KR900006575B1 - 사독(蛇毒) 성장정지 펩티드, 및 그 수득 및 정제방법 - Google Patents

사독(蛇毒) 성장정지 펩티드, 및 그 수득 및 정제방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

사독(蛇毒) 성장정지 펩티드, 및 그 수득 및 정제방법
독성제에는 여러가지 용도가 발견될 수 있다. 특히 세포독소제가 특수하거나 특수균주 또는 세포형태에 따라 특수하게 변이묄 수 있다면 그 세포독소제는 다수의 상이한 형대의 세포를 포함하는 배양균 또는 조직으로부터 특수한 균주 또는 특수 세포형태를 제거하는데 그 용도를 발견할 수 있다. 예를들면 악성종양의 경우에 보통 또는 건강한 세포를 죽이지 않고 악성종양 세포를 특수하게 제거시킨 수 있는 방법이 요구되고 있다.
독소의 한가지 원천은 사독이다. 수많은 독소가 알려져 있다. 그러나 특수한 용도에 사용할 수 있는 독소의 성분을 증가시키는 부가적인 독소를 발견하는데 아직 흥미를 갖고 있다. 독소는 독소의 면역반응에 따라 변화할 수 있고, 기타 시약과 쉽게 결합하고, 독소의 작용위치 등에 따라서 변화할 수 있다. 사독으로부터 새로운 독소를 개발하기 위하여 용도분석, 다량추출, 정제, 순도 및 아디노산 서열을 설정하기 위한 분석이 요구되고 있다.
방울뱀의 여러가지 종류의 독소로부터 단리시킨 세포독소 펩티드에 대하여는 서열, 단리방법과 상세한 설명이 기술되어 있다. 미오톡신(Myotoxin)은 대초원 방울뱀의 독인크로탈루스(Crotalus)(Fox et al., Biochemistry(1979) 18 : 678-83)로부터 유도되며, 크로타민(Crotamine)은 남아메리카 방울뱀의 독인 크로탈루스 듀리슈스 테 리피쿠스(Crotalus durissus terrificus) (Lauree and Hoppe-Seyler. Physiol. Chem.(1975) 356 : 213-15)로부터 유도되고, 독성펩티드 C는 남태평양 방울뱀의 독인 크로탈루스 비리디스 헬레리(Crotalus Viridis helleri)(Maeda et al, Toxicon (1978) 16 : 431-41)로부터 유도된다.
신규의 세포독소 또는 세포성장정지 펩티드는 서부 마를모꼴 무늬 방울뱀의 독인 그로탈루스 아트록스(Crotalus atrox)로부터 단리된 펩티드와 관계가 있다. 특수 결합대, 예컨대, 배위자 및 습수체를 가진 이들 팹티드의 배합체는 세포의 혼합물로부터 세포를 선택척으로 제거하는데 사용될 수 있다.
세포독소제는 크로탈루스 아트록스의 독, 그 세포독소 동족체 및 보조결합대에 특수한 결합을 의한 특수배위자 및 습수체를 가진 팹티드와 세포독소제의 배합체로부터 단리된 약 6킬로탈튼(KD) 펩티드로 구성된다. 활성성분을 최소한 약 15개 이상의 아미노산을 가지며, 통상적으로 약 25개의 아미노산을 갖고 있으며, 특히 최소한 약 35개 이상의 아미노산을 갖고 있으며, 아미노산이 약 60개 이상을 초과하지 않으며, 통상적으로 아미노산이 약 50개 이상을 초과하지 않는다. 이들 활성성분은 후술되는 여러가지 종류의 기타 화합물과 결합할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 다음과 같은 일반식을 갖는다.
pp1QC1aa4aa5aa6GGaa9C2aa11aa12aa13aa14C3aa16aa17aa18aa19SDaa22GKaa25aa26C4aa28aa29aa30WKC5C6Kaa36aa38aa39pp2
상기 식에서, pp1은 N-단말기이며 수소, 단일아미노산, 특히 극성아미노산, 더 구체적으로 말하면 수산기치환 아미노산 또는 염기성 아미노산 또는 결합기, 변이기 또는 이와 유사한 여러가지 기능을 가진 2-20, 통상 2-10개의 아미노산을 가진 폴리펩티드가 될 수 있다.
pp2는 C-말단기 이며, 말단수산기, 단일아미노산, 특히 극성 아미노산, 더 구체적으로 말하면 아미노산을 함유하는 카르복시아미도 또는 pp1과 같은 기능을 가진 2-20, 통상 2-10개의 아미노산을 가진 폴리펩티드가 될 수 있다.
각개의 문자들은 다음에 나타낸 1개의 문자 아미노산 부호로서의 일반적인 의미를 갖는다.
아미노산이 5개까지, 통상 약 3개 이하인 것은 그 구성에서 제의되도록 결합제 역할을 한다.
