NO309656B1 - DNA-sekvens kodende for gelonintoksin samt fremgangsmåte for fremstilling av vesentlig ren gelonintoksin eller fragmenter eller derivater derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av vesentlig ren gelonin.

En utfordring for konstruksjon av et medikament for behandling av en hvilken som helst sykdom er spesifisitet og effektivitet. Forskjellige medikamenter som er tilgjengelige for behandling av cancer har problemer med dette. Konseptet med å målsøke toksiske medikamenter selektivt til visse tumorer har vært av stor interesse i de senere årene (Thorpe

(1985) Biol. Clin. Application 84: 475-512; Moller Ed. (1982) Immun. Rev. 62: 1-215). I den senere tiden har både monoklonale og polyklonale antistoffer, lektiner, lymfokiner og hormoner som gjenkjenner spesifikke determinanter på overflaten av tumorcellen blitt anvendt som bærere for å levere toksiske midler inn i cellen, hvor de sistnevnte kan utøve deres cytotoksiske potentiale (Blatter, et al. (1985) Biochemistrv 24: 1517-152; Frankel, et al. (1985) J. Biol. Res. Modif. 4: 437-446; Reimann, et al. (1988) J. Clin. Invest. 82: 129-138; Schwartz og Vale (1988) Endocrinology 122: 1695-1700; Scott, et al. (1987) J Nati. Cancer Inst. 79: 1163-1172; Singh, et al. (1989) Biol. Chem. 264: 3089-3095; Srinivasan, et al. (1985) FEBS Letters 192: 113; Schwartz, et al. (1987) Endocrinology 121: 1454-1460). Toksiske deler som frem til nå er blitt undersøkt vedrørende disse 1everingsmiri-lene omfatter radionuklider (Ghose, et al. (1967) Br. Med. J. 1: 90-96), cytotoksiske medikamenter som vanligvis^ blir anvendt innen cancerkjemoterapi (Thorp og Ross (1962) Immun. Rev. 62. 119-157; Deweger, et al, (1982) Immun. Rev. 62: 29-45; Arnon og Sela (1982) Immun. Rev. 62: 5-27; Pimm, et al.

(1982) Cancer Immun. Immunotherap. 12: 125-134; Rowland og Axton (1984) Cancer Immun. Immunotherap. 19: 1-7) og proteiner avledet fra bakterier og planter så som difteri eller ricin (Jansen, et al. (1982) Immun. Rev. 62: 185-216; Raso (1982) Immun. Rev. 62: 93-117. Vitetta, et al. (1982) Immun. Rev. 62: 159-183; Nelville og Youle (1982) Immun. Rev. 62: 47-73; Thorpe, et al. (1981) Eur. J. Biochem. 116: 447-454). Et spesifikt molekyl er konstruert for å erstatte den uspesifikke B-kjeden med et antistoff eller et hormon.

Bakterielle toksiner og plantetoksiner, så som difteritoksin (DT), Pseudomonas aeuruginosa toksin A, abrin, ricin, mistletoe, modeccin og Shigella toksin, er potente cytocidale midler på grunn av deres evne til å ødelegge en kritisk cellulær funksjon. DT og ricin inhiberer den cellulære proteinsyntesen ved inaktivering av elongeringsfaktor-2 og inaktivering av ribosomale 60s subenheter ( Bacterial Toxins and Cell Membranes. Eds. Jelajaszewicz og Wadstrom (1978) Academic Press, s. 291). Disse toksinene er ekstremt potente på grunn av at de er enzymer og virker katalytisk i stedet for støkiometrisk. Molekylene til disse toksinene består av en enzymatisk aktiv polypeptidkjede eller fragment, vanligvis betegnet "A"-kjede eller fragment, koblet til en eller flere polypeptidkjeder eller fragmenter, vanligvis betegnet "B"-kjeder eller fragmenter, som binder molekylet til celleoverflaten og muliggjør at A-kjeden når virkningssetet, for eksempel cytosol og dermed utfører dets ødeleggende funksjon. Hendelsen som omfatter at adgang til cytosol oppnås, kalles "internalisering", "intoksikering" eller "translokasjon". Disse proteintoksinene hører til en klasse som bærer to kjeder, referert til som A- og B-kjedene. B-kjeden har evne til å bli bundet til nesten alle cellene, mens den cytotoksiske aktiviteten blir utvist av A-kjeden. Det antas at A-kjeden må bli frigjort fra B-kjeden ved rett tidspunkt og ofte ved reduksjon av disulfidbinding for å gjøre A-kjeden funksjonell. Disse naturlige toksinene er generelt ikke selektive for en gitt celle eller vevstype på grunn av at deres B-kjeder gjenkjenner og bindes til receptorer som er tilstede på forskjellige celler.

