NL8602939A

NL8602939A - Van slangengif afkomstig groei-beteugelend peptide.

Info

Publication number: NL8602939A
Application number: NL8602939A
Authority: NL
Original assignee: Oncogen
Priority date: 1985-11-22
Filing date: 1986-11-19
Publication date: 1987-06-16
Also published as: GR862788B; GB2185023B; GB2185023A; DK560986A; DE3639796A1; KR900006575B1; CH670451A5; IT1207580B; ES2002915A6; AU6667590A; SE8604991L; YU199586A; FI864715A; KR870005014A; CN86108593A; DK560986D0; FR2590576A1; SE8604991D0; IT8622425A0; ZA868849B

Description

VO 8473

Van slangengif afkomstig groei-beteugelend peptide

Giftige verbindingen kennen talrijke toepassingen. In het bijzonder kan, wanneer het cytotoxische middel specifiek is of veranderd kan worden zodat het specifiek is voor bepaalde stammen of celtypen, het cytotoxische middel toegepast worden bij het verwij-5 deren van een bepaalde stam of celtype uit een cultuur of weefsel dat een groot aantal verschillende celtypen omvat. Bij maligniteiten is het bijvoorbeeld gewenst om de maligne cellen specifiek te kunnen elimineren zonder ernstige sterfte te veroorzaken bij de normale of gezonde cellen.

10 Een bron van toxines is slangegif. Er is een aantal toxines bekend. Er bestaat echter nog steeds belangstelling voor het vinden van verdere toxines teneinde het arsenaal van toxines te vergroten , die beschikbaar zijn voor het gebruik bij bepaalde toepassingen. Toxines kunnen variëren wat betreft de immuno-respons tegen het 15 toxine,het gemak van koppelen aan andere reagentia,de werkingsplaats van het toxine, enz. Het ontdekken van een nieuw toxine uit slangegif vereist onder meer een bruikbaarheidstest, uitgebreide extracties,zuivering, en analyse om de zuiverheid en de aminozuur-volgorde te bepalen.

20 Er zijn cytotoxische peptiden geïsoleerd uit het gif van verscheidene soorten ratelslangen en de volgorde daarvan zijn bepaald en beschreven. Myotoxine is afgeleid van het gif van de prairie ratelslang, Crotalus (Fox et al., Biochemistry (1979) 18:678-83); crotamine van het gif van de Zuidamerikaanse ratelslang, 25 Crotalus durissus terrificus (Lauree en Hoppe-Seyler, Physiol. Chem. (1975) 356, 213-15); en het toxisch peptide C uit het gif van de Zuid-pacific ratelslang, Crotalus viridis helleri (Maeda et al; Toxicon (1978) 16, 431-41).

Er worden nieuwe cytotoxische of celgroei beteugelende 30 peptiden verschaft die verwant zijn aan een peptide, geisoleerd uit het gif van de "Western Diamondback" ratelslang, Crotalus atrox. Conjugaten van deze peptiden met specifieke bindingsgroepen, bijvoorbeeld liganden en receptoren, kunnen gebruikt worden voor het selectief verwijderen van cellen uit een mengsel van cellen.

35 Er worden cytotoxische middelen verschaft omvattende 8602939 -2- ,- -·* ,\ een ongeveer 6 kilodalton (kD) peptide, geïsoleerd uit het gif van Crotalus atrox , cytotoxische analoga daarvan, en conjugaten van de cytotoxische middelen met peptiden, in het bijzonder liganden en receptoren voor specifieke binding aan een complementaire bin-5 dingsgroep. Het actieve gedeelte zal ten minste ongeveer 15 aminozuren omvatten, gewoonlijk tenminste ongeveer 25 aminozuren, meer gewoonlijk tenminste ongeveer 35 aminozuren, en niet meer dan ongeveer 60 aminozuren, meer gewoonlijk niet meer dan ongeveer 50 aminozuren. Deze actieve gedeelten kunnen verbonden worden met een grote verscheiden-10 heid aan andere verbindingen,die hierna beschreven zullen worden.

