KR100673566B1

KR100673566B1 - 인터페론-감마의 면역작용 증강제인 한국산 겨우살이 렉틴및 상기 면역작용 증강제와 인터페론-감마를 유효성분으로하는 면역증강 조성물

Info

Publication number: KR100673566B1
Application number: KR1020050078661A
Authority: KR
Inventors: 허억; 전명하
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2005-08-26
Filing date: 2005-08-26
Publication date: 2007-01-24
Also published as: KR20050104311A

Abstract

본 발명은 인터페론-감마의 면역작용 증강제 및 상기 면역작용 증강제와 인터페론-감마를 유효성분으로 하는 면역증강 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 한국산 겨우살이에서 유래한 렉틴의 일종인 한국산 겨우살이 렉틴이 인터페론-감마의 면역활성 효과를 상승시키는 점을 이용한 한국산 겨우살이 렉틴 및 인터페론-감마를 함유하는 면역 증강제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르는 한국산 겨우살이 렉틴은 부작용이 없으며, 바이러스, 세균 및 진균 감염치료 등에 사용되는 인터페론-감마 제제의 유효증강제로 사용되어, 인터페론-감마를 단독으로 투여했을 때의 1/100 농도로도 인터페론-감마 단독투여보다 더 높은 면역상승효능을 보여주므로, 높은 농도로 장기 투여할 때 많은 부작용이 따르는 인터페론-감마와 함께 혼합 투여하면 소량의 인터페론-감마를 투여해도 면역 활성이 효과적으로 상승되고, 다량의 인터페론-감마투여에 의한 각종 부작용을 완화하는 탁월한 효과가 있다. 인터페론-감마에 대한 이러한 한국산 겨우살이 렉틴의 효능이 인터페론-감마의 비루스, 세균 및 진균 등의 감염 치료효과를 개선해줌과 동시에 다량의 인터페론-감마 투여로 인한 각종 부작용과 의료 부담을 크게 덜어줄 수 있다.

한국산 겨우살이 유래의 렉틴, 한국산 겨우살이 렉틴, 면역활성 상승증강제, 인터페론-감마, 인터페론-감마 유효 증강 보조제

Description

인터페론-감마의 면역작용 증강제인 한국산 겨우살이 렉틴 및 상기 면역작용 증강제와 인터페론-감마를 유효성분으로 하는 면역증강 조성물 {Korean mistletoe lectin enhancing the immune action of interferon-gamma, and immune-enhancing composition comprising interferon-gamma and the lectin}

도 1은 본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴이 대식세포로부터 종양괴사인자-알파 (TNF-α)의 유전자 mRNA 유도에 미치는 농도 의존성 (A 및 B) 및 시간 의존성(C 및 D) 효과를 나타낸 것이다.

A 및 C: 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)의 결과;

B 및 D: 상기 데이타의 광 농도 측정 분석 결과

도 2는 대식세포로부터 종양괴사인자-알파의 유전자 mRNA 유도에 미치는 인터페론-감마의 농도 의존성(A 및 B) 및 시간 의존성(C 및 D) 효과를 나타낸 것이다.

A 및 C: 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)의 결과;

B 및 D: 상기 데이타의 광 농도 측정 분석 결과

도 3은 본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴이 대식세포로부터 종양괴사인자-알 파의 생산 및 분비 유도에 미치는 농도 의존성(A 및 B) 및 시간 의존성(C 및 D) 효과를 나타낸 것이다.

A 및 C: 면역 블럿팅의 결과;

B 및 D: 상기 데이타의 광 농도 측정 분석 결과

도 4는 대식세포로부터 종양괴사인자-알파의 생산 및 분비 유도에 미치는 인터페론-감마의 농도 의존성 (A 및 B) 및 시간 의존성(C 및 D) 효과를 나타낸 것이다.

A 및 C: 면역 블럿팅의 결과;

B 및 D: 상기 데이타의 광 농도 측정 분석 결과

도 5는 본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴이 인터페론-감마에 의한 대식세포로부터 종양괴사인자-알파의 유전자 mRNA 유도에 미치는 면역 증강 효과를 나타낸 것이다.

A : 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)의 결과;

B : 상기 데이타의 광 농도 측정 분석 결과

도 6은 본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴이 인터페론-감마에 의한 대식세포로부터 종양괴사인자-알파의 생산 및 분비 유도에 미치는 면역 증강 효과를 나타낸 것이다.

A : 면역 블럿팅의 결과;

B : 상기 데이타의 광 농도 측정 분석 결과

도 7은 본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴이 실험동물의 비장세포에 미치는 독성을 생존율 그래프로 나타낸 것이다.

도 8은 본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴이 실험동물의 간 조직에 미치는 독성을 그래프로 나타낸 것이다.

도 9는 본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴이 실험동물의 신장 조직에 미치는 독성을 그래프로 나타낸 것이다.

도 10은 본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴이 미성숙 실험동물에 미치는 영향을 체중 변화로 나타낸 것이다.

도 11은 본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴이 성숙 실험동물에 미치는 영향을 체중 변화로 나타낸 것이다.

본 발명은 인터페론-감마의 면역작용 증강제 및 상기 면역작용 증강제와 인터페론-감마를 유효성분으로 하는 면역증강 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 한국산 겨우살이에서 유래한 렉틴(Korean mistletoe lectin; 이하 "KML"라고 약칭함)이 인터페론-감마의 면역활성 효과를 상승시키는 점을 이용한 한국산 겨우살이 렉틴 및 인터페론-감마를 함유하는 면역 증강제용 조성물에 관한 것이다.

인터페론-감마 (interferon-γ)는 면역조절물질인 사이토카인 (cytokines)의 한 종류로서, 임상적으로 림프구들과 기타 면역세포들의 활성을 강화하거나 (Wu L. et al., Science, 309(5735): 774 ~ 7, 2000년 7월 29일), B형 및 C형 만성 간염 등의 급성 염증을 억제하거나, 다발성 골수종 등을 포함한 각종 암 및 박테리아나 진균성 질환을 치료하는 데 널리 이용되고 있다. 그러나 아직 인터페론-감마의 치료 효과는 별로 높지 않는 것으로 보고되어 있다. 예를 들어, C형 만성 간염에 있어서는 치료 효율이 29% 그리고 다발성 골수종에 있어서는 그 효율이 약 20% 에 지나지 않는다고 알려졌다 (일본의약정보센터편, 2003년판 일본의약품집, 야쿠교지호사 2002년).

특히 인터페론-감마는 약효를 나타내는 반감기 (half life)가 짧기 때문에 고용량으로 자주 그리고 오랜 기간 동안 경구 투여하거나 혈관 주사를 해야 하기 때문에 열, 설사, 혼수상태 등의 수많은 부작용을 초래한다. 이러한 인터페론-감마의 문제점을 감안하여 상기 부작용을 완화하여 인터페론의 치료 효과를 증진시키는 증강제에 대한 연구가 많이 수행되고 있긴 하지만 아직까지 별다른 성과를 거두지 못하고 개발 단계에 있는 실정이다.

면역 증강제는 그 개념이 로만 (Roman)에 의해 처음 제시된 바 있고 (Roman G., Bull. Soc. Centr. Med. Vet., 101, 277, 1925년), 항원에 대한 세포성 및 체액성 면역능을 상승시킬 수 있는 모든 물질을 일컫는다 (Rajesh K. Gupta et. al., Vaccine, 11: 293, 1993년). 이와 같이 항원에 대하여 생체 내에서 일어나는 여러 가지 면역 작용을 상승시키는 면역 증강제의 작용 기전으로는, 대표적으로 항원 제공 세포 (예로 대식세포 등)의 활성화와 림프구에 대한 특이적인 활성 효과 등을 들 수 있다 (Waksman B. H., Springer Semin, Immunopathol., 2: 5, 1979년; Bomford, R., Clin . Exp . Immunol ., 39: 435, 1980년).