Tilgjengeligheten av et toksinmolekyl som ikke er toksisk for forskjellige celler når de blir administrert alene har vært begrensende. Anvendelse av visse naturlig forekommende enkeltkjedetoksinmolekyler som ikke i seg selv blir bundet til celleoverflatereceptorer, og som derfor ikke normalt blir internalisert av cellene, har gitt toksiske molekyler som er relativt ikke-toksiske overfor de fleste, om ikke alle, celler når de blir administrert alene. Slike naturlig forekommende enkeltkjedetoksiner som er kjent frem til nå, omfatter, men er ikke begrenset til, kermesbær antiviralt protein (Ramakrishnan og Houston (1984 ) Cancer Res. 44: 201-208), saponin (Thorpe, et al. (1985) J. Nati. Cancer Inst. 75: 151-159), og gelonin (Stirpe, et al. (1980) J. Biol. Chem. 255: 6947-6953). Disse proteinene er ikke-toksiske for celler i fri form, men kan inhibere proteinsyntesen når de får adgang inn i cellen. Tilgjengeligheten av disse enkeltkjedetoksinene i vesentlig ren form er derimot begrenset på grunn av det faktum at de må renses fra plantekildene hvor de er tilstede i relativt lave mengder og reproduserbarheten av konsentrasjonen av toksin i plantene er avhengig av betingelsene for plantevekst og plantehøsting.

Gelonin er et enkeltkjedepolypeptid isolert fra frøene til en plante, Gelonium multiforum. som har en molekylvekt på omtrent 28.000-30.000 kD. Gelonin er et basisk glykoprotein med et omtrentlig isoelektrisk punkt på 8,15 og inneholder mannose og glukosaminresidier (Falasca, et al. (1982) Biochem. J. 207: 505-509 ). I motsetning til andre plante-og bakterielle toksiner er dette proteinet ikke toksisk for cellene i seg selv, men når levert til celler gjennom en bærer, skades den 60s ribosomale subenhet. In vivo og in vitro biologiske data tyder på at gelonin er ekvivalent eller overlegen i forhold til andre plantetoksiner. Resultatene av en sammenligning av geloninkonjugater in vitro og in vivo med andre A-kjedekonjugater indikerer at gelonin har lignende potens, bedre selektivitet, bedre tumorlokalisering og mer signifikante terapeutiske virkninger (Sivan, et al (1987) Cancer Res. 47: 3169-3173). Tilgjengeligheten av en reproduserbar, lett tilgjengelig tilførsel av gelonin fra naturlige kilder er begrenset. Rensing av gelonin fra plantekiIder er i tillegg vanskelig og utbyttet er meget lavt.

Gelonin i seg selv er blitt vist å være abortfremkallende i mus og forsterker antistoffavhengig cellecytotoksisitet (Yeung, et al (1988) Internatl. J. Peptide Protein Res. 31: 265-268).

Flere forskere har anvendt gelonin som et cytotoksisk middel kjemisk koblet til monoklonale antistoffer eller til peptidhormoncellulære målsøkende ligander. Kjemisk modifikasjon av gelonin og cellulære målsøkende deler kan derimot redusere effektiv målsøking og det cytotoksiske potentialet til gelonin. Naturlige kilder av gelonin er videre utsatt for forskjeller i høsting og planteveksten som kan påvirke den cytotoksiske aktiviteten til gelonin. Evnen til å produsere et syntetisk gelonintoksin, kjemisk eller ved anvendelse av rekombinant teknologi, gir en stor og reproduserbar toksinkilde.

