KR100220502B1 - 식물성 독소 겔로닌의 단백질 구조물 - Google Patents

식물성 독소 겔로닌의 단백질 구조물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 겔로닌을 암호화하거나 세포성 단백질 합성을 억제하지만 세포표면 수용체와는 결합하지 않는 활성을 지닌 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA 및 이에 대한 아미노산 서열에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]
식물성 독소 겔로닌의 단백질 구조물
[기술 분야]
본 발명은 실질적으로 정제된 겔로닌, 이의 독성 단편, 겔로닌을 암호화하는 DNA 서열 및 재조합 기술에 의해 겔로닌, 이의 독성 단편 및 융합 단백질을 제조하기 위한 DNA의 용도에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 겔로닌의 1차 아미노산 서열, 상기 겔로닌을 암호화하는 DNA의 1차 아미노산 서열 및 합성 겔로닌 및 이의 독성 단편의 제조 방법에 관한 것이다.
[배경기술]
특정 질환 치료용 약물을 고안하는 경우에 있어서, 주로 특이성과 효능에 대해 도전한다. 암 치료용으로 유용한 각종 약물도 이러한 특이성 및 효능이 문제가 된다. 특정 종양에 독성 약물을 선택적으로 표적시키고자 하는 구상은 지난 수년동안의 집중적인 연구 대상이 되어 왔다[참조: Thorpe(1985) Biol. Clin. Ap[plications 84: 475-512; Moller ed. (1982) lmmun. Rev. 62:1-215)]. 최근에 종양 세포의 표면상에서 특이적 결정 인자(determinant)를 인식하는 모노클로날과 폴리클로날 항체, 렉틴, 임파액 및 호르몬을 다체로서 사용하여 독성 약물을 세포에 전달해왔고, 이로써 세포는 이의 세포독성 잠재력을 나타낼 수 있다[참조: Blattler, et al. (1985) Biochemistry 24: 1517-1524; Frankel, et al. (1985) J. Biol. Res. Modif. 4: 437-446; Reimann, et al. (1988) J. Clin. Invest. 82: 129-138; Schwartz and Vale (1988) Endocrinology 122; 1695-1700; Scott, et al. (1987) J Natl. Cancer Inst. 79: 1163-1172; Singh, et al. (1988) Biol. Chem. 264: 3089-3095; Srinivasan, et al. (1985) FEBS Letters 192: 113; Schwartz et al. (1987) Endocrinology 121: 1454-1460]. 이들 전달제를 사용하여 조사된 독성 잔기에는 방사성 핵종[ 참조: Ghose, et al. (1967) Br. Med. J. 1: 90-96), 암 화학요법에서 통상적으로 사용된 세포독성 약물[참조 : Thorp and Ross(1982) Immun. Rev. 62: 119-157; Deweger, et al. (1982) Immun. Rev. 62: 29-45; Arnon and Sela (1982) Immun. Rev. 62: 5-27; Pimm, et al. (1982) Cancer Immun. Immunotherap. 12; 125-134; Rowland and Axton (1985) Cacer Immun. Immunotherap. 19: 1-7] 및 디프테리아 또는 리신과 같은 식물 및 세균으로부터 유도된 단백질[참조 : Jansen, et al. (1982) Immun. Rev. 62: 185-216; Raso(1982)Immun. Rev. 62: 93-117. Vitetta, et al. (1982) Immun. Rev. 62: 159-183; Nelville and Youle (1982) Immun. Rev. 62: 47-73; Thorpe, et al. (1981) Eur. J. Biochem. 116: 447-454]이 포함된다. 특이적 분자는 비특이적 B쇄를 항체 또는 호르몬으로 대체함으로써 고안된다.