한편, 렉틴은 혈구세포 및 림프구(lymphocyte), 섬유모세포(fibroblast), 정자(spermatozoid), 박테리아(bacteria), 진균(fungi) 등의 세포를 응집시키며, 탄수화물과 결합하는(divalent or polyvalent) 단백질 또는 당 단백질이다(Elgavish et al., 1997; Goldstein et al., 1980). 유럽산 겨우살이 렉틴의 분자학적 및 생화학적 특성이 잘 규명되어 있으며, 일부 물질은 임상에 응용되고 있는 실정이다(Franz H. 등, Biochem. J. 195:481-484, 1981년; Inbar J and, Chet I Critical reviews in Biotechnology 17:1-20, 1997년). 이러한 연구 분위기에 고조되어 1990년도 중반에 들어오면서 많은 연구진들에 의해 한국산 겨우살이에 대한 연구가 활성화되면서 한국산 겨우살이 렉틴(KML)의 생화학적 연구가 많이 이루어지고 있다(윤택준 등, Cancer Lett. 97(1):83-91, I995년 10월 20일; 윤택준과 허억 등, International Immunopharmacology, 1(5):881-889, 2001년). 한방에서는 겨우살이를 오래 전부터 고혈압을 비롯한 각종 질환에 한방 탕제로 널리 애용되어오고 있다. 한국산 겨우살이에서 추출한 렉틴(Korean mistletoe lectin)은 대식세포를 비롯한 다른 면역반응에도 관여하고 있는 것으로 보고되어 있으며, 면역증강 작용을 하고 있다(허억 등, 한국생약학회지, 34(3):210-217, 2003년 10월).

이에 본 발명자들은 인터페론-감마의 효능을 증진시키는 면역 증강제를 개발하기 위하여 노력을 계속한 결과, 면역 활성제인 인터페론-감마를 한국산 겨우살이에서 유래한 혈구응집물질 렉틴의 일종인 한국산 겨우살이 렉틴을 함께 사용하면 부작용이 없이 단독으로 사용할 때보다 낮은 인터페론-감마 농도, 즉 1/100의 농도에서도 인터페론-감마 면역 활성이 크게 상승되는 점을 확인하고, 한국산 겨우살이 렉틴의 유효 성분을 포함하는 면역 증강 보조제 및 이와 함께 인터페론-감마를 함유하는 면역 증강제용 조성물을 제공함으로써 본 발명을 성공적으로 완성하였다.

본 발명은 한국산 겨우살이 렉틴 (Korean mistletoe lectin, KML)과 인터페론-감마를 유효 성분으로 하는 면역 증강제 및 상기 면역 증강제를 이용한 항비루스, 항균제, 항진균제, 항염증제 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 한국산 겨우살이 렉틴의 유효 성분을 포함하는 면역 증강 보조제를 제공한다.

본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴은 한국산 겨우살이에서 유래한 렉틴인 혈구응집물질 한국산 겨우살이 렉틴 및/또는 면역 증강의 활성을 가지는 한국산 겨우살이 렉틴 유도체 등을 포함할 수 있다.

바람직하게, 본 발명은 한국산 겨우살이 렉틴을 유효 성분으로 함유하여 인터페론-감마의 면역 활성 효과를 증진시키는 면역 증강 보조제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 한국산 겨우살이 렉틴 및 면역 활성제로서 인터페론-감마를 유효 성분으로 함유하는 면역 증강제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용한 인터페론-감마는 천연 인터페론-감마, 유전자 재조합으로 생산된 인터페론-감마 및/또는 인터페론-감마의 면역 활성을 가지는 인터페론-감마 유도체 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 면역 증강제용 조성물을 항비루스, 항균, 항진균, 항염증제 등으로 사용하는 용도를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 한국산 겨우살이 렉틴 (Korean mistletoe lectin; KML)의 유효 성분을 포함하는 면역 활성제의 작용을 상승시키는 면역 증강 보조제를 제공한다.

본 발명에서 사용한 한국산 겨우살이 렉틴은 한국산 겨우살이에서 유래한 렉틴인 혈구응집물질 한국산 겨우살이 렉틴 및/또는 면역 증강의 활성을 가지는 한국산 겨우살이 렉틴 유도체 등을 포함한다.

바람직하게, 본 발명은 한국산 겨우살이에서 유래한 한국산 겨우살이 렉틴의 유효 성분을 포함하는 면역 증강 보조제를 제공한다.

또한, 본 발명은 한국산 겨우살이 렉틴의 유효 성분을 포함하는 면역 활성제의 면역 활성 효과를 증진시키는 인터페론-감마에 유효한 면역 증강 보조제를 제공한다.

본 발명에서 면역 활성제로 사용한 인터페론-감마는 천연 인터페론-감마, 유전자 재조합으로 생산된 인터페론-감마 및/또는 인터페론-감마의 활성을 가지는 인터페론-감마 유도체 등을 포함한다.

구체적으로, 본 발명에서는 한국산 겨우살이에서 유래한 렉틴의 일종인 한국산 겨우살이 렉틴이 인터페론-감마가 대식세포에 작용하여 면역 활성을 나타내는 과정에서 면역 증강 효과를 상승시키는 것을 확인하고 (도 1 ~ 도 6 참조), 상기 한국산 겨우살이 렉틴 및 이를 함유하는 면역 증강제용 조성물이 세포 독성, 간 독성 및 신장 독성 등을 나타내지 않을 뿐만 아니라 미성숙 및 성숙한 실험동물에서도 그 성장에 어떠한 저해 활성도 나타내지 않은 것을 검증하였다 (도 7 ~ 도 11 참조). 따라서, 본 발명의 면역 증강 보조제는 인체에 안전하고 부작용이 없으며 동시에 인터페론-감마의 면역 활성을 효과적으로 상승시키는 면역 증강제에 유효 성분으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 면역 증강 보조제 및 면역 활성제를 유효 성분으로 함유하고 이에 약학적으로 허용 가능한 담체, 안정제 및 완충제 등을 추가로 포함하는 면역 증강제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 면역 증강 보조제로는 한국산 겨우살이에서 유래한 렉틴인 한국산 겨우살이 렉틴 및/또는 면역 증강의 활성을 가지는 한국산 겨우살이 렉틴 유도체 등이 사용될 수 있고, 바람직하게는 한국산 겨우살이에서 유래한 혈구응집물질인 한국산 겨우살이 렉틴이 사용된다.

본 발명에서 상기 면역 활성제로는 인터페론-감마가 사용되고, 이 때 인터페론-감마는 천연 인터페론-감마, 유전자 재조합으로 생산된 인터페론-감마 및/또는 인터페론-감마의 활성을 가지는 인터페론-감마 유도체를 포함한다.

바람직하게, 본 발명은 상기 면역 증강제 및 면역 활성제가 한국산 겨우살이 렉틴 : 인터페론-감마를 10,000 : 1 내지 500,000 : 1의 무게 비율로 함유하는 면역 증강제용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 면역 증강제용 약학적 조성물을 항암제, 항종양제 및/또는 항염증제 등으로 사용하는 용도를 제공한다.

본 발명의 면역 증강제용 약학적 조성물은 경구 투여할 수 있는 정제, 캡슐제 또는 수액제 등의 제제로서 제공될 수 있다.

또한, 본 발명의 면역 증강제용 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있는 정맥 주사 또는 피하 주사용 액제 또는 현탁액 등의 제제로서 제공될 수 있다.

또한, 본 발명의 면역 증강제용 약학적 조성물은 비강내 투여할 수 있는 액체 액적 (droplet) 흡입용 스프레이 또는 흡입용 분말 형태 등의 제제로서 제공될 수 있다.

