PT98669B - Processo para a preparacao da estrutura proteica da toxina de gelonina vegetal - Google Patents

Description

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de os referidos agentes tóxicos podem exercer a sua potencial actividade citotoxica (Blattler et al.,' Biochemís try/24 (1985) 1517-1524; Frankel et al. J.' Biol. Res, Modif,, £(1985) 437-446; Reimann et al., J. Clin. Tnvest., 32(1988) 129-138; Schwartz e Vale, Endocrinology, 122(1988) 1695-1700; Scott et al,, J Natl. Câncer Inst., 79(1987) 1163—1172; Singh et al,, Biol. Chem., 264 (1989) 3089-3095; Srinivasan et al, , FEBS liOtters, 192 (1985) 113; Schwartz et al., Endocrinology 121(1987) 1454-1460. Os radicais tóxicos investigados com estes agentes de libertação englobam radionuclídeos (Ghose et al., Br. Med. J., £(1967) 90-96), fãrmacos citotoxicos vulgarmente utilizados na quimioterapia cancerosa (Thorp e Ross,' Immun. Rev., ££(1982) 119-157; Deweger et al., Immun, Rev., £2(1982) 29-45; Arnon e Sela, Immun, Rev., £2(1982) 5-27; Pimm et al., Câncer Immun. Immunotherap., 12(1982) 125-134; Rowland e Axton,' Câncer immun. Immunotherap., 19 (1985) 1-7) e proteínas derivadas de bactérias e de plantas, tais como a toxina diftêrica ou da ricina (Jansen et al,, Immun, Rev,,62 (1982) 185-216; Raso Immun, Rev., 62(1982) 93-117« Vitetta et al,, Immun, Rev., ££(1982) 159-183; Nelville e Youle immun. Rev., 62(1982) 47-73; Thorpe et al., Eur« J. Biochem., 116(1981) 447--454), Concebe-se uma molécula especifica substituindo a cadeia B não específica por um anticorpo ou uma hormona.

As toxinas das bactérias e das plantas, tais como a toxina diftêrica (TD), a toxina A de Pseudomonas aeruglnosa, abrina, ricina, viscobranco, modecina e a toxina da Shigela, são agentes citotoxicos potentes devido â sua capacidade de destruírem uma função celular crítica. Por exemplo, a TD e a ricina ini bem a síntese das proteínas celulares inactivando, respectivamen te, o prolongamento do factor 2 e inactivando 60 subunidades ri- -3 bossdmlcas (Bactéria! Toxins andCell Membranes, (Eds., Jelajaszewics e Wardstrom) Academic Press, 1978, p. 291). Estas toxinas sao extremamente potentes devido ao facto de serem enzimas e de ac— tuarem mais pela via catalítica do que pela via estequiométrica. As moléculas dessas toxinas são compostas por uma cadeia poli-peptídica enzimaticamente activa ou por um seu fragmento, vulgarmente designado por cadeia ou fragmento "A”, ligado a uma ou mais cadeias polipeptídicas ou seus fragmentos, designados vulgarmente por cadeias ou fragmentos. "B", que ligam a molécula â superfície da célula e que tornam possível â cadeia "A" atingir o seu local de acção, por exemplo, o citossol, e efectuar a sua função destrutiva, 0 acto de atingir o citossol designa-se por "internalizaçio", "intoxicação" ou "translocação,,. Estas toxinas, que são proteínas, pertencem a uma classe portadora de duas cadeias que se designam por cadeias A e B. A cadeia B possui a capacidade de se ligar a quase todas as células enquanto a cadeia A exibe a actividade citotõxica. Crê—se que a cadeia A se possa libertar periodicamente da cadeia B-frequentemente por re dução da ponte dissulfureto-no sentido de tornar funcional a cadeia A, Estas toxinas naturais não são, geralmente, selecti-vas para uma dada célula ou para um determinado tipo de tecido devido ao facto de as suas cadeias B reconhecerem e se ligarem a receptores que se encontram presentes em diversas células. A disponibilidade de uma molécula de toxina que não seja citotõxica para diversas células quando administrada individualmente e limitada. A utilização de determinadas moléculas de toxinas naturais de cadeia unica, que não se ligam aos recep tores da superfície celular e, por isso, não são internalizadas pelas células, proporciona moléculas toxicas que são relativa- -4- mente não toxicas para a maioria se nao para todas as células, quando administradas individualmente, Incluem—se nestas toxinas naturais, de cadeia unica, conhecidas até à data, a proteína an ti-viral da varíola (Ramakrishnan e Houston, Câncer Res,, 44 (1984) 201-208), saponina (Thorpe et al,, J, Natl, Câncer Tnst,, 75 (1985) 151-159) e a gelonina (Stirpe et al., J, Biol, Chem,, 255 (1980) 6947-6953), Estas proteínas não são toxicas para as células, na sua forma livre, mas podem inibir a síntese das pro teínas desde que consigam penetrar na célula, No entanto, a di£ ponibilidade destas toxinas de cadeia unica, numa forma substan cialmente pura ê limitada, devido ao facto de ser necessário pu rificã-las a partir de fontes vegetais nas quais existem em quan tidades relativamente pequenas e também devido ao facto de a pos sibilidade de a reprodutibilidade da concentração de toxina na planta depender das condições de desenvolvimento e de colheita da planta, A gelonina ê um polipiptido de cadeia unica, isolado a partir de sementes de uma planta, o Gelonium multiforum, que ρθ£ sui um peso molecular compreendido entre, aproximadamente, 28000 e 30 000 kd. A gelonina ê uma glicoproteína básica com um ponto iso elêctrico de cerca de 8,15 e que contém resíduos de manose e de glucosamina (Falasca et al., Biochem J,, 207 (1982) 505-509), Em contraste com outras toxinas vegetais e toxinas bacterianas, esta proteína não ê, por si sõ, toxica para as células mas, quando libertada nas células através de um veículo, danifica 60 subuni-dades ribossõmicas, Os dados biológicos in vivo e in vitro sugerem que a gelonina é equivalente ou superior a outras toxinas ve getais. Com efeito, os resultados de uma comparação de conjuga- dos de gelonina in vitro e' in vivo com outros conjugados de ca-deia A indicam que a gelonina possui uma potência semelhante, uma melhor selectividade, uma melhor localização do tumor e efei tos terapêuticos mais significativos (Sivan et al., Câncer Res., 47 (1987) 3169-3173)« No entanto, a disponibilidade de um fornecimento reprodutível e facilmente acessível de gelonina a partir de fontes naturais ê limitada. Alem disso, a purificação da gelo nina a partir de fontes vegetais, ê difícil e o rendimento muito baixo.

