FI112492B - Kasvitoksiini geloniinia koodaava DNA-sekvenssi - Google Patents

Description

, 112492

Kasvitoksiini geloniinia koodaava DNA-sekvenssi

Tekninen ala Tämä keksintö koskee geloniinia koodaavaa DNA-sek-5 venssiä. Sitä voidaan käyttää geloniinin ja fuusiopro-teiinien tuottamiseen rekombinanttiteknologian avulla.

Taustatietoj a Tärkeä vaatimus lääkkeen suunnittelussa minkä tahansa sairauden hoitoa varten on spesifisyys ja tehokkuus. 10 Monenlaiset lääkkeet, joita on saatavissa syövän hoitoa varten, kärsivät tämän luonteisista ongelmista. Periaate, että myrkyllisiä lääkkeitä suunnataan selektiivisesti eräisiin kasvaimiin, on ollut intensiivisen tutkimuksen aihe muutamina viime vuosina (Thorpe, Biol. Clin. Appli-15 cations 84 (1985) 475 - 512; Möller toim., Immun. Rev. 62 (1982) 1 - 215) . Viime aikoina sekä monoklonaalisia että polyklonaalisia vasta-aineita, lektiinejä, lymfokiinejä ja hormoneja, jotka tunnistavat kasvainsolun pinnalla olevia spesifisiä determinantteja, on käytetty kantajina myrkyl-20 listen aineiden toimittamiseksi soluun, jossa viimeksi mainitut voivat osoittaa soluille myrkyllisen vaikutuksensa (Blattler et ai., Biochemistry 24 (1985) 1517 - 1524; , ; Frankel et ai., J. Biol. Res. Modif. 4 (1985) 437 - 446;

Reimann et ai., J. Clin. Invest. 82 (1988) 129 - 138; ( 25 Schwartz ja Vale, Endocrinology 122 (1988) 1695 - 1700; ( Scott et ai., J. Natl. Cancer Inst. 79 (1987) 1163 - 1172;

Singh et ai., Biol. Chem. 264 (1989) 3089 - 3095; Sriniva-' san et ai., FEBS Letters 192 (1985) 113; Schwartz et ai.,

Endocrinology 121 (1987) 1454 - 1460) . Myrkyllisiä osia, * * ’ 3 0 joita on tähän mennessä tutkittu näiden toimittavien ai- ; neiden kanssa, ovat radioaktiiviset atomit (Ghose et ai., , Br. Med. J. 1 (1967) 90 - 96), soluille myrkylliset lääk- keet, joita yleisesti käytetään syövän kemoterapiassa ’ (Thorp ja Ross, Immun. Rev. 62 (1982) 119 - 157; Deweger : : ; 35 et ai. , Immun. Rev. 62 (1982) 29 - 45; Arnon ja Sela, 2 112-192

Immun. Rev. 62 (1982) 5 - 27; Pimm et al., Cancer Immun.

Immunotherap. 12 (1982) 125 - 134; Rowland ja Axton,

Cancer Immun. Immunotherap. 19 (1985) 1-7), ja baktee reista ja kasveista peräisin olevat proteiinit kuten dif-5 teriä tai risiini (Jansen et ai., Immun. Rev. 62 (1982) 185 - 216; Raso, Immun. Rev. 62 (1982) 93 - 117. Vitetta et ai., Immun. Rev. 62 (1982) 159 - 183; Nelville ja

Youle, Immun. Rev. 62 (1982) 47 - 73; Thorpe et ai., Eur. J. Biochem. 116 (1981) 447 - 454). Spesifinen molekyyli 10 rakennetaan korvaamalla epäspesifinen B-ketju vasta-aineella tai hormonilla.

Bakteeri- ja kasvitoksiinit kuten difteriatoksiini (DT), Pseudomonas aeruginosa - toksiini A, abriini, risiini, misteli, modekkiini ja Shigella-toksiini ovat tehok-15 kaita soluja tappavia aineita, mikä johtuu niiden kyvystä saattaa sekaisin kriittinen solun toiminto. Esimerkiksi DT ja risiini estävät solun proteiinisynteesiä vastaavasti inaktivoimalla pidennystekijän 2 ja inaktivoimalla riboso-mien 60s-alayksikköjä (Bacterial Toxins and Cell Membra-20 nes, toimittajat Jelajaszewicz ja Wadstrom (1978), Academic Press, s. 291). Nämä toksiinit ovat erittäin tehokkai-: ta, koska ne ovat entsyymejä ja vaikuttavat katalyyttises- ' * ti eikä stoikiometrisesti. Näiden toksiinien molekyylit , koostuvat entsymaattisesti aktiivisesta polypeptidiketjus- 25 ta tai fragmentista, jota tavallisesti nimitetään "A"-ket-juksi tai -fragmentiksi ja joka on sidottu yhteen tai useampaan polypeptidiketjuun tai fragmenttiin, joita ta- '·’ ‘ vallisesti nimitetään "B"-ketjuiksi tai -fragmenteiksi ja jotka sitovat molekyylin solun pintaan ja tekevät A-ket- V 30 julle mahdolliseksi päästä sen vaikutuskohtaan, esim. so- : lulimaan, ja suorittaa sen keskeyttävä tehtävä. Solulimaan pääsemisen tapahtumaa nimitetään eri tavoin joko "sisäistämiseksi", "myrkytykseksi" tai "translokaatioksi". Nämä T proteiinitoksiinit kuuluvat luokkaan, jolla on kaksi ket- 35 jua, joita nimitetään A- ja B-ketjuksi. B-ketju kykenee 112492 3 sitoutumaan melkein kaikkiin soluihin, kun taas A-ketju osoittaa soluille myrkyllistä aktiivisuutta. Uskotaan, että Δ-ketju täytyy vapauttaa oikeaan aikaan B-ketjusta -usein pelkistämällä disulfidisidos - A-ketjun tekemiseksi 5 funktionaaliseksi. Nämä luonnolliset toksiinit eivät yleensä ole selektiivisiä määrätylle solu- tai kudostyypille, koska niiden B-ketjut tunnistavat monien erilaisten solujen pinnalla läsnä olevia reseptoreita ja sitoutuvat näihin.