시스테인 브리지가 존재한다면 C1과 C5, C2와 C4및 C3와 C6가 시스테인 브리지를 형성한다.
aa4는 지방산 또는 방향족 아미노산이며, 특히 D, E, H이다.
aa5는 지방족 극성 또는 염기성 아미노산, 특히 카르복시 아미도치환 또는 염기성인 것이며, N, Q, K, R이다.
aa6는 산성 또는 염기성인 지방족 아미노산으로 특히 D, E, K 또는 R로 표시된다.
aa9은 방향족 하전된 아미노산으로 특히 F, H, W, Y이다.
aa11은 지방족 하전된 아미노산으로 특히 염기성 아미노산이며, 특히 K, R이다.
aa12는 방향족 아미노산 또는 지방족 극성 또는 하전된 아미노산, 특히 산성 또는 중성인 것, 더 구체적으로 말하면 중성으로서 히드록시 치환된 것으로 F, H, W, Y, D, E, S, T 등이 있다.
aa13은 지방족 비극성 또는 하전된 아미노산, 특히 비극성 또는 염기성, 더 구체적으로 말하면 4-6개의 탄소 원자를 가진 것으로 L, I, V, K, R 등이 있다
aa14는 지방족 비극성 아미노산, 특히 4-6개의 탄소원자를 가진것 큭, L, I, V이다.
aa16는 4-6개의 탄소원자를 가진 지방족 비극성 아미노산, 특히 P, I, L, V이다.
aa17은 3-5개의 탄소원자를 가진 지방족 비극성 또는 극성아미노산, 특히 극성인때 히드록시 치환된 것으로서, 특히 S, T, A, P, V이다
aa18은 3-6, 통상 4-6개의 탄소원자를 가진 특히 하전시에 염기성인 지방족 하전된 또는 비극성 아미노산으로서, 특히 P, I, L, V, K, R 등이다.
aa19는 3-4개의 탄소원자를 가진, 특히 히드록시치환 지방족 극성아미노산으로서, 특히 S, T이다.
aa22는 지방족 비극성 또는 방향족 아미노산으로서 5-6개의 탄소원자를 가진 지방족인 경우에 특히 F, I, L, V 이다.
aa25는 3-6개의 탄소원자를 가진 지방족 중성아미노산, 특히 4-6개의 탄소원자를 가진 극성 또는 비극성인 것으로서, 극성인 경우에 유황원자를 가진 것, 특히 M, I, L, V이다.
aa26은 2-5, 통상 2-4개의 탄소원자를 가진 지방족 하전된 또는 비극성 아미노산, 극성인 경우에 특히 산성인, 특히 G, A, P, D, E이다.
aa28은 염기성 또는 산성인 4-6개의 탄소원자를 가진 지방족 하전된 아미노산, 특히 D, E, K, R이다.
aa29는 지방족 또는 방향족 아미노산으로서, 지방족의 경우는 3-5개의 탄소원자를 갖는 것이며 특히 A, P, V, F, H, W, Y 등이다.
aa30은 지방족 중성 비극성 또는 염기성 아미노산으로서, 중성 비극성인 경우에 4-6개, 통상 5-6개의 탄소원자를 가지며 특히 I, L, V, K, R 등이다.
aa36은 지방족 염기성 아미노산으로, 특히 K, R이다.
aa37은 지방족 또는 방향족 아미노산이며, 지방족인 경우에 2-3개의 탄소원자를 가지며, 특히 G, A, F, H, W, Y 이 다.
aa38은 2-4개의 탄소원자를 가진 지방족 중성. 극성 또는 비극성 아미노산으로서, 극성인 경우에 특히 히드록시로 치환되며, 특히 G, A, P, S, T이다.
aa39논 2-6개의 탄소원자를 가진, 특히 2-3개의 탄소원자를 가진 지방족 비극성 아미노산으로서, 특히G, A, P, I, L, V 이 다.
여러가지 아미노산군과 1문자 지정은 다음과 같이 표시한다.
지방족
중성
비극성 아미노산 G, A, P, V, I, L
극 성 아미노산 S, T, M, C, N, Q
하전된
산성 아미노산 D, E
염기성 아미노산 K, R
방향족 아미노산 F, H, W, Y
G-글리신 N-아스파라긴
A-알라닌 Q-글루타민
P-프롤린 D-아스파르트산
V-발린 E-글루타민산
I-이소로이신 K-리신
L-로이신 R-아르기닌
S-세린 F-페닐알라닌
T-트레오닌 H-히스티딘
M-메티오닌 W-트립토판
C-시스테인 Y-티로신
특히 흥미로운 것은 다음 일반식의 펩티드이다.
Figure kpo00001
Figure kpo00002
상기 식에서, 두개의 아미노산이 같은 위치에 표시될 때 그중의 하나는 바로 그 위치에 존재할 수 있다. 그러나 상기 선상에 있는 아미노산들은 같이 모이고, 선아래에 있는 아미노산끼리 같이 모이는 것이 바람직하다.