Demonstrou-se que a gelonina, por si só é abortiva nos ratos e intensifica a citotoxicidade celular dependente dos anti corpos (Yeung et al., Internatl. J. Peptide Protein Res., 31 (1988) 265-268).

Diversos investigadores utilizaram a gelonina como um agente citotôxico quimicamente acoplado a anticorpos monoclonais ou a ligandos dirigidos para pêptidos hormonais celulares. No en tanto, a modificação química da gelonina e dos radicais para bom bardeamento celular pode reduzir a eficácia do bombardeamento e o potencial citotôxico da própria gelonina. Além disso, as fontes naturais de gelonina estão sujeitas â variabilidade das condições de crescimento e de colheita das plantas o que pode afec-tar a actividade citotóxica da gelonina. A capacidade para produ zir uma toxina de gelonina de síntese, quimicamente ou utilizando a tecnologia recombinante, proporciona uma fonte de toxina plena e susceptível de ser reproduzida.

Sumário da Presente Invenção A presente invenção proporciona gelonina numa forma es sencialmente pura e que possui a sequência de aminoãcidos indica

da na Figura 1. A presente invenção proporciona também a sequên cia de ADN, para a gelonina, indicada na Figura 2, A utilização das sequências da presente invenção para produzir gelonina subs_ tancialmente pura em quantidades satisfatórias, de acordo com a tecnologia recombinante, proporciona quantidades abundantes de toxina que até agora não era possível obter-se a partir de fontes naturais.

Breve descrição das Figuras A Figura 1 mostra a sequência de aminoãcidos da gelonina. A Figura 2 indica o cADN que codifica a gelonina. A Figura 3 indica a homologia da sequência de aminoãcidos da gelonina com a sequência de tricosantina, cadeia A da ricina, precursor da aglutinina isolado a partir de sementes de rícino e da cadeia A da abrina. A Figura 4 representa o cromatograma de HPLC dos fraçj mentos CNBr. A Figura 5 representa o cromatograma de HPLC de; A) Lys-c; B) estafilococos protease? e c) produto da digestão da gelonina por hidroxilamina. A Figura 6 representa os diagramas de hidrofobicida-de da; A) gelonina, b) tricosantina, C) abrina, D) ricina e E) precursor da aglutinina.

