KR20030070704A - 에드워드시엘라 타르다에 대한 난황항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 에드워드시엘라 타르다에 대한 난황항체에 관한 것이다. 보다 상세하게는 에드워드시엘라 타르다에 대한 항원을 동물에 주입하여 면역시킨 다음 상기 동물에서 배출되어지는 난, 상기 난으로부터 분리된 난황항체 및 상기 난황항체를 포함하는 에드워드시엘라 타르다 감염 방제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 난황 항체는 에드워드시엘라 타르다에 의한 감염을 억제하여 에드워드병에 대한 예방제로서 사용가능하다.

Description

에드워드시엘라 타르다에 대한 난황항체{ANTI-Edwardsiella tarda IGY}

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 에드워드시엘라 타르다에 대한 난황항체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 양식 뱀장어의 세균성 질병의 원인균인 에드워드시엘라 타르다를 동물에 면역시키고, 상기 동물의 난으로부터 제조한 난황항체에 관한 것이다.

[종래기술]

이태리에서 처음 시작된 뱀장어 양식은 1877년 일본을 필두로 최근에는 대만 및 아열대 지역에서 집약양식이 행해지고 있다. 우리 나라에서는 1960년 이후 정부의 뱀장어 양식 진흥책으로 인하여 활성화되어있다.

뱀장어는 세계적으로 널리 분포하며 종류는 16종(種) 3아종(亞種)으로, 총 19종이 알려져 있으며, 국내에서는 뱀장어(Anguilla japonica)와 무태장어(Anguilla marmorata)의 2종이 있으나 양식 대상 종은 뱀장어 1종이다.

뱀장어 양식은 지수식(하천수, 저수지물, 지하수)과 순환여과식(지하수, 용천수, 온천수)으로 나뉘고, 수질은 중성으로 pH 6.5∼8.5 사이가 적당하며, 또한 기후가 온화하고 남향으로 바람이 심하게 일지 않는 곳이 좋다. 현재 국내에서는경남(김해, 녹산, 하동), 전남(광양, 섬진강하구의 강진, 장흥, 해남), 충남(강경), 전북(고창, 김제), 경기(강화, 김포) 등지에서 뱀장어 양식이 행해지고 있다.

뱀장어 양식 장에서 발병하는 감염증은 크게 세균성 질병과 기생충성 질병으로 나눌 수 있다. 기생충성 질병에는 아가미 흡충증, 피부 흡충증, 닻벌레증, 트리코디나증, 백점충증, 폴리스트라포라증 등이 있으며, 세균성 질병은 지느러미 묽은 병, 에드워드병, 지느러미·아가미 부식병, 적점병, 점액세균성 아가미병 등이 보고되었다.

그람음성 단간균인 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda)의 감염에 의해 5∼9월에 발생하는 에드워드 병은 항문이 붉어지는 것이 가장 현저한 특징으로, 특히 실뱀장어에 발병하기 쉬우며 일단 발생하면 전파도 빠르기 때문에 조기발견 및 조기치료를 필요로 하는 세균성 질병이다. 에드워드 병은 실뱀장어에 실지렁이로 먹이부침을 할 때 실지렁이를 투여하기 시작한 지 6∼7일경에는 거의 발생하며, 양성 중에도 빈발하였지만 배합사료가 개발되고 나서는 감소되는 경향이었으나 뱀장어의 사육방식이 비닐하우스 가온 양식으로 바뀌고 나서는 점차 빈발하는 경향이다. 에드워드병은 5∼9월에 발생하지만 주 발생시기는 여름철 고수온기이다.

에드워드 병은 기적병과 비슷함으로 진단에는 세심한 관찰이 필요하다. 육안으로 보아 가장 현저한 특징은 항문과 뒷지느러미의 발적이다. 체표도 간장 부근까지 심한 발적을 일으키고 있으며 때로 복강에 도달할 정도로 구멍이 나 있는 경우도 있으며, 항문도 돌출 확장되어 있는 경우가 대부분이다. 뒷지느러미 이외의 지느러미에도 심한 발적과 출혈반점이 나타난다. 실뱀장어가 이 병에 감염되면 수면 부근을 힘없이 헤엄치게 되는데 이것을 살펴보면 체색이 퇴색되어 있는 것을 알 수 있다. 실뱀장어인 경우 전파는 매우 빠르기 때문에 발견되는 즉시 처치하여야만 한다.