De peptiden volgens de uitvinding bezitten de volgende formule: 15 ra5C6Ka.36M3VV9pp2 waarin: pp^- de N-terminus is en een waterstofatoom, een enkel aminozuur, in het bijzonder een polair aminozuur, meer in het bijzonder een met een hydroxylgroep gesubstitueerd aminozuur of een basisch aminozuur, 20 kan zijn, of een polypeptide met 2-20, gewoonlijk 2-10 aminozuren, die een groot aantal functies kan bezitten zoals een verbindende groep, een modificerende groep, enz.; 2 pp is de C-terminus en kan de terminale hydroxylgroep zijn, een enkel aminozuur,in het bijzonder een polair aminozuur, meer in het 25 bijzonder een carboxamido-bevattend aminozuur, of een polypeptide met 2-20, gewoonlijk 2-10 aminozuren, die dezelfde functies kunnen bezitten als pp*; ( ώ af zonderlijke letters hebben de gebruikelijke betekenis

f I

als onderdeel van de een-letter aminozuur code,die hieronder wordt 30 aangegeven; ten hoogste 5, gewoonlijk niet meer dan 3 aminozuren kunnen dienen als bindingen, zodat zij deleties in de structuur zijn; wanneer cysteine-bruggen aanwezig zijn vormen C. met C- I 5j C_ met C,, en C, met C, cysteine .-bruggen; 35 1 * br 0 aa is een alifatisch zuur of aromatisch aminozuur, 8502939 -3- in het bijzonder D, E, H; aa^ is een alifatisch polair of basisch aminozuur, in het bijzonder een carboxamido-gesubstitueerd of basisch aminozuur meer in het bijzonder N, Q, K, of R; 5 aa^ is een alifatisch geladen aminozuur, zuur of basisch, in het bijzonder D,E,K of R; 9 aa is een aromatisch aminozuur, in het bijzonder F,H,W of Y; aa^ is een alifatisch geladen aminozuur, in het bijzonder basisch aminozuur, meer in het bijzonder K, R; 12 10 aa is een aromatisch aminozuur of een alifatisch polair of geladen aminozuur, in het bijzonder zuur of neutraal, meer in het bijzonder een hydroxyl gesubstitueerd dan neutraal aminozuur, waaronder F, H, W, Y, D, E, S, of T; 13 aa is een alifatisch apolair of geladen aminozuur, in 15 het bijzonder een apolair of basisch aminozuur, meer in het bijzonder met 4-6 koolstofatomen, waaronder L, I, V, K of R; 14 aa is een alifatisch apolair aminozuur, in het bijzonder met 4-6 koolstofatomen met name L, 1, V; 16 aa is een alifatisch apolair aminozuur met 4-6 koolstofatomen, 20 in het bijzonder P, I, L of V; aa^ is een alifatisch apolair of polair aminozuur met 3-5 koolstofatomen, in het bijzonder een hydroxyl gesubstitueerd aminozuur waniterhet een polair aminozuur betreft, meer in het bijzonder S, T, A, P, V; 18 25 aa is een alifatisch geladen of apolair aminozuur, in het bijzonder een basisch aminozuur wanneer het een geladen aminozuur betreft, en met 3-6, gewoonlijk 4-6 koolstofatomen, in het bijzonder P, I, L,V,K of R; 19 aa is een alifatisch polair aminozuur met 3-4 koolstofatomen, 30 in het bijzonder een hydroxyl gesubstitueerd aminozuur, meer in het bijzonder S of T; 22 aa is een alifatisch apolair of aromatisch aminozuur, met 5-6 koolstofatomen wanneer het een alifatisch aminozuur betreft, in het bijzonder F, I, L, V; 25 35 aa is een alifatisch neutraal aminozuur met 3-6 koolstofatomen, 8602939

