KR101749548B1

KR101749548B1 - 전복의 베타글루칸 결합 단백질로부터 유도된 항균 펩타이드, 이를 코딩하는 핵산 및 이들의 용도

Info

Publication number: KR101749548B1
Application number: KR1020150145265A
Authority: KR
Inventors: 남보혜; 김영옥; 김동균; 안철민
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2015-10-19
Filing date: 2015-10-19
Publication date: 2017-06-21
Also published as: KR20170062559A; JP2017077236A; JP6045678B1

Abstract

본 발명은 항균 특성 및 새로운 생리학적 활성으로서 항암 특성을 가지는 펩타이드, 이 펩타이드를 코딩하는 핵산 및 이 펩타이드 또는 핵산의 응용에 관한 것이다. 본 발명에 따라 합성된 펩타이드, 또는 이 펩타이드를 코딩하는 핵산이 삽입된 벡터를 유효 성분으로 사용하여, 항균 및/또는 항암 조성물, 예를 들어 약학적 조성물, 화장품 조성물 및/또는 식품 첨가제로 활용될 수 있다.

Description

전복의 베타글루칸 결합 단백질로부터 유도된 항균 펩타이드, 이를 코딩하는 핵산 및 이들의 용도{ANTIMICROBIAL PEPTIDE DERIVED FROM ABALONE LIPOPOLYSACCHARIDE AND BETA-GLUCAN BINDING PROTEIN, NUCLEIC ACID ENCODING THE PEPTIDE AND USES THEREOF}

본 발명은 신규 펩타이드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항균 활성 및/또는 항암 활성을 가지는 신규 펩타이드, 이를 코딩하는 핵산 및 이들의 산업적 응용과 같은 용도에 관한 것이다.

외부 병원체에 대한 방어 시스템으로서 면역 체계는 생명체에 따라 다르게 존재한다. 모든 면역 체계는 자기(self)와 비-자기(non-self)를 구분하여 외부 분자를 인식(recognition), 처리(disposal), 전달(communication)하는 시스템으로 구성될 수 있다. 생명체에서 외부 병원체에 대한 면역 체계는 크게 병원체가 처음 침투하였을 때 이를 즉각 인지하고 반응하는 선천성 면역 체계(innate immune system)와, 동일한 병원체가 침입하였을 때 이를 기억하여 효율적으로 병원체에 대한 방어 시스템을 구축하는 후천성 면역 체계인 적응성 면역 체계(adaptive immune system)로 크게 구별될 수 있다.

적응성 면역 체계가 발달한 척추동물과 달리, 무척추동물은 항체가 없고 적응성 면역 체계가 없거나 부족하다. 대신에 무척추동물은 침입하는 병원체에 대한 방어 시스템으로서 매우 효율적인 선천성 면역계를 가지고 있다. 특히 해저 환경에는 병원체가 될 수 있는 미생물이 풍부하게 존재하므로, 해양 무척추동물은 이러한 미생물이 풍부한 환경에서 생존하여 번성하기 위하여 육상의 무척추동물에 비하여 더욱 효율적인 선천성 면역계가 발달하였다.

해양 무척추동물을 비롯한 생명체에서의 선천성 면역 반응의 첫 번째 단계는 생체내에 침입하고자 하는 병원균을 인식하는 것이다. 대표적인 병원체의 하나인 미생물의 세포벽에는 지질다당류(lipopolysaccharides, LPS), 베타-1,3-글루칸(β-1,3-glucan) 및 펩티도글리칸(peptidoglycans)과 같은 당단백질로 이루어진 병원성 관련 분자 유형(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)을 가지고 있는데, 이들은 숙주에는 존재하지 않거나 여러 가지 방법으로 감추어져 있다. 이러한 병원성 관련 분자 유형(PAMPs)은 무척추동물의 선천성 면역 체계를 구성하는 특정 단백질, 예를 들어 유형인식수용체(PRRs, pattern recognition receptors) 또는 유형인식단백질(PRPs, pattern recognition proteins)에 의해 인식될 수 있다.