10 Sellaisen toksiinimolekyylin saatavissa olo, joka ei ole sytotoksinen monille erilaisille soluille yksin annettuna, on ollut rajoitettua. Eräiden sellaisten luonnossa esiintyvien yhden ainoan ketjun toksiinimolekyylien käyttäminen, jotka eivät itse sitoudu solun pinnan resep-15 toreihin ja joita solut sen vuoksi eivät normaalisti ota sisään, on tarjonnut myrkyllisiä molekyylejä, jotka ovat suhteellisen ei-myrkyllisiä useimmille, ellei kaikille, soluille yksin annettuina. Tällaisia nykyään tunnettuja luonnossa esiintyviä yhden ainoan ketjun toksiineja ovat, 20 mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, kermesmarjan virus-vastainen proteiini (Ramakrishnan ja Houston, Cancer Res. 44 (1984) 201 - 208), saponiini (Thorpe et ai., J. Natl.

; Cancer Inst. 75 (1985) 151 - 159) ja geloniini (Stirpe et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 6947 - 6953). Nämä proteii-! 25 nit eivät ole myrkyllisiä soluille vapaassa muodossa, mut- ta voivat estää proteiinisynteesiä päästessään solun si-* sään. Kuitenkin näiden yhden ainoan ketjun toksiinien saa tavuus oleellisesti puhtaassa muodossa on rajoitettua sen johdosta, että ne täytyy puhdistaa kasvilähteistä, joissa j _·* 30 niitä esiintyy suhteellisen pieninä määrinä, ja toksiinin : pitoisuuden kasveissa toistuvuus on riippuvaista kasvin h_ kasvuolosuhteista ja kasvin korjuun olosuhteista.

4 •1 Λ r, Λ ρ r\ I ! L 4 ^ l

Geloniini on yhden ainoan ketjun polypeptidi, joka on eristetty kasvin Gelonium multiforum siemenistä ja jonka molekyylipaino on noin 28 000 - 30 000 kilodaltonia. Geloniini on emäksinen glykoproteiini, jonka likimääräinen 5 isoelektrinen piste on 8,15, ja se sisältää mannoosi- ja glukosamiinijäännöksiä (Falasca et ai., Biochem. J. 207 (1982) 505 - 509). Päinvastoin kuin muut kasvi- ja bakteeritoksiinit, tämä proteiini ei ole itsekseen myrkyllinen soluille, mutta kun se on toimitettu soluihin kantajan 10 avulla, se vaurioittaa 60s-ribosomialayksikköä. In vivo ja in vitro saadut biologiset tulokset viittaavat siihen, että geloniini on samanarvoinen tai parempi kuin muut kas-vitoksiinit. Itse asiassa tulokset geloniinikonjugaattien vertailusta in vitro ja in vivo muiden A-ketjukonjugaat-15 tien kanssa osoittivat, että geloniinilla oli samanlainen tehokkuus, parempi selektiivisyys, parempi kasvaimen paikallistaminen ja merkittävämpiä terapeuttisia vaikutuksia (Sivan et ai., Cancer Res. 47 (1987) 3169 - 3173). Kuitenkin toistettavan, helposti saavutettavan geloniinimäärän 20 saatavuus luonnon lähteistä on rajoitettua. Lisäksi gelo-niinin puhdistaminen kasvilähteistä on vaikeaa, ja saanto : on hyvin pieni.

: Geloniinin on itsekseen osoitettu olevan keskenme- » , [<i non aiheuttava hiirillä, ja se lisää vasta-aineista riipii! 25 puvaista solun myrkyllisyyttä soluille (Yeung et ai., ; I Internatl. J. Peptide Protein Res. 31 (1988) 265 - 268).

* » '1* Useat tutkijat ovat käyttäneet geloniinia soluille ’·’ * myrkyllisenä aineena kiinnitettynä kemiallisesti monoklo- naalisiin vasta-aineisiin tai peptidihormonisoluuntähtäys-•',· 30 ligandeihin. Kuitenkin geloniinin ja soluuntähtäysosien : : kemiallinen muuntaminen voi vähentää tähtäystehokkuutta ja geloniinin itsensä kykyä olla myrkyllinen soluille. Lisäk-,\, si geloniinin luonnolliset lähteet ovat alttiita vaihtele- • t vuudelle sadonkorjuussa ja kasvin kasvussa, mikä voi vai-: 35 kuttaa geloniinin soluille myrkylliseen aktiivisuuteen.

112492 5

Kyky tuottaa synteettistä geloniinitoksiinia kemiallisesti tai käyttäen rekombinanttiteknologiaa tarjoaa runsaan, toistettavan toksiinilähteen.

Keksinnön yhteenveto 5 Tämä keksintö tarjoaa DNA-sekvenssin geloniinia varten, jolle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa esitetään. Keksinnön mukainen sekvenssi vastaa kuviossa 2 ja SEQ ID NO:l:ssä esitettyä DNA-sekvenssiä, jossa nukleotidit WSN (nro 121 - 123) ovat 10 AGR. Tämän keksinnön mukaisten sekvenssien käyttäminen oleellisesti puhtaan geloniinin tuottamiseksi suurina määrinä rekombinanttitekologian avulla aikaansaa runsaita toksiinimääriä, jollaisia ei ole tähän mennessä ollut saatavissa luonnon lähteistä.

15 Piirrosten lyhyt kuvaus

Kuvio 1 esittää geloniinin aminohapposekvenssin.

Kuvio 2 esittää geloniinin koodaavan cDNA:n.

Kuvio 3 osoittaa geloniinin aminohapposekvenssin homologian trikosantiinin, risiinin A-ketjun, risiinin 20 siemenestä eristetyn agglutiniinin edeltäjän ja abriinin A-ketjun sekvenssin kanssa.

Kuvio 4 esittää CNBr-fragmenttien HPLC-profiilin.

; Kuvio 5 esittää geloniinin pilkontatuotteiden, jotka on aikaansaanut A) Lys-c, B) stafylokokkiproteaasi * 25 ja C) hydroksyyliamiini, HPLC-profiilin.