신중하게 치환시켜야만 된다는 사실을 이해하여야만 된다. 신중하게 치환시킴으로써 같은 선상에 있는 다음의 아미노산이 기타에 대한 아미노산과 치환될 수 있게 하기 위한 것이다.
G, A
V, I, L
D, E
K, R
S, T
F, H, W, Y
펩티드의 N-말단기는 차단 또는 비차단될 수 있으나, 일반적으로 지방산, 예컨대, 아세트산 또는 포름산을 포함한 차단 알킬화된다. 표제의 화합물들은 시험항목에서 설명된 실험방법에서 열 및 산에 안전한 것을 발견하였다.
특히 흥미로운 것은 적어도 약 90%, 바람직하게는 95%, 특히 바람직하게는 99% 순도를 가진 자연적으로 존재하는 성장정지 펩티드이다. 이것은 그 자체로서 또는 다른 독소와 혼합하여 사용할 수 있다.
표제의 세포독소 또는 성장억제 화합물들을 통상의 기술에 의하여 여러가지 광범위한 배위자 및 습수체와 결합시킬 수 있다. 결합에 이용된 관능기는 카르복실, 술포닐 및 포스포릴기와 같은 산기, 티올과 올레핀의 결합체, 디티오, 알데히드, 아조기, 디아조기 또는 이와 유사한 것들이다. 동시에 반응하는 2관능기 화합물이 사용될 수도 있지만 대부분 경우에 단계적으로 반응하는 2관능기의 화합물이 이용된다. 대표적인 시약은 글루타르알데히드, 포름알데히드, 파라-말레이미도벤조산, 메틸디티오아세트산, 디아조벤조산 또는 이와 유사한 것들이다. 독소성분을 특수한 결합대와 결합시키는데 사용되는 특수한 방법은 본 발명에만 국한되지 않는다.
특수한 결합대는 배위자 또는 습수체인데 이 특수 결합대는 특수목표물에 특수결합을 하게 한다. 예를들면, 세포는 보통 특수 세포형태의 특성을 가진 표면 항원 및 습수체를 갖는다. 그래서 독성제에 결합된 적당한 배위자 또는 습수체를 사용함으로써 독성제는 특수결합대를 가진 세포로 배향될 수 있다.
배위자로서 사용될 수 있는 여러가지 화합물은 스테로이드, 저비중의 리포프로테인, 성장인자, 비루스성단백질 등이 있다. 대비하기 위하여 천연습수체 또는 바람직하게는 면역글로불린 또는 이들의 일부분이 사용될 수 있으며 여기서 습수체는 특수표면 항원으로 배향된다. 유익한 면역 글로불린은 IgA, IgD, IgM, IgE 및 IgG인데, 바람직한 것은 아형중의 어느 하나를 포함한 IgG이다. 면역글로불린은 어떤 편리한 근원체, 특히 새앙쥐 또는 인체로부터 유도될 수 있다. 면역글로불린은 변형세포에서 비롯된 히브리도마스, 예컨대, EBV 변형 임파구 또는 재조합 DNA기술에 의해서 유도될 수 있다. 특히 생쥐의 변이대역은 더 낮은 항원성에 제공할 수 있는 개체변이 면역글로불린에 제공하기 위하여 인체 또는 기타 숙주의 일정대역에 결합될 수 있다. 이에 더하여 전체 면역글로불린이 사용될 필요는 없다. 그러나 Fab, F(ab')2, FV 또는이와 유사한 것과 같은 그 일부분을 사용할 수 있다.
배위자 및 독소는 독소와 목표시약을 세포중에 분리시킬 수 있도록 목표세포에 안전하거나 불안전한 결합대에 의하여 결합될 수 있다. 독소가 세포사이에서 작용할 수 있도록 엔도시토스(endocytosed)되는 것이 요구된다. 목적 독성제가 독소의 독성작용에 결정적인 영향을 끼치지 않는다면 절단될 수 있는 결합대가 필요없을 겻이다. 절단될 수 있는 결합대가 필요하다면 숙주 세포내에서 환원될 수 있는 이황화 결합을 이용하는 것이 편리하다.
배합물은 목적독소제, 특수결합대 및 독소간에 여러형태의 광범위한 비율로 구성될 수 있다. 통상적으로 단위목적 독성제에 대하여 최소한 1개의 독소가 있다. 그러나 목적독성제 0.5KD에 대하여 약 1개 이상의 독소가 존재하지 않는다. 통상적으로 목적독성제 100KD당 최소한 1개 이상의 독소분자가 존재하며, 목적독성제 50KD에 대하여 최소한 1개이상이 존재하는 것이 더 보편적이다. 목적독성제가 저분자량의 헵텐과 같이 작다면 단위독소에 대하여 2 또는 그 이상의 배위자가 존재할 수 있으며, 통상적으로 단위 독소당 약5개 이상의 배위자가 존재하지 않는다.