PRPs와 PAMPs는 복합체를 형성하여 일련의 활성화된 면역 반응을 유도한다. 각각의 PRPs는 다세포 생물에는 없으며 병원성 미생물의 표면에만 존재하는 적절한 PAMPs를 인식, 결합하여, 식균작용(phagocytosis), 노듈 형성(nodule formation), 피포화(encapsulation), 단백질분해효소 케스케이드(proteinase cascade) 활성화, 및 항균 펩타이드의 합성 등과 같은 일련의 면역 반응을 유발시킨다. 예를 들어 펩티도글리칸 인식 단백질(PGRPs, peptidoglycan recognition protein), C-type 렉틴(lectins), 지질다당류 결합 단백질(LPS-binding proteins), 베타-1,3-글루칸 결합 단백질(βGBP, β-glucan binding proteins) 등과 같은 지질다당류 및 글루칸 결합 단백질(LGBP, lipopolysaccharides and glucan binding proteins)로 대표되는 다양한 형태의 무척추동물 유래의 PRRs가 보고되었다.

미생물의 세포벽에 존재하는 PAMPs는 무척추동물의 방어적 세포 기능을 직접 활성화시키기는 하지만, 무척추동물의 PRPs에 의하여 야기되는 일련의 자극을 증폭시키는 면역 반응은, 척추동물의 항체의 2차적 활성과 유사하다. 특히, 프로페놀록시다아제(prophenoloxydase, pro-PO)-활성 체계는 매우 다양한 무척추동물에서 중용한 방어 메커니즘을 보여준다. 이 면역 체계는 효모 및 균류(fungus)와 같은 진균류의 세포의 주요 성분으로 존재하는 LPS, 펩티도글리칸 및 베타-1,3-글루칸과 같은 세균성 항원(당류 모이어티, saccharide moiety)을 인식하는데 근거한다.

수서 생물에서 일부 LGBP가 클로닝(cloning)되고 분석되었다. 예를 들어, 가재 Pacifastacus leniusculus LGBP, 보리새우 Marsupenaeus japonicas LGBP, 대하(Chinese shrimp) Fenneropenaeus chinensis LGBP, 비단가리비(Zhikong scallop) Chlamys farreri LGBP, 까막전복(disk abalone) Haliotis discus BGRP(beta-glucan recognition protein), 진주조개(pearl oyster) Pinctada fucata LGBP 등이 보고되었다. 특히, 가재 Pacifastacus leniusculus LGBP는 프로페놀록시다아제(proPO) 활성에서 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있다.

일반적으로, LGBP는 다당류 결합 모티프(polysaccharide binding motif)와 베타-글루칸 인식 모티프(beta glucan recognition motif)의 2개의 다당류 인식 부위를 포함하고 있다. 무척추동물은 모든 효모 및 균류 세포의 주요 성분으로서 존재하는 LPS, 펩티도글리칸 및 베타-1,3-글루칸과 같은 세균 항원(당류 모이어티)을 인식한다.

LPS의 결합 또는 인식 도메인(domains)에 근거하여 설계된 항균 펩타이드가 알려져 있다. 현재, 다양한 갑각류로부터 얻어진 항-지질다당류 인자(ALF, anti-lipopolysaccharide factor)의 상응하는 합성 LPS-결합 도메인 펩타이드에서 항균 활성이 보고되었다. 예를 들어, 비헴성 철(non-hemic iron) 결합 당단백질인 락토페린(lactoferrin)은 그 LPS-결합 도메인이 항균 활성을 가지고 있다. 그람 음성 결합 단백질 3(Gram negative binding protein 3, GNBP3)의 재조합 N-말단 도메인은 베타-1,3-글루칸에 결합하여 항균 활성을 보여주었다.

하지만, 새로운 유형의 항균 펩타이드를 개발하고, 이들의 새로운 생리학적 활성을 연구할 필요성이 있다.

본 발명은 항균 및/또는 항암 활성을 갖는 신규 펩타이드, 신규 펩타이드를 코딩하는 핵산 및 신규 펩타이드를 코딩하는 핵산이 삽입되어 있는 재조합 발현 벡터를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신규 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 항균용 및/또는 항암용 조성물로서의 약학 조성물, 화장품 조성물 및/또는 식품 첨가 보조제를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명은 항균 특성 및 새로운 생리학적 활성으로서 항암 특성을 가지는 펩타이드, 이를 코딩하는 핵산 및 응용에 관한 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 하기 서열 일반식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드를 제공한다.