Kuvio 6 esittelee geloniinin (A) , trikosantiinin (B), abriinin (C), risiinin (D) ja agglutiniinin edeltäjän (E) hydrofobisuuden graafisen esityksen.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 30 Ilmaus "oleellisesti puhdas" tarkoittaa käytettynä : tämän keksinnön mukaisesta geloniiniproteiinista, että _ polypeptidi on oleellisesti vapaa muista kasviproteiineis- ta, joita on normaalisti liittyneenä geloniiniin sen luon- > » 1;* nollisessa tilassa, ja osoittaa toistettavia elektroforee- :V; 35 - Ί Λ Γ> / Π Ο e μΖ4>ζ si- tai kromatografiatuloksia, eluutioprofiileja ja toksista aktiivisuutta. Ilmauksen "oleellisesti puhdas" ei tarkoiteta sulkevan pois keinotekoisia tai synteettisiä seoksia, joissa on geloniiniproteiinia muiden yhdisteiden 5 kanssa.

Geloniini puhdistettiin kasvin Gelonium multiforum siemenistä alan ammatti-ihmisten tuntemien tekniikkojen avulla. Aminohapposekvenssi määritettiin käyttäen Edman-pilkontamenetelmän muunnosta.

10 Geloniininäytteitä lisättiin käänteisfaasireaktio- kammioon ja niille suoritettiin Edman-pilkonta. Geloniinin N-päätteen todettiin olevan heterogeeninen (1/2 proteiini-molekyyleistä oli ilmeisesti yhtä aminohappoa lyhyempiä kuin toiset). Tämän heterogeenisyyden vuoksi oli vaikeaa 15 sekvenssoida paljon enemmän kuin 40 sykliä. Sen vuoksi muiden sekvenssissä olevien aminohappojen määrittämiseksi suoritettiin entsymaattista pilkontaa.

Proteiinien sisäinen sekvenssi saadaan yleensä pilkkomalla tai katkomalla suuri proteiinimolekyyli pie-20 nemmiksi palasiksi käyttäen entsyymien ja kemiallisten pilkkomisten yhdistelmää. Kun alkuperäiselle geloniinille suoritettiin erilaisia proteolyyttisillä entsyymeillä pilkkomisia, sen todettiin pilkkoutuvan epätäydellisestä. Tämän havaittiin osittain johtuvan molekyylin N-terminaa-25 lisessa osassa olevasta disulfidisidoksesta. Tämän sidoksen katkaiseminen pelkistämällä ja alkyloimalla jodietik-kahapon avulla tuotti fragmentin, joka oli vähemmän liu-• ' koinen kuin alkuperäinen aine entsymaattisen pilkonnan vaatimassa pH-arvossa. Alkuperäisen geloniinin pilkkomis-• ' · 30 ten yhdistelmä käyttäen trypsiiniä, lysiiniaminopeptidaa- : siä (Lyse), stafylokokkiproteaasia (V8) ja kymotrypsiiniä, tuotti peptidejä enimmäkseen molekyylin C-terminaalisesta osasta. Tämä osoitti, että molekyylin N-terminaalinen osa (N-terminaalisesta analyysistä paikkaan Asp-Ala-Pro jään- 7 112492 nöksen 70 kohdalla) ei ollut helposti lähestyttävissä entsyymeillä pilkkomista varten.

Geloniini pilkottiin syaanibromidin avulla kolmeksi suureksi peptidiksi. Proteiininäytteitä (0,2 mg/ml) liuo-5 tettiin 70 % muurahaishappoon. Syaanibromidikide lisättiin liuokseen ja reaktion annettiin tapahtua vähintään 18 tunnin ajan. Liuos laimennettiin sitten vedellä ja lisättiin pieneen sekvenssointipylvääseen. Näytteen lisäämisen jälkeen käytettiin gradienttia, jonka muodosti 1 - 10 % 10 n-propanoli 0,1 % TFA:n kanssa, proteiinifragmenttien eluoimiseksi. Eluutioprofiili on esitetty kuviossa 4.

Kokonaisen proteiinin tai CNBr-fragmenttien entsy-maattinen pilkonta tuotti päällekkäin meneviä peptidejä. Suoritettiin entsymaattiset pilkonnat lysyyliendopeptidaa-15 silla liuoksessa, jossa oli 0,1 % SDS 100 mM Tris-puskuri-liuoksessa, pH 8,0, Staphylococcus aureus -proteaasilla 0,1 % SDSrssä tai trypsiinillä 0,1 % Tween 20:ssä. Geloniini sisältää yhden kysteiinijäännöksen asemassa 49. Pelkistäminen ja karboksimetylointi tuottaa proteiinin, joka 20 saadaan paremmin talteen käänteisfaasi-HPLC:sta ja on alttiimpi entsymaattiselle pilkonnalle. Sen vuoksi useimmat entsymaattiset pilkonnat suoritettiin 0,1 % SDS:ssa tai 0,1 % Tweenissä.

C-päätteen jälkeen 160 jäännöstä asetettiin suoraan 25 riviin käyttäen yhdistelmää, johon kuului CNBr-pilkontoja ja entsymaattisia katkaisuja. Jäljelle jäänyt tuntematon sekvenssi jäännösten 40 ja 70 välillä määritettiin käyttäen yhdistelmää, johon kuului kysteiinin kemiallinen muuntaminen jodietikkahapolla ja alkyloidun proteiinin • ' 30 liuottaminen SDS:n avulla. RCM-alkyloitua geloniinia pil- ; kottiin sitten ylimäärällä Lysc-entsyymiä 37 °C:ssa lyhyi tä aikoja (1-5 tuntia). HPLC-eluutioprofiili on esitetty kuviossa 5A.

Tämä menetelmä tuotti uuden sekvenssin, jota ei 35 oltu nähty aikaisemmin. Tämä uusi sekvenssi osoitti Asn- 8 112492

Gly-yhdistelmän esiintymisen. Tämä aminohappojen yhdistelmä voidaan katkaista kemiallisen menetelmän avulla käyttäen hydroksyyliamiinia.