디프테리아 독소(DT), 슈도모나스 아에루기노사(pseudomonas aeruginosa) 독소 A, 아브린, 리신, 미스틀레토, 모데신, 및 시겔라(Shigella) 독소와 같은 세균성 및 식물성 독소는 결정적인 세포 기능을 파괴하는 이의 능력에 기인한 효능있는 세포 사멸제이다. 예를 들어, DT 및 리신은 각각 인자-2의 신장의 불활성화 및 리보좀 60s 아단위의 불활성화에 의해 세포성 단백질 합성을 억제한다[참조 : Bacterial Toxins and Cell Membranes. Eds. Jelafaszewicz and Wadsfrom(1978) Academic Press, p. 291]. 이들 독소는 효소이며 화학량론적응로 보다는 촉매적으로 작용하므로 매우 효능이 있다. 이들 독소 분자는 통상적으로 "B"쇄 또는 단편으로 언급되는 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄 또는 단편에 결합된, 통상적으로 "A"쇄 또는 단편으로 언급되는 효소적으로 활성인 폴리펩타이드 쇄 또는 단편으로 이루어지며, 여기서 "B"쇄 또는 단편은 독소 분자를 세포 표면에 결합시키고 "A"쇄를, 예를 들어, 세포질과 같은 작용부위에 도달시켜 이의 파괴 작용을 수행할 수 있도록 한다. 세포질에 접근하는 작용은 다양하게 "내부이행(internalization)", "중독(intoxication)" 또는 "전위(translocation)"라 한다. 이들 단백질 독소는 A 및 B쇄로 언급된 2개의 쇄를 포함하는 부류에 속한다. B쇄는 거의 모든 세포에 결합하는 능력을 갖는 반면 세포독성 활성은 A쇄에 의해 나타난다. A쇄는 B쇄로부터 적합한 시기에 유리-종종 디설파이드 결합의 환원에 의해-되어야만 작용할 수 있는 것으로 생각된다. 이들 천연의 독소는 이미 B쇄가 여러 세포에 존재하는 수용체들을 인지하고 이들에 결합하므로 지정된 유형의 세포 또는 조직에 대해서는 일반적으로 선택적이지 않다.
단독으로 투여하는 경우 여러 세포에 대해 세포독성을 나타내지 않는 독소분자의 유용성은 제한되어 있다. 세포 표면 수용체에 결합하지 않으므로 세포에 의해 정상적으로 내부 이행되지 않는 천연의 특정 단일 쇄 독소 분자를 사용하면 단독으로 투여하는 경우 전부는 아니라도 대부분 세포에 대해 비교적 비-독성인 독소 분자가 제공된다. 오늘날까지 공지된 이러한 천연의 단일 쇄 독소에는 이로써 한정되지는 않지만, 아메리카 장녹(pokeweed) 항바이러스 단백질[참조 : Ramakrishnan and Houston(1984) Cancer Res. 44:210-208], 사포닌[참조 : Thorpe, et al. (1985) J. Natl. Cancer Inst. 75:151-159] 및 겔로닌[참조 : Stirpe, et al(1980) J. Biol. Chem. 225: 6947-6953]이 포함된다. 이들 단백질은 유리 형태의 세포에 대해서는 비독성이나, 이들이 일단 세포내에 들어가면 단백질 합성을 억제할 수 있다. 그러나, 비교적 소량으로 존재하여 식물성 원료로부터 정제되어야만 하고 식물중에서의 독소 농도의 재생성이 식물 생장 조건 및 식물 수확조건에 좌우된다는 사실에 비추어 볼 때, 실질적으로 순수한 형태의 이들 단일 쇄 독소의 유용성은 제한된다.
겔로닌은 분자량이 약 28,000-30,000kd인 식물, 겔로니움 멀티포룸(Gelonium multiforum)의 종자로부터 분리된 단일쇄 폴리펩타이드이다. 겔로닌은 등전점이 약 8.15인 염기성 당단백질이고 마노즈 및 글루코사민 잔기를 함유한다[참조 : Falasca, et al. (1982) Biochem J. 207:505-509]. 기타 식물 및 세균성 독소와는 대조적으로, 이 단백질은 자체로서는 세포에 대해 독성이지 않지만, 담체를 통해 세포로 전달되는 경우 60s 리보좀 아단위에 손상을 준다. 생체내 및 시험관내 생물학적 데이터는 겔로닌이 기타 식물성 독소에 대해 동등하거나 우월함을 제안하고 있다. 사실상, 생체내 및 시험관내에서 겔로닌 접합체와 기타 A쇄 접합체의 비교의 결과는 겔로닌이 유사한 효능, 우수한 선택성, 우수한 종양 위치 지정 및 더 중요한 치료 효과를 갖는다는 것을 지적해준다[참조 : Sivan, et al(1987) Cancer Res. 47:3169-3173]. 그러나, 천연 공급원으로부터의 재생 가능하고 용이하게 수득할 수 있는 공급물의 유용성은 제한된다. 또한, 식물성 원료로부터의 겔로닌의 정제는 어렵고 수율은 매우 낮다.