또한, 본 발명은 한국산 겨우살이 렉틴을 포함한 기타 면역 증강 보조제를 검색하는 방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 면역 증강 보조제와 함께 면역 활성제를 함유하는 면역 증강제를 검색하는 방법을 제공할 수 있다. 바람직하게는, 한국산 겨우살이 렉틴 또는 이와 유사한 물질 그리고 인터페론-감마 또는 이와 유사한 면역 활성 물질을 함유하는 면역 증강제를 검색하는 방법을 제공할 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 인터페론-감마가 대식세포에서 면역 활성 작용을 나타내는 데 있어서 한국산 겨우살이 렉틴이 면역 상승효과 (synergistic effect)가 있음을 보여주기 위하여, 다음과 같은 효능 검사들을 수행한다: (1) 일차면역 반응세포인 대식세포에서 한국산 겨우살이 렉틴과 인터페론-감마가 종양괴사인자-알파 (tumor necrosis factor-α, 이하 "TNF-α"라고 약칭함) 유전자의 발현에 미치는 효과; (2) 대식세포에서 한국산 겨우살이 렉틴과 인터페론-감마가 TNF-α 단백질의 생산 및 분비 유도에 미치는 효과; (3) 한국산 겨우살이 렉틴이 인터페론-감마에 의한 TNF-α 유전자의 발현 유도에 미치는 상승효과; (4) 한국산 겨우살이 렉틴이 인터페론-감마에 의한 TNF-α 단백질의 생산 및 분비 유도에 미치는 상승효과; (5) 한국산 겨우살이 렉틴의 세포 독성 유무 검사; (6) 한국산 겨우살이 렉틴이 독성에 민감한 장기인 간과 신장에 미치는 효과를 조사하는 조직 독성 검사; 및 (7) 한국산 겨우살이 렉틴이 미성숙 또는 성숙한 실험동물의 체중 증감 변화에 미치는 효과를 조사하는 안전성 검사.

본 발명의 면역 증강 보조제 및 면역 증강제용 조성물은 해당 용도에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 독립적으로 또는 약품 첨가제로 사용되거나, 사람에게 투여하기 적합한 기타 모든 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 면역 증강 보조제 및 면역 증강 조성물에 함유될 수 있는 담체로는 증량제, 고섬유 첨가제, 캡슐화제 및 지질 등이 포함될 수 있으며, 이러한 담체들의 예는 당업계에 충분히 공지되어 있다.

본 발명의 면역 증강 보조제 및 면역 증강제용 조성물은 질환의 진행 정도, 나이, 성별, 신체 상태, 투여 기간, 투여 방법, 환자의 체중, 식사, 배출 속도 등에 따라 용량을 달리하여 투여될 수 있다.

바람직하게는, 상기 면역 증강제용 조성물 중 한국산 겨우살이 렉틴은 체중 1 ㎏ 당 0.01 내지 1 ㎍ 범위로, 그리고 인터페론-감마는 체중 1 ㎏ 당 1 내지 500 IU 범위로 비경구 또는 경구 투여될 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 실시예에서는 주요 실험 시약인 한국산 겨우살이 렉틴 및 인터페론-감마 (미국, R & D 시스템사 제품)에 대해 세균의 내독소인 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide; 이하 "LPS"라고 약칭함)의 잔류량으로 오염 유무를 검사하였다. 그 결과, 리포폴리사카라이드의 잔류량은 17 엔도톡신 유닛 (endotoxin units; EU)/㎖ 인 것으로 조사되었다. 참고로 유럽 국가에 있어서 상기 실험 시약에 대한 LPS 잔류량의 기준 허용 범위는 350 EU/㎖ 이므로 (Scheer, Arzenimittelforschung, 43(7): 975 ~ 800, 1993년 7월), 본 발명에서 사용한 한국산 겨우살이 렉틴 및 인터페론-감마는 기준 허용 범위와 비교하여 내독소 LPS 잔류량이 잔유량 허용범위의 1/20 이하인 것으로 확인되었다.

본 발명의 실시예에서는 한국산 겨우살이 렉틴 및 인터페론-감마의 면역 활성 상승효과를 조사하기 위하여, 일차 면역반응 세포이면서 대표적인 항원 제공 세포인 대식세포를 사용하였고, 한국산 겨우살이 렉틴이 비장세포, 간, 신장 및 성장에 미치는 독성을 검사하기 위하여 실험동물인 Balb/c 마우스 (한국. 대전 화학연구소 제공)를 사용하였다.

실시예 1. 대식세포에서 종양괴사인자-알파의 유전자 발현에 미치는 한국산 겨우살이 렉틴 및 인터페론-감마의 효능 조사

본 발명은 한국산 겨우살이 렉틴 (KML) 및 인터페론-감마 (IFN-γ)가 면역계의 일차적인 면역반응에 주로 관여하는 대식세포의 활성화에 미치는 효과를 조사하기 위하여, 해당 지표가 되는 종양괴사인자-알파 (tumor necrosis factor-α; TNF-α)의 유전자 발현 유도능을 다음과 같이 (1) 한국산 겨우살이 렉틴 추출 (2) 마우스 복강으로부터 대식세포의 분리; (3) 대식세포 자극 및 전체 RNA 의 분리; 및 (4) 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 수행하여 측정하였다.

(1) 한국산 겨우살이 렉틴 추출

한국산 겨우살이로부터 렉틴의 추출은 기존의 방법(윤택준과 허억 외 7인, International Immunopharmacology 1: 881-889, 2001년) 을 이용해 수행하였으며 간단히 설명하면 다음과 같다. 본 실험에서 사용된 겨우살이는 강원도 원주 치악산 일대에서 참나무에 자생하는 것으로써 11~12 월 사이에 채취했다. 실험에 이용된 겨우살이는 1~2 년생으로 증류수에 2-3회 세척 후, 응달에서 건조하고 진공 포장하여 물질 추출 시까지 -70 ℃에서 보관하였다. 초저온냉장고(-70 ℃)에 보관하고 있는 시료를 잘게 세절한 후 10 배 부피의 PBS를 첨가하여 cold room에 3시간 배양했다. 배양한 후 cold room에서 2 분 동안 2 회씩 믹서기(솔잎8282A, 대구)로 분쇄한 후 cold room에서 4 시간 Dispenser(교반기, 제일과학, 서울)를 사용해 저속으로(40 V) 교반하였다. 그 후 30 분 간 원심분리(20,000 g, Rotor A6.14, Kontron, Italy)한 후, 얻은 상등액을 공극크기(pore size)를 달리하는 여과막(60 ~ 0.45 ㎛; Millipore, Bedford, MA 01730, USA)을 통과한 후 여과한 상등액을 70 %의 황산암모늄에 가하여 cold room에서 4 시간정도 저속으로 교반배양하였다. 교반배양 후 30 분간 원심분리(4 ℃, 20,000 g, Rotor A6.14, Kontron, Italy)한 후 얻은 침전물에 PBS(4 ℃)를 첨가하여 투석여과막(MWCO 3,500; Spectra/Por-CE, Rancho Dominguez, CA, USA)에 주입한 후 PBS로 cold room(4 ℃)에서 6 시간씩 교환하면서 4 회 투석하여 황산암모늄을 제거시켰다. 투석한 용액을 원심분리(10,000 g, 30 분, 4 ℃)한 후 상층액을 0.45 ㎛로 여과한 후 0.2 N HCl로 가수분해된 세파로즈 4B(Sepharose-4B, Bio-Rad, USA) 칼럼에 적용시켜 1.5 시간 고정시켰다. 고정 후 cold-PBS로 세척하고 0.1 M 락토즈 용액으로 용출시켜 280 nm UV 분광계로 흡광도 를 측정하였다. 피크가 높은 분획을 회수하여, 락토즈(lactose)를 제거하기 위해 투석여과막(Spectra/Por-CE, MWCO 3,500)에 주입한 후 PBS로 cold room(4 ℃)에서 6 시간씩 교환하면서 4 회 투석하였다. 투석한 후, 원심분리(10,000 g, 30 분, 4 ℃)하여 상층액을 동결 건조한 분말을 한국산 겨우살이 렉틴(Korean mistletoe lectin, 이하 KML"이라 약칭함)이라 칭하였으며, 이를 다음 실험 때까지 -20 ℃에 보관하였다.