이러한 에드워드 병에 대한 방제 대책으로서, 발병하기 쉬운 고수온기에는 푸란제를 경구투여 하거나 과식을 금하는 방법이 있다. 실뱀장어인 경우 실지렁이가 감염원이기 때문에 실지렁이를 깨끗이 씻은 다음 푸란제로 약욕시킨 다음 투여하며, 실지렁이를 급여 할 기간의 수온은 25 ℃를 넘지 않게 유지하고 먹이 부침이 완료되면 가능한 빨리 배합사료로 전환하여 에드워드병에 대한 감염을 예방할 수 있다. 하지만, 최근 항생제의 과다사용으로 내성균의 출현이 심한 상황이므로 약제를 투약하는 것이 지양되고 있는 실정이다.

한편, 뱀장어를 비롯한 양식 어류에 대한 감염증의 방제 대책으로서, 종래의 능동 면역에 대신하여 수동 면역이 주목받고 있다. 수동 면역이란, 병원체에 대한 항체를 어류가 아닌 조류와 같은 가축에게 투여하여 생성된 항체를 뱀장어 에드워드 감염증의 방제에 이용하는 것을 말한다. 산란계의 난황 항체를 이용한 수동 면역의 공지 예로서는, 스토렙토코카스 뮤탄스 세균이 이에 부착 감염되어 일어나는 충치의 예방(J. Dent, Res., 70,162-166,1991년), 로타바이러스가 장관 표피 세포에 부착하여 감염된 로타바이러스성 설사증의 예방 (Microbiol. Immunol., 34, 617-629,1990년) 등이 보고되어 있다.

양식 분야에 있어서 수동 면역의 공지 예로서는 부리유결절증의 예방, 광어치어의 장관 백탁증의 예방 등, 어류의 감염증에 대한 항체를 이용한 수동 면역의 유효성에 관하여 보고되어 있다(일본 특개평 1-168246).

따라서, 본 발명은 에드워드시엘라 타르다 항체를 이용한 에드워드병 방제방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 에드워드시엘라 타르다 항원에 대한 항체를 포함하는 난을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 에드워드시엘라 타르다에 대한 난황항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 항 에드워드시엘라 타르다 난 또는 난황항체를 포함하는 감염 방제용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 에드워드시엘라 타르다 항원을을 동물에 주입하여 면역시킨 다음 상기 동물에서 배출되어지는 난을 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 난으로부터 분리되어진 에드워드시엘라 타르다 항체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 난을 포함하는 에드워드시엘라 타르다 감염 방제용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 에드워드시엘라 타르다 항체를 포함하는 에드워드시엘라 타르다 감염 방제용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 에드워드시엘라 타르다에 대한 항체를 제조하였으며, 이를 이용하여 에드워드병에 대한 방제용 조성물을 개발하였다.

본 발명의 항체는 에드워드시엘라 타르다에 대하여 특이적인 결합 활성을 갖는 것이다.

본 발명의 항체는 에드워드시엘라 타르다에 대한 항원을 동물에 주입하여 면역시킨 다음 상기 동물에서 배출되어지는 난으로부터 제조된다. 상기 동물은 조류가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 닭, 오리, 칠면조 등이다. 동물에서 항원을 주입하고, 면역시켜 항체를 포함하는 난을 제조하는 방법은 기술분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에겐 용이하게 실시할 수 있는 것이다.

상기 에드워드시엘라 타르다에 대한 항원은 파쇄된 에드워드시엘라 타르다 균체, 에드워드시엘라 타르다 불활성화 균체, 에드워드시엘라 타르다 약독화 균체 또는 에드워드시엘라 타르다 단백질을 사용할 수 있다. 상기 에드워드시엘라 타르다 단백질은 에드워드시엘라 타르다 단백질 중에서도 가장 병원력이 우세한 것으로 알려진 단백질의 DNA를 분리하여 재조합한 단백질을 사용함으로써 저렴한 가격으로 대량 생산이 가능하다.