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av vesentlig ren gelonintoksin eller fragmenter eller derivater derav, hvor nevnte fragmenter og derivater representerer polypeptider som har en aktivitet som inhiberer cellulær proteinsyntese, men som ikke binder til en celleoverflatereseptor, hvor nevnte gelonintoksin har aminosyresekvensen:

kjennetegnet ved å dyrke en egnet vertscelle som er transformert med en egnet vektor som inneholder en DNA-sekvens som koder for nevnte aminosyresekvens i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsreguleringssekvenser som er istand til å dirigere ekspresjon av nevnte DNA-sekvens, hvoretter nevnte gelonintoksin blir isolert og renset.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også DNA-sekvens kjennetegnet ved at den koder for gelonintoksin med aminosyresekvensen som vist over.

Fig. 1 viser aminosyresekvensen til gelonin.

Fig. 2 demonstrerer cDNA kodende for gelonin.

Fig. 3 demonstrerer homologien mellom aminosyresekvensen til gelonin og sekvensen til trikosantin, ricin A-kjede, agglutininforløper isolert fra lakserbønne og abrin A-kjeden. Fig. 4 demonstrerer HPLC-profilen til CNBr-fragmentene. Fig. 5 demonstrerer HPLC-profilen til (A) Lys-c, (B)

Staphyloccus-protease og (C) hydroksylaminspaltinger av gelonin.

Fig. 6 demonstrerer hydrofobisitetsplottene til gelonin (A),

trikosantin (B), abrin (C), ricin (D) og agglutinin-forløperen (E).

Betegnelsen "vesentlig ren" når anvendt for geloninproteinet, betyr at polypeptidet er vesentlig fritt for andre plantepro-teiner som normalt er assosiert med gelonin i dets naturlige tilstand og som utviser reproduserbar elektroforetisk eller kromatografisk respons, elueringsprofiler og toksisk aktivitet. Betegnelsen "vesentlig ren" skal ikke ekskludere kunstige eller syntetiske blandinger av gelonproteinet med andre forbindelser.

Gelonin ble renset fra frøene til planten Gelonium multiforum ved teknikker som er kjent for fagfolk innenfor dette området. Aminosyresekvensen ble bestemt ved anvendelse av en modifikasjon av Edman-degraderingsmetoden.

Prøver av gelonin ble applisert i reversfasereaksjonskammeret og utsatt for Edman-degradering. N-terminalen til gelonin ble funnet å være heterogen (1/2 av molekylene til proteinet mangler tilsynelatende en aminosyre i forhold til de andre). Denne heterogenisiteten gjorde det vanskelig å sekvensere mer enn 40 cykluser. For derfor å bestemme ytterligere aminosyrer i sekvensen, ble det utført enzymatisk spalting.

De indre sekvensene til proteiner blir generelt oppnådd ved spalting eller oppkutting av det store proteinmolekylet til mindre biter med en kombinasjon av enzymer og kjemiske spaltinger. Når nativt gelonin ble eksponert for forskjellige proteolytiske enzymspaltinger, ble det funnet å bli ufullstendig spaltet. Dette ble funnet å være delvis forårsaket av en disulfidbinding i den N-terminale delen av molekylet. Brytning av denne bindingen ved reduksjon og alkylering med jodeddiksyre ga et fragment som var mindre oppløselig enn det native materialet ved pH nødvendig for enzymatisk spalting. En kombinasjon av spalting av nativt gelonin med trypsin, lysin aminopeptidase (Lyse), stafylokok-kal protease (V8) og kymotrypsin ga peptider som for det meste fra den C-terminale delen av molekylet. Dette indikerte at den N-terminale delen av molekylet (fra N-terminalanalyse til Asp-Ala-Pro ved residie 70) ikke var lett tilgjengelig for enzymatiske spaltinger.

Gelonin ble spaltet med cyanogenbromid til 3 store peptider. Proteinaliquoter (0,2 mg/ml) ble løst i 70$ maursyre. En krystall av cyanogenbromid ble tilsatt til oppløsningen og reaksjonenn ble fortsatt i minst 18 timer. Oppløsningen ble deretter fortynnet med vann og ble applisert på en liten sekvenseringskolonne. Etter applisering av prøve ble en gradient på 1 til 10% n-propanol med 0,1% TFA anvendt for å eluere proteinfragmentene. Elueringsprofilen er vist i fig.4.