표제의 화합물은 생체내 또는 생체외에서 사용할 수 있다. 생체내의 용도에 있어서, 이들 화합물은 배양체 또는 조직내의 기타 세포로부터 분리시킬 수 있는 세포를 선택적으로 파괴하는데 사용할 수 있다. 표제의 화합물은 불필요한 세포를 파괴하는데 충분한 양을 매질에 첨가시킬 수 있다. 예를들면 특수한 조직적적합성 항원을 검출함에 있어서 특수한 조직적 적합성 항원에 대하여 특수한 항체를 함유하는 시약을 첨가시킬 수 있다. 죽은 세포에 의해서만이 흡수되는 염료를 첨가시킴으로써 세포내에 염료가 존재하게 되면 특수한 조직적 적합성 형태로 나타날 것이다. 목적 독소시약의 양은 광범위하게 변화할 수 있으며 생체의 사용시에 특수한 경우에 활용할 수 있다. 과다량의 목적 독소시약은 사용되지 않아야 되며, 너무 많이 사용하면 비특수 결합이 일어나며 부정적인 양성을 갖게되는 반면에 너무 적은양을 사용하면 결합수준이 낮기 때문에 쉽게 검출되지 않는 부정적인 음성을 나타낼 수 있다.
생체내에 사용하기 위하여 배합물을 비경구적 또는 주사, 특히 정액내에 투여할 수 있다. 사용될 배합물의 양은 죽이는 세포의 성질, 세포수량, 배합물에 대한 세포의 저항성, 배합물의 효력 등과 같은 것에 따라 광범위하게 변화한다. 특정 부위외에 투약시에 통상적으로 단백질의 양은 숙주체중 1Kg당 약 1μg-10mg범위내에서 변화되며, 통상적으로 2mg이내로 투여한다. 특수한 위치에 사용한다면 단백질의 양은 더 낮은 농도범위로 투여될 것이다. 배합물을 염산염 완충염수, 염수, 또는 기타 적합한 담체와 같이 생리학적으로 허용되는 매질내에 투여할 수 있다. 분말로서 배합물은 특수한 기관, 오랜기간동안 해이된 부위등에 그 조성물을 투여할 수 있는 기타 물질과 혼합할 수 있다. 단백질 조성물이 숙추에 투여될 수 있는 방법은 종래의 기술에서 완전히 예시되어 있으며 여기서 더 이상 설명하지 않을 것이다.
목적세포로서 특히 홍미로운 것은 암세포와 병원성 미생물이다. 광범위하게 발생하기 때문에 특히 흥미로운 것은 폐암, 결장 및 직장암 세포, 유방암, 자궁앙, 전립선암, 방광 및 신장암, 임파종, 백혈병 및 호지킨 병 등이다.
병원성 미생물을 예로들면 플라스모듐 비바스, 피.말레리에, 피.오발 및 피.팔시파륨과 같은 프로토조아, 슈도모나스, 클레브시엘라 및 나이세리아 등과 같은 그람 음성균, 그람양성균 등과 같은것이 있다.
[실험예]
(재료 및 방법)
크로탈루스 아트록스의 독으로부터 성장정지 펩티드의 정제
조제의 펩티드 화합물은 크로탈루스 아트록스로부터 독을 짜내어 동결건조시키기 전에 저속 원심분리시켜 정제하였다. 동결건조된 독을 1M 아세트산에 용해시켜(10mg/ml) 불용성 물질은 저속 원심분리법에 의하여 제거하였다.
최초 정제는 7.5ml의 시료를 1M 아세트산과 평행을 이룬 바이오-겔 칼럼에 적용시켜 유분을 수집한 다음(3.5ml) 분리시킬 수 있는 물질은 제거하여 동결 건조시킴으로써 성취된다. 분리시킬 수 있는 물질에 대하여는 먼저 A549 인체 폐암 세포배양에서 DNA합성의 억제를 위하여 시험하였다. 간단히 말해서 2×104A549 세포를 96-웰 플레이트(wE1l plate)내에 이식하여 부착시킨 후 그 세포를 적당한 칼럼유분으로 처리하였다. 5일후에 상기 웰을125I 데옥시 우리딘과 함께 율동시켜 DNA합성을125I 데옥시우리딘 혼합을 기초로한 조절 웰과 비교하여 측정하였다. 2개 주 억제피크가 나타났다. 6,000Mr인슐린 마크 가까이에서 용리되는 저분자량의 억제 작용을 가진 첫째 피크는 고압액체 크로마트그래피(HPLC)를 이용하여 더 정제하였다.
시료를 동결건조시켜 HPLC급 정제수(Water's Associates)중의 0.05% 트리플루오로아세트산(TFA)에 재현탁시켰다. 불용성 물질은 원심분리하여 제거하고 그 시료를 C18-노바팩 칼럼에 주입하였다. 이 샘플을 22℃서 1ml/min의 유속으로 0.05% TFA중의 20-60% 아세트니트릴로써 경사용리시켰다. 각 A214흡수펩티드를 별도로 모아서 분리가능물질은 DNA 합성의 억제를 위하여 시험하였다. 54% 아세트니트릴에 용리한 펩티드는 A549세포의 DNA 합성을 억제하였다. 기타 칼럼의 유분을 사용하였으나 아무런 억제 작용이 나타나지 않았다. 이러한 작용을 가진 SDS-PAGE는 만일 은-염색밴드를 나타냈다. 이 켈상에 펩티드가 균질하게 정제되었다고 추측되는 어떠한 다른 밴드도 관측되지 않았다.