J 'V

-4- in het bijzonder van 4-6 koolstofatomen dat polair of apolair kan zijn, en een zwavelatoom bezit wanneer het polair aminozuur betreft, in het bijzonder Μ, I, L of V; 26 aa is een alifatisch geladen of apolair aminozuur, 5 wanneer het een polair aminozuur betreft in het bijzonder een zuur aminozuur, met 2-5, gewoonlijk 2-4 koolstofatomen, meer in het bijzonder G, A, P, D of E; 28 aa is een alifatisch geladen aminozuur met 4-6 koolstofatomen, dat basisch of zuur kan zijn^in het bijzonder D, E, K, of R; 29 10 aa is een alifatisch of aromatisch aminozuur, met 3-5 koolstofatomen wanneer het een alifatisch aminozuur betreft, in het bijzonder A, P, V, F, H, W of Y; 30 aa is een alifatisch neutraal apolair of basisch aminozuur, 6ΘΠ dat wanneer het neutraal apolair aminozuur betreft 4-6, gewoonlijk 5-6 15 koolstofatomen bezit, in het bijzonder I, L, V, K, of R; 36 a.& is een alifatisch basisch aminozuur, in het bijzonder K of R; 37 aa is een alifatisch of aromatisch aminozuur, dat wanneer het een alifatisch aminozuur betreft, 2-3 koolstofatomen bezit, 20 in het bijzonder G,A, F, H , W, of Y; 38 aa is een alifatisch neutraal polair of apolair aminozuur, met 2-4 koolstofatomen, dat wanneer het een polair aminozuur betreft, in het bijzonder hydroxyl gesubstitueerd is, en meer in het bijzonder G, A, P, S of T is; 39 25 aa is een alifatisch apolair aminozuur met 2-6 koolstof atomen, in het bijzonder 2-3 koolstofatomen, in het bijzonder G,A, P, I, L of V.

De groepen van de verschillende aminozuren en e^en-letter aanduidingen worden hieronder als volgt weergegeven: 30 alifatische neutrale

apolaire G,A,P,V,I,L

polaire S,T,M,C,N,Q

geladen

35 zure D,E

basische K,R

aromatische F,H,W,Y

8602939 ί ·ν -5-.

G - glycine Ν - asparagine A - alanine Q - glutamine P - proline D - asparaginezuur V - valine E - glutaminezuur 5 I - isoleucine K - lysine L - leucine R - arginine S - serine F - fenylalanine T -threonine H - histidine M - methionine W - tryptofaan 10 C - cysteine Y - tyrosine

Van bijzonder belang zijn peptiden met de volgende formule: SQCEQEGGgC^Fy £

c f S E ? S D 1 G K Jg C E P Lï K C C K L S L M

£ W G G

15 waarin: wanneer op dezelfde plaats twee aminozuren worden aangegeven, elk van beide op die plaats aanwezig kan zijn, maar het de voorkeur verdient dat de aminozuren boven de lijn bij elkaar horen en de aminozuren onder de lijn eveneens.

20 Het is verder duidelijk dat conservatieve substituties toegela ten zijn. Onder conservatieve substituties wordt verstaan,dat de volgende aminozuren op dezelfde lijn gesubstitueerd kunnen worden door de andere.

G, A

25

3 V, I, L

D, E K, R S, T

F, H, W, Y

30 De N-terminus van het peptide kan al dan niet geblokkeerd zijn, waarbij de blokkering gewoonlijk een alifatisch zuur omvat, 8602939 -6- bijvoorbeeld azijnzuur of mierezuur, een alkylering, enz.

De verbindingen volgens de uitvinding blijken warmte- en zuurbestendig te zijn onder de in het experimentele gedeelte beschreven testhandelingen.

Van bijzonder belang is het natuurlijk voorkomende groei-5 beteugelende peptide dat ten minste 90%, bij voorkeur 95% en meer bij voorkeur 99% zuiver is.Het kan op zichzelf of in combinatie met andere toxines gebruikt worden.

De cytotoxische of groei-remmende verbindingen volgens de uitvinding kunnen met gebruikelijke technieken aan een grote ver-10 scheidenheid van liganden en receptoren geconjugeerd worden.

De bij de koppeling betrokken functionele groepen kunnen een groot aantal zuurgroepen zijn, zoals carboxyl, sulfonyl en fosforyl, combinaties van thiol en olefinen, dithio, aldehyden, azogroepen, diazogroepen en dergelijke. Meestal zullen difunctionele verbindingen -15 gebruikt worden, die stap voor stap kunnen reageren,hoewel eveneens difunctionele verbindingen gebruikt kunnen worden die gelijktijdig reageren.Voorbeelden van reagentia omvatten glutaaraldehyde, formaldehyde, para-maleITmidobenz oezuur, methyldithioazijnzuur, diazobenzoëzuur en dergelijke. De preciese manier die gebruikt wordt voor het koppelen 20 van het cytotoxische gedeelte aan een specifieke bindingsgroep is volgens de uitvinding niet kritisch.