겔로닌은 마우스에서 낙태제이며 항체 의존성 세포의 세포독성을 증진시키는 것으로 나타났다[참조 : Yeung, et al (1988) Internatl. J. Peptide Protein Res 31: 265-268].
몇몇의 연구자들은 모노클로날 항체 또는 펩타이드 호르몬 세포내 표적화리간드에 화학적으로 결합된 겔로닌을 세포 독성제로서 사용하였다. 그러나, 겔로닌 및 세포내 표적화 잔기의 화학적 변형은 표적화 효율을 감소시키고 겔로닌 자체의 세포독성 잠재력을 감소시킬 수 있다. 또한, 겔로닌의 천연공급원은 수확 및 식물 생장시에 변화되기쉬우며, 이는 겔로닌 세포독성 활성에 영향을 끼칠 수 있다. 화학적으로 또는 재조합 기술을 이용하여 합성 겔로닌 독소를 제조하는 능력은 독소의 풍부하고 재생가능한 공급원을 제공한다.
[발명의 요약]
본 발명은 제1도에서 나타낸 아미노산 서열(서열 번호: 1)을 갖는 실질적으로 순순한 겔로닌을 제공한다. 본 발명은 또한 제2도에서 나타낸 겔로닌에 대한 DNA서열(서열 번호 : 2)을 제공한다.
실질적으로 순수한 겔로닌을 재조합 기술에 의해 풍부한 양으로 제조하기 위한 본 발명의 서열의 사용은 이전까지는 천연공급원으로부터 이용할 수 없었던 다량의 독소를 제공한다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 겔로닌의 아미노산 서열을 도시한다.
제2도는 겔로닌을 암호화하는 cDNA를 나타낸다.
제3도는 겔로닌 아미노산 서열과 트리코산틴, 리신 A쇄, 피마자로부터 분리한 아글루티닌 전구체 및 아브린 A쇄의 서열과의 상동성(homology)을 나타낸다.
제4도는 CNBr 단편의 HPLC 프로필을 도시한다.
제5도는 겔로닌의 (A) Lys-c, (B) 스타필로코커스 프로테아제 및 (C) 하이드록실아민 분해물의 HPCL 프로필을 도시한다.
제6도는 겔로닌(A), 트리코산틴(B), 아브린(C), 리신(D) 및 아글루티닌 전구체(E)의 소수성 플롯을 나타낸다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명의 겔로닌 단백질에 적용하는 용어 "실질적으로 순수한"은 폴리펩타이드가 천연상태에서 겔로닌과 정상적으로 결합되어 있는 기타의 식물성 단백질이 거의 없는 순수한 상태이며, 재생가능한 전기영동 및 크로마토그래피 반응, 용출프로필 및 독성 활성을 나타냄을 의미한다. 용어 "실질적으로 순수한"은 겔로닌 단백질과 기타 화합물과의 인공적인 또는 합성적인 혼합물을 배제하는 것은 아니다.
겔로닌은 식물 겔로니움 멀티포룸의 종자로부터 본 기술분야의 숙련가에게 종지된 기술로 전제된다. 이의 아미노산 서열은 에드만(Edmam) 분해법의 변형방법을 사용하여 결정한다.
겔로닌 샘플을 역상반응 채임버에 넣고 에드만 분해시킨다. 겔로닌의 N-말단은 이종성(단백질 분자의 1/2이 기타 분자보다 외관상 하나의 아미노산 만큼 짧다)임이 밝혀졌다. 이러한 이종성은 40 사이클 이상의 서열분석을 어렵게 만든다. 그러므로 추가의 아미노산 서열을 결정하기 위해 효소적 절단을 수행한다.
단백질의 내부 서열은 일반적으로 큰 단백질 분자를 효소와 화학적 절단을 병용해서 사용하여 보다 작은 조각으로 분해하거나 절단함으로써 얻어진다. 천연 겔로닌을 다양한 단백질 분해 효소 분해제에 노출시키면, 이 겔로닌은 불완전하게 절단됨이 밝혀졌다. 이는 부분적으로는 분자의 N-말단 부분에 있는 디설파이드 결합때문이라고 밝혀졌다. 환원 및 요오드아세트산을 사용한 알킬화에 의해 이 결합을 절단하면 효소적 분해를 위해 요구되는 pH에서 천연 물질보다 덜 가용성인 단편이 수득된다. 트립신, 리신 아미노펩티다아제(Lysc), 스타필로코커스 프로테아제(V8) 및 키모트립신과 천연 겔로닌의 분해물과의 배합물은 대부분 분자의 C-말단부분으로부터 기인하는 펩타이드를 생성시킨다. 이는 분자의 N-말단 부분(잔기 70에 있는 Asp-Ala-Pro에 대한 N-말단 분석으로부터)이 효소 분해에 의해 용이하게 접근할 수 없다는 것을 지시한다.