일반식 Ⅰ

(N-말단)-WLWKAIWKLLX-(C 말단)

(일반식 Ⅰ에서 X는 리신(K), 아르기닌(R) 및 히스티딘(H)으로 구성되는 군에서 선택되는 염기성 아미노산이거나, 세린(S), 트레오닌(T), 아스파라진(N) 및 글루타민(Q)으로 구성되는 군에서 선택되는 극성 아미노산임)

예를 들어, 상기 일반식 Ⅰ의 펩타이드는 서열번호:3 또는 서열번호:5의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

예시적인 실시형태에서, 상기 일반식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드의 C-말단은 아미드화되어 있다.

상기 펩타이드는 항균 활성 및 항암 활성 중에서 선택되는 적어도 하나의 생리적 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 전술한 펩타이드를 코딩하는 핵산을 제공한다.

예를 들어, 상기 핵산은 서열번호: 4 또는 서열번호: 6의 염기 서열로 구성되는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 전술한 펩타이드를 코딩하는 핵산이 삽입된 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 전술한 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물을 제공한다.

예를 들어, 상기 펩타이드는 자궁암, 자궁경부암 및 폐암으로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 암을 치료하기 위한 약학 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 전술한 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 항균용 약학 조성물을 제공한다.

예를 들어, 상기 펩타이드는 그람양성세균, 그람음성세균 및 효모에 대하여 항균 활성을 나타낸다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 전술한 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 항균용 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 전술한 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 항균용 식품 첨가제를 제공한다.

본 발명에 따라 얻어진 펩타이드 변이체는 다양한 병원체에 대하여 효율적인 항균 활성을 보여주었다. 아울러, 본 발명에 따라 합성된 펩타이드는 항균 활성 이외에 다른 생리적 활성으로서 다양한 암 세포주에 대한 항암 활성을 보여주었다.

따라서 본 발명에 따라 합성된 펩타이드는 항균, 항생용 조성물 및/또는 항암용 조성물의 유효 성분으로 응용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 합성된 펩타이드는 항암용 및/또는 항균용 약학 조성물의 유효 성분으로서는 물론이고, 화장품 보존제로서 항균용 화장품 조성물의 유효 성분이나 항균용 식품 첨가제의 유효 성분으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따라, 전복(abalone)에서 유래한 지질다당류 및 베타-1,3-글루칸 결합 단백질(HDH-LGBP)의 전장 아미노산 서열 및 cDNA 서열을 표시한 것이다. 신호 펩타이드 서열과 폴리-(A) 신호 부위는 밑줄로 각각 밑줄로 표시하였으며, 인테그린 결합 모티프와 N-당화 부위는 박스 형태로 회색으로 강조되어 있다. 다당 결합 모티프는 붉은 이탤릭체로 표시하였으며 밑줄로 구분하였다.
도 2는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 전복에서 유래한 지질다당류 및 베타-1,3-글루칸 결합 단백질(HDH-LGBP)을 구성하는 펩타이드 및 천연 펩타이드에서 일부 아미노산을 치환하여 합성된 펩타이드 변이체에 대한 시퍼-에드먼드선(Schiffer-Edmundson) 나선 휠(helical wheel) 다이어그램을 도시한 것이다. 화살표는 천연 펩타이드(HDH-LGBP)에서 치환된 아미노산 잔기를 나타내며, 펩타이드를 구성하는 소수성 아미노산 잔기와 친수성 아미노산 잔기는 사각 박스로 표시되어 있다.
도 3a 및 도 3b는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 희석 분석(dilution assay)합성된 펩타이드 변이체인 HDH-LGBP-A1 및 HDH-LGBP-A2의 항균 활성을 측정한 그래프이다. 미생물의 성장은 펩타이드가 없는 상태에서 관찰된 최대 흡광도(OD)에 대한 백분율로 표시되어 있다. 데이터는 3회의 독립적인 실험을 통해 얻어졌으며, 평균± 표준편차(SD)의 값으로 표시되어 있다.
도 4는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 합성된 펩타이드 변이체의 열처리 후의 항균 활성을 보여주는 사진이다. 도 4에서 N과 H는 각각 열처리 하지 않은(Non-heated) 펩타이드와, 100℃에서 10분 동안 열처리(heating) 한 펩타이드의 방사 확산 분석(radial diffusion assay) 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 합성된 펩타이드의 염 농도에 따른 항균 활성을 보여주는 사진이다.
도 6a 및 도 6b는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 합성된 펩타이드 변이체인 HDH-LGBP-A1(도 6a) 및 HDH-LGBP-A2(도 6b)를 HeLa 세포주와 A549 세포주에 대하여 다른 농도로 처리한 뒤의 세포 형태를 위상차 현미경을 이용하여 촬영한 사진이다. 도 6a 및 도 6b에서 위쪽이 HeLa 세포주에 대한 분석 결과이고, 아래쪽이 A549 세포주에 대한 분석 결과이다.
도 6c 및 도 6d는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 합성된 펩타이드 변이체인 HDH-LGBP-A1 및 HDH-LGBB-A2를 HeLa 세포주, A549 세포주 및 정상 세포주에 대하여 37℃에서 24시간 처리한 뒤, 각 세포주의 생존력을 측정한 그래프이다.
도 7a 내지 도 7e는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 합성된 펩타이드 변이체인 HDH-LGBP-A1를 다른 농도로 24시간 처리하고, Annexin-Ⅴ-FITC/PI로 염색한 HeLa 세포에서의 세포막 구조 유지 및 포스파티딜세린의 노출 정도를 측정한 FACS 분석 결과를 도시한 그래프이다.
도 8a 내지 도 8e는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 합성된 펩타이드 변이체인 HDH-LGBP-A2를 다른 농도로 24시간 처리하고, Annexin-Ⅴ-FITC/PI로 염색한 HeLa 세포에서의 세포막 구조 유지 및 포스파티딜세린의 노출 정도를 측정한 FACS 분석 결과를 도시한 그래프이다.
도 9a 및 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 합성된 펩타이드 변이체의 DNA에 대한 겔 지연 분석(gel retardation assay) 결과를 도시한 사진이다. 아가로스 겔을 이용하여 상업적 분자량 마커인 λ-Hind Ⅲ로 절단된(digested) DNA (50 ng)의 지연을 측정하여 DNA에 대한 펩타이드의 결합을 측정하였다.
도 9b는 본 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 합성된 펩타이드 변이체의 DNA 중합효소 억제 분석 결과를 도시한 사진이다. DNA 중합효소에 대한 펩타이드의 효과는 E. coli 16S rDNA를 증폭한 PCR을 이용하여 시험하였다.