Specifieke bindingsgroepen zullen liganden en receptoren zijn, waarbij de specifieke bindingsgroepen dienst doen om een specifieke binding te verschaffen aan een bepaald doel. Cellen zullen bij-25 voorbeeld gewoonlijk oppervlakteantigenenen receptoren bezitten die karakteristiek zijn voor een bepaald celtype. Door dus gebruik te maken van geschikte liganden of receptoren, geconjugeerd aan het toxische middel, kan dit met voorkeur gericht worden tegen die cellen die de wederkerige specifieke bindingsgroep bezitten.

30 Verscheidene verbindingen die gebruikt kunnen worden als liganden omvatten sterolden, lage-dichtheid-lipoprotelne, groeifactoren, virale eiwitten, enz.Daarentegen kunnen natuurlijke receptoren of bij voorkeur immunoglobulines of hun fragmenten gebruikt worden, waarbij de receptoren gericht zijn tegen specifieke oppervlakte-35 antigenen.De belangrijke immunoglobulinen omvatten IgA, IgD, IgM,IgE en IgG, bij voorkeur IgG, met inbegrip van elk van de subtypen.

De immunoglobulines kunnen worden verkregen uit elke geschikte 8602939 -7- bron, in het bijzonder de muis of de mens. De immunoglobulines kunnen worden verkregen uit hybridomen, uit getransformeerde cellen,b.v.

EBV getransformeerde lymfocyten, of met behulp van recombinant-DNA technologie. In het bijzonder kunnen variabele gebieden van de muis 5 gekoppeld worden aan constante gebieden van de mens of een andere gastheer teneinde chimerische immunoglobulines te verschaffen die een lagere anti-geniciteit kunnen verschaffen. Bovendien behoeft het gehele immunoglo-buline niet gebruikt te worden, maar eerder fragmenten daarvan, zoals Fab, FCab'^j Fv, enz.

10 Het ligande . en het toxine kunnen gekoppeld worden door bindingen die stabiel zijn in de doel-cel of instabiel, zodat het toxine en het doelgerichte reagens in de cel gescheiden kunnen worden. Het is wenselijk dat het toxine door endocytose wordt opgenomen, zodat het zijn werking intracellulair teweegbrengt . Wanneer het doelgerichte middel<fe toxische 15 activiteit van het toxine niet nadelig beïnvloedt, bestaat er geen noodzaak voor een binding die verbroken kan worden. Wanneer een verbreekbare binding gewenst is, is het gemakkelijk om een disulfidebinding te gebruiken die in de gastheercel gereduceerd kan worden.

De conjugaten kunnen een grote verscheidenheid omvatten 20 van verhoudingen tussen het doelgerichte middel, de specifieke bindings-groep en het toxine. Gewoonlijk zal er ten minste een toxine per doelgericht middel zijn, maar niet meer dan ongeveer een toxine per 0,5 kilodaltons (kD) van het doelgerichte middel. Gewoonlijk zal er ten minste een toxinemolecuul per 100 kD van het doelgerichte middel 25 zijn, meer gebruikelijk is ten minste een molecuul per 50 kD van het doelgerichte middel. Wanneer het doelgerichte middel klein is, zoals een hapteen met laag molecuulgewicht, dan kunnen er 2 of meer liganden per toxine zijn,gewoonlijk niet meer dan ongeveer 5 liganden per toxine.

De verbindingen volgens de uitvinding kunnen in vitro of 30 in vivo gebruikt worden.Bij het gebruik in vitro kunnen zij gebruikt worden om selectief cellen te vernietigen die van andere cellen in een culture of in het weefsel onderscheiden kunnen worden. De verbindingen volgens de uitvinding kunnen aan het medium worden toegevoegd in hoeveelheden die voldoende zijn om de ongewenste cellen te vernietigen. Men V«ti 35 bijvoorbeeld bij het aantonen van bepaalde histocompatibiliteits- antigenen reagentia toevoegen die antilichamen bevatten die specifiek 8602939 «r' -8- zijn voor het bepaalde histocompatibiliteits-antigen.

Door een kleurstof toe te voegen die alleen door dode cellen geabsorbeerd zal worden, zal de aanwezigheid van de kleurstof in de cellen een aanwijzing zijn voor het bepaalde type histocompatibiliteit.