겔로닌을 시아노겐 브로마이드를 사용하여 3개의 큰 펩타이드로 절단한다. 단백질 부분표본(0.2/)을 70포름산 중에 용해시킨다. 시아노겐 브로마이드의 결정을 용액에 가하고 반응을 18시간 이상 동안 수행시킨다. 이어서 용액을 물로 희석하고 작은 서열분석 컬럼에 넣는다. 샘플을 가한 후, 0.1TFA와 함께 1내지 10n-프로판올의 구배를 사용하여 단백질 단편을 용출시킨다. 용출 프로필은 제4도에 도시되어 있다.
완전한 단백질 또는 CNBr 단편의 효소적 분해는 중첩 펩타이드를 생성시킨다. 0.1SDS 100mM 트리스(pH8)중의 리실 엔도펩티다아제, 0.1SDS중의 스타필로코커스 아우레우스 프로테아제 또는 0.1트윈(Tween) 20중의 트립신을 사용하여 효소 분해시킨다. 겔로닌은 위치 49에서 하나의 시스템인 잔기를 함유한다. 환원 및 카복시메틸화시키면 역산 HPLC 상에서 보다 우수하게 회수되고 보다 효소적 분해되기 쉬운 단백질이 생성된다. 그러므로, 대부분의 효소적 분해는 0.1SDS 또는 0.1트윈에서 수행한다.
C-말단 160 잔기를 CNBr 분해물과 효소적 절단물을 병용하여 정렬시킨 후, 잔류하는 잔기 40 내지 70의 알려지지 않은 서열을 요오도 아세트산을 사용한 시스테인의 화학적 변형방법과 SDS를 사용한 알킬화된 단백질의 가용화방법의 조합으로 결정한다. 이어서, RCM 알킬화된 겔로닌을 과량의 Lysc 효소를 사용하여 37에서 단시간(1내지 5시간) 동안 절단시킨다. HPLC 용출 프로필은 제5a도에 도시되어 있다.
이 방법으로 인해 이전에는 알려지지 않았던 새로운 서열이 밝혀졌다. 이 새로운 서열은 SAsn-Gly 배합물이 존재함을 보여준다. 이러한 아미노산의 배합물은 하이드록실아민을 사용한 화학적 방법에 의해 절단가능하다.
하이드록실아민 절단은 2M NaCl, 1mm EDTA 및 10에탄올을 함유하는 0.1M 트리스(pH 9.0) 중의 갓 제조한 하이드록실아민(2M)에 겔로닌 100㎍을 가함으로써 수행된다. 실온에서 7시간 동안 배양한 후, 전체 반응 혼합물을 서열분석 컬럼에 넣는다. 이어서, 컬럼을 수 종의 1TFA로 세척하고 아세토니트릴 구배로 용출시키거나 혼합물로서 직접 서열 분석한다. 이러한 화학적 절단으로 인해 잔기 70에서 Asp-Ala-Pro에 연결된 대략 200개의 아미노산 서열을 함유하는 큰 소수성 펩타이드가 생성된다. 용출 프로필은 제5c도에 도시되어 있다.
잔류하는 짧은 섹션의, 잔기 40 내지 50으로부터의 중첩 서열은 SDS에서 Lysc로 알킬화시키지 않고 겔로닌을 분해시킴으로써 결정한다. 이것은 물질의 C-말단부의 가장 떨어진 위치를 분해한다. 그다음에 이 혼합물을 키모트립신으로 다시 분해한다. 이 분해의 생성물을 HPLC로 분리한다. 큰 펩타이드의 서열 분석을 분자의 N 종결말단으로부터의 약 5번째 아미노산에서 출발하는 서열(Ser Thr Lys)을 나타낸다. 이것은 분자의 이종성 부분을 제거하고 더 긴 서열 분석을 수행하는데 있어서 유용하다.