Hydroksyyliamiinilla katkaiseminen suoritettiin 5 lisäämällä 100 pg geloniinia juuri valmistettuun hydrok-syyliamiiniin (2 M) 0,2 M Tris-puskuriliuoksessa (pH 9,0), jossa oli 2 M NaCl, 1 mM EDTA ja 10 % etanolia. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 7 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, koko reaktioseos lisättiin sekvenssointipylvääseen. Pyl-10 västä pestiin sitten liuoksella, jossa oli 1 % TFA vedessä, ja joko eluoitiin asetonitriiligradientin avulla tai sekvenssoitiin suoraan seoksena. Tämä kemiallinen pilkkominen tuotti suuren hydrofobisen peptidin, joka sisälsi noin 200 aminohapon sekvenssin, joka liittyi yhteen Ala-15 Asp-Pro:n kanssa jäännöksen 70 kohdalla. Eluutioprofiili on esitetty kuviossa 5C.

Jäljellä oleva, lyhyt osa päällekkäin menevää sekvenssiä jäännösten 40 ja 50 väliltä määritettiin pilkkomalla geloniinia alkyloimatta Lysc:n avulla SDS:ssa. Tämä 20 pilkkoi pois suurimman osan aineen C-terminaalisesta osasta. Sitten tätä seosta pilkottiin jälleen kymotrypsiinin . ,·. avulla. Tämän pilkonnan tuotteet eroteltiin sitten HPLC:n avulla. Suuren peptidin sekvenssianalyysi paljasti sekvenssin (SerThrLys), joka alkoi noin 5 aminohapon päästä 25 molekyylin N-terminaalisesta päästä. Tämä oli hyödyllistä siksi, että se poisti molekyylin heterogeenisen osan ja mahdollisti pitemmän sekvenssiäjon.

' Geloniiniproteiini sisältää 258 aminohappoa, joiden sekvenssi on esitetty kuviossa 1. Geloniinin aminohappo-; ' ; 30 sekvenssiä verrattiin muihin tunnettuihin sekvensseihin, ; joita oli saatavana sekvenssitietopankeissa (Genbank, PIR, EMBL), jotta saataisiin määritettyä, onko geloniinilla mitään homologia-alueita muiden proteiinien kanssa. Geloniinin aminohapposekvenssin vertaaminen muihin proteiinei-35 hin, joilla on tunnettu aminohapposekvenssi, osoitti, että 9 112492 geloniinin sekvenssi on ainutlaatuinen. Todettiin gelonii-nin sekvenssin eräiden osien homologiaa muiden proteiinien osien kanssa. Esimerkiksi geloniini osoittaa 36,0 % homologiaa lajista Trichosanthin Kirilowi peräisin olevan al-5 fatrikosantiinin kanssa, 33,8 % homologiaa intialaisesta lakritsikasvista peräisin olevan abriinin A-ketjun kanssa, 35,2 % homologiaa risiinin siemenestä peräisin olevan agglutiniinin edeltäjän kanssa, 33,7 % homologiaa risiinin siemenestä peräisin olevan risiini D:n A-ketjun kanssa ja 10 27,3 % homologiaa lajista Mirabilis jalapa peräisin olevan virusvastaisen proteiinin (MAP) kanssa. Yhteenveto homolo-gia-asteesta näiden ja muiden proteiinien kanssa on esitetty kuvioissa 3 ja 4.

Kuvioissa 6A - 6E olevat hydrofobisuuden graafiset 15 esitykset osoittavat samankaltaisuuden trikosantiinin, risiinin ja muiden ribosomeja estävien proteiinien hydrofobisten alueiden kanssa.

Geloniinin rakenteen hydropatian graafinen esitys osoittaa hydrofobisen alueen jäännöksissä 35 - 80 ja 150 -20 180. Nämä ovat alueita, joilla luultavasti esiintyy mole kyylin huomattavaa laskostuneisuutta. Tätä samanlaista hydrofobisuusmallia havaitaan myös muillla toksiineilla (katso kuvio 6A - 6E), ja se voi viitata siihen, että aktiivinen entsymaattinen keskus voi sisältyä näihin laskos-25 tuneisiin alueisiin. Sen vuoksi aktiivista entsymaattista kohtaa ei ehkä löydy molekyylin lineaariselta alueelta, ja näiden rakenteiden täytyy ehkä laskostua sopivasti oikean-* laisen entsymaattisen keskuksen aikaansaamiseksi.

Geloniinin cDNA:ta käyttämällä voidaan tuottaa re-30 kombinanttigeloniinia. Mutaatioita voidaan lisätä spesi- : fisesti molekyyliin sellaisen rekombinanttigeloniinin ai kaansaamiseksi, josta puuttuu hiilihydraattiryhmiä, jotka voivat suunnata geloniini-vasta-ainekonjugaatteja harhaan.

; ’ Kohdennetun mutageneesin avulla voidaan tuottaa sellaisia 35 rekombinanttigeloniinimolekyylejä, että niillä on suurem- 10 112432 pi toksinen aktiivisuus kuin alkuperäisellä molekyylillä, että ne otetaan tehokkaammin sisään sen jälkeen kun ne ovat sitoutuneet solun pintaan kantajan kuten monoklonaa-lisen vasta-aineen tai suuntaavan ligandin kuten IL-2:n, 5 EGF:n, IFN:n jne. avulla, että ne vastustavat lysosomis-sa tapahtuvaa hajottamista ja ovat siten stabiilimpia ja kauemmin vaikuttavia myrkyllisenä osana.

Rekombinanttigeloniinimolekyylejä voidaan myös rakentaa fuusiotuotteiksi, jotka sisältävät muita funktio-10 naalisia tapoja tappaa soluja, kuten entsymaattisen aktiivisuuden, TNF:n, IFN-aktiivisuuden, toisen toksisen aktiivisuuden kuten difteriatoksiinivaikutuksen (jossa mainittu toinen aktiivisuus liittyy erilaiseen biologiseen reittiin kuin geloniini), aikaansaaden siten "supertoksiini" tai 15 toksiini, jolla on monifunktionaalisia vaikutuksia.

Voidaan rakentaa fuusioproteiineja geloniinin kanssa lääkkeiden kuten kemoterapeuttisten aineiden tai isotooppien röntgenkuvausta tai sädehoitoa varten kuljettamiseksi. Geloniinipeptidejä voidaan käyttää keskenmenon 20 aiheuttavina aineina, immuunivastetta vaimentavina aineina, syöpää vastustavina aineina ja virusvastaisina aineina (kuten anti-HIV-aineena).