5 De hoeveéLhfiLd toxisch doelgericht middel kan over een groot bereik gevarieerd worden en kan voor bepaalde situaties in in vitro gebruik geoptimaliseerd worden. Men dient niet te veel toxisch doelgericht middel te gebruiken, aangezten dit tot aspecifieke binding en vals positieve resultaten leidt, terwijl ook niet te weinig gebruikt moet worden, 10 hetgeen tot vals negatieve resultaten zal kunnen leiden tengevolge van een te laag bindingsniveau dat niet gemakkelijk kan worden waargenomen.

Voor het gebruik in vivo kan het conjugaat parenteraal of door injectie, in het bijzonder intraveneus worden toegediend.

15 De hoeveelheid gebruikt conjugaat zal over een groot bereik variëren, afhankelijk van de aard van de te doden cel, de omvang van de populatie van cellen, de weerstand van de cel tegen het conjugaat, de doeltreffendheid van het conjugaat, enz. Wanneer het anders dan op een specifieke plaats wordt toegediend, zal de hoeveelheid eiwit gewoonlijk 20 variëren van ongeveer 1 ^ug tot 10 mg, gewoonlijk tot ongeveer 2 mg, per kilogram lichaamsgewicht van de gastheer. Bij toediening op een specifieke plaats zal de hoeveelheid eiwit in het onderste gedeelte van het concentratiebereik zijn.Het conjugaat kan worden toegediend in een fysiologisch aanvaardbaar medium, zoals fosfaat gebufferd zout, 25 een zoutoplossing, of in een ander geschikt medium. Als poeders kunnen de conjugaten geleid worden met andere materialen die kunnen zorgen voor het richten van de samenstelling tegen een bepaald orgaan, een verlengde afgifte, enz. De wijze waarop eiwitachtige samenstellingen aan een gastheer kunnen worden toediend wordt in 30 de stand der techniek voldoende uiteengezet en zal niet verder besproken worden.

Van bijzonder belang als doel-cellen zijn tumorcellen en pathogene microorganismen. Van bijzonder belang wegens hun veelvuldig voorkomen zijn longcarcinomen, darm- en rectale kankercellen, borstkanker, 35 baarmoedercarcinomen, prostaatcarcinomen, blaas- en nierkanker, lymfoom, leukemie, en de ziekte van Hodgkin.

8602939 'ψ -9-

Voorbeelden van pathogene micro-organismen zijn protozoa, zoals Plasmodium vivas, P. maleriae, P. ovale en P. falciparum, gram-negatieve bacteriën, zoals Pseudomonas, Klebsiella, en Neisseria, gram-positieve bacteriën, enz.

5 Materiaal en methoden

Zuivering van het groeiremmend peptide uit het gif van Crotalus atrox.

De ruwe peptideverbinding werd verkregen door het gif uit Crotalus atrox te melken en het werd helder gemaakt door centrifugeren bij lage snel^heid voorafgaande aan vriesdrogen.

Het gevriesdroogde gif werd opgelost (10 mg/ml) in 1M azijnzuur en onoplosbaar materiaal werd verwijderd door centrifugeren bij lage snelheid.

Een eerste zuivering werd bereikt door het monster in hoeveelheden van 7,5 ml aan te brengen op een Bio-Gel P10 kolom, 15 geëquilibreerd met 1M azijnzuur, en fracties van 3,5 ml werden opgevangen en monsters werden verwijderd en gevriesdroogd. De monsters werden eerst getest op remming van de DNA-synthese in celcultures 4 van A549 menselijk longcarcinoom. Kort gezegd werden 2x10 A549 cellen geënt op platen met 96 putjes en na aanhechting van de cellen werden 20 zij behandeld met de geschikte kolomfracties. Vijf dagen later werden de putjes gepulsed met 125j._ deoxyuridine en de DNA-synthese werd gemeten ten opzichte van controleputjes, op basis van de ^^i-deoxy- uridine inbouw.Er werden twee grote pieken van remming gezien. Een eerste piek met een remmende activiteit van laag molecuulgewicht die nabij de 25 insuline marker met een molecuulgewicht van 6.000 elueerde,werd verder gezuiverd met behulp van hogedruk-vloeistofchromatografie(HPLC).

Het monster werd geviesdroogd en geresuspendeerd in 0,05% trifluorazijnzuur (TFA) in HPLC-kwaliteit gezuiverd water (Water's Associates). Onoplosbaar materiaal werd verwijderd door 30 centrifugeren en het monster werd geïnjecteerd op een C^g-Novopak kolom. Het monster werd geëlueerd met een lineaire gradient van 20-60% acetonitril in 0,05% TFA bij een stroomsnelheid van 1 ml/min bij 22°C.