겔로닌 단백질은 258개의 아미노산으로 이루어지며 이의 서열은 표 1에 기재되어 있다. 겔로닌의 아미노산 서열을 서열 데이터 뱅크(Genbank, PIR, EMBL)에서 구입가능한 기타 공지된 서열과 비교하여 겔로닌이 기타 단백질과 상동성 영역을 갖는지의 여부를 측정한다. 공지된 아미노산 서열을 갖는 기타 단백질과 겔로닌 아미노산 서열과의 비교는 겔로닌 서열이 독특함을 입증해준다. 기타 단백질의 부분에 대한 겔로닌 서열의 특정 부분의 상동성 여부를 검정한다. 예를 들어, 겔로닌은 트리코산틴 키릴로위(Trichosanthin kirilowi)로부터의 알파트리코산틴과는 36.0의 상동성을 나타내고, 인디안 리쿠오라이스(Indian Licquorice)로부터의 아브린 A쇄와는 33.8의 상동성을 나타내며, 피마자로부터의 아글루티닌 전구체와는 35.2의 상동성을 나타내며, 피마자로부터의 리신(Ricin) D, A쇄와는 33.7의 상동성을 나타내며, 미라빌리스 잘라파(Mirabilis jalapa)로부터의 항바이러스성 단백질(MAP)과는 27.3의 상동성을 나타낸다. 상기 및 기타 단백질에 대한 상동성 정도의 요약이 제3도 및 제4도에 나타나있다.
제6(a)도 내지 제6(e)도에 나타낸 소수성 플롯은 트리코산틴, 리신 및 기타 리보조말 억제 단백질의 소수성 영역에 대한 유사성을 입증해준다.
겔로닌 구조물의 수치법(hydropathy)에 대한 플롯은 잔기 35 내지 80 및 150 내지 180에서 소수성 영역을 보여준다. 이들은 분자의 실질적 폴딩(folding)이 나타나는 것으로 생각되는 영역이다. 또한 유사한 소수성 패턴이 기타 독소에 대해 관찰되어(제6a 내지 제6e도 참조) 활성 효소적 중심이 이들 폴딩된 영역내에 함유될 수 있음이 제안될 수 있다. 그러므로, 활성 효소적 부위는 분자의 직선 영역에서 발견될 수 없으며 이들 구조는 적당한 효소적 중심을 얻기 위해 적당하게 폴딩되어야 할 것이다.
겔로닌의 cDNA를 이용하여, 재조합 겔로닌이 생성될 수 있다. 겔로닌-항체접합체를 잘못 지시할 수 있는 탄수화물 그룹이 결핍된 재조합 겔로닌을 제조하기 위해 분자내로 돌연변이체가 특이적으로 도입될 수 있다. 천연분자 보다 더 큰 독성 활성을 가지며, 담체(예 : 모노클로날 항체) 또는 표적화 리간드(예 : IL-2, EGF, IFN등)에 의해 세포 표면에 일단 결합된 후 보다 더 효과적으로 내부이행될 수 있으며 라이소좀 분해에 대해 내성을 가지므로 독성 잔기로서 보다 더 안정하게 더 오랫동안 작용할 수 있는 재조합 겔로닌 분자가 부위 지시된 돌연변이 유발에 의해 생성될 수 있다.
또한, 재조합 겔로닌 분자는 세포를 죽이는 기타 작용성 양상, 예를 들어, 효소 활성, TFN, IFN 활성, 제2 독성 활성(예: 디프테리아 독성 작용) (여기서, 제2활성은 겔로닌 보다는 상이한 생물학적 경로를 통해 이루어진다)을 함유하는 융합 생성물로서 공학적으로 제조될 수 있으므로, "초독소(wupertoxin)" 또는 다작용성 특성을 갖는 독소가 창출된다.
융합 단백질은 화학요법 제제 또는 방사선 영상법 또는 방사선 요법을 위한 방사선 동위 원소와 같은 약물을 수반하기 위해 겔로닌과 함께 공학적으로 제조될 수 있다. 겔로닌 펩타이드는 낙태제, 면역억제제, 항암제 및 항바이러스제(예: 항-HIV제)로서 사용될 수 있다.
하기 실시예는 겔로닌의 제조, 특성화 및 아미노산 서열에 대해 상세한 설명을 제공한다. 이용된 실험적 방법은 하기 실시예에 상세히 기술되어 있다. 이들 실시예는 어떤 식으로든 본 발명을 제한하고자 의도된 것은 아니다.