억제된 세포형태학
억제된 세포는 "성장정지 펩티드"(GAP)로서 표시되는 펩티드로서 치리한지 24시간후에 현저한 형태학적변화를 나타냈다. 인체 종양세포와 비변이 섬유아세포가 약 100mg/ml의 펩티드 농도로 이 분석물내에서 억제되었다. 세포 후처리법은 계속되었고 대부분의 수지상 돌기는 사라졌다. 그런데 세포들은 아직까지 그판상에 부착되어 있었다. 이 효과는 세척한 세포와 같이 비가역적이며 10%혈청을 함유하는 새로운 매질과 함께 재공급하있으나 세포를 처음 표현형으로 재생시키지 않았다.
GAP의 화학구조
GAP의 아미노산 서열은 (a) 엔도프로테이나제 리신-C, (b) TPCK-트립신(L-(1-토실아미도-2-페닐)-에틸클로로메틸케톤), 및 스타필로코칼 아우레우스 V8과 환원 및 S-카르복시아미도베틸화된 GAP의 효소 분해물로부더 얻은 펩티드를 마이크로시퀀스 분석에 의하여 결정되었다. 펩티드부분은 휘발성 용매를 사용하여 역상 HPLC에 의하여 정제하였다. 아미노 말단기 차만 펩티드를 환경온도에서 16시간 동안 12NHCl중에 넣어두었다. 그후 이 시료를 동결건조시켰다. 펩티드는 470A형 가스상 단백질서열기(Applied Biosystem, Inc.)에서 자동화 에드만 분해를 실시하였다. 페닐티오히단티온 아미노산을 rpHPLC에 의하여 분석하였다.
GAP의 아미노산 서열은 다음과 같다.
Figure kpo00003
구조는 마이크로시퀀스 분석에 의하여 결정되었다. GAP는 디티오트레이톨로써 환원되며 요도 아세트아이드로써 S-카르복스 아미도메틸화되며 10% 분리될 수 있는 물질은 자동화 에드만 분해시켰다. 여러차례 에드만 분해를 시행하있으나 N-말단 아미노산이 전혀 검출되지 않았으므로 GAP의 말단 아미노기는 차단된 것으로 추정되었다.
S-카르복스아미도매틸화 GAP의 45% 분리가능한 물질을 러신-C 효소로써 분해시켰다. 펩티드 K1-24및 K25-32는 rpHPLC에 의하여 분리시켰다. 펩티드 K33-35 및 K36-39는 칼럼에 남아있지 않았으며 혼합물로서 용리되었다. 이들 펩티드를 정제하기 위한 어떠한 시도도 하지 않았다. 펩티드 K1-24 및 K25-32의 50% 분리가능 물질은 각각 자동화 에드만 분해를 실시하였다. K1-24가 서열이 정해질때 아무런 N-말단 아미노산이 검출되지 않았다. 이어서 K1-24의 나머지 50% 분리가능 물질을 TPCK-트립신으로써 분해하었다. 트럼틱 팹티드 T1-11, T12-18 및 T19-24는 rpHPLC에 의하여 분해시킨 다음 에드만분해를 실시하였다. 펩티드 T1-11의 50% 분해가능 물질에 대한 서열이 정해졌을때 아무런 N-말단 아미노산이 검출되지 않았으므로 T1-11가 K1-24의 N-말단 펩티드인 것으로 추정되었다. 이어서 T1-11의 나머지 50% 분리가능 물질을 12N HCl로써 비차단시켜 산 처리된 T1-11의 서열을 결정하였다. T12-18은 C-말단 아르지닌 잔기를 포함하고 있으며 여기서 K1-24는 C-말단 리신 잔기를 포함하고 있으므로 K1-24의 카르복실-말단 펩티드인 것으로 추정되었다. 펩티드 K25-32에 대하여는 완전히 서열이 결정되었다. 나타난 데이타는 잔유물 1-32에서 비롯된 GAP의 제의된 아미노산서열을 지원해주고 있다.