Descrição Pormenorizada da Presente Invenção A designação "substancialmente pura", quando aplicada â proteína gelonina, da presente invenção, significa que o polipêptido esta essencialmente isento de outras proteínas vege -7- tais, que se encontram normalmente associadas a gelonina no seu estado natural e que apresenta respostas electroforêticas ou cromatogrãficas, curvas de eluição e actividade tóxica reprodutíveis. A designação "substancialmente pura” não pretende excluir, misturas artificiais ou de síntese da proteína gelonina com outros compostos.

Purificou-se a gelonina proveniente das sementes da planta Gelonium muitifórum, de acordo com técnicas conhecidas pelo especialista. Determinou-se a sequência de aminoâcidos utilizando uma modificação do método de degradação de Edman,

Colocaram-se as amostras de gelonina no compartimento de reacção de fase inversa e submeteram-se a degradação de Edman. Descobriu-se que a extremidade N da gelonina era heterogénea (1/2 das moléculas diferiam, aparentemente, das outras por possuírem menos um aminoãcido em extensão). Esta heterogeneidade tornou difícil efectuar a sequenciação muito mais do que 40 ciclos. Por este motivo, e tendo em vista determinar mais aminoâcidos na sequência, efectuou-se uma clivagem enzimã-tica,

Obtem-se geralmente a sequência interna das proteínas digerindo ou cortando a grande molécula de proteína em pequenos pedaços, com uma combinação de enzimas e de clivagens químicas. Quando se expôs a gelonina nativa a diversas digestões proteolíticas, decobriu-se que esta era incompletamente clivada. Descobriu-se também que este facto se devia, especialmente, â ponte dissulfureto existente na porção N-terminal da molécula, A ruptura desta ponte, por redução e alquilação com acido iodoacético, proporcionou um fragmento que era menos solú vel do que o material nativo ao pH necessário para digestão en zimãtica. A combinação da digestão de gelonina nativa com trip sina, lisina aminopeptidase (LYsc), protease estafilocõcica (V8) e quimiotripsina proporcionou peptidos que eram na sua grande maioria da porção C-terminal da molécula. Este facto indica que a porção N-terminal da molécula (por análise N-termi-nal de Asp-Ala-Pro no resíduo 70) não se tornava facilmente acessível por digestão enzimatica.

Clivou-se a gelonina com brometo de cianogénio em três grandes peptidos. Dissolveram-se alíquotas de proteínas (0,2 mg/ml) em acido fõrmico a 70%. Adicionou-se a solução um cristal de brometo de cianogénio e deixou-se prosseguir a reac ção durante pelo menos 18 horas. Diluiu-se então a solução com água e aplicou-se a uma pequena coluna de sequenciação. Apõs aplicação da amostra, utilizou-se um gradiente de 1 a 10% de n--propanol com 0,1% de TFA para eluir os fragmentos da proteína. Na Figura 4 mostra-se a curva de eluição. A digestão enzimãtica da totalidade da proteína ou dos fragmentos obtidos com CNBr proporcionaram peptidos que se sobrepunham. Efectuou-se a digestão enzimãtica com lisil endo-peptidase em 0,1% de SDS, Tris 100 mM a pH 8,0, Staphylococcus aureus protease em 0,1% de SDS ou tripsina em 0,1% de Tween 20. A gelonina contém um resíduo de cisteína na posição 49. A redução e a carboximetilação proporcionou uma proteína que se recuperava melhor por hplc de fase inversa e era mais sensível â digestão enzimãtica. Por este motivo, a maioria das digestões enzimãticas foram efectuadas em 0,1% de SDS ou em 0,1% de Tween,

Efectuou-se depois o alinhamento dos 160 resíduos C--terminais por combinação dos produtos de digestão com CNBr e de clivagens enzimãticas. Determinou-se a sequência que permanecia incógnita entre os resíduos 40 e 70 por meio de uma combinação de modificação química, da cisteína com o acido iodoacé tico e de solubilização da proteína alquilada com SDS. Em segui da, clivou-se a gelonina RCM alquilada com enzima Lysc em excesso, a 37°C, durante curtos períodos (1-5 horas). Na Figura 5A mostra-se a curva de eluição de hplc.