[실시예 1]
겔로닌의 정제 및 특성화
겔로닌을 문헌[참조 : Stripe, et al. (1980) J. Biol. Chem 255: 6947-6953]에 기술된 방법에 따라 필수적으로 식물 겔로니움 멀티포룸의 종자로부터 분리한다. 요약하면 완충된 식염 용액(pH 7.4)중에서 종자를 균질화하여 종자로부터 겔로닌을 추출한다. 5mM 인산 나트륨(pH 6.5)에 대해 투석시킨 후 상층액을 농축시키고 추가로 하기에 기술되는 바와 같이 이온 교환 크로마토그래피로 정제한다. 겔로닌 독소의 순도는 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-Page)하여 평가한다. 겔로닌 독소는 분자량이 약 29,000 내지 30,000 달톤인 단일밴드로서 이동한다.
겔로닌 독소 활성은 세포-비함유 시스템에서의 단백질 합성 억제에 의해 실시예 2의 기술되는 바와 같이 측정한다.
겔로니움 멀티포룸의 종자를 껍질을 벗기고, 너트를 5mM 인산 나트륨(pH 7.4)을 함유하는 8배 용적의 0.14M NaCl과 함께 균질화기에서 분쇄시킨다. 균질물을 계속적으로 교반하면서 4에서 밤새 정치시키고 빙상에서 냉각시키고 20분 동안 0에서 35,000xg으로 원심분리한다. 상층액을 제거하고 5mM 인산나트륨(pH 6.5)에 대해 투석시키고 pm 10 필터를 이용하여 농축시킨다. 샘플을 5mM 인산나트륨(pH 6.5)으로 평형시킨 CM-52 이온-교환 컬럼(20x1.5cm)상에 부하한다. 이온 교환 수지에 결합된 물질을 400의 0 내지 0.3M 직선 NaCl 구배로 4에서 25m/시간의 속도로 용출시킨다. 5분획을 수집한다. 분획을 분광광도계로 280nm에서 모니터한다. 겔로닌을 약 55 내지 70번의 분획에서 용출되는데, 이들의 마지막 주요 용출 피이크를 나타내기 때문이다. 이들 분획들을 모아, 0.1M Na2HPO4완충액(pH 7.4)중 0.1M NaCl에 대해 투석시킨다. 그 다음에 샘플을 미리 0.1M/Na2HPO4/0.1M NaCl 완충액으로 평형시킨 시바크론 블루 세파로오즈(Cibacron blue spharose) 컬럼(24×2cm)에 적용시킨다. 컬럼을 컬럼의 3배 용적의 완충액으로 세척하고 400의 선형 영구배(0.1M NaCl로부터 2M NaCl까지)로 용출시킨다. 결합 물질의 용출은 컬럼 분획을 로우리(Lowery) 분석함으로써 모니터한다. 단일 단백질 피이크를 함유하는 분획들을 모으고 PBS에 대해 4에서 밤새 투석한다. 겔로닌 독소는 염색된 PAGE로부터 평가되는 바와 같이 97순도 이상으로 정제한다. 각 제조물의 순도 및 분자량을 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4)을 사용하여 TSK 3000겔 투과 컬럼을 이용하는 고압 액체 크로마토그래피 및 15나트륨 도데실설페이트-플리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-Page)으로 측정한다. 겔로닌은 분자량이 약 29,000 내지 30,000달톤인 단일 밴드로서 이동되었다.
[실시예 2]
겔로닌 활성의 분석
겔로닌 활성은 세포-비함유 단백질 합성 억제 분석에서 모니터한다. 세포-비함유 단백질 합성 억제 분석은 사용직전에 해동시킨 50㎕의 래비트 망상적혈구 용해물을 첨가하고, 순차적으로 0.2M 트리스 HCl 0.5(pH 7.8), 에틸렌 글리콜 8.9및 1M HCl 0.25을 각각 첨가한 후 혼합하여 수행한다.
20㎕의 염-아미노산-에너지 혼합물(SAEM)은 0.375M KCi, 10mM Mg(CH3CO2)2, 15mM 글루코오즈, 0.25-10mM 아미노산(루이신 제외), 5mM ATP, 1mM GTP, 50mM 트리스-HCl(pH 7.6), 10㎕크레아티닌 포스페이트-크레아티닌 포스포키나제, 8㎕[14C] 루이신(348mCi mmol; Amersham 제품)으로 구성되며 여기에 다양한 농도의 겔로닌 혼합물을 함유하는 용액 1.5㎕를 가한다. 혼합물을 30에서 60분 동안 배양한다.14C-루이신 혼입은 유리 섬유 필터상에 합성된 단백질을 침전시키고 10TCA 및 아세톤중에서 세척하고 아쿠아졸 신틸레이션 액(Aquasol scintillation fluid)을 사용하여 베타-카운터에서 방사성을 모니터함으로써 분취량의 혼합물로 모니터한다. 이 분석을 이용하여 정제된 겔로닌은 특이 활성이4×10/단백질이다. 겔로닌 활성의 단위는 세포-비함유 분석에서 [14C]루이신의 단백질로의 혼입이 50억제를 야기시키는 겔로닌 단백질의 양이다.