(2) 마우스 복강으로부터 대식세포의 분리

대식세포 (macrophage)를 추출하기 위하여, 사육된 실험동물로 6~10 주령의 Balb/c 마우스를 사용하고, 2 개월 이상 배양된 티오글리콜레이트 배지 (thioglycolate medium; 미국 Gibco사 제품)를 마우스에 투여한 다음 4 일이 경과한 후 마우스를 경추 탈골시켰다. 희생시킨 마우스의 복강에 100 U/㎖ 농도로 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 불완전 RPMI-1640 배지 (미국 Gibco사 제품)를 주입하여 복강 내에 있던 대식세포를 추출하고 다시 원심분리한 다음 24-웰 플레이트에 1 × 10⁶세포/웰 농도로 분주하였다.

분주된 세포 플레이트는 약 1 시간 정도 CO₂배양기에서 배양한 다음 상기 플레이트에 부착하지 않은 세포와 기타 부유물들을 불완전 RPMI-1640 배지를 사용하여 2 번 씻어내었다. 그 다음 100 U/㎖ 농도의 페니실린-스트렙토마이신과 10 % 우태아 혈청이 첨가된 완전 RPMI-1640 배지를 1.5 ㎖/웰 양으로 주입하고 다시 3일 동안 CO₂배양기 (습도 100 %, 37 ℃, 5 % CO₂조건)에서 배양하였다.

이 때 대식세포의 순수도는 부착된 세포들을 분리하고 사이토스핀-Ⅲ (Cytospin-Ⅲ; 500 rpm, 5 분)을 이용하여 슬라이드 글라스에 부착시킨 다음 Wright and Giemsa 염색법으로 세포를 염색하여 측정하였고, 그 결과 상기 순수도는 95 % 이상임을 확인할 수 있었다.

(3) 대식세포 자극 및 전체 RNA 의 분리

상기에서 기술한 바와 같이 분리된 마우스의 대식세포는 6-웰 플레이트 (미국 Falcon사 제품)에 3 × 10⁶세포/웰 농도로 도말하고 100 U/㎖ 의 페니실린-스트렙토마이신과 10 % 우태아 혈청이 첨가된 완전 RPMI-1640 배지 (미국 Gibco사 제품)를 사용하여 3일 동안 배양하였다. 세포 배양이 끝난 다음 배양 배지를 씻어내고 새로운 100 U/㎖ 의 페니실린-스트렙토마이신만이 첨가된 불완전 RPMI-1640 배지(미국 Gibco사 제품)를 주입하여 적당한 배지 조건 하에서 상기 대식세포들을 한국산 겨우살이 렉틴과 인터페론-감마를 사용하여 자극시켰다.

세포 자극이 끝난 다음, 차가운 PBS 완충용액으로 배양 세포를 2회 씻어내고 PBS 완충용액을 제거한 각 웰에 1 ㎖의 트리졸 (Trisol)을 투여하여 5분 동안 항온에서 배양하였다. 배양이 끝난 다음, 트리졸에 녹인 세포 용액을 3 회 피펫팅하여 E-튜브에 담고 0.2 ㎖ 의 클로로포름을 첨가한 다음 10 초 정도 볼텍스 (vortex)하여 세포를 잘 혼합하고 다시 원심분리 (속도 12,000 rpm, 60 분, 4 ℃)하였다. 그 다음 전체 RNA 층인 상층액만을 E-튜브에 옮기고, 차가운 100 % 이소프로판올을 넣어 적어도 하루 동안 침전시켰다. 다시 동일한 조건에서 20 분 정도 원심분리하여 상층액을 따라 버리고 이 과정을 반복하여 순수한 전체 RNA 를 분리하였다.

그 다음 75 % 에탄올을 첨가하여 손으로 잘 저어 혼합하고 원심분리 하였으며, 원심분리가 끝나면 상층액을 버리고 0.1 % DEPC-H₂O를 넣어 65 ℃에서 10 분 동안 가열한 후 -20 ℃에서 사용할 때까지 저장하였다.

(4) 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)

역전사-중합효소 연쇄반응을 수행하기 위하여 하기에 기술한 모든 프라이머는 주식회사 바이오니아 (청원, 충북)에 의뢰하여 주문 합성하였다. 구체적으로 TNF-α의 정방향 프라이머 (forward primer; 5'-GGCAGGTCTTTGGAGTCATTGC-3') 및 역방향 프라이머 (reverse primer; 5'-CATTCGAGGCTCCAGTGAATTCCAG-3'), 그리고 베타-액틴의 정방향 프라이머 (β-actin forward primer; 5'-CAAAGAAAATGGACGCCGCCGAACTTGG-3') 및 역방향 프라이머 (β-actin reverse primer; 5'-CCTGCTTGCTTGCTGATCCACATCTGCTGG-3')를 사용하였다.

중합효소 연쇄반응으로 cDNA 를 합성하기 위하여, 5× 역전사효소 완충용액, 2.5 mM dNTP, 500 ng 프라이머/㎕, 200 U/㎕ MMLV 역전사효소 (reverse trancriptase; 일본 Takara사 제품), 전체 RNA, 0.1 % DEPC-처리된 이차 증류수 (DDW)를 첨가하여 반응 혼합액을 준비하였다. 이 때 사용한 프라이머는 역방향 프 라이머였다. 그러고 나서 42 ℃에서 30 분 동안 배양, 75 ℃에서 30 분 동안 배양을 실시하여 cDNA 를 얻었다.

그 다음 상기 역전사 반응 과정에서 얻은 cDNA 가 포함된 RT 혼합액, 10× Taq 폴리머라제 완충용액, 2.5 mM dNTP, 정방향 프라이머(25 pmol/㎕), 역방향 프라이머(25 pmol/㎕), Taq 폴리머라제 (2.5 units/㎕; 일본 Takara사 제품), 이차 증류수를 잘 혼합하여 반응 조건 95 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 1 분, 72 ℃에서 30 초를 30 회로 반복하여 cDNA 를 증폭하였다. 그리고 나서 상기 cDNA 를 전기영동하여 종양괴사인자-알파 유전자의 mRNA 발현 상의 차이를 확인하였다.

그 결과, 본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴의 경우는 10 ㎍/㎖ 농도에서 TNF-α 유전자의 발현을 보이기 시작하다가 300 ㎍/㎖ 농도에서는 최고조로 TNF-α 유전자의 발현 유도를 보였으며 (도 1 A 및 B 참조), 또한, 세포 자극 후 30 분에서 TNF-α 유전자의 발현을 보이기 시작하다가 자극 후 6 시간이 경과하면서 최고조로 TNF-α 유전자의 발현을 보였으며 이후에는 유전자의 발현이 감소하였다 (도 1 C 및 D 참조).

도 1은 본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴이 대식세포로부터 종양괴사인자-알파의 유전자 mRNA 유도에 미치는 농도 의존성 (A 및 B) 및 시간 의존성(C 및 D) 효과를 나타낸 것으로서, 패널 A 및 C 는 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)의 결과이고 패널 B 및 D 는 상기 데이타의 광 농도 측정 분석 (densitometric analysis) 결과이다. 이 때 농도 의존성 효과 검사에서는 세포 자극 시간을 7 시간으로, 시간 의존성 효과 검사에서는 한국산 겨우살이 렉틴의 농도를 300 ㎍/㎖ 로 하여 처리하고, 내독소 LPS 는 1 ㎍/㎖ 농도로 하여 양성 대조군으로 사용되었다.