Seuraavat esimerkit tarjoavat geloniinin valmistuksen, karakterisoinnin ja aminohapposekvenssin yksityiskoh-25 täisen kuvauksen. Käytetyt koemenetelmät on kuvattu yksityiskohtaisesti alla olevissa esimerkeissä. Näiden esimerkkien ei ole tarkoitus rajoittaa keksintöä millään ta-. : valla.

Esimerkki 1 30 Geloniinin puhdistus ja karakterisointi : Geloniini eristettiin kasvin Gelonium multiforum siemenistä noudattaen oleellisesti kuvattua menetelmää (Stirpe et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 6947 - 6953). Lyhyesti kuvattuna geloniini uutettiin siemenistä homoge-35 noimalla puskuroidussa suolaliuoksessa (pH 7,4). Superna- u 112^92 tantti konsentroitiin sen jälkeen kun oli dialysoitu 5 mM natriumfosfaattia (pH 6,5) vastaan ja geloniinia puhdistettiin lisäksi ioninvaihtokromatografian avulla kuten on kuvattu alla. Geloniinitoksiinin puhtaus tutkittiin kor-5 keapainenestekromatografian (HPLC) ja natriumdodesyyli-sulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesin (SDS-Page) avulla. Geloniinitoksiini kulkeutui yhtenä ainoana vyöhykkeenä, jonka likimääräinen molekyylipaino oli 29 000 -30 000 daltonia.

10 Geloniinitoksiinin aktiivisuus mitattiin kuten on kuvattu esimerkissä 2 käyttämällä proteiinisynteesin estämistä solunulkoisessa järjestelmässä.

Kasvin Gelonium multiforum siemenistä poistettiin kuori ja pähkinät jauhettiin homogenoijassa kahdeksan ti-15 lavuuden kanssa 0,14 M NaCl, joka sisälsi 5 mM natrium-fosfaattia (pH 7,4). Homogenaatti jätettiin yön ajaksi 4 °C:seen sekoittaen jatkuvasti, jäähdytettiin jään päällä ja sentrifugoitiin nopeudella 35 000 x g 20 minuutin ajan 0 °C:ssa. Supernatantti poistettiin, sitä dialysoitiin 20 5 mM natriumfosfaattia (pH 6,5) vastaan ja se konsentroi tiin käyttäen pmlO-suodatinta. Näyte sijoitettiin kerrokseksi CM-52-ioninvaihtopylvääseen (20 x 1,5 cm), joka oli ; tasapainotettu 5 mM natriumfosfaatilla (pH 6,5). Aine, ‘ joka sitoutui ioninvaihtohartsiin, eluoitiin 400 ml:11a 25 0 - 0,3 M NaClrn muodostamaa lineaarista gradienttia käyt- ; täen nopeutta 25 ml tunnissa 4 °C:ssa. Koottiin 5 ml:n fraktioita. Fraktioita tarkkailtiin aallonpituudella 280 nm spektrofotometrissä. Geloniini eluoitui noin fraktioissa 55 - 70 ja oli viimeinen suuri eluutiohuippu. Nämä ; . 30 fraktiot yhdistettiin, dialysoitiin liuosta vastaan, jossa : oli 0,1 M NaCl 0,1 M Na2HP04-puskuriliuoksessa (pH 7,4).

Näyte lisättiin sitten Cibacron blue sepharose -pylvääseen (24 x 2 cm), joka oli aikaisemmin tasapainotettu 0,1 M Na2HPO4/0,l M NaCl -puskuriliuoksella. Pylväs pes-35 tiin 3 kolonnintilavuudella puskuriliuosta ja eluoitiin -1 1 O I cr- 12 1 ' ^ z- 400 ml:n lineaarisella suolagradientilla (0,1 M NaCl - 2 M NaCl). Sitoutuneen aineen eluoitumista tarkkailtiin pylvään fraktioiden Lowry-analyysin avulla- Yksinäisen pro-teiinihuipun sisältävät fraktiot yhdistettiin ja dialysoi-5 tiin yön ajan 4 °C:ssa fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta (PBS) vastaan. Geloniinitoksiini puhdistettiin yli 97 % puhtaaksi arvioituna hopeavärjätyn PAGE:n perusteella. Kunkin valmisteen puhtaus ja molekyylipaino tarkistettiin korkeapainenestekromatografian avulla käyttäen TSK 3000 10 -geelipermeaatiopylvästä ja 50 mM natriumfosfaattipuskuri- liuosta, pH 7,4, ja 15 % natriumdodesyylisulfaattipolyak-ryyliamidigeelielektroforeesin (SDS-Page) avulla. Geloniini kulkeutui yhtenä ainoana vyöhykkeenä, jonka likimääräinen molekyylipaino oli 29 000 - 30 000 daltöniä.

15 Esimerkki 2

Geloniinin aktiivisuuden määritys

Geloniinin aktiivisuutta tarkkailtiin solunulkoi-sessa proteiinisynteesin estämisen määrityksessä. Solun-ulkoisen proteiinisynteesin estämisen määritys suoritet-20 tiin lisäämällä peräkkäin 50 pl:aan kanin retikulosyytti-lysaattia, joka oli sulatettu välittömästi ennen käyttöä, , sekoittaen kunkin lisäyksen jälkeen, seuraavat aineosat: ,\ ; 0,5 ml 0,2 M Tris-HCl (pH 7,8), 8,9 ml eteeniglykolia ja ' / 0,25 ml 1 M HC1.

i 25 20 μΐ suola-aminohappo-energiaseosta (SAEM), joka koostui seuraavista: 0,375 M KC1, 10 mM Mg(CH3C02)2, 15 mM glukoosi, 0,25 - 10 mM aminohappoja (lukuunottamatta v ‘ leusiinia), 5 mM ATP, 1 mM GTP, 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 μΐ kreatiniinifosfaatti-kreatiniinifosfokinaasia, 8 μΐ 30 [14C]-leusiinia (Amersham, 348 mCi millimooli), ja lisäten 1,5 μΐ liuoksia, jotka sisälsivät vaihtelevia pitoisuuksia geloniiniseosta. Seosta inkuboitiin 60 minuutin ajan 30 °C:ssa. 14C-leusiinin liittymistä tarkkailtiin seoksen näytteessä saostamalla syntetisoitu proteiini lasikuitu-35 suodattimille, pesemällä 10 % TCA:ssa ja asetonissa ja 112492 13 tarkkailemalla radioaktiivisuutta beetalaskurissa käyttäen Aquasol-tuikenestettä. Tätä määritystä käytettäessä puhdistetun geloniinin ominaisaktiivisuus oli 4 x 109 yksikköä (U)/mg proteiinia. Geloniinin aktiivisuuden yksikkö on se 5 määrä geloniiniproteiinia, joka aiheuttaa [14C]-leusiinin liittymisen proteiiniin 50 % estymisen solunulkoisessa määrityksessä.