[실시예 3]
겔로닌 아미노산 서열의 결정
겔로닌 아미노산 서열은 문헌[참조: EP-257737]에 기술된 바와 같이 자동화 된 아미노산 서열분석기를 이용하여 에드만 분해 방법으로 결정한다. 큰 펩타이드 및 분획화되지 않은 단백질은 서열 반응 채임버의 역상 부분에 적용시킨다. 목적하지 않는 완충액 성분은 과량의 물로 세척하여 제거한다. 그 다음에 단백질 또는 펩타이드 샘플은 에드만 화학법에 의해 서열분석하고, 추출된 ATZ 아미노산 유도체는 H2O중 25TFA에 의해 65에서 PTH 형태로 전환시킨다. PTH 샘플은 Np 1090 컬럼 상에서 역상 분석적 분리에 의해 동정한다.
아미노산 서열을 추가로 수득하기 위해, 단백질을 다양한 단백질 분해제 및 화학제제로 분해한 다음 펩타이드로 고성능 액체 크로마토 그래피로 정제한다. 겔로닌은 트립신(아르기닌 및 리신 잔기 뒤에서 절단함) 및 아세틸 트립신(리신 잔기뒤에서 절단함)의 노출에 대해 상당한 내성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 단백질은 5(w/w) 정도의 효소에 대해 내성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 단백질 분해 효소 트립신에 대한 겔로닌의 내성은 겔로닌이 21번 리신과 12버너 아르기닌 잔기를 함유하기 때문에 트립신에 대한 겔로닌의 내성은 겔로닌이 21번 리신과 12번 아르기닌 잔기를 함유하기 때문에 트립신 절단 부위의 결핍으로 인한 것이 아님을 알 수 있다. 이 결과는 겔로닌이 단백질 분해 효소가 접근할 수 없도록 견고하게 패킹된 분자라는 것을 지적해준다.
겔로닌이 단백질 분해 효소에 의한 절단에 대해 내성을 나타내기 때문에 단백질의 화학적 절단만이 연구된다.
[실시예 4]
겔로닌의 CNBr 절단
실시예 1에서와 같이 제조된 겔로닌을 70포름산에 용해시킨다. 시아노겐 브로마이드 결정을 용액에 첨가한다. 18시간 이상후에, 용액을 작은 컬럼(0.15cm×5cm) 역상[참조 : J.T.Baker : 15cm-C-1B 결합된 상 Cat II 7191-02] 또는 분석적(4.6x100mm) 역상 칼럼에 적용시킨다. 수중 1TFA를 사용한 1내지 70n-프로판올의 구배 용출은 제6도에서 나타나는 바와 같이 5개의 피이크를 생성한다. 각각의 피이크를 서열 분석하고 또한 전체 서열과 함께 조각으로서 효소에 의한 추가의 분해를 위해 사용한다. 피크 1을 직접적으로 서열분석하여 38개 잔기로 이어지는 Phe(F)에서 출발하여 Glu(E)로 종결되는 서열을 수득한다. 이 서열은 상기 분리된 펩타이드의 질량 분광학 및 Lysc 분해에 의해 확인한다. 피크 2를 직접적으로 서열 분석하여 47번 cy로 이어지는 Val(V)에서 출발하는 서열을 수득하며 이것은 cy 47에서 Ala 후에 중단없이 계속 이어진다. 피크 3을 서열 분석하여 피크 2와 동일한 서열을 수득한다. 피크 2 및 피크 3의 SDS 겔 및 피크 2 및 3의 Lysc 분해는 피크 3이 C-말단 CNBr 펩타이드를 또한 함유함을 보여준다. 겔로닌의 후속의 트립신 분해는 이들 두 개의 CNBr 펩타이드 서열 TSGANGMFSEAVELER을 제공한다. 피크 4 및 5는 둘다 N- 말단 서열 GLDT...를 제공한다. 이것은 C-종결 말단으로부터의 펩타이드를 수득하기 위한 Lysc , 1,8에 의한 특정 분해를 위해 사용한다.