에드워드시엘라 타르다 항원은 동물에 근육 주사, 피하 주사, 정맥 주사, 복강 내 주사 또는 경구 투여 등의 방법으로 주입할 수 있으며, 바람직한 방법은 근육주사이다. 항원의 주입량은 항원의 단백질 양으로 환산하였을 때 10 ㎍ 내지 1㎎이 사용가능하나, 동물의 상태나 조건에 의해 달리 적용하는 것이 바람직하다. 또한 항원의 투여는 계란의 난황 중에 나타나는 특이적 항체(대응 항원에 대하여 특이적 결합 활성을 갖는 항체) 양의 추이를 효소 면역 측정법 등의 방법으로 조사하여 항체양이 최대치로 될 때까지 반복하여 실시한다.

본 발명의 항체는 상기의 면역화된 난으로부터 통상의 항체 분리방법으로 분리되어질 수 있다. 또한 상기 난을 분말, 건조하여 항체로 사용할 수 있으며, 전란 분말, 난황 분말, 또는 노른자위의 수용성 단백질화 분말을 더욱 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 상기의 난 또는 난황항체를 포함하는 에드워드시엘라 타르다 감염 방제용 조성물을 제공한다. 상기 방제용 조성물은 뱀장어 사료나 양식장 물에 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 에드워드시엘라 타르다 감염 방제용 조성물은 에드워드시엘라 타르다에 대한 특이적 항체를 포함하여, 면역계의 난으로부터 얻어지는 전난 분말, 난황분말, 노른자위 수용성 단백질 분말, 계란 항체 순품 분말 등을 더욱 포함할 수 있다. 방제용 조성물내의 난 또는 난황항체의 혼합량은 통상의 함량으로 0.01 중량% 내지 10 중량%가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.1 중량% 내지 1 중량%이나 이에 한정되지 않으며, 난황항체의 역가에 맞게 조절하는 것이 바람직하다.

또한 방제용 조성물은 분말상, 과립상, 펠렛상 등 통상의 제형으로 제조할 수 있으며, 경구 투여를 목적으로 한 경우, 스프레이 드라이 법 등에 의한 미립자 분말상으로 가공한 것이 바람직하다.

본 발명의 에드워드시엘라 타르다 난황항체는 에드워드시엘라 타르다에 대하여 특이적인 방제효과를 가지고, 식용으로 사용하는 난을 이용한 것이므로 무해할 뿐만 아니라 난에 포함된 풍부한 천연 단백질로 우수한 영양가를 갖는다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 에드워드시엘라 타르다 항원 준비

에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda,ATCC23656)를 SS 한천배지에서 35 ℃로 24시간 배양하여 수집하였다. 균체를 3,000 ×g에서 20 분간 원심분리하여 균체만 회수하였고, 이를 인산완충식염수에 현탁하였다. 현탁 균체를 초음파로 파쇄하고, 10,000 ×g에서 15분 동안 원심분리한 후, 파쇄되지 않은 균체는 제거하여 상청액만 취한 다음 다시 100,000 ×g으로 30분 동안 초원심분리하였다. 침전된 파쇄균체를 인산완충식염수에 현탁하여 이를 항원으로 이용하였다.

실시예 2: 난황 항체 제조

항체 생산을 위한 산란계(Hy-Line Brown)는 산란이 시작된 21 주령을 사용하고, 실시예 1에서 준비한 항원을 프레운드 완전 보조체(Freund's complete adjuvant, Sigma chemical Co.)와 동량으로 혼합하여 유화한 조성물을 0.3 mL(단백질양: 100 ㎍/마리)씩 다리 근육에 1 차 접종하였다.

그 후 충분한 항체역가가 형성될 때까지 2 주 간격으로 6 주간 총 3 회 접종하였다. 난을 수집하여 난황내의 에드워드시엘라 타르다 항체가를 측정하였으며, 높은 역가를 가지는 단계의 면역란을 수거하여 할란하였다. 할란한 전란을 균질화하였고, 63 ℃에서 30 분 동안 살균한 후, 스프레이 건조하여 에드워드시엘라 타르다 항체 분말을 수득하였다.