Esimerkki 3

Geloniinin aminohapposekvenssin määritys 10 Geloniinin aminohapposekvenssi määritettiin Edman- pilkontamenetelmän avulla käyttäen automaattista aminohap-posekvenssoijaa kuten on kuvattu EP-patenttihakemuksessa 257 735. Suuria peptidejä ja pilkkomatonta proteiinia pantiin sekvenssireaktiokammion käänteisfaasiosaan. Epäsuota-15 vat puskuriliuoksen komponentit pestiin pois ylimäärällä vettä. Proteiini- tai peptidinäyte sekvenssoitiin sitten Edman-kemian avulla ja eristetyt ATZ-aminohappojohdannaiset muutettiin PTH-muotoon käyttäen 25 % TFA H20:ssä 65 °C:ssa. PTH-näytteet identifioitiin käänteisfaasi-ana-20 lyyttisen erottelun avulla käyttäen Np 1090 -pylvästä.

Jotta saataisiin lisää aminohapposekvenssiä, pro-, , , teiinia pilkottiin erilaisilla proteolyyttisillä ja ke- ; maallisilla vaikuttaja-aineilla ja sitten peptidit puhdis tettiin korkeapainenestekromatografian avulla. Geloniini 25 todettiin varsin kestäväksi trypsiinin (katkaisee arginii-ni- ja lysiinijäännösten jälkeen) ja asetyylitrypsiinin (katkaisee ainoastaan lysiinijäännöksen jälkeen) vaikutusta vastaan. Proteiini todettiin vastustuskykyiseksi niin suurelle määrälle kuin 5 % (paino/paino) entsyymiä. Gelo-'; 30 niinin kestävyys proteolyyttisen entsyymin trypsiinin suh teen ei johdu trypsiinin katkaisukohtien puutteesta, sillä geloniini sisältää 21 lysiini- ja 12 arginiinijäännöstä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että geloniini on ehkä jäykästi pakattu molekyyli, minkä johdosta se on suljettu 35 proteolyyttisiltä entsyymeiltä.

A A r, ο r\ 14 11/4y/

Koska geloniini todettiin vastustuskykyiseksi pro-teolyyttisten entsyymien aiheuttamalle pilkkoutumiselle, tutkittiin proteiinin kemiallista pilkkomista.

Esimerkki 4 5 Geloniinin CNBr-pilkonta

Geloniini, joka oli valmistettu kuten esimerkissä 1, liuotettiin 70 % muurahaishappoon. Syaanibromidikide lisättiin liuokseen. Kun oli kulunut vähintään 18 tuntia, liuos lisättiin joko pieneen (0,15 cm x 5 cm) käänteisfaa-10 sipylvääseen (J.T. Baker; 15 cm C-1B sidottu faasi Cat II 7191-02) tai analyyttiseen (4,6 x 100 mm) käänteisfaasi-pylvääseen. Gradienttieluutio, joka käsitti 1 - 70 % n-propanolia 1 % TFA:n vedessä kanssa, tuotti 5 huippua, kuten on esitetty kuviossa 6. Kukin huipuista sekvenssoi-15 tiin ja myös käytettiin lisäpilkontaan entsyymien avulla koko sekvenssin kokoamiseksi palasista. Huippu 1 sekvens-soitiin suoraan ja antoi sekvenssin, joka alkoi jäännöksestä Phe (F) ja jatkui 38 jäännöksen verran päättyen jäännökseen Glu (E). Tämä sekvenssi varmistettiin tämän 20 eristetyn peptidin massaspektroskopian ja Lysc-pilkkomis-ten avulla. Huippu 2 sekvenssoitiin suoraan ja antoi sekvenssin, joka alkoi jäännöksestä Vai (V) ja jatkui 47 jäännöksen verran ja jota ei voitu keskeyttää kohdalla 47 olevan jäännöksen Ala jälkeen. Huippu 3 sekvenssoitiin ja 25 antoi saman sekvenssin kuin huippu 2. Huippujen 2 ja 3 SDS-geelit sekä huippujen 2 ja 3 Lysc-pilkonta osoittivat, että huippu 3 sisälsi myös C-terminaalisen CNBr-peptidin.

• Myöhempi geloniinin pilkonta trypsiinillä tuotti peptidin, joka yhdisti nämä kaksi CNBr-peptidisekvenssiä. Kun tämä 30 trypsiinin avulla saatu peptidi sekvenssoitiin, se antoi sekvenssin TSGANGMFSEAVELER. Huiput 4 ja 5 antoivat kummatkin N-terminaalisen sekvenssin GLDT.... Tätä käytettiin pilkkomiseen jonkin verran Lysc:n avulla, 1/8, jolloin saatiin peptidejä sen C-terminaalisesta päästä.

i5 112492

Esimerkki 5 CNBr:11a katkotun geloniinin entsymaattinen pilkon-ta

Kokonaisen proteiinin tai CNBr-fragmenttien näyt-5 teitä pilkottiin lysyyliendopeptidaasin (Wako Chemical Dallas, TX) avulla liuoksessa, jossa oli 0,1 % SDS, 100 mM Tris, pH 8,0, tai Staphylococcus aureus -proteaasin (Pierce) avulla 0,1 % SDS:ssa tai trypsiinin (Sigma) avulla 0,1 % Tween 20:ssä. Pilkontaseokset eroteltiin HPLCrn 10 avulla ja koottuja peptidejä sekvenssoitiin prototyyppi-sekvenssikäytön kaasufaasi-Edman-sekvenssointimenetelmien avulla.