Elk peptide met een absorptie bij 214 nanometer werd afzonderlijk opgevangen en monsters werden getest op remming van de DNA-synthese.

Het peptide dat bij 54% acetonitril elueerde remde de DNA-synthese van 35 8602939 -10- A549-cellen; geen remming werd gezien bij gebruik van andere kolom-fracties. SDS-PAGE van deze activiteit gaf bij zilverkleuring een enkele band; geen andere banden werden op deze gel zichtbaar, hetgeen suggereert dat het peptide tot homogeniteit gezuiverd was.

5 Morfologie van de geremde cellen

Geremde cellen vertoonden hun opvallende morfologische verandering 24 uur na behandeling met dit peptide^ dat wordt aangeduid • als "Growth Arresting Peptide" (GAP). Zowel menselijke tumorcellen als niet-getransformeerde fibroblasten werden bij deze test geremd 10 (50% van de geënte cellen) bij een peptide concentratie van ongeveer 100 ng/ml. Cellen werden nh de behandeling rond en de meeste dendrietachtige uitstulpingen waren op opvallende wijze afwezig; de cellen hechtten echter nog steeds aan de plaat. Dit effect was irreversibel aangezien wassen van de behandelde cellen en opnieuw voeden met vers medium dat 15 10% cerum bevatte, niet in staat was de cellen te laten herstellen tot hun oorspronkelijke fenotype.

De chemische structuur van GAP

De aminozuur volgorde van GAP werd bepaald door micro-sequentie analyse van peptiden die verkregen waren uit 20 enzymatische verteringen van gereduceerd en ge-S-carboxamidomethyleerd GAP met (a) het endoproteinase lysine-C; (b) TPCK-trypsine (L-(l-tosyl-amido-2-fenyl)-ethylchloromethylketon); en (c) Staphylococcus aureus V8 protease. De peptide fragmenten werden gezuiverd door reverse phase HPLC, gebruikmakende van vluchtige oplosmiddelen. Aan de terminale aminogroep 25 gebldckeerde peptiden werden geïncubeerd in 12N HC1 bij omgevingstemperatuur gedurende 16 uur. Vervolgens werden de monsters gedroogd door vriesdrogen. De peptiden werden onderworpen aan automatische Edman degradatie in de model 470A gasfase Protein Sequencer (Applied Biosystems,

Ine.).De fenylthiohydantoine-aminozuren werden geanalyseerd met behulp 30 van reverse phase HPLC.

De aminozuur volgorde van GAP is als volgt:

SQCEQEGGFCRFLLCPSRTSDIGKL

rt——;_j - GCEPLWKCCKRWGG' 8602939 -11-

De structuur werd bepaald met microsequentie analyse. Kort gezegd^ het GAP werd gereduceerd met dithiothreltol, ge-S-carboxamido-methyleerd met jodoaceetamide en een 10Z monster werd onderworpen aan automatische Edman-degradatie.Er werd geen N-terminaal aminozuur 5 waargenomen, zelfs wanneer verschillende cycli van de Edman-degradatie werden uitgevoerd, hetgeen suggereert dat de terminale aminogroep GAP geblokkeerd is.

Een 45Z monster van ge-S-carboxamidomethyleerd GAP werd verteerd met enzym Lysine-C. Peptiden Kl-24 en K25-32 werden gescheiden 10 met behulp van rpHPLC. De peptiden K33-35 en K36-39 werden niet door de kolom achtergehouden en werden geelueerd als een mengsel. Er werd geen poging gedaan deze peptiden te zuiveren. Een 50%’s monster van de peptiden Kl-24 en K25-32 werd respectievelijk onderworpen aan automatische Edman-degradatie. Er werd geen N-terminaal aminozuur gedetecteerd 15 wanneer Kl-24 gesequenced werd. Het resterende 50%’s monster van

Kl-24 werd vervolgens verteerd met TPCK-trypsine. De tryptische peptiden Tl-11, T12-18 en T19-24 werden gescheiden met behulp van rpHPLC en onderworpen aan Edman-degradatie. Er werd geen N-terminaal aminozuur waargenomen wanneer 50%’s monster van peptide Tl-11 werd gesequenced, hetgeen sugge-20 reert dat Tl-11 het N-terminale peptide van Kl-24 is. Het resterende 50%’s monster van Tl-11 werd vervolgens gedeblokkeerd met 12 N HC1 en de volgorde van het met zuur behandelde Tl-11 werd bepaald.