인터페론-감마의 경우는 0.3 ng/㎖ 농도에서 TNF-α 유전자의 발현을 보이기 시작하다가 30 ng/㎖ 농도에서 최고조의 TNF-α 유전자의 발현 유도를 보였으며 (도 2 A 및 B 참조), 또한 자극 후 30분에서 TNF-α 유전자의 발현을 보이기 시작하다가 자극 후 3시간이 경과하면서 최고조로 TNF-α 유전자의 발현 유도를 보였으며 이후에는 유전자의 발현이 감소하였다 (도 2 C 및 D 참조).

도 2는 대식세포로부터 종양괴사인자-알파의 유전자 mRNA 유도에 미치는 인터페론-감마의 농도 의존성(A 및 B) 및 시간 의존성(C 및 D) 효과를 나타낸 것으로서, 패널 A 및 C 는 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)의 결과이고, 패널 B 및 D는 상기 데이타의 광 농도 측정 분석 결과이다. 이 때 농도 의존성 효과 검사에서는 세포 자극시간을 3시간으로, 시간 의존성 효과 검사에서 인터페론-감마의 농도를 10 ng/㎖ 으로 하여 처리하고, 내독소 LPS 는 1 ㎍/㎖ 농도로 하여 양성 대조군으로 사용되었다.

따라서 도 1 및 도 2 에 나타난 바와 같이, 한국산 겨우살이 렉틴과 인터페론-감마는 대식세포 활성의 지표인 TNF-α 유전자를 대량으로 발현시키면서, TNF-α 유전자의 발현 유도에 농도 의존적으로 또한 자극 시간 의존적으로 영향을 미치는 것을 확인하였다.

실시예 2. 대식세포에서 종양괴사인자-알파의 분비 유도에 미치는 한국산 겨 우살이 렉틴 및 인터페론-감마의 효능 조사

상기 실시예 1 에서 살펴본 바와 같이, 한국산 겨우살이 렉틴 및 인터페론-감마는 면역계의 일차적인 면역반응에 주로 관여하는 대식세포에서 그 활성화의 해당 지표인 TNF-α 유전자의 발현 유도능을 가지지만, 이러한 TNF-α 유전자의 발현 유도가 TNF-α 단백질의 생산 및 분비로도 이어지는지 여부를 조사하기 위하여, TNF-α 단백질의 분비를 다음과 같이 (1)대식세포 자극; 및 (2) 면역 블럿팅 (immunoblotting)을 수행하여 분석하였다.

(1) 대식세포 자극

상기 실시예 1 에서 기술한 바와 같은 과정으로 분리한 마우스의 대식세포를 6-웰 플레이트 (미국 Falcon사 제품) 에 3 × 10⁶세포/웰 농도로 접종하고 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신과 10 % 우태아 혈청이 첨가된 완전 RPMI-1640배지 (미국 Gibco사 제품)를 사용하여 3 일 동안 배양하였다. 세포 배양이 끝난 다음 배양 배지를 씻어내고 새로운 불완전 RPMI-1640 배지로 적당한 배지 조건 하에서 대식세포들을 한국산 겨우살이 렉틴 및 인터페론-감마를 농도별 및 시간별로 나누어 자극시켰다. 이 때 양성 대조군으로는 기존에 잘 알려진 리포폴리사카라이드 (LPS; 미국 Sigma사 제품)를 10 ㎍/㎖ 농도로 사용하였다.

세포 자극을 위한 배양이 끝난 다음 즉시 각 배양액을 채취하여 원심분리(1000 g, 4 ℃, 5 분)하고 배양 상층액을 수거하여 하기에 기술한 바와 같은 면역 블럿팅을 사용하여 배양 상등액에 존재하는 TNF-α 단백질의 양을 측정하였다.

(2) 면역 블럿팅을 이용한 TNF-α 단백질의 정량적 분석

면역 블럿팅의 과정을 간단히 설명하면 다음과 같다. 0.1 % SDS 폴리아크릴아미드 전기영동 상의 분리 겔과 상단 겔은 각각 16 % 및 3 %를 사용하였고, 전기영동 시 전류는 55 mA (Powersupply; 스웨덴 Pharmacia사 제품)로 공급하고, 온도는 쿨링 시스템 (cooling system; 스웨덴 LKB사 제품)을 사용하여 4 ℃를 유지하며 약 4 ~ 5시간 동안 러닝하였다. 또한, 전기영동 시스템은 Hoefer SE 600 (미국 Hoefer-Pharmacia사 제품)을 사용하였다.

상기 전기영동이 끝난 다음 얻은 겔은 트랜스퍼 완충용액 (transfer buffer; 39 mM 글리신 2.9 g, 48 mM 트리스 베이스 5.8 g, 0.037 % SDS, 20 % 메탄올, pH 8.3)에 미리 적신 니트로셀룰로스 멤브레인 (nitrocellulose membrane; NC)을 위에 올려놓고 파이버 패드 (fiber pad)에 넣어 조립시켰다. 그러고 나서 면역 블럿팅 트랜스퍼 카세트 (immunoblotting transfer cassette)를 니트로셀룰로스 멤브레인이 양극 (positive charge) 방향으로 오고, 겔이 음극 (negative charge) 방향으로 오도록 맞추어 트랜스퍼 챔버에 넣어두었다. 전류는 1 A 로 공급하고, 온도는 쿨링 시스템을 사용하여 4 ℃를 유지하면서 1 시간 30 분 동안 트랜스퍼시켰다.

상기 니트로셀룰로스 멤브레인은 블로킹 완충용액 (blocking buffer; 5 % 비지방 분유 (nonfat dry milk)를 녹인 TBS-T 완충용액 (20 mM 트리스-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05 % 트윈-20)) 약 200 ㎖ 에 1 시간 동안 Red-Rocker (Hoefer; CA, USA)를 사용하여 로킹하고 항체 (antibody)의 비특이적 결합(non-specific binding)을 블로킹한 다음, 다시 TBS-T 완충용액으로 15 분 동안 1 회, 10 분 동안 2 회 씻어내었다.

그 다음 TBS-T 완충용액 3 ㎖를 실리콘 용기 (siliconized bottle)에 분주하고 여기에 토끼 항-생쥐 TNF-α 다클론 일차 항체 (rabbit anti-murine TNF-α polyclonal primary antibody; PBS 완충용액에 500 ㎍/1.5 ㎖ 농도) 30 ㎕(1 : 300 희석 비율)를 각각 첨가하여 니트로셀룰로스 멤브레인을 실리콘 용기 (siliconized bottle)에 넣은 후 4 ℃로 맞춘 하이브리디제이션 반응기 (hybridization incubator; 미국 Robbins사 제품)에서 10 rpm 속도로 12 시간 동안 반응시켰다.

그리고 나서 TBS-T 완충용액 70 ㎖ 을 사용하여 20 분 동안 각각 3 번 하이브리디제이션 반응기에서 12 rpm 속도로 씻어내고 이차 항체로서 염소 항-토끼 IgG 퍼옥시다제 결합 항체 (goat anti-rabbit IgG horseradish peroxidase conjugated affinity purified antibody; 스톡 용액은 PBS 완충용액에 0.02 mg/4 ㎖ 농도)를 친화성 분리하여 3 ㎖ TBS-T 완충용액에 30 ㎕ (1 : 20,000 희석 비율)을 첨가한 다음 4 ℃로 맞춘 하이브리디제이션 반응기에서 3 시간 동안 배양하고 다시 70 ㎖ TBS-T 완충용액을 사용하여 20 분 동안 각각 4 번 씻어내었다.

