로 하였다. 시험군 2, 3, 4는 시험군 1과 동일한 일반 배합 사료에 난황 항체를 각각 0.5 %, 1.0 %, 2.0 %의 비율로 첨가한 다음, 사료 비율과 동량의 물을 섞어 잘 반죽한 후 동결건조법으로 다시 분말화하여 실험군으로 사용하였다.

새우 흰 반점 바이러스 감염을 위해, -80 ℃로 동결 보관하고 있던 흰 반점 바이러스에 감염되어 폐사한 새우 3 g을 멸균하여 생식 완충 용액 30 ㎖ 중에서 균질화한 후, 원심분리 (12,000×g, 30분)하여 얻은 상층액을 0.45 ㎛의 밀리포어 필터로 여과하였다.

여과액을 각각의 시험군 수조에 10 ㎖씩 투여하여 바이러스 감염을 실시하였다. 15 일간 각 군의 폐사 개체수를 조사하여 새우 유생의 생존율을 측정하였다.

대조구 및 실험군의 새우 유생의 생존율은 표 1과 같이 나타났다.

구분	대조구	실험군
구분	시험군 1	시험군 2	시험군 3	시험군 4
난황항체 함유율 (%)	0	0.5	1.0	2.0
새우 생존율 (%)	0	56	72	88

난황항체를 처리하지 않은 대조구는 0 %의 생존율을 나타낸 것에 비하여 실험군은 난황항체의 투여 농도에 따라 증가된 생존율을 나타내었다. 난황항체가 포함된 비교구의 생존율은 통계적으로 유의한 차이 (P＜0.01)가 인정되어 실험결과의신뢰성을 뒷받침하였다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 새우 흰 반점 바이러스에 대한 난황항체는 새우류에 적용하였을 때 우수한 방제효과를 나타낸다. 또한 난황항체는 독성 및 식품으로 사용하는 난으로부터 제조된 것이므로, 새우 체내 잔류성 및 독성이 없는 안전한 시료이다.

Claims

새우 흰 반점 바이러스 또는 상기 바이러스의 단백질을 동물에 주입하여 면역시킨 다음 상기 동물에서 배출되어지는 난.
제 1 항에 있어서, 상기 동물은 조류인 난.
제 1항에 있어서, 상기 흰 반점 바이러스는 불활성화 또는 약독화된 바이러스인 난.
제 1 항에 있어서, 상기 흰 반점 바이러스 단백질은 VP24, VP26, 및 VP28로 이루어진 군에서 1 종 이상 선택되는 난.
제 1항 내지 4항중 어느 한항에 따른 난으로부터 분리되어진 새우 흰 반점 바이러스에 대한 항체.
제 1항 내지 제 4항중 어느 한항에 따른 난을 포함하는 새우 흰 반점 바이러스 방제용 조성물.
제 5항의 새우 흰 반점 바이러스 항체를 포함하는 새우 흰 반점 바이러스 방제용 조성물.