T12-18 bevatte een C-terminaal arginine residu, terwijl Kl-24 een C- terminaal lysine residu bevatte en er werd derhalve aangenomen dat dit van 25 het carboxy -terminale peptide·Kl-24 is. Van peptide K25-32 werd de volgorde in zijn geheel bepaald. De weergegeven gegevens ondersteunen de voorgestelde aminozuurvolgorde van GAP op grond van residuen 1-32.

Het resterende 45%’s monster van het ge-S-carboxamido- methyleerde GAP werd verteerd met Staphylococcus aureus V8 protease. De peptiden 30 El-6, E7-21 en E22-39 werden gescheiden met behulp van rpHPLC. Een 50%’s monster van peptiden El-6, E7-21 en E22-39 werd onderworpen aan automatische Edman degradatie. Er werd geen N-terminaal aminozuur waargenomen voor het peptide El-6. De volledige volgorden van E7-21 en E22-39 breidde de voorgestelde structuur van GAP uit op grond 35 van de residuen 1-39 en bevestigde de toekenningen, gedaan voor de peptiden T12-18, T19-24 en K25-32. Een 50%’s monster van peptide El-6 8602939 -12- werd vervolgens gedeblokkeerd met 12 N HC1, mogelijkerwijs door middel van een zuur gekatalyseerde N-O-acetyl verschuiving op Ser-1.

De volgorde van het met zuur behandelde El-6 werd bepaald. Er bestond nog steeds de mogelijkheid dat er nog meer peptiden aanwezig zouden 5 zijn in de structuur na Gly-39, aangezien geen carboxypeptidase-behandeling van GAP Gly-39 als C-terminaal aminozuur bevestigde.

De uitgebreide sequentie-homologie tussen GAP en Crotamine, Myotoxine A en het toxische peptide C verleent echter geloofwaardigheid aan de voorgestelde structuur.

10 Uit structureel oogpunt behoort GAP tot de familie van de ratelslang toxinen,een groep van polypeptiden die spierdegeneratie veroorzaken door het endoplasmatisch reticulum als primair doel te beschadigen. Vergelijking van het GAP met alle in de Protein Sequence Database (PIR Release 5.0,Mei 1985) opgeslagen eiwit-sequenties bracht 15 geen uitgebreide homologie aan het licht met enige andere bekende sequentie.De sequenties van GAP en de ratelslang toxinen kunnen naast elkaar worden gelegd zodat de cysteine-residuen homologe posities vertonen, door twee deleties te inserteren tussen de residuen 10 en 11 van GAP.

De aanwezigheid van zes halve-cystine residuen in GAP suggereert de 20 aanwezigheid van drie disulfide-bruggen in het polypeptide.De boven aangegeven aminozuurvolgorde kan over een breed gebied gevarieerd worden wat betreft de aminozuur volgorde,terwijl de conformationele structuur en de cytotoxische werking behouden blijft.

De toxines volgens de uitvinding kunnen worden gebruikt 25 in plaats van toxines zoals ricine, difterie toxine, abrine en dergelijke, overeenkomstig bekende werkwijzen. Zie bijvoorbeeld: Jansen et al., Recept.-Mediated Binding Intern. Toxins Horm. /Proc.Symp.J 1980 (pub. 1981) 351-356 (C.A. 95:126l85u); Masuho et al., Biochem.

Biophys. Res. Comm. (1979) 22 > 320-326; U.S.Patent No. 4.340.535.

30 Hoewel de uitvinding in het voorafgaande bij wijze van toelichting en voorbeeld in detail beschreven is om redenen van helderheid en begrijpelijkheid, zal het duidelijk zijn, dat zekere veranderingen en modificaties kunnen worden aangebracht, zonder van het wezen van de uitvinding af te wijken.