Este método proporcionou uma nova sequência que não tinha sido anteriormente observada. Esta nova sequência demonstrou a existência de uma combinação Asn-Gly. Esta combinação de aminoãcidos pode ser clivada, de acordo com um método químico em que se utiliza hidroxilamina,

Efectuou-se a clivagem com hidroxilamina adicionando 100 jjlg de gelonina a hidroxilamina recentemente preparada (2M) em Tris 0,2 M (pH 9,0) com NaCl, 2M, EDTA 1 mM e etanol a 10%. Após incubação durante 7 horas ã temperatura ambiente, aplicou--se a totalidade da mistura reaccional a uma coluna de sequen-ciação. Lavou-se, depois a coluna com 1% de TFA em agua e eluiu -se com um gradiente de acetonitrilo ou sequenciou-se directa-mente sob a forma de uma mistura. Esta clivagem química produziu um grande péptido hidrõfobo que continha uma sequência de aminoãcidos de aproximadamente 200 aminoãcidos que se encontrava conectada com Asp-Ala-Pro no resíduo 70. A curva de eluição apresenta-se na Figura 5C.

Determinou-se a porção restante mais pequena da sequência que e possível sobrepor entre os resíduos 40 e 50, por digestão da gelonina com Lysc em SDS, sem alquilação. Deste modo, efectua-se a digestão de grande parte da porção Oterminal do material. Em seguida, digeriu-se a mistura, novamente, com -10 quimiotripsina, Separaram-se, então, os produtos de digestão por HPLC, A analise sequencial do grande pêptido revelou uma sequência (SerThrLys) que começa aproximadamente 5 aminoãcidos contados a partir da extremidade N-terminal da molécula,, A uti lidade deste facto reside na remoção da porção, heterogénea da molécula o que permite uma maior sequenciação da molécula, A proteína gelonina ê constiuída por 258 aminoãcidos, cuja sequência se indica na Figura 1, Comparou-se a sequência de aminoãcidos da gelonina com outras sequências conhecidas e que se encontram disponíveis em bases de dados (Genbank, PIR, EMBL) para se determinar se a gelonina possuia quaisquer ãreas de homologia com outras proteínas, A comparação da sequência de aminoãcidos da gelonina com a de outras proteínas que pos-suiam uma sequência de aminoãcidos conhecida demonstrou que a sequência da gelonina ê unica, Detectou-se homologia entre determinadas porções da sequência da gelonina com porções de outras proteínas. Por exemplo, a gelonina apresenta uma homologia de 36,0% com a alfa-tricosantina de tricosantiona Kirilowi, 33,8% de homologia com a cadeia A da Abrina de "Liquorice Indiano", 35,2% de homologia com o precursor da aglutinina da se mente de rícino, 33,7% de homologia com a Ricina D, cadeia A da semente do Ricino e 27,3% de homologia com a proteína anti-viral (MAP) de Mirabilis jalapa.

Nas Figuras 3 e 4 apresenta-se um resumo do grau de homologia para estas e outras proteínas.

Os diagramas de hidrofobicidade indicados nas Figuras 6A-6E indicam a semelhança entre as regiões hidrõfobas da tri-cosantina, da Ricina e de outras proteínas inibidoras da acti-vidade ribossõmica,. Um diagrama da hidropatia da estrutura da -11 gelonlna indica uma região hidrõfoba nos resíduos 35-80. e 150--180. Nestas áreas existe, provavelmente, uma dobragem substan ciai da molécula. Também se observou um padrão semelhante de hidrofobicidade em outras toxinas (ver Figuras 6A-6E), o que pode sugerir que o centro de actividade enzimâtica pode encontrara-se nessas regiões de dobragem. Por este motivo e possível que nunca se encontre o sítio enzimâtico activo, numa região linear da molécula e que possa ser necessário dobrar-se adequa damente estas estruturas para se atingir o centro enzimâtico adequado.

Utilizando cADN de gelonina, pode produzir-se geloni_ na recombinante. Podem introduzir-se mutações, especificamente, na molécula com o objectivo de proporcionar gelonina recombinan te que não possua os grupos hidrato de carbono que podem desco-mandar os conjugados de gelonina-anticorpos. Podem produzir-se moléculas de gelonina recombinante por mutagênese comandada de um sítio, para conseguir uma actividade toxica superior â da mo lecula nativa, para ser mais eficazmente internalizada, uma vez ligada â superfície celular através de um veículo, tal como um anticorpo monoclonal ou um ligando de bombardeamento, tal como IL-2, EGF, IFN, etc., para resistir à degradação lisossõmica e, portanto, ser mais estável e actuar durante um intervalo de tem po superior, tal como um radical toxico.

Pode também, construir-se moléculas de gelonina recom binante, sob a forma de produtos de fusão, que contenham outras modalidades funcionais, para aniquilar células, tais como, acti vidade enzimâtica, actividade TNF e IFN, uma actividade toxica secundária, tal como a acção da toxina diftêrica (em que a refe rida actividade secundária se efectua através de um esquema bio -12- lôgico diferente do da gelonina), criando-se, assim, uma "super toxina" ou uma toxina com uma multifuncionalidade de acções,

Podem construir-se proteínas de fusão com gelonina, para transportar fârmacos, tais como agentes quimioterapêuticos ou isõtopos para visualização ou radioterapia, Os pêptidos de gelonina podem ser utilizados como agentes abortivos, agentes imunossupressores, agentes anticancerigenos e como agentes anti virais (como um agente anti-Ηΐν).