Enzymatisk spalting av hele proteinet eller av CNBr-fragmen-tet ga overlappende peptider. Enzymatiske spaltinger med Lysyl-endopeptidase i 0,1% SDS lOOmM Tris pH 8,0, Staphylococcus Aureus protease i 0,1% SDS eller trypsin i 0,1% Tween 20 ble utført. Gelonin inneholder et cysteinresidie i posisjon 49. Reduksjon og karboksymetylering gir et protein som isoleres bedre på revers fase HPLC og mer mottagelig for enzymatisk spalting. De fleste enzymatiske spaltingene ble derfor utført i 0,1% SDS eller 0,1% Tween.

Etter C-terminalen ble 160 residier oppstilt ved en kombinasjon av CNBr-spaltinger og enzymatiske spaltinger. Den gjenværende ukjente sekvensen mellom residlene 40 til 70 ble bestemt ved en kombinasjon av kjemisk modifikasjon av cystein med jodeddiksyre og oppløsning av det alkylerte proteinet med SDS. RCM-alkylert gelonin ble deretter spaltet med overskudd Lysc-enzym ved 37°C for kortere tidsperioder (1-5 timer). HPLC-elueringsprofilen er vist i fig. 5A.

Denne metoden ga en ny sekvens som ikke var blitt oppdaget før. Denne nye sekvensen viste tilstedeværelse av Asn-Gly-kombinasjonen. Denne kombinasjonen av aminosyrer er spaltbar ved en kjemisk metode ved anvendelse av hydroksylamin.

Hydroksylaminspaltingen ble utført ved tilsetning av 100 >jg gelonin til friskt preparert hydroksylamin (2M) i 0,2 M Tris (pH 9,0) med 2M NaCl, 1 mm EDTA og 10% etanol. Etter inkubasjon i 7 timer ved romtemperatur ble hele reaksjons-blandingen applisert på en sekvenseringkolonne. Kolonnen ble deretter vasket med 1% TFA i vann og enten eluert med en acetonitrilgradient eller ble sekvensert direkte som en blanding. Denne kjemiske spaltingen produserte et stort hydrofobt peptid som inneholdt omtrent en 200 aminosyresekvens som var koblet med Asp-Ala-Pro ved residie 70. Elueringsprofilen er vist i fig. 5C.

Den gjenværende korte delen av den overlappende sekvensen fra mellom residiene 40 til 50 ble bestemt ved spalting av gelonin uten alkylering med Lyse i SDS. Dette spaltet det meste av C-terminaldelen av materialet. Deretter ble dette materialet spaltet på ny av kymotrypsin. Produktene av denne spaltingen ble deretter separert ved HPLC. Sekvensanalyse av et stort peptid viste en sekvens (SerThrLys) begynnende omtrent 5 aminosyrer fra N-terminalenden av molekylet. Dette var nyttig på grunn av at det fjernet den heterogene delen av molekylet og muliggjorde for et lengre sekvensløp.

Geloninprotein omfatter 258 aminosyrer og sekvensen er demonstrert i fig. 1. Aminosyresekvensen til gelonin ble sammenlignet med andre kjente sekvenser som er tilgjengelige i sekvensdatabanker (Genbank, PIR, EMBL) for å bestemme om gelonin har noen områder som er homologe med andre proteiner. Sammenligning av aminosyresekvensen til gelonin med andre proteiner som har kjente aminosyresekvenser demonstrerte at geloninsekvensen er unik. Homologi mellom visse deler av geloninsekvensen og deler av andre proteiner ble detektert. Gelonin demonstrerer blant annet en 36,0% homologi med alfatrikosantin fra Trichosanthin Kirilowi, 33,8% homologi med abrin A-kjeden fra Indian Licquorice, 35,2% homologi med agglutininforløperen fra lakserbønne, 33,7% homologi med ricin D, A-kjede fra lakserbønne og 27,3% homologi med antiviralt protein (MAP) fra Mirabilis jalapa. En oppsum-mering av homologigraden til disse og andre proteiner er vist i fig. 3 og 4.

Plott av hydrofobisiteten vist i fig. 6A-6E demonstrerer en likhet med de hydrofobe regionene til trikonsantin, ricin og andre ribosomale inhiberende proteiner.