실시예 3: 에드워드시엘라 타르다에 대한 항체제조

실시예 2의 면역란에서 난황액을 수거하여 균질화한 다음 필터로 여과하였다. 이후 여과액 5 mL에 동량의 증류수 5 mL를 혼합하고, 0.15 %의 람다 카라기난 20 mL을 혼합하여 상온에서 30분 동안 방치하였다. 상기 혼합액을 3,000 ×g, 15 분, 20 ℃의 조건으로 원심분리하여 상청액만 취하고, 19 %의 황산나트륨을 첨가하여 완전히 녹인 후 상온에서 40 분간 방치하여 원심분리하였다(10,000 ×g, 15분). 침전물을 인산완충용액으로 녹여 정제된 난황항체(IgY)를 수득하였다.

실시예 4: 항-에드워드시엘라 타르다 난황항체의 역가 측정

실시예 3의 난황항체를 에드워드시엘라 타르다에 반응시켜 항원-항체 반응 역가를 측정하였다.

에드워드시엘라 타르다로부터 분리한 단백질을 0.5 ㎍/mL로 희석하여 96 웰 플레이트(well plate)에 코팅하고, 난황항체를 100 ㎍/mL의 농도로 먼저 희석한 후 계속해서 2 배 희석(two-fold dilution)하여 각 웰에 넣었다. 항 닭-염소(Goat anti-chicken) IgY-AP 컨쥬게이트로 발색하여 종말점 (end point)을 결정한 후 항체 1 ㎎당 역가로 표시하였다. 실험결과 난황항체의 역가는 20,480 정도로 나타났다.

실시예 5: 에드워드시엘라 타르다 난황 항체를 포함하는 조성물을 이용한 에드워드병 방제효과 확인

에드워드시엘라 타르다 난황항체에 의한 에드워드병 방제효과를 확인하였다.

양식 뱀장어를 500 마리씩 4군으로 나누어 시험군 1은 뱀장어 양식 장에서 일반적으로 투여되는 배합 사료를 처리하여 대조군으로 하였다. 시험군 2, 3, 4는 시험군 1과 동일한 일반 배합 사료에 난황 항체를 각각 0.5%, 1.0%, 2.0%의 비율로 첨가한 다음, 사료 비율과 동량의 물을 섞어 잘 반죽한 후 동결건조법으로 다시 분말화하여 실험군으로 사용하였다.

에드워드시엘라 타르다를 10⁵∼10⁶cells/ml 농도로 희석한 후, 각각의 시험군 1 내지 4의 수조에 10 ㎖씩 투여하였다. 그 후, 30 일간 각 군의 폐사 미수를 조사하여 뱀장어의 생존율을 구하였으며, 하기 표 1로 나타내었다.

구 분	난황 항체 함유율 (%)	뱀장어 생존율 (%)
대조군	시험군 1	0	0
실험군	시험군 2	0.5	68
	시험군 3	1.0	85
	시험군 4	2.0	94

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 대조군의 생존율은 0 %로 나타났으나, 에드워드시엘라 타르다 난황항체를 투여한 시험군 2 내지 4는 각각 68 %, 85 %, 94 %의 생존율을 나타내었다. 시험군 2 내지 4의 생존율은 통계적으로 유의한 차이(P＜0.01)가 인정된다. 이는 에드워드시엘라 타르다 난황항체가 에드워드병을 방제할 수 있음을 의미하는 것이다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 에드워드시엘라 타르다에 대한 난황항체는 뱀장어에 적용하였을 때 우수한 방제효과를 나타낸다. 또한 난황항체는 독성 및 식품으로 사용하는 난으로부터 제조된 것이므로, 뱀장어 체내 잔류성 및 독성이 없는 안전한 시료이다.

Claims (6)

1. 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 항원을 동물에 주입하여 면역시킨 다음 상기 동물에서 배출되어지는 난.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 동물은 조류인 난.
3. 제 1항에 있어서, 상기 항원은 파쇄된 에드워드시엘라 타르다 균체, 에드워드시엘라 타르다 불활성화 균체, 에드워드시엘라 타르다 약독화 균체 및 에드워드시엘라 타르다 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 난.
4. 제 1항 내지 3항중 어느 한항에 따른 난으로부터 분리되어진 에드워드시엘라 타르다에 대한 항체.
5. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한항에 따른 난을 포함하는 에드워드시엘라 타르다 감염 방제용 조성물.
6. 제 4항의 에드워드시엘라 타르다에 대한 항체를 포함하는 에드워드시엘라 타르다 감염 방제용 조성물.