[실시예 5]
CNBr 절단된 겔로닌의 효소적 분해
완전한 단백질 또는 CNBr 단편의 샘플을 0.1SDS 100mm 트리스(pH 8.0) 중 리실 엔도펩티다아제(덱사스 소재의 Wako Chemical Dallas 제품) 또는 0.1SDS 중 스타필로코커스 아우레우스 프로테아제(Pierce 제품) 또는 0.1트윈 20중 트립신(Sigma 제품)을 사용하여 분해한다. 분해 화합물을 HPLC로 분리한다. 수집된 펩타이드를 기체상 에드만 서열분석 방법을 사용하여 프로토타입(prototype) 서열에 대해 서열 분석한다.
[실시예 6]
겔로닌의 아미노산 서열
총 258개 아미노산 잔기 서열을 실시예 3에서 기술된 CNBr 단편의 분석에 따라 수득한다. 제1도는 겔로닌의 아미노산 서열을 보여준다. 겔로닌은 총 약 258개의 아미노산 잔기를 함유한다. DNA 서열은 이 아미노산 서열로부터 연역한다. 퇴행성 DNA 서열은 제2도에 나타내었다.
본 발명에 대해 충분히 기술되었으나, 당해 기술분야의 숙련가에게는 본 발명의 요지 또는 범위로부터 벗어나지않고 많은 변화 및 변형이 있을수 있음이 명백할 것이다.
[서열 목록]
(1) 일반적인 정보:
(ⅰ) 출원인 : 마이클 로젠블룸, 윌리암 잭 코어, 브하라트 약가활
(ⅱ) 발명의 명칭 : 식물성 독소 겔로닌의 단백질 구조물
(ⅲ) 서열 수 : 2
(ⅳ) 서신 주소 :
(A) 주소 : 풀브라이트 앤드 야보르스키(Fulbright & Jaworski) 특허부
(B) 거리 : 맥키니 #5100 1301
(C) 도시 : 휴스톤
(D) 주 : 텍사스
(E) 국가 : 미합중국
(F) ZIP : 77010
(ⅴ) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 타입 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC(호환성)
(C) 운영체계 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트 웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #l.25
(ⅵ) 현재의 출원 데이터 :
(A) 출원 번호 :
(B) 출원일 :
(C) 분류 :
(ⅶ) 이전 출원 데이터 :
(A) 출원번호 : 미합중국 특허원 제07/567.220호
(B) 출원일 : 1990년 8월 14일
(ⅷ) 대리인/사 정보 :
(A) 이름 : 샤를렌 에이. 라우너
(B) 등록번호 : 33,035
(C) 참조/DOCKET 번호 : D-5195 PCT
(ⅸ) 통신정보 :
(A) 전화번호 : (713)651-3634
(B) 팩시밀리번호 : (713)651-5246
(2) 서열 동정 번호 1에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 774개 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄성 : 이본쇄
(D) 위상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자 타입 : DNA(게놈성)
(ⅲ) 가설 : 인정
(ⅵ) 최초 공급원
(A) 유기체 : 겔로니움 멀티포룸
(B) 발달 단계 : 종자
(F) 조직 타입 : 너트
(ⅸ) 특징 :
(A) 이름/KEY : CDS
(B) 위치 : 1..774
(ⅹi) 서열 기술 : 서열 동정번호 1:
(2) 서열 동정번호 2에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 258개 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 위상 : 알려지지 않음
(ii) 분자 타입 : 단백질
(xi) 서열기술 : 서열 동정 번호 2 :

Claims (2)

  1. 하기 아미노산 서열을 갖는, 실질적으로 순수한 겔로닌 독소.
  2. 하기 서열식의 DNA 서열.
    상기 식에서, R은 A 또는 G이고, K는 G 또는 T이고, N은 모두 염기이고, Y는 C 또는 T이고, M은 A 또는 C이고, S는 C 또는 G이고, B는 C, G 또는 T이고, V는 A, C 또는 G이고, W는 A 또는 T이고, D는 A, G 또는 T이고, H는 A, C 또는 T이고, X는 미지의 염기이다.
KR1019930700412A 1990-08-14 1991-08-14 식물성 독소 겔로닌의 단백질 구조물 KR100220502B1 (ko)

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