Et plott av hydropatien til geloninstrukturen viser en hydrofob region i residiene 35-80 og 150-180. Dette er områder hvor den vesentlige foldingen av molekylet sannsyn-ligvis oppstår. Dette lignende hydrofobiske mønsteret er også observert for andre toksiner (se fig. 6A-6E) og kan tyde på at det aktive enzymatiske senteret kan være tilstede innenfor disse foldede regionene. Det aktive enzymatiske setet behøver ikke å være tilstede i en lineær region av molekylet, og disse strukturene kan behøve å bli tilstrekke-lig foldet for å oppnå det riktige enzymatiske senteret.

Ved anvendelse av cDNA til gelonin kan rekombinant gelonin bli dannet. Mutasjoner kan spesifikt bli innført inn i molekylet for å tilveiebringe rekombinant gelonin som mangler karbohydratgrupper som kan føre til gale gelonin-antistoff-konjugater. Rekombinante geloninmolekyler kan bli produsert ved seterettet mutagenese til større toksisk aktivitet enn det native molekylet for å bli mer effektivt internalisert når det først er bundet til celleoverflaten av en bærer så som et monoklonalt antistoff eller en målsøkende ligand så som 11- 2, EGF, EFN etc. for å motstå lysosomal degradering og derfor være mer stabil og lengervirkende som en toksisk del.

Rekombinante geloninmolekyler kan også bli omkonstruert som fusjonsprodukter for å inneholde andre funksjonelle modalite-ter for å drepe celler så som en enzymatisk aktivitet, TNF, IFN-aktivitet, en andre toksisk aktivitet, så som difteri-toksinvirkning (hvor nevnte andre aktivitet var gjennom en annen biologisk vei enn gelonin), for derved å danne et "supertoksin" eller et toksin med multifunksjonelle virkninger .

Fusjonsproteiner kan bli konstruert med gelonin slik at de bærer medikamenter så som kjemoterapeutiske midler eller isotoper for radiobilleddannelse eller radioterapi. Geloninpeptider kan anvendes som abortfremkallende midler, immunsuppressive midler, anticancermidler og som antivirale midler (så som et anti-HIV middel).

Følgende eksempler tilveiebringer en mer detaljert beskriv-else av fremstillingen, karakteriseringen og aminosyresekvensen til gelonin.

Eksempel 1

Rensing og karakterisering av gelonin

Gelonin ble isolert fra frøene til planten Gelonium multi-f orum ifølge fremgangsmåten som beskrevet (Stirpe, et al.

(1980) J. Biol. Chem 255 6947-6953). Gelonin ble ekstrahert fra frøene ved homogenisering i bufret saltvannsoppløsning (pH 7,4). Supernatanten ble konsentrert etter dialyse med 5 mM natriumfosfat (pH 6,5) og gelonin ble ytterligere renset ved ionebyttekromatografi som beskrevet nedenfor. Renheten til gelonintoksin ble vurdert ved høytrykks væskekromatografi (HPLC) og natriumdodecylsulfat-polyacylamin gelelektroforese

(SDS-Page). Gelonintoksin migrerer som et enkelt bånd med en omtrentlig molekylvekt 29-30.000 dalton.

Gelonintoksinaktivitet ble målt som beskrevet i eksempel 2 ved proteinsynteseinhibisjon i et cellefritt system.