그 다음 니트로셀룰로스 멤브레인을 얇고 투명한 비닐에 넣고 퍼옥시다제 기질 (ECL; peroxidase substrate) 반응용액 1 및 반응용액 2를 50 % 씩 혼합한 반응용액 3 ㎖ 을 이 위에 분주하고 5분 동안 배양하였다. 반응이 끝난 다음 암실 (10 W 안전 램프; 미국 Kodak사 제품)에서 NC 가 들어있는 카세트에 X-선 필름을 끼우 고 5 분 또는 10 분 이상 감광시킨 후 X-선 필름 현상용 박스 안의 현상 용액 (develop solution)에 약 3 분 동안 넣어 반응시켰다.

그러고 나서 이 X-선 필름을 다시 2 분 동안 물로 씻은 다음 고정 용액 (fixing solution)에서 3 분 동안 반응시키고 다시 2 분 동안 물로 씻어 나타나는 밴드를 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴의 경우는 10 ㎍/㎖ 농도에서 TNF-α 단백질의 분비를 보이기 시작하다가 300 ㎍/㎖ 농도에서는 최고조의 TNF-α의 분비를 보였으며 (도 3 A 및 B 참조), 세포 자극 후 30 분에서 TNF-α의 분비를 보이기 시작하다가 자극 후 7 시간이 경과하면서 최고조의 TNF-α의 분비를 보였으며 이후로는 분비가 감소하였다 (도 3 C 및 D 참조).

도 3은 본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴이 대식세포로부터 종양괴사인자-알파의 생산 및 분비 유도에 미치는 농도 의존성(A 및 B) 및 시간 의존성(C 및 D) 효과를 나타낸 것으로, 패널 A 및 C 는 면역 블럿팅의 결과이고, 패널 B 및 D 는 상기 데이타의 광 농도 측정 분석 결과이다. 이 때 농도 의존성 효과 검사에서 자극시간을 8 시간으로, 시간 의존성 효과 검사에서 한국산 겨우살이 렉틴의 농도를 300 ㎍/㎖ 로 하여 처리하였다.

인터페론-감마의 경우는 0.3 ng/㎖ 농도에서 TNF-α의 분비를 보이기 시작하다가 30 ng/㎖에서 최고조의 TNF-α의 분비를 보였으며 (도 4 A 및 B 참조), 자극 후 2 시간에서 TNF-α의 분비를 보이기 시작하다가 자극 후 8 시간이 경과하면서 최고조의 TNF-α의 분비를 보였으며 이후로는 분비가 감소하였다 (도 4 C 및 D 참 조).

도 4는 대식세포로부터 종양괴사인자-알파의 생산 및 분비 유도에 미치는 인터페론-감마의 농도 의존성 (A 및 B) 및 시간 의존성(C 및 D) 효과를 나타낸 것으로, 패널 A 및 C 는 면역 블럿팅의 결과이고, 패널 B 및 D 는 상기 데이타의 광 농도 측정 분석 결과이다. 이 때 농도 의존성 효과 검사에서 자극시간을 8 시간으로, 시간 의존성 효과 검사에서 인터페론-감마의 농도를 10 ng/㎖ 로 하여 처리하였다.

따라서 도 3 및 4 에 나타난 바와 같이, 한국산 겨우살이 렉틴과 인터페론-감마는 대식세포 활성의 지표인 TNF-α를 대량으로 발현하여 생산 분비시키는 것을 확인하였으며, 이 결과는 TNF-α의 분비에 농도 의존적 그리고 자극시간 의존적인 효과임을 알 수 있었다.

실시예 3. 한국산 겨우살이 렉틴이 인터페론-감마에 의한 TNF-α 유전자의 발현에 미치는 상승 효과 조사

상기 실시예 1 에서 살펴본 바와 같이, 한국산 겨우살이 렉틴 및 인터페론-감마는 면역계의 일차적인 면역반응에 주로 관여하는 대식세포에서 그 활성화의 해당 지표인 TNF-α 유전자의 발현 유도능을 가지지만, 이러한 인터페론-감마에 의한 TNF-α 유전자의 발현에 한국산 겨우살이 렉틴이 상승 효과를 나타내는지 여부를 다음과 같이 (1) 대식세포 자극 및 전체 RNA 의 분리; 및 (2) 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 수행하여 확인하였다.

(1) 대식세포 자극 및 전체 RNA 의 분리

상기 실시예 1 에서 기술한 바와 같이 마우스 대식세포를 추출 분리하고 배양하였다. 배양이 끝난 다음 배양 배지를 제거하고 새로운 100 U/㎖ 의 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 불완전 RPMI-1640 배지 (미국 Gibco사 제품)를 주입하여 적당한 배지 조건 하에서 상기 대식세포들을 각각 인터페론-감마 (1 ng/㎖), 한국산 겨우살이 렉틴 (10 ㎍/㎖), 인터페론-감마 (1 ng/㎖) + 한국산 겨우살이 렉틴 (10㎍/㎖)으로 최적의 자극시간인 3 시간 (인터페론-감마의 경우) 및 6 시간(한국산 겨우살이 렉틴의 경우)으로 자극하였다. 자극 반응이 끝나면 상기 실시예 1에서 기술한 바와 같이 전체 RNA를 분리하고 다음 실험 때까지 -20 ℃에 저장하였다.

(2) 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)

상기 실시예 1 에서 기술한 동일한 과정으로 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 그 다음 역전사 중합효소 연쇄반응에서 얻은 cDNA 를 전기영동하고, 인터페론-감마에 의한 TNF-α 유전자의 발현능에 한국산 겨우살이 렉틴이 상승효과를 미치는지 여부를 조사하였다.

그 결과 도 5 에 나타난 바와 같이, 인터페론-감마에 의한 TNF-α 유전자의 발현능에 한국산 겨우살이 렉틴이 상승효과를 미치는 것을 다음과 같이 확인하였다. 인터페론-감마를 최고 농도 30 ng/㎖ 에 대해 1/100 에 해당하는 저 농도인 0.3 ng/㎖ 로, 한국산 겨우살이 렉틴을 최고 농도에 대해 1/30 에 해당하는 저 농 도인 10㎍/㎖ 로 함께 자극한 경우가 인터페론-감마 최고 농도 30 ng/㎖ 으로 단독 투여한 경우보다 더 높거나 거의 동일한 대식세포의 면역 활성 효과를 보여 주었다(도 5).

도 5는 본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴이 인터페론-감마에 의한 대식세포로부터 종양괴사인자-알파의 유전자 mRNA 유도에 미치는 면역 증강 효과를 나타낸 것으로서, 패널 A 는 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)의 결과이고, 패널 B 는 상기 데이타의 광 농도 측정 분석 결과이다. 이 때 인터페론-감마(IFN)의 농도는 0.3 ng/㎖ 이고 자극시간은 3 시간이며, KML 의 농도는 10 ㎍/㎖ 이고 자극시간은 7 시간이며, IFN + KML 는 IFN 의 농도 0.3 ng/㎖ 및 KML 의 농도 10 ㎍/㎖ 를 함께 투여한 것이고 자극시간은 각각 3 시간과 7 시간이다. 내독소 LPS 는 농도 1 ㎍/㎖ 로 하여 양성 대조군으로 사용되었다.