8602939

Claims

1. Toxisch peptide met de formule: «lVWW^.%.2VV0 WC5C6Km36*«37«»38m39pp2 waarin , pp de N-terminus is en waterstof is, of een aminozuurketen met 1-20 aminozuren; 2 PP is de C-terminus en kan een hydroxylgroep zijn of een 10 amino zuur ke t en met 1-20 aminozuren; de afzonderlijke letters hebben hun gebruikelijke betekenis zoals deze wordt gegeven in de eén-letter aminozuurcode; ten hoogste vijf van de met cijfers aangeduide aminozuren kunnen dienen als bindingen; 15 wanneer cysteinebruggen aanwezig zijn, paart met C^, C2 met C^i en met C^j aa4 is een alifatisch zuur of aromatisch aminozuur; aa3 is een alifatisch polair of basis aminozuur; aa** is een alifatisch geladen aminozuur; 9 20 aa is een aromatisch aminozuur; aa"^ is een alifatisch basisch aminozuur; 12 aa is een aromatisch aminozuur of alifatisch polair of geladen aminozuur; aa is een alifatisch apolair of geladen aminozuur;

25 J.4 aar is een alifatisch apolair aminozuur; aa^-6 is een alifatisch apolair aminozuur met 4-6 koolstofatomen; aa^·7 is een alifatisch apolair of polair aminozuur met 3-5 koolstofatomen; 30 18 aa is een alifatisch apolair of basisch aminozuur met 3-6 koolstofatomen; 19 aa is een alifatisch polair aminozuur en 3-4 koolstofatomen; 22 aa is een alifatisch apolair of aromatisch aminozuur; $602939 -14- p\ 25 aa is een alifatisch neutraal aminozuur met 3-6 koolstof- atomen; 26 aa is een alifatisch geladen of apolair aminozuur met 2-5 koolstofatomen; 28 5 aa is een alifatisch geladen aminozuur met 4-6 koolstof atomen; 29 aa is een alifatisch aminozuur met 3-5 koolstofatomen of een aromatisch aminozuur; 30 aa is een alifatisch apolair of basisch aminozuur met 10 4-6 koolstofatomen; 36 aa is een alifatisch basisch aminozuur; 37 aa is een alifatisch aminozuur met 2-3 koolstofatomen of een aromatisch aminozuur; 38 aa is een alifatisch neutraal aminozuur met 2-4 koolstof-15 atomen; en 39 aa is een alifatisch apolair aminozuur, waarin de N-terminus al dan niet geblokkeerd kan zijn.

2. Toxisch peptide volgens conclusie 1, waarin de N-terminus niet geblokkeerd is. 20

3, Toxisch peptide volgens conclusie 1, waarin pp*- waterstof 2 is en pp hydroxyl.

4. Toxisch peptide volgens conclusie 3, waarin de N-terminus geblokkeerd is.

5. Toxisch peptide met de formule

25 SQCBQESG Jc J clsrssdlgkmgceplwkccx g W G G waarin wanneer er op dezelfde plaats twee aminozuren aangegeven zijn ^ elk van beide aminozuren aanwezig kan zijn.

6. Toxisch peptide volgens conclusie 5, waarbij alleen de 8602939 -15- bovenste aminozuren aanwezig zijn.

7. Toxisch peptide volgens conclusie 5, waarbij alleen de onderste aminozuren aanwezig zijn.

8. Toxisch peptide-conjugaat omvattende een toxisch peptide 5 volgens conclusie 1, covalent gebonden aan een groep van een specifiek bindingspaar.

9. Toxisch peptide-conjugaat volgens conclusie 8, waarin de groep van het specifieke bindingspaar een ligande is.

10. Toxisch peptide-conjugaat volgens conclusie 8, waarin de 10 groep van het specifieke bindingspaar een receptor is.

11. Toxisch peptide-conjugaat volgens conclusie 10,waarin de receptor een antilichaam is.

12. Toxisch peptide-conjugaat omvattende een toxine van Crotalus atrox covalent gebonden aan een specifieke bindingspaar-groep.

13. Werkwijze voor het remmen van de groei van een tevoren vastgestel de groep cellen in een mengsel van cellen, omvattende: het combineren van het mengsel van cellen met een toxisch peptide"Conjugaat volgens conclusie 10, waarin de receptor specifiek is voor een antigeen op het oppervlak van de groep cellen, in een 20 hoeveelheid die voldoende is om de groei van de cellen te beteugelen, waardoor de groei van de cellen geremd wordt. 8602939