Frø av Gelonium multiforum ble avskallet og nøttene malt i en homogenisator med åtte volum 0,14 M NaCl inneholdende 5 mM natriumfosfat (pH 7,4). Homogenatet fikk stå over natt ved 4°C med kontinuerlig omrøring, avkjølt på is og sentrifugert ved 35.000 x g i 20 minutter ved 0°C. Supernatanten ble fjernet, dialysert med 5 mM natriumfosfat (pH 6,5) og konsentrert ved anvendelse av et pmlO filter. Prøven ble applisert på en CM-52 ionebyttekolonne (20 x 1,5 cm) ekvilibrert med 5 mM natriumfosfat (pH 6,5). Materiale som ble bundet til ionebytteharpiksen ble eluert med 400 ml 0 til 0,3 M lineær NaCl-gradient ved en rate på 25 ml time ved 4°C. 5 ml fraksjoner ble oppsamlet. Fraksjonene ble registrert ved 280 nm i et spektrofotometer. Gelonin eluerte i fraksjonene 55-70 og var den siste hovedelueringstoppen. Disse fraksjonene ble slått sammen, dialysert med 0,1 M NaCl i 0,1M Na2HP04 buffer (pH 7,4). Prøven ble deretter applisert på en Cibacron blå sefarosekolonne (24 x 2 cm) på forhånd ekvilibrert med 0,1M Na2HP04/0,l M NaCl buffer. Kolonnen ble vasket med 3 kolonnevolum av bufferen og eluert med en 400 ml lineær saltgradient (fra 0,1M NaCl til 2 M NaCl). Eluering av det bundede materialet ble registrert ved Lowry-analysen av kolonnefraksjonene. Fraksjonene inneholdende den enkelte proteintoppen ble slått sammen og dialysert over natt ved 4°C mot PBS. Gelonintoksin ble renset til en høyere renhet enn 97% vurdert fra sølvfarget PAGE. Renheten og molekylvekten til hvert preparat ble undersøkt på høytrykks væskekromatografi ved anvendelse av en TSK 3000 gel permeas j onskolonne med 50 mM natriumf osf at-buffer, pH 7,4 og 15% natriumdodecylsulfat-polyakrylamid gelelektroforese (SDS-page). Gelonin migrerte som et enkelt bånd med en omtrentlig molekylvekt på 29-30.000 dalton.

Eksempel 2

Analyse av geloninaktivitet

Geloninaktiviteten ble registrert i en celle-fri proteinsyntese-inhibisjonsanalyse. Den celle-frie proteinsyntese-inhibisjonsanalysen ble utført ved fortløpende tilsetning til 50 pl kaninretikulocyttlysat, tinet øyeblikkelig før bruk, blandet etter hver tilsetning, følgende komponenter: 0,5 ml 0,2 M Tris HC1 (pH 7,8), 8,9 ml etylenglykol og 0,25 ml 1 M HC1 ). 20 mikroliter av en salt-aminosyre-energiblanding (SAEM) bestående av 0,375 M KC1 , 10 mM Mg(CH3C02)2, 15 mM glukose, 0,25-10 mM aminosyrer (bortsett fra leucin), 5 mM ATP, 1 mM GTP, 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 pl kreatinin fosfat-kreatinfosfokinase, 8 pl [<14>C] leucin (Amersham, 348 mCi mmol), og tilsetning av 1,5 pl oppløsninger inneholdende varierende konsentrasjoner av geloninblandingen. Blandingen ble inkubert i 60 minutter ved 30°C. <14>C-leucininkor-porering ble registrert i en aliquot av blandingen ved presipitering av syntetisert protein på glassfiberfiltre, vasking i 10% TCA og aceton, og registrering av radioaktivi-teten i en Beta-teller ved anvendelse av Aquasol-scintilla-sjonsvæske. Anvendelse av denne analysen hadde renset gelonin en spesifikk aktivitet på 4 X 10^ U/mg protein. En enhet geloninaktivitet er mengden av geloninprotein som forårsaker 50% inhibisjon av inkorporeringen av [<14>C] leucin inn i proteinet i den cellefrie analysen.

Eksempel 3

Bestemmelse av aminosyresekvensen til gelonin Aminosyresekvensen til gelonin ble bestemt ved Edman-degrader ingsmetoden ved anvendelse av en automatisert aminosyresekvenator som beskrevet i europeisk patentsøknad nr. EP-257735. Store peptider og ufragmentert protein ble applisert på reversfasedelen av sekvensreaksjonskammeret. Uønskede bufferkomponenter ble vasket bort med overskudd av vann. Protein eller peptidprøven ble deretter sekvensert ved Edman-kjemi og ekstraherte ATZ-aminosyrederivater ble overført til PTH-formen ved 25% TFA i H20 ved 65° C. PTH-prøvene ble identifisert ved reversfase analytisk separering på en Np 1090 kolonne.