Os Exemplos que se seguem proporcionam uma descrição pormenorizada da preparação, caracterização, e sequenciação de aminoãcidos da gelonina. Os métodos experimentais utilizados encontram-se pormenorizadamente descritos nos Exemplos que se seguem. Os referidos Exemplos não deverão, de modo algum, limitar o âmbito da presente invenção.

Exemplo 1

Purificação e Caracteri z ação da Gelonina

Isolou-se a gelonina a partir das sementes da planta Gelonium multiforum, essencialmente de acordo com o procedimento descrito por Stirpe et al., JV Biol. Chem., 255 (1980) 6947— -6953. Resumidamente, extraiu-se a gelonina das sementes por ho mogeneização em solução salina tamporada (pH 7,4). Concentrou--se o sobrenadante após diãlise contra fosfato de sõdio 5 mM (pH 6,5) e purificou-se posteriormente a gelonina por cromato-grafia de permuta de iões, tal como se descreve adiante. Confir mou-se a pureza da toxina gelonina por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e por electroforese em dodecilsulfato de sõ dio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). A toxina gelonina migrou -13- \

X como uma banda única com um peso molecular aproximado de 29-30 000 dalton.

Mediu-se a actividade da toxina gelonina, tal como se descreve no Exemplo 2, por inibição da síntese das proteínas num sistema isento de células.

Descascaram-se as sementes de Gelonium multiforum e triturou-se o miolo num homogeneizador com 8 volumes de NaCl 0,14 M contendo fosfato de sódio 5 mM (pH 7,4). Deixou-se o homogeneizado durante a noite â temperatura de 4°C, depois agitou-se con-tinuamente, arrefeceu-se num banho de gelo e centrifugou-se a 35 000 x g, durante 20 minutos a 0°C. Removeu-se o sobrenadante, dializou-se contra fosfato de sódio 5 mM (pH 6,5) e concentrou-se utilizando um filtro pmlO. Aplicou-se a amostra, em camadas, numa coluna de resina de permuta iónica, CM-52 (20 x 1,5 cm) equilibra da com fosfato de sódio 5 mM (pH 6,5). Eluiu-se o material que se ligou â coluna de resina de permuta iónica com 400 ml de um gradiente linear de NaCl de 0 a 0,3M, com um caudal de 25 ml/hora, a o 4 C. Recolheram-se fracçoes de 5 ml. Observaram-se as fracçoes num espectrofotómetro a 280 nm. A gelonina eluiu aproximadamente nas fracçoes 55-70 e constituiu o último pico principal de elui-ção. Agregaram-se essas fracçoes, dializaram-se contra NaCl 0,1M em tampão Na2HPO^ 0,1M (pH 7,4). Aplicou-se, então, a amostra a uma coluna de sefarose azul de Cibacron (24 x 2 cm) previamente equilibrada com tampão ^2^0^ 0,1 M/NaCl 0,1 M. Lavou-se a coluna com 3 volumes de coluna de tampão e eluiu-se com 400 ml de um gradiente salino, linear (desde NaCl 0,1 M até NaCl 0,2 M). Obser vou-se a eluição do material ligado pelo ensaio de Lowry das frac çóes da coluna. Agregam-se as fracçoes que continham um único pico de proteína e dializaram-se durante a noite a 4°C contra PBS.

Purificou-se a toxina gelonina a um nível superior a 97%, conforme se calculou a partir de PAGE corado com prata. Verificou--se a pureza e o peso molecular de cada preparação, por cromato grafia líquida a alta pressão, utilizando uma coluna de permea-bilização em gel TSK 3000, com tampão de fosfato de sodio 50 mM, a pH 7,4 e por electroforese em 15% de dodecilsulfato de sõdio--gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) , A gelonina migrou como uma única banda com um peso molecular aproximado de 29-30 000 dal-ton.