정의

본 명세서에서 용어 "아미노산"은 가장 넓은 의미로 사용되고, 자연-발생 L-아미노산 또는 잔기를 포함하는 것으로 의도된다. 자연-발생 아미노산에 대해 통상적으로 사용되는 1- 및 3-문자 약어가 본 명세서에 사용된다(문헌 [Lehninger, Biochemistry, 2d ed., pp. 71-92, (Worth Publishers: New York, 1975]). 아미노산은 D-아미노산뿐만 아니라 화학적으로-변형된 아미노산, 예컨대 아미노산 유사체, 단백질에 통상적으로 혼입되지 않는 자연-발생 아미노산, 예컨대 노르류신, 및 아미노산의 특징인 것으로 당업계에 공지된 특성을 갖는 화학적으로-합성된 화합물을 포함한다. 예를 들어, 천연 페닐알라닌(Phe) 또는 프롤린(Pro)과 동일한 펩티드 화합물의 입체 형태 제한을 허용하는 페닐알라닌 또는 프롤린의 유사체 또는 모방체가 아미노산의 정의 내에 포함된다. 이러한 유사체 및 모방체는 본 명세서에서 아미노산의 "기능적 균등물"로서 지칭된다. 아미노산의 다른 예는 문헌 [Roberts and Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Eds. Gross and Meiehofer, Vol. 5, p. 341(Academic Press, Inc.: N.Y. 1983)]에 열거되어 있다.