For å oppnå ytterligere aminosyrekvens ble proteinet spaltet med forskjellige proteolytiske og kjemiske midler og deretter ble peptidene renset ved høy-ytelse væskekromatografi. Gelonin ble funnet å være meget resistent overfor utsetning for trypsin (spaltes etter arginin og lysinresidiene) og acetyltrypsin (spaltes bare etter lysinresidiet). Proteinet ble funnet å være resistent overfor 5% (v/v) enzym. Resistensen til gelonin overfor det proteolytiske enzymet trypsin er forårsaket av en mangel på trypsinspaltingsseter på grunn av at gelonin inneholder 21 lysin og 12 arginin-residier. Disse resultatene indikerer at gelonin kanskje er et fast pakket molekyl som ikke gjør det mottagelig for proteolytiske enzymer.

På grunn av at gelonin ble funnet å være resistent overfor spalting ved proteolytiske enzymer, ble kjemisk spalting av proteinet undersøkt.

Eksempel 4

CNBr spalting av gelonin

Gelonin preparert som i eksempel 1 ble løst opp i 70% maursyre. En krystall av cyanogenbromid ble tilsatt til oppløsningen. Etter minst 18 timer ble oppløsningen applisert til en liten kolonne (.15 cm 5 cm) revers fase (J.T. Baker; 15 cm C-1B bundet fase Cat II 7191-02) eller analytisk (4,6 x 100 mm) revers fasekolonne. En gradientelu-ering av 1 til 70% n propanol med 1% TFA i vann produserer 5 topper som vist på fig. 6. Hver av toppene ble sekvensert og også anvendt for ytterligere spalting av enzymene for å oppnå hele sekvensen. Topp 1 ble sekvensert direkte og ga en sekvens begynnende med en Phe (F) som forløp med 38 residier og slutte med en Glu (E). Denne sekvensen-ble bekreftet ved massespektroskopi og Lysc-spaltinger av dette isolerte peptidet. Topp 2 ble sekvensert direkte og ga en sekvens begynnende med en Val (V) som ble kjørt i 47 cy og ble ikke avbrutt etter Ala ved cy 47. Topp 3 ble sekvensert og ga samme sekvens som topp 2. SDS-gelene av toppene 2 og 3 samt Lysc-spal ting av toppene 2 og 3 viste at topp 3 også inneholdt det C-terminale CNBr-peptidet. Påfølgende trypsin-spalting av gelonin produserte et peptid som koblet disse to CNBr-peptidsekvensene. Dette trypsinpeptidet ga når det ble sekvensert sekvensen TSGANGMFSEAVELER. Topp 4 og 5 ga begge den N-terminale sekvensen GLDT .... Dette ble anvendt for en viss spalting av Lyse, 1/8, for å gi peptider fra dets C-terminale ende.

Eksempel 5

Enzymatisk spalting av CNBr- spaltet gelonin

Prøver av helt protein eller CNBr-fragmenter ble spaltet med Lysyl-endopeptidase (Wako Chemical Dallas, TX) i 0,1% SDS 100 mm Tris pH 8,9 eller Staphylococcus Aureus protease (Pierce) i .1% SDS eller trypsin (Sigma) i 0,1% Tween 20. Spaltings-blandinger ble separert ved HPLC og samlede peptider ble sekvensert på prototypesekvensen ved anvendelse av gass-fase Edman-sekvenseringsmetodehe.

Eksempel 6

Aminosyresekvensen til gelonin

Totalt 258 aminosyreresidiesekvenser ble oppnådd etter analyse av CNBr-fragmentene oppnådd i eksempel 3. Fig. 1 viser aminosyresekvensen til gelonin. Gelonin består av totalt omtrent 258 aminosyreresidier. DNA-sekvensen ble utledet fra denne aminosyresekvensen. Den degenererte DNA-sekvensen er vist i fig. 2.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av vesentlig ren gelonintoksin eller fragmenter eller derivater derav, hvor nevnte fragmenter og derivater representerer polypeptider som har en aktivitet som inhiberer cellulær proteinsyntese, men som ikke binder til en celleoverflatereseptor, hvor nevnte gelonintoksin har aminosyresekvensen: karakterisert ved å dyrke en egnet vertscelle som er transformert med en egnet vektor som inneholder en DNA-sekvens som koder for nevnte aminosyresekvens i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsreguleringssekvenser som er istand til å dirigere ekspresjon av nevnte DNA-sekvens, hvoretter nevnte gelonintoksin blir isolert og renset.

2 . DNA-sekvens, karakterisert ved at den koder for gelonintoksin med aminosyresekvensen som angitt i krav 1.