Esimerkki 6

Geloniinin aminohapposekvenssi 15 Kaikkiaan 258 aminohappojäännöksen sekvenssejä saa tiin esimerkissä 3 saatujen CNBr-fragmenttien analyysin jälkeen. Kuvio 1 esittää geloniinin aminohapposekvenssin. Geloniini sisältää kaikkiaan noin 258 aminohappojäännöstä. DNA-sekvenssi johdettiin tästä aminohapposekvenssistä.

20 Degeneroitunut DNA-sekvenssi on esitettu kuviossa 2.

Kun keksintö on nyt kuvattu täydellisesti, on alan ammatti-ihmiselle ilmeisen selvää, että siihen voidaan tehdä monia vaihteluja ja muunnoksia poikkeamatta alla esitetyn mukaisesta keksinnön hengestä tai suojapiiristä.

16 112492

Sekvenssiluettelo 1) Yleisiä tietoja: i) patentinhakija: 5 Rosenblum, Michael

Kohr, William Jack Aggarwal, Bharat ii) keksinnön otsake: Kasvitoksiinin geloniini proteiini-rakenne 10 iii) sekvenssien lukumäärä: 2 iv) kirjeenvaihto-osoite: A) vastaanottaja: Fulbright & Jaworski Patent Department B) katu: 1301 McKinney #5100 C) kaupunki: Houston 15 D) valtio: Texas

E) maa: USA

F) postinumero: 77010 v) tietokoneella luettava muoto: A) välinetyyppi: levyke 20 B) tietokone: IBM PC -yhteensopiva

C) käyttöjärjestelmä: PC-DOS/MS-DOS

D) ohjelma: Patentin Release #1,0, versio #1,25 vi) nykyisen patenttihakemuksen tiedot: * A) patenttihakemuksen numero: 25 B) jättöpäivämäärä: C) luokitus: vii) aikaisemman patenttihakemuksen tiedot: • · A) patenttihakemuksen numero: US 07/567 220 B) jättöpäivämäärä: 14. elokuuta 1990 : 30 viii) asianajajaa koskevat tiedot: ; A) nimi: Launer, Charlene A.

B) rekisteröintinumero: 33 035 C) viittaus/luettelonumero: D-5195 PCT ix) tietoliikennetiedot: 35 A) puhelin: (713)651-3634 B) telekopio: (713)651-5246 17 110/100 I 1 c.1-, s £.

2) tiedot sekvenssistä SEQ ID N0:1: i) sekvenssin ominaisuudet: A) pituus: 774 emäsparia B) tyyppi: nukleiinihappo 5 C) säikeisyys: kaksisäikeinen D) topologia: tuntematon ii) molekyylityyppi: DNA (genomin) iii) hypoteettinen: kyllä vi) alkuperäinen lähde: 10 A) organismi: Gelonium multiforum D) kehitysvaihe: siemen F) kudostyyppi: pähkinä ix) erikoispiirre: A) nimi/tunnus: CDS 15 B) asema: 1..774 xi) sekvenssin kuvaus: SEQ ID N0:1: GGNYTNGAYA CNGTNWSNTT YVSNACNAAR GGNGCNACNT AYATHACNTA YGTNAAYTTY 60 YTNAAYGARY TNMGNGTNAA RYTNAARCCN GARGGNAAYW SNCAYGGNAT HCCNYTNYTN 120 MGNAARGGNG AYGAYCCNGG NAARTGYTTY GTNYTNGTNG CNYTNWSNAA YGAYAAYGGN 180 20 CARYTNGCNG ARATHGCNAT HGAYGTNACN WSNGTNTAYG TNGTNGGNTA YCARGTNMGN 240 AAYMGNVJSNT AYTTYTTYAA RGAYGCNCCN GAYGCNGCNT AYGARGGNYT NTTYAARAAY 300 ACNATHAARA AYCCNYTNYT NTTYGGNGGN AARACNHGNY TNCAYTTYGG NGGNWSNTAY 360 CCNWSNYTNG ARGGNGARAA RGCNTAYMGN GARACNACNG AYYTNGGNAT HGARCCNYTN A20 MGNATHGGNA THAARAARYT NGAYGARAAY GCNATHGAYA AYTAYAARCC NACNGARATH 480 GCNWSNWSNY TNYTNGTNGT NATHCARATG GTNWSNGARG CNGCNMGNTT YACNTTYATH 540 25 GARAAYCARA THMGNAAYAA YTTYCARCAR HGNATHHGNC CNGCNAAYAA YACNATHWSN 600 YTNGARAAYA ARTGGGGNAA RYTNWSNTTY CARATHMGNA CNWSNGGNGC NAAYGGNATG 660 TTYWSNGARG CNGTNGARYT NGARMGNGCN AAYGGNAARA ARTAYTAYGT NACNGCNGTN 720 GAYCARGTNA ARCCNAARAT HGCNYTNYTN AARTTYGTNG AYAARGAYCC NGAR 774 2) tiedot sekvenssistä SEQ ID NO:2: ; ; 30 i) sekvenssin ominaisuudet: A) pituus: 258 aminohappoa B) "tyyppi: aminohappo D) topologia: tuntematon ii) molekyylityyppi: proteiini 35 xi) sekvenssin kuvaus: SEQ ID NO:2:

18 λ η ο /1 O O

I I L H y L·

Gly Leu Asp Thr Val Ser Phe Ser Thr Lys Gly Ala Thr Tyr lie Thr 15 10 15 g Tyr Val Asn Phe Leu Asn Glu Leu Arg Val Lys Leu Lys Pro Glu Gly 20 25 30

Asn Ser His Gly lie Pro Leu Leu Arg Lys Gly Asp Asp Pro Gly Lys 35 AO 45

Cys Phe Val Leu Val Ala Leu Ser Asn Asp Asn Gly Gin Leu Ala Glu 50 55 60 10 He Ala lie Asp Val Thr Ser Val Tyr Val Val Gly Tyr Gin Val Arg 65 70 75 80