S-카르복스아미도메틸 GAP의 나머지 45% 분리가능 물질은 스타필로코칼 아우레우스 V8로써 분해시켰다. 펩티드 E1-6, E7-21 및 E22-39는 rpHPLC에 의하여 분리시켰다. 펩티드 E1-6, E7-2l 및 E22-39의 50% 분리가능 물질은 자동화 에드만 분해를 실시하였다. 펩티드 E1-6에 대한 아무런 N-말단 아이노산이 검출되지 않았다. E7-21 및 E22-39의 완전한 서열은 잔류 1-39에서 이롯된 GAP의 제안된 구조를 표현하였으며 펩티드 T12-18, T19-24 및 K25-32에 대하여 만든 연구과제를 확인하였다. 이어서 펩티드 E1-6의 50% 분리가능물질은 가능한 Ser-1에서 산촉매 N-O 아세틸 변이를 통하여 12N HC1로써 비차단화시켰다. 산 처리한 E1-6의 서열을 결정하였다. GAP의 카르복시팝티다제가 C-말단 아이노산으로서 Gly-39를 확인시키지 않았으므로 부가적인 펩티드가 잔류 Gly-39와 다른 구조로 존재할 가능성이있다. 그러나 GAP와 크로타민, 미오톡신 A와 독성펩티드 C간의 광범위한 서열 상동성은 제의된 구조에 대한 신뢰도를 증가시켜 준다.
구조적으로 GAP는 방울뱀 독소종류인 일차 목적물로서 내질세망(內質細網)을 손상시킴으로써 근육분해를 일으키는 폴리펩티드군에 속한다. 단백질 서열 데이타베이스(PIR릴리이스 5.0,1985년 5월)에 저장된 모든 단백질 서열과 GAP를 비교하면 기타 알려진 서열과 상동성을 나타내지 않았다. GAP와 방울뱀 독소의 서열은 시스테인 잔류물이 GAP의 잔유물 10과 11 사이에 2개의 삭제부분을 삽입함으로써 동일한 위치를 나타내도록 배열시킬 수 있다. GAP중에 2분의 6-시스틴 잔유물이 존재하는 것은 폴리펩티드내에 3개의 디술파이드 브리지가 있는 것으로 추정된다. 상기 지적된 아미노산 서열은 그 구조 및 세포독소 작용을 유지하는 동안 아미노산 서열로서 광벙위하게 변화할 수 있다.
표제의 독소는 공지의 방법에 따라서 리신, 디프테리아 독소, 아브린 등과 같은 독소대신 사용될 수 있다. 예를들어, Jansen et al., Recept.-Mediated Binding Intern. Toxins Horm.[Proc. Symp.]1980(Pub.1981)351-356(C.A.95 : 126185u) : Masuho et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1979)90 : 320-326 ; U. S. Patent No. 4,340,535 참조하기 바랍니다.
상기 발명의 상세한 설명에서 본 발명에 대하여 비교적 상세히 설명하였으나 이것은 본 발명을 더욱 명확하게 이해시키기 위한.예시에 불과한 것이며, 이것으로 본 발명을 제한시키고자 하는 것은 아니고, 다음의 청구범위에 기재된 범위내에서 변경 및 개선을 할 수 있다는 사실을 이해하여야 된다.

Claims (20)

  1. 하기 일반식으로 표시되는 독성펩티드
    pp1QC1aa4aa5aa6GGaa9C2aa11aa12aa13aa14C3aa16aa17aa18aa19SDaa22GKaa25aa26C4aa28aa29aa30WKC5C6Kaa36aa38aa39pp2
    상기 식에서, pp1은 N-말단기이며, 수소 또는 1-20개의 아미노산을 가진 아미노산 사슬이고, pp2는C-말단기이고, 히드록실 또는 1-20개의 아미노산을 가진 아미노산 사슬이며, 각개의 문자는 아미노산 부호를 1문자로 부여하는 일반적인 의미를 갖고, 구성인자로써 지정원 5개 이내의 아미노산은 결합대로서의 역할을 하며, 시스테인 브리지가 존재한다면 C1과 C5, C2와 C4, 및 C3와 C6가 한쌍을 이루고, aa4는 지방족산 또는 방향족 아미노산이며, aa5는 지방족 극성 또는 염기성 아미노산이고, aa6는 하전된 지방족 아미노산이며, aa9는 방향족 아미노산이고, aa11은 지방족 염기성 아미노산이며, aa12는 방향족 아미노산 또는 지방족 극성 또는 하전된 아미노산이고, aa13은 지방족 비극성 또는 하전된 아미노산이며, aa14는 지방족 비극성 아미노산이고, aa16은 4-6개의 탄소원자를 가진 지방족 비극성 아미노산이며, aa17은 3-5개의 탄소원자를 가진 지방족 비극성 또는 극성 아미노산이고, aa18은 3-6개의 탄소원자를 가진 지방족 비극성 또는 염기성 아미노산이며, aa19는 3-4개의 탄소원자를 가진 지방족 극성 아미노산이고, aa22는 지방족 비극성 또는 방향족 아미노산이며, aa25는 3-6개의 탄소원자를 가진 지방족 중성 아미노산이고, aa26은 2-5개의 탄소원자를 가진 지방족 하전 또는 비극성 아미노산이며, aa28은 4-6개의 탄소원자를 가진 하전된 지방족 아미노산이고, aa29는 3-5개의 탄소원자를 가진 지방족 아미노산 또는 방향족 아미노산이며, aa30은 4-6개의 탄소원자를 가진 지방족 비극성 또는 염기성 아미노산이고, aa36은 지방족 염기성 아미노산이며, aa37은 2-3개의 탄소원자를 가진 지방족 아미노산 또는 방향족 아미노산이고, aa38은 2-4개의 탄소원자를 가진 지방족 중성 아미노산이며, aa39는 N-말단기가 차단 또는 비차단될 수 있는 지방족 비극성 아미노산이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 N-말단기가 비차단된 것이 특징인 독성펩티드.