Exemplo 2

Ensaio da Acttvidade da Gelonina

Verificou-se a actividade da gelonina num ensaio de inibição da síntese das proteínas na ausência de células. Efec-tuou-se o ensaio de inibição da síntese das proteínas na ausência de células, adicionando sequencialmente a 50 jxl de lisado reticulocítico de coelho, descongelado imediatamente antes de se utilizar, e misturando, apos cada adição, os seguintes compo nentes: 0,5 ml de Tris/HCl 0,2M (pH 7,8), 8,9 ml de etilenogli-col e 0,25 ml de HC1 1M; 20 microlitros de uma mistura energêti ca aminoãcida, salina (MEAS) constituída por: KC1 0,375 M,

Mg (CH2CO2) 2 roM/ glucose 15 raM, aminoãcidos 0,25-10 mM (ex cluindo a leuciha), ATP 5 mM, GTP 1 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), 10 Jil de fosfato de creatinina-creatininofosfoquinase, 8 jil de £ CJ leucina (Amersham, 348 mCi mmole) e adicionando 1,5 Jil de soluções contendo concentrações variáveis da mistura de gelo nina. Incubou-se a mistura durante 60 minutos a 30°C. Verificou ~ 14 * -se a incorporação de C-leucina numa aliquota da mistura, mediante precipitação da proteína sintetizada em filtros de fibra de vidro, lavagem com TCA a 10¾ e acetona e medição da radioac- tividade num contador Beta utilizando fluido de cintilação Aqua sol. Utilizando este ensaiO/ a gelonina purificada possuia uma 9 actividade específica de 4 x 10 -U/mg de proteína. Uma unidade de actividade de gelonina é a quantidade de gelonina que origi- „ „ 14 «» na uma inibição de 50% na incorporação de CJ leucina na proteína, no ensaio na ausência de células.

Exemplo 3

Determinação da Sequência de Aminoãcidos da Gelonina

Determinou-se a sequência de aminoãcidos da gelonina, de acordo com o método de degradação de Edman, utilizando um se quenciador automático de aminoãcidos, tal como o descrito no pe dido de patente de invenção europeia n? 257735. Aplicaram-se grandes pêptidos e proteínas não fragmentadas à parte de fase inversa da câmara de reacção do sequenciador. Lavaram-se os com ponentes tampão indesejáveis com ãgua em excesso. Sequenciou-se, então, a proteína ou a amostra de pêptido de acordo com o método químico de Edman e converteram-se os derivados aminoãcidos ATZ na forma PTH, com 25% de TFA em ãgua a 65°C. Identificaram--se as amostras de PTH por separação analítica de fase inversa numa coluna Np 1090.

Com o objectivo de obter mais elementos da sequência de aminoãcidos, efectuou-se a digestão da proteína com diversos agentes proteolíticos e químicos e, depois, purificaram-se os pêptidos por cromatografia líquida de alta resolução. Descobriu *-se que a gelonina era bastante resistente â exposição â tripsi na (cliva a seguir aos resíduos arginina e lisina) e â acetil-'•tripsina (cliva apenas depois do resíduo lisina) . Verificou-se

que a proteína era resistente a uma quantidade equivalente a 5% (p/p) da enzima, A resistência da gelonina â enzima proteo lítica tripsina não se deve â carência de sítios de clivagem para a tripsina, uma vez que a gelonina possui 21 resíduos de lisina e 12 resíduos de arginina. Estes resultados indicam que a gelonina e, possivelmente, uma molécula com uma configuração mais rígida, o que a torna inacessível às enzimas proteolíticas.

Uma vez verificado que a gelonina era resistente ã clivagem pelas enzimas proteolíticas, examinou-se a clivagem química das proteínas.

Exemplo 4

Clivagem da Gelonina por CNBr

Dissolveu-se a gelonina preparada, tal como se indicou no Exemplo 1, em ácido fõrmico a 70%. Adicionou-se â solução um cristal de brometo de cianogênio. Decorridas, pelo menos, 18 horas, aplicou-se a solução a uma pequena coluna (15 cm x 5 cm) de fase inversa (J.T. Baker; 15 cm, fase ligada C-1B CAT XI 7191-02) ou numa coluna analítica (4,6 x 100 mm) de fase inversa. Um gradiente de eluição de 1 a 70% de n-propanol em água, produziu 5 picos, tal como se indica na Figura 6. Efectuou-se a sequênciação de cada um dos picos, que se utilizaram novamente para digestão posterior com enzimas, de forma a juntar-se a sequência na sua totalidade. Sequenciou-se directamente o pico 1, que proporcionou a sequência com inicio em Phe (F) que continua va por 38 resíduos e terminava com Glu (E). Confirmou-se esta sequência por espectrometria de massa e por digestões com Lysc do referido péptido isolado. Sequenciou-se directamente o pico