Asn Arg Ser Tyr Phe Phe Lys Asp Ala Pro Asp Ala Ala Tyr Glu Gly 85 90 95

Leu Phe Lys Asn Thr lie Lys Asn Pro Leu Leu Phe Gly Gly Lys Thr 100 105 110 15 Arg Leu His Phe Gly Gly Ser Tyr Pro Ser Leu Glu Gly Glu Lys Ala 115 120 125

Tyr Arg Glu Thr Thr Asp Leu Gly lie Glu Pro Leu Arg lie Gly lie 130 135 140

Lys Lys Leu Asp Glu Asn Ala lie Asp Asn Tyr Lys Pro Thr Glu lie 145 150 155 160 20 Ala Ser Ser Leu Leu Val Val lie Gin Met Val Ser Glu Ala Ala Arg 165 170 175

Phe Thr Phe Ile Glu Asn Gin He Arg Asn Asn Phe Gin Gin Arg He : : 180 185 190

Arg Pro Ala Asn Asn Thr lie Ser Leu Glu Asn Lys Trp Gly Lys Leu 195 200 205 25 Ser Phe Gin He Arg Thr Ser Gly Ala Asn Gly Met Phe Ser Glu Ala 210 215 220

Val Glu Leu Glu Arg Ala Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Val Thr Ala Val 225 230 235 240

Asp Gin Val Lys Pro Lys He Ala Leu Leu Lys Phe Val Asp Lys Asp 245 250 255 30 Pro Glu

Claims (1)

1. Λ Λ Γ, Λ η Γ; ΐ9 I Patenttivaatimus DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että sillä on kaava: 5 GGNYTNGAYA CNGTNWSNTT YWSNACNAAR GGNGCNACNT AYATHACNTA YGTNAAYTTY 60 YTNAAYGARY TNMGNGTNAA RYTNAARCCN GARGGNAAYW SNCAYGGNAT HCCNYTNYTN 120 AGRAARGGNG AYGAYCCNGG NAARTGYTTY GTNYTNGTNG CNYTNW S NAA YGAYAAYGGN 180 CARYTNGCNG ARATHGCNAT HGAYGTNACN WSNGTNTAYG TNGTNGGNTA YCARGTNMGN 240 10 AAYMGNWSNT AYTTYTTYAA RGAYGCNCCN GAYGCNGCNT AYGARGGNYT NTTYAARAAY 300 ACNATHAARA AYCCNYTNYT NTTYGGNGGN AARACNMGNY TNCAYTTYGG NGGNWSNTAY 3 60 CCNWSNYTNG ARGGNGARAA RGCNTAYMGN GARACNACNG AYYTNGGNAT HGARCCNYTN 420 MGNATHGGNA THAARAARYT NGAYGARAAY GCNATHGAYA AYTAYAARCC NACNGARATH 480 GCNWSNWSNY TNYTNGTNGT NATHCARATG GTNWSNGARG CNGCNMGNTT YACNTTYATH 540 15 GARAAYCARA THMGNAAYAA YTTYCARCAR MGNATHMGNC CNGCNAAYAA YACNATHWSN 600 YTNGARAAYA ARTGGGGNAA RYTNWSNTTY CARATHMGNA CNWSNGGNGC NAAYGGNATG 660 TTYWSNGARG CNGTNGARYT NGARMGNGCN AAYGGNAARA ARTAYTAYGT NACNGCNGTN 72 0 GAYCARGTNA ARCCNAARAT HGCNYTNYTN AARTTYGTNG AYAARGAYCC NGAR 774 20 jossa R = A tai G, Y = C tai T, M = A tai C, H = A, C tai T, N = mikä tahansa, S = C tai G ja W = A tai T, ja joka koodaa • proteiinia, jolla on aktiivisuus, joka estää solun proteiini- .·, : synteesiä, muttei sitoudu solun pinnan reseptoriin. • » • » > ♦ > 20 112492 DNA-sekvens, kännetecknadav att den har formeln: 5 GGNYTNGAYA CNGTNWSNTT YWSNACNAAR GGNGCNACNT AYATHACNTA YGTNAAYTTY 60 YTNAAYGARY TNMGNGTNAA RYTNAARCCN GARGGNAAYW SNCAYGGNAT HCCNYTNYTN 120 AGRAARGGNG AYGAYCCNGG NAARTGYTTY GTNYTNGTNG CNYTNWSNAA YGAYAAYGGN 180 CARYTNGCNG ARATHGCNAT HGAYGTNACN WSNGTNTAYG TNGTNGGNTA YCARGTNMGN 240 10 AAYMGNWSNT AYTTYTTYAA RGAYGCNCCN GAYGCNGCNT AYGARGGNYT NTTYAARAAY 300 ACNATHAARA AYCCNYTNYT NTTYGGNGGN AARACNMGNY TNCAYTTYGG NGGNWSNTAY 360 CCNWSNYTNG ARGGNGARAA RGCNTAYMGN GARACNACNG AYYTNGGNAT HGARCCNYTN 420 MGNATHGGNA THAARAARYT NGAYGARAAY GCNATHGAYA AYTAYAARCC NACNGARATH 480 GCNWSNWSNY TNYTNGTNGT NATHCARATG GTNWSNGARG CNGCNMGNTT YACNTTYATH 540 15 GARAAYCARA THMGNAAYAA YTTYCARCAR MGNATHMGNC CNGCNAAYAA YACNATHWSN 600 YTNGARAAYA ARTGGGGNAA RYTNWSNTTY CARATHMGNA CNWSNGGNGC NAAYGGNATG 660 TTYWSNGARG CNGTNGARYT NGARMGNGCN AAYGGNAARA ARTAYTAYGT NACNGCNGTN 720 GAYCARGTNA ARCCNAARAT HGCNYTNYTN AARTTYGTNG AYAARGAYCC NGAR 774 20 där R = A eller G, Y = C eller T, M = A eller C, H = A, C eller T, N = vilken som heist, S = C eller G och W = A el-ler T, och vilken kodar för ett protein, som har en akti-'· d vitet som hindrar cellens proteinsyntes men inte binds vid ·'· en receptor pä cellens yta.