다시 말하면 인터페론-감마와 한국산 겨우살이 렉틴을 함께 투여하면 인터페론-감마를 저농도로 투여하더라도 인터페론-감마를 고농도로 단독 투여하는 경우와 거의 같은 탁월한 효능을 나타내는 것을 입증하였다. 이와 같이 한국산 겨우살이 렉틴이 면역 상승효과를 부여하므로, 이를 이용하면 인터페론-감마를 고농도로 투여하여 생기는 부작용을 줄일 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 한국산 겨우살이 렉틴이 인터페론-감마에 의한 TNF-α 단백질의 분비 유도에 미치는 상승효과 조사

상기 실시예 3에서 살펴본 바와 같이, 한국산 겨우살이 렉틴 및 인터페론-감 마는 면역계의 일차적인 면역반응에 주로 관여하는 대식세포에서 그 활성화의 해당 지표인 TNF-α 유전자의 발현 유도능을 가지지만, 이러한 TNF-α 유전자의 발현 유도가 TNF-α 단백질의 분비로도 이어지는지 조사하기 위하여, TNF-α 단백질의 생산 및 분비를 다음과 같이 (1) 대식세포 자극; 및 (2) 면역 블럿팅을 수행하여 분석하였다.

(1) 대식세포 자극

상기 실시예 2 에서 기술한 바와 같이, 대식세포를 마우스에서 추출 분리하여 배양하였다. 배양이 끝난 다음 배양 배지를 제거하고 새로운 100 U/㎖ 의 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 불완전 RPMI-1640 배지 (미국 Gibco사 제품)를 주입하여 적당한 배지 조건 하에서 상기 대식세포들을 각각 인터페론-감마 (1 ng/㎖), 한국산 겨우살이 렉틴 (10 ㎍/㎖), 인터페론-감마 (1 ng/㎖) + 한국산 겨우살이 렉틴 (10㎍/㎖)으로 최적의 자극시간인 8 시간 (인터페론-감마의 경우) 및 7 시간(한국산 겨우살이 렉틴의 경우)으로 자극하였다. 자극 반응이 끝나면 즉시 각 배양액을 채취하여 원심분리 (1000 g, 4 ℃, 5 분)한 다음 배양 상등액을 수거하여 면역 블럿팅 방법으로 배양 상등액에 존재하는 TNF-α 단백질을 정량 조사하였다.

(2) 면역 블럿팅을 이용한 TNF-α 단백질의 정량적 분석

상기 실시예 2 에서 기술한 동일한 과정으로 TNF-α 단백질을 면역 블럿팅으로 정량적 분석을 하여, 한국산 겨우살이 렉틴이 인터페론-감마에 의한 TNF-α 생 산 분비능에 면역 상승적 효과를 나타내는지 여부를 검증하였다.

그 결과 도 6 에 나타난 바와 같이, 인터페론-감마에 의한 TNF-α의 생산 분비능에 한국산 겨우살이 렉틴이 면역 상승 효과를 미치는 것을 다음과 같이 확인하였다. 인터페론-감마를 최고 농도 30 ng/㎖ 에 대해 1/100 에 해당하는 저 농도인 0.3 ng/㎖ 로, 한국산 겨우살이 렉틴을 최고 농도의 1/30 에 해당하는 저 농도 10 ㎍/㎖ 로 함께 자극한 경우가 인터페론-감마만을 최고 농도인 30 ng/㎖ 로 처리한 경우보다 더욱 높거나 거의 동일한 대식세포 면역 활성 효과, 즉 TNF-α 분비의 상승효과를 보여 주었다(도 6).

도 6은 본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴이 인터페론-감마에 의한 대식세포로부터 종양괴사인자-알파의 생산 및 분비 유도에 미치는 면역 증강 효과를 나타낸 것으로서, 패널 A 는 면역 블럿팅의 결과이고, 패널 B 는 상기 데이타의 광 농도 측정 분석 결과이다. 이 때 인터페론-감마(IFN)의 농도는 0.3 ng/㎖이고 자극시간은 8 시간이며, KML 의 농도는 10 ㎍/㎖ 이고 자극시간은 7시간이며, IFN + KML 는 IFN 의 농도 0.3 ng/㎖ 및 KML 의 농도 10 ㎍/㎖ 를 함께 투여한 것이고 자극시간은 각각 8 시간과 7 시간이다. 내독소 LPS 는 농도 1 ㎍/㎖로 하여 양성 대조군으로 사용되었다.

다시 말하면 도 5 에서 나타난 TNF-α 유전자의 발현 효과와 같이, 인터페론-감마와 한국산 겨우살이 렉틴을 함께 투여하면 인터페론-감마를 저 농도로도 투여하더라도 인터페론-감마를 고농도 단독 투여하는 경우와 거의 같은 탁월한 효능을 나타내는 것을 입증하였다. 이와 같이 한국산 겨우살이 렉틴이 면역 상승효과를 부 여하므로 이를 이용하면 인터페론-감마를 고 농도로 투여하여 생기는 부작용을 줄일 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 5. 한국산 겨우살이 렉틴의 세포 독성 유무 검사

본 발명은 면역 활성제인 인터페론-감마의 증강 보조제인 한국산 겨우살이 렉틴이 면역 활성에 탁월하더라도 생체 내에 독성이 있으면 약제학적으로 사용할 수 없기 때문에 다음과 같이 (1) 비장세포 추출 및 배양; 및 (2) 화학적 세포독성분석을 위한 MTT 시험으로 나누어 세포 독성에 대한 안전성을 조사하였다.

(1) 비장세포 추출 및 배양

본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴이 정상 세포에 미치는 세포 독성 유무를 조사하기 위하여 마우스의 비장세포를 이용하여 연구하였다. 구체적으로 7 주령의 Balb/c 마우스 (한국, 대전 화학연구소)를 경추 탈골해서 희생시키고 비장을 무균 상태에서 회수한 다음 100 U/㎖의 페니실린-스트렙토마이신만이 첨가된 차가운 불완전 RPMI-1640 배지(미국 Gibco사 제품)로 2회 씻고 다시 차가운 불완전 RPMI-1640 배지를 주입하여 Daunce 세포균질기(미국 Wheaton사 제품)를 사용하여 각각 하나의 세포를 만들고 얼음물에 10분 동안 배양하였다.

배양이 끝난 다음 세포 상층액만을 수집하여 원심분리 (1000 g, 5 분, 4 ℃)하고 다시 상층액을 따라버리고 세포를 얻었다. 비장세포는 96-웰 플레이트에 1.5 × 10⁵세포/웰 농도로 분주하여 100 U/㎖ 의 페니실린-스트렙토마이신과 10 % 우태아 혈청이 첨가된 완전 RPMI-1640 배지(미국 Gibco사 제품)로 배양하였다. 그 다음 각 웰에 한국산 겨우살이 렉틴을 농도별로 첨가하고 2 일 동안 배양하여 MTT 분석을 수행하였다.

(2) 화학적 세포독성 검사를 위한 MTT 분석

본 발명에서는 비장세포에 대한 한국산 겨우살이 렉틴의 세포 독성 유무를 MTT 방법을 사용하여 검증하였다. MTT 분석은 프랑소아와 리타 (Francois D and Lita L., J. Immunological methods, 89, 271-277, 1986년)의 방법에 준하여 다음과 같이 실시하였다. 비장세포의 배양이 완료되면 MTT 반응액 (HBSS 완충용액에서 농도 1 ㎎/㎖)을 각 웰 당 50 ㎕씩 첨가하고 37 ㅀC 에서 4 시간 동안 다시 배양하였다. 이후 배양 상등액은 모두 제거하고 침전된 불용성 포르마잔 (formazan)을 녹이기 위하여 디메틸설포옥사이드 (dimethylsulfoxide; DMSO)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하여 15 분 동안 저어주고 (stirring), 엘리자 판독기 (ELISA reader; 미국 Pharmacia사 제품)를 사용하여 540 nm 파장에서의 흡광도(O. D.)를 측정하여 다음과 같은 공식에 따라 % 세포 독성(cytotoxicity)을 측정하였다.

× 100

그 결과 도 7 에서 보는 바와 같이, 본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴은 높은 농도인 300 ㎍/㎖ 에서도 비장세포에 독성 효과를 미치지 않으며 오히려 대조군과 비교하여 더 높은 생존율을 보여주었다(도 7).