  3. 제 1 항에 있어서, pp1가 수소이고 pp2가 히드록실기인 것이 특징인 독성펩티드.
  4. 제 3 항에 있어서, N-말단기가 차단된 것이 특징인 독성펩티드.
  5. 하기 식으로 표시되는 독성펩티드.
    Figure kpo00004
    상기 식에서, 2개의 아미노산이 같은 위치에 표시되어 있을때 그중 어느 하나의 아미노산만이 참가할 수 있다.
  6. 제 5 항에 있어서, 다만 최상부의 아미노산만이 참가하는 것이 특징인 독성펩티드.
  7. 제 5 항에 있어서, 다만 최하부의 아미노산만이 참가하는 것이 특징인 독성펩티드.
  8. 특수한 결합쌍의 일원에 고유결합원 제 1 항에 따른 독성펩티드로. 구성됨을 특징으로 하는 독성펩티드 배합물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 특수 결합쌍의 일원이 배위자인 것이 특징인 독성펩티드 배합물.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 특수 결합쌍이 습수체인 것이 특징인 독성펩티드 배합물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 습수체가 항체인 것이 특징인 독성펩티드 배합물.
  12. 특수 결합쌍에 고유결합된 크로탈루스 아트록스로부터 얻은 독소로 구성됨을 특징으로 하는 독성펩티드.
  13. 습수체가 세포군의 표면에 있는 항원에 대하여 특수한 작용을 하는 제10항에 따른 독성펩티드 배합물과 세포의 혼합물을 세포의 성장을 정지시키는데 충분한 양을 혼합하여 세포의 성장을 억제시키는 것을 특징으로 하는 세포의 혼합물중의 예정된 세포군의 성장을 억제하는 방법.
  14. 크로탈루스 아트록스로부터 독을 짜내어 조제의 펩티드 화합물을 얻은 다음 저속원심분리시켜 동결건조시키고, 이 동결건조시킨 독을 아세트산에 용해시켜 불용성 물질은 저속 원심분리시켜 제거한 다음 다시 동결건조시키고 트리플루오로아세트산(TFA)에 재현탁시켜 불용성 물질을 원심분리하여 제거하고 TFA중의 아세토니트릴 용출액으로써 용리시킴을 특징으로 하는 하기 일반식으로 표시되는 독성펩티드의 수득 및 정제방법.
    pp1QC1aa4aa5aa6GGaa9C2aa11aa12aa13aa14C3aa16aa17aa18aa19SDaa22GKaa25aa26C4aa28aa29aa30WKC5C6Kaa36aa38aa39pp2
    상기 식에서, pp1은 N-말단기이며, 수소 또는 1-20개의 아미노산을 가진 아미노산 사슬이고, pp2는C-말단기이고, 히드록실 또는 1-20개의 아미노산을 가진 아미노산 사슬이며, 각개의 문자는 아미노산 부호를 1문자로 부여하는 일반적인 의미를 갖고, 구성인자로써 지정된 5개 이내의 아미노산은 결합대로서의 역할을 하며, 시스테인 브리지가 존재한다면 C1과 C5, C2와 C4, 및 C3와 C6가 한쌍을 이루고, aa4는 지방족산 또는 방향족 아미노산이며, aa5는 지방족 극성 또는 염기성 아미노산이고, aa6는 하전된 지방족 아미노산이며, aa9는 방향족 아미노산이고, aa11은 지방족 염기성 아미노산이며, aa12는 방향족 아미노산 또는 지방족 극성 또는 하전된 아미노산이고, aa13은 지방족 비극성 또는 하전된 아미노산이며, aa14는 지방족 비극성 아미노산이고, aa16은 4-6개의 탄소원자를 가진 지방족 비극성 아미노산이며, aa17은 3-5개의 탄소원자를 가진 지방족 비극성 또는 극성 아미노산이고, aa18은 3-6개의 탄소원자를 가진 지방족 비극성 또는 염기성 아미노산이며, aa19는 3-4개의 탄소원자를 가진 지방족 극성 아미노산이고, aa22는 지방족 비극성 또는 방향족 아미노산이며, aa25는 3-6개의 탄소원자를 가진 지방족 중성 아미노산이고, aa26은 2-5개의 탄소원자를 가진 지방족 하전 또는 비극성 아미노산이며, aa28은 4-6개의 탄소원자를 가진 하전된 지방족 아미노산이고, aa29는 3-5개의 탄소원자를 가진 지방족 아미노산 또는 방향족 아미노산이며, aa30은4-6개의 탄소원자를 가진 지방족 비극성 또는 염기성 아미노산이고, aa36은 지방족 염기성 아미노산이며, aa37은 2-3개의 탄소원자를 가진 지방족 아미노산 또는 방향족 아미노산이고, aa38은 2-4개의 탄소원자를 가진 지방족 중성 아이노산이며, aa39는 N-말단기가 차단 또는 비차단될 수 있는 지방족 비극성 아미노산이다.