2, o que proporcionou uma sequência com inicio em Vai (V) e que continuava por 47 resíduos próximos e não era susceptível de ser interrompida a seguir ao resíduo Ala na posição 47« Sequenciou--?se o pico 3, tendo-se obtido a mesma sequência obtida no pico 2. Geles SDS dos picos 2 e 3, assim como a digestão com Lysc dos pi cos 2 e 3 demonstraram que o pico 3 continha o pêptido CNBr C-«•terminal. A digestão subsequente com tripsina da gelonina origi nou um pêptido que fazia a conexão entre estas duas sequências peptídicas de CNBr, Este pêptido obtido por digestão com tripsina, quando sequenciado proporcionou a sequência TSGANGMFSEAVELER. Os picos 4 e 5 proporcionaram a sequência N-terminal GLDT.... Uti lizou-se esta sequência que se dirigiu com Lysc, 1/8, para se obterem pêptidos da sua extremidade C-terminal.

Exemplo 5

Digestão Enzimãtica de Gelonina Clivada por CNBr

Digeriram-se amostras de toda a proteína ou fragmentos obtidos com CNBr, com Lisil-endopeptidase (Wako Chemical Dallas, TX) em 0,1% de SDS, Tris 100 mM, a pH 8,0, ou com protease de Staphylococcus aureus (Pierce) em 0,1% de SDS ou Tripsina (Sigma) em 0,1% de Tween 20, Separaram-se as misturas de digestão por HPLC e recolheram-se os pêptidos que se sequenciaram na sequência protótipo, utilizando métodos de sequenciação de Edman, em fase gasosa.

Exemplo 6

Sequência de Aminoãcidos da Gelonina

Obtiveram-se sequências que possuiam, na sua totalida- -18 de, 258 resíduos aminoãcidos, por analise dos fragmentos obtidos com CNBr, no Exemplo 3, Na Figura 1 indica-se a sequência de aminoacidos da gelonina, A gelonina contêm, na sua totalida de, aproximadamente 258 resíduos aminoacidos* A sequência de ADN foi deduzida a partir desta sequência de aminoacidos* Na Figura 2 indica-se a sequência de ADN degenerada.

Apôs a descrição completa da presente invenção serã evidente para o especialista que se podem fazer modificações e alterações â referida invenção sem afastamento ao espírito e âmbito da mesma, tal como se define nas reivindicações. -19-

REIVINDICAÇÕES 1.- Processo para a preparação de toxina de geloni- de aminoácidos: na praticamente pura que possui a sequência

Gly Leu ãjêo Thr Vai Ser Pha Ser Thr Lya Gly Ala Thr Tyr Ile Eur 1*5 10 15

Tyr Vai Aen ?he Lau Aen Glu Lau Arg Vai Lya Leu. Lya Pm Gin. Gly 20 25 30

Aen Ser Sis Gly Ile ?re Leu. Leu Ser Lys Gly Asp Amo Pm Gly Lya 35 AO 45*

Cya Pie Vai Leu Vai Ale Leu Ser Aan Aep. Aan Gly Gin Leu Ale Glu 50 55 60

Ile Ale Ile Aap Vai Thr Ser 7el Tyr 7al Vai Gly Tyr Gin VaX Arg 65 70 75 80

Aea Arg Ser Tyr ?he ?he Lya Aap Ale ?ro Aap Ale Ale Tyr'Glu Gly 85 90 95

Leu Pha Lya Aau Thr Ile Lya Ata Pm Leu Leu ?ha Gly Gly Lya Thr 100 105 110

Arg Leu Hia PLa Gly Gly Ser Tyr ?ro Ser Leu Glu Gly Glu Lya Ale 115 120 125

Tyr Arg Glu Thr Thr Aap Lau Gly Ile- Glu ?ra Leu Arg Ile Gly Ile L30 * 135 140

Lya Lya Leu Aep Glu Aea Ale Ile Aep Aen Tyr Lya Prs Thr Gin Ile 145 150 125 -ISO

Ale Ser Ser Leu Leu Vai Vai Ile Gin Mec Vai Ser Gin Ale Ale Arg 155 170 175

Pha Thr Pha Ue Gin Aen Gin Ile Arg Aen Aas Pha Gin Gin Arg Ile ISO 1S5 190

Arg Pro Ala Aan Aen Thr Ile Ser Leu Glu Aaa Lya Trp Gly Lya Lau 195 200 · 205

Ser Pie Gin Ile Arg Thr Ser. Gly Ale Aau Gly Her ?h* Ser Gin Ala 210 215 ·——«220

Vai Glu Leu Glu Arg Ale Aen Gly Lya Lya Tyr Tyr Vai Thr Ale 7al 225 230 235 240 Aαν Gin Vai Lya Pm Lya Ile Ale Leu Leu Lya Pha Vai Aep Lya Aep 245 250 255