도 7은 본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴이 실험동물의 비장세포에 미치는 독성을 생존율 그래프로 나타낸 것으로서, 이 때 한국산 겨우살이 렉틴의 농도는 10 ~ 300 ㎍/㎖ 범위이고 자극시간은 2 일이며, MA (medimu alone)는 KML 대신 식염수로 면역 자극하여 음성 대조군으로, 내독소 LPS 는 1 ㎍/㎖ 농도로 양성 대조군으로 사용되었다.

이러한 결과로 미루어 한국산 겨우살이 렉틴은 세포 독성이 없으며 인터페론-감마에 유효한 면역 증강 보조제로서 안전성이 있는 것을 확인하였다.

실시예 6. 한국산 겨우살이 렉틴의 장기 독성 검사

본 발명은 실시예 5 에서 기술한 한국산 겨우살이 렉틴의 세포 독성 검사만으로는 안전성에 안심할 수 없기 때문에 다음과 같이 한국산 겨우살이 렉틴이 생체의 신진대사와 독성에 민감한 주요 장기인 간과 신장에 미치는 효과를 검사하였다. 신장 기능은 혈액 크레아틴 (blood creatin, CRE)와 혈액 우레아 질소 (blood urea nitrogen, BUN)의 혈중 농도를 측정하여 검사하고, 간 기능은 간세포가 함유하는 GOT (glutamic-oxalacetate transaminase)와 GPT (glutamic pyruvic transaminase)의 두 효소의 혈중 농도를 측정하여 검사하였다.

7 주령의 마우스 (Balb/c; 한국, 대전 화학연구소)를 사용하여 실험군에는 한국산 겨우살이 렉틴 10 ㎍ 및 300 ㎍ 을 0.01 M PBS 완충용액 2 ㎖ 에 용해시켜 정맥에 매일 1 회 2 ㎖씩 투여하고, 정상군에는 PBS 완충용액 2 ㎖만을 매일 1 회 투여하여 동일한 과정으로 실험하였다. 정맥 주사 후 1, 2, 5 및 10 일이 경과하면 마우스의 눈으로부터 채혈하여 얻은 혈청 10 ㎕를 다층 필름 (multilayer film) 상에 놓고 후지 드라이 켐 시스템 (Fugi Dry Chem System; 일본 Fugi Photo Film 사 제품)을 이용하여 각각 CRE, BUN, GOT 및 GPT 값을 측정하였다.

그 결과 도 8 및 9 에서 보는 바와 같이, 한국산 겨우살이 렉틴 10 ㎍를 투여한 실험군에서는 GOT, GPT, CRE 및 BUN 의 혈중 농도가 정상군과 거의 동일하였으며, 한국산 겨우살이 렉틴을 300 ㎍ 투여한 실험군에서는 정상군보다는 조금 높지만 유의한 차이는 없었다(도 8 및 도 9).

도 8은 한국산 겨우살이 렉틴의 간 독성 영향을 나타낸 그래프이다. 사용된 한국산 겨우살이 렉틴 10 ㎍과 300 ㎍을 각각 마우스에 매일 투여했으며 1 일, 5 일, 10 일에 채혈해서 간 조직에 미치는 독성을 검사(GOT, GPT) 하였으며, 대조군(Con)은 한국산 겨우살이 렉틴 대신 식염수로 자극하였다.

도 9는 한국산 겨우살이 렉틴의 신장 독성 영향을 나타낸 그래프이다. 사용된 한국산 겨우살이 렉틴 10 ㎍과 300 ㎍을 각각 마우스에 매일 투여했으며 1 일, 5 일, 10 일에 채혈해서 신장 조직에 미치는 독성을 검사(CRE, BUN) 하였으며, 대조군(Con)은 한국산 겨우살이 렉틴 대신 식염수로 자극하였다.

따라서 한국산 겨우살이 렉틴은 간 및 신장 모두에서 유해한 독성을 미치지 않는 것을 확인할 수 있다.

실시예 7. 한국산 겨우살이 렉틴에 의한 실험동물의 체중 변화 검사

본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴의 안전성을 확인하기 위하여, 미성숙 또는 성숙한 쥐의 신체 발육에 미치는 영향을 체중 증감 변화로 조사하였다. 한국산 겨우살이 렉틴을 10 ㎍/㎖ 및 300 ㎍/㎖ 농도가 되도록 0.01 M PBS 완충용액에 녹이고 생후 1 일째의 미성숙 마우스에는 매일 피하 주사하고, 생후 7 주령된 성숙 마우스에는 매일 복강 내 주사하였으며, 대조군에는 0.01 M PBS 완충용액을 피하주사하거나 복강 내 주사하였다.

그 결과 도 10 (미성숙 쥐의 경우)과 도 11(성숙 쥐의 경우)에서 보는 바와 같이, 미성숙 마우스와 성숙 마우스 모두에서 한국산 겨우살이 렉틴의 10 ㎍/㎖ 및 300 ㎍/㎖ 농도가 대조군과 비교하여 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 10 및 11). 이와 같이 한국산 겨우살이 렉틴은 실험동물에 있어서 신체 발육에 유해한 독성을 미치지 않고 안전한 것을 알 수 있었다.

도 10 및 도 11은 본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴이 각 미성숙 및 성숙한 마우스에 미치는 영향을 체중 변화로 나타낸 것으로서, 이 때 KML 10 ㎍ 과 300 ㎍ 을 각각 마우스에 매일 투여한 다음 0, 2, 4, 6, 8, 10 일에 마우스의 체중을 측정한다.

따라서, 본 발명의 한국산 겨우살이 렉틴은 면역계를 자극시키는 강력한 효과가 있을 뿐만 아니라, 인터페론-감마의 면역 활성 효능을 증강시키는 효과가 있 음을 확인하였다. 즉, 인터페론-감마와 한국산 겨우살이 렉틴을 함께 투여하면 인터페론-감마를 저 농도로 투여하더라도 인터페론-감마를 고 농도로 단독 투여하는 경우와 똑같이 높은 면역 활성을 나타낼 수 있고, 이러한 한국산 겨우살이 렉틴의 상승 효과로 인터페론-감마의 고농도 투여에 의한 부작용을 줄일 수 있음을 입증하였다. 또한, 쥐를 사용한 동물 실험에서는 한국산 겨우살이 렉틴이 세포, 조직 및 신체 발육에 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 한국산 겨우살이 렉틴 (Korean mistletoe lectin)을 유효 성분으로 하는 면역 증강 보조제 및 이를 포함하는 면역 증강 조성물에 관한 것으로서, 상기 면역 증강 보조제는 바이러스, 진균 및 세균에 의한 감염치료 등에 사용되는 면역 활성제인 인터페론-감마에 포함되어 부작용이 없이 낮은 인터페론-감마 농도에서도 효과적으로 면역 활성을 증진시킬 수 있다. 실제로 적은 농도의 한국산 겨우살이 렉틴을 인터페론-감마와 같이 사용하면 인터페론-감마 단독으로 사용할 때보다 1/100의 농도로도 면역 활성이 크게 상승되므로 인터페론-감마를 고농도로 투여하여 생기는 부작용을 제거하면서 아주 적은 양의 인터페론-감마로도 많은 양의 인터페론-감마와 동일한 효과를 나타낼 수 있어, 항비루스, 항균, 항진균 및 항염증제로 이용되는 인터페론-감마에 첨가되면 질병 치료 효과를 크게 개선함과 동시에 환자의 의료비 부담을 많이 덜어줄 수 있다.

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Claims

한국산 겨우살이 렉틴과 인터페론-감마를 유효 성분으로 함유하는 면역 증강제용 약학적 조성물.
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