  15. 제14항에 있어서, 상기 N-말단기가 비차단된 것이 특징인 독성펩티드의 수득 및 정제방법.
  16. 제14항에 있어서, pp1이 수소이고, pp2가 허드록실기인 것이 특징인 독성펩티드의 수득 및 정제방법.
  17. 제14항에 있어서, N-말단기가 차단된 것이 특징인 독성펩티드의 수득 및 정제방법.
  18. 제14항에 있어서, 독성펩티드가 하기식으로 표시되는 것이 특징인 독성펩티드의 수득 및 정제방법.
    Figure kpo00005
    상기 식에서, 2개의 아미노산이 같은 위치에 표시되어 있을때 그중 어느 하나의 아미노산만이 참가할 수 있다.
  19. 제18항에 있어서, 최상부의 아미노산만이 참가하는 것이 특징인 독성펩티드의 수득 및 정제방법.
  20. 제18항에 있어서, 최하부의 아미노산만이 참가하는 것이 특징인 독성펩티드의 수득 및 정제방법.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990015072A1 (en) * 1989-06-07 1990-12-13 Genentech, Inc. Platelet aggregation inhibitors and related molecules
WO1991001740A1 (en) * 1989-08-05 1991-02-21 Varánusz Gm Process for producing pharmacosmetics
US5232911A (en) * 1990-01-03 1993-08-03 Ventech Research Inc. Mixture of a non-covalent heterodimer complex and a basic amphiphatic peptide as cytotoxic agent
US5766897A (en) * 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
DE4433890C2 (de) * 1994-09-22 1999-02-18 Deutsches Krebsforsch Konjugat aus einem Wirkstoff und einem nicht als körperfremd angesehenen, nativen Protein
SG129211A1 (en) * 1997-11-06 2007-02-26 Univ Singapore Therapeutic molecules
BR0101088A (pt) * 2001-03-19 2003-03-18 Biolab Sanus Farmaceutica Ltda Processo de isolamento e purificação de peptìdeos inibidores das vasopeptidases, com especificidade para o sìtio carboxìlico da enzima conversora da angiotensina, secretados pelas glândulas do veneno de serpentes (bpps), particularmente bothrops jararaca, ou produzidos endogenamente (evasins) possuindo ação vasodilatadora e anti-hipertensiva; processo de determinação da sequência de amido-ácidos dos peptìdios inibidores secretados pela glândula de veneno de serpentes (bpps) ou endógenos (evasins); processo de determinação da sequência de aminoácidos dos bpps por dedução do cdna dos precursores dessas moléculas expressos em tecidos de serpentes, especificamente bothrops jararaca. processo de determinação da sequência de aminoácidos dos evasins por dedução do cdna dos precursores dessas moléculas expressos em tecidos de serpentes, especificamente bothrops jararaca, processo de amplificação do cdna a partir das bibliotecas de cdna de pâncreas e/ou cérebro de serpentes, especificamente bothrops jararaca; processo de sìntese em fase sólida de peptìdeos inibidores das vasopeptidases com ação vasodilatadora e anti-hipertensiva, peptìdeos inibidores das vasopeptidases com ação anti-hipertensiva; utilização dos peptìdeos inibidores das vaso peptidases com ação vasodilatadora e anti-hipertensiva na obtenção de composições farmacêuticas; processo de determinação da atividade inibitória sobre as vasopeptidases e de atividade biológica sobre músculo liso, sistema cardiovascular e microcirculatório.
BRPI0501037B8 (pt) * 2005-03-18 2021-07-27 Fund De Amparo A Pesquisa Do Estado De Sao Paulo uso de crotamina e composição
US20060234934A1 (en) * 2005-04-15 2006-10-19 Kilmon Joseph A Composition and Method for Selective Cytostasis

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5836308B2 (ja) * 1977-02-10 1983-08-08 大塚製薬株式会社 抗体の製造方法
US4220722A (en) * 1978-02-10 1980-09-02 Syva Company Method for conjugating to polyamino compounds employing haloacyl groups and compositions prepared thereby
FR2437213A1 (fr) * 1978-09-28 1980-04-25 Cm Ind Produits cytotoxiques formes par liaison covalente de la chaine a de la ricine avec un anticorps et leur procede de preparation
US4500637A (en) * 1982-07-19 1985-02-19 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Prevention of graft versus host disease following bone marrow transplantation

Also Published As

Publication number Publication date
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