Pm Glu

Claims (2)

1. e dos seus fragmentos e derivados, codificando os referidos fragmentos e derivados a gelonina ou um polipeptido que ρο£ sui urna actividade que inibe a síntese de proteína celular mas não se liga a um receptor da superfície celular, carac-terizado pelo facto de se purificar gelonina proveniente de sementes da planta Gelonium multiforum e de se determinar de pois a sequência de aminoácidos da gelonina.
2. 2.- Processo para a preparação de sequências de ALN da toxina de gelonina vegetal, tendo as referidas sequências a fórmula geral GGHITHGAZÀ CHCTHffSSIT 7K5HACHAAS. GGHGCHACST ΑΤΑΤΗλΟΠΑ. ΤσΤΉΑΔΖΤΤΓ 60 TTgAAYCAS? THHGHGIBÂA RIXHàASCCH G&EGGHàAIff SHCAJGGSAX HCCTYTSITH 120 WSH4A2GGHG AICAICCHGG HAAJIGTTTT GTHYTHCTHG CSTISwSHAA TCATAATGCH ISO CAJSmiCCHG ÍSA3HGC5&Z' HCAICTHACF WSHGimiG ISCIHCCHIl ICAXGXJttíGH 240 ÀàZHGHWSHT ΑΓΓΓΓΓΠΔΑ EGiZGCHCCH GA2GCSGCHX AIGASGGSIT SITTAARAAT 300 ACTAT?AAT?A AZCCHYTSYT HTTIGCTGGN AA2ACSHGST T5CAIT77GG SGGSffSHTàZ 360 CCSWSHTIHG A2GGHGARAA HGCSTA2HCT GARACHACSG A223HGGHAI HGARtiiHTilM 420 KSSAISGGHá. TffAABAARTf 5GA7GA2AAY GCTATKCATA ÀZTAYM2CC RACNGAIATE 4S0 GCSHSHffSHT THTrSCISGT HA2HCA2AIG GTSW5HCA2G CSGCSHGHTT TiCHTmTS 540 CA-gAATCA-RA TPMCTAATAA YTT2CASLCA2. MCH4IS£C8C CHGGKAAZÀÀ TACSATggSW 600 ?TTfeAgAA?A aztggggxaa massarir ca-*atp»4cta cswshgctgc haascgsaig 66o TIZMSHGAEC CHCIBCSlRST NGARiíCTGCX AA2GGSÀARA. ARTAYTAYG7 HACHGCHGTH 720 774 GA2CAZGTHA ARCCHAARAT HGCXYI32T5 AA2THGTHG AYAARCAYCC SOAR. -21- em que: R * A ou G K s G ou I N =* qualquer Y = C ou T M * A ou C S = C ou G B = C, G, ou T V =* A, C, ou G W - A ou T D = A, G, ou T H = A, C, ou τ X =» desconhecido

   e dos seus fragmentos e derivados, codificando os referidos frag mentos e derivados a gelonina ou um polipeptido que possui uma actividade que inibe a síntese de proteína celular mas não se liga a um receptor da superfície celular, caracterizado pelo facto de se purificar proteína de gelonina, de se determinar a sequência de aminoácidos da referida gelonina e de se deduzir a sequência de ADN para a gelonina. φ Oficial 3a Proori<»Hgr?m inHin^n»!

   Lisboa, 25 de Março de 1992 -22- /V. RESUMO "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA PROTEICA DA TOXINA DE GELONINA VEGETAL" A presente invenção refere-se a uma sequência de aminoácidos e a um cADN que codifica a gelonina ou um polipeptido que possui uma actividade que inibe a síntese de proteína celular mas não se ligam a um receptor da superfície celular. Diz também respeito a um processo para a prepara-çao de gelonina praticamente pura, dos seus fragmentos tóxi cos, das sequências de ADN e de gelonina codificadora e à sua utilização para produzir por tecnologia recombinante da gelonina, os seus fragmentos tóxicos e proteínas de fusão. Proporciona-se também um processo para a preparação de sequên cias de ADN que codificam a gelonina e para a preparação de gelonina sintética e seus fragmentos. 0 processo é caracterizado pelo facto de se purificar gelonina proveniente de sementes da planta Gelonium multiforum e de se determinar depois a sequência de aminoáci^ dos da gelonina. © Agente Oficial da Prooriedads Industrial

   Lisboa, 25 de Março de 1992

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