예를 들어, 표준 고체-상 합성 기술에 의해 합성된 합성 펩티드는 유전자에 의해 코딩되는 아미노산으로 제한되지 않으며, 이에 따라 주어진 아미노산에 대해 보다 광범위하게 다양한 치환을 허용한다. 유전자 코드에 의해 코딩되지 않은 아미노산은 본 명세서에서 "아미노산 유사체(analog)"로서 지칭되며, 예를 들어 WO 90/01940에 기재되어 있다. 예를 들어, 아미노산 유사체는 Glu 및 Asp에 대한 2-아미노 아디프산 (Aad); Glu 및 Asp에 대한 2-아미노피멜산 (Apm); Met, Leu 및 다른 지방족 아미노산에 대한 2-아미노부티르산 (Abu); Met, Leu 및 다른 지방족 아미노산에 대한 2-아미노헵탄산 (Ahe); Gly에 대한 2-아미노부티르산 (Aib); Val, Leu 및 Ile에 대한 시클로헥실알라닌 (Cha); Arg 및 Lys에 대한 호모아르기닌 (Har); Lys, Arg 및 His에 대한 2,3-디아미노프로피온산 (Dap); Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-에틸글리신 (EtGly); Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-에틸글리신 (EtGly); Asn 및 Gln에 대한 N-에틸아스파라긴 (EtAsn); Lys에 대한 히드록시리신 (Hyl); Lys에 대한 알로히드록시리신 (AHyl); Pro, Ser 및 Thr에 대한 3-(및 4-)히드록시프롤린 (3Hyp, 4Hyp); Ile, Leu 및 Val에 대한 알로-이소류신(AIle); Arg에 대한 4-아미디노페닐알라닌; Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-메틸글리신 (MeGly, 사르코신); Ile에 대한 N-메틸이소류신 (MeIle); Met 및 다른 지방족 아미노산에 대한 노르발린 (Nva); Met 및 다른 지방족 아미노산을 위한 노르류신 (Nle); Lys, Arg 및 His에 대한 오르니틴 (Orn); Thr, Asn및 Gln에 대한 시트룰린 (Cit) 및 메티오닌 술폭시드 (MSO); 및 Phe에 대한 N-메틸페닐알라닌 (MePhe), 트리메틸페닐알라닌, 할로-(F-, Cl-, Br- 또는 I-)페닐알라닌 또는 트리플루오릴페닐알라닌을 포함한다.

본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 자연적으로 존재하는 것으로부터 분리하였거나, 재조합 기술(recombinant technique)에 의하여 또는 화학적으로 합성된 단백질, 단백질 단편 및 펩타이드를 모두 포함한다. 특정 실시양태에서, 화합물의 변이체, 예컨대 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 펩타이드 변이체가 제공된다. 본 명세서에서 "펩타이드 변이체(peptide variants)"란 하나 또는 그 이상의 아미노산이 펩타이드의 아미노산 서열에 치환(substitutions), 결실(deletions), 첨가(additions) 및/또는 삽입(insertions)되어 있으면서, 원래의 아미노산으로 구성된 펩타이드와 거의 동일한 생물학적 기능을 발휘하는 것을 말한다. 펩타이드 변이체는 원래의 펩타이드와 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성(identity)을 가지고 있어야 한다. 이러한 치환체로서 "보존성"이라고 알려진 아미노산 치환제가 포함될 수 있다. 변이체는 또한 비보존성(nonconservative) 변화를 포함할 수도 있다. 하나의 예시적인 실시양태에서, 변이체 폴리펩타이드의 서열은 5개 또는 그 이하의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입됨으로서 원래의 서열과 달라진다. 변이체들은 또한 펩타이드의 면역원성(immunogenicity), 2차 구조(secondary structure) 및 수치료성(hydropathic nature)에 최소한의 영향을 주는 아미노산들의 결실 또는 부가에 의해 변화될 수 있다.

달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에서"보존성" 치환이란 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되었을 때에도 폴리펩타이드의 2차 구조 및 수치료성(hydropathic nature) 등의 특성에 큰 변화가 없는 것을 의미한다. 이러한 보존성 치환과 관련하여 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대 극성(polarity), 전하(charge), 수용성(solubility), 소수성(hydrophobicity), 친수성(hydrophilicity) 및/또는 양친화성(amphipathic nature) 등의 유사성을 기초로 하여 얻어질 수 있다.

예를 들어 아미노산은 공통적인 곁사슬 특성에 따라 ⅰ) 소수성(류신, 메티오닌, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신) ⅱ) 중성 친수성(시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민), ⅲ) 산성(아스파르트산, 글루탐산), ⅳ) 염기성(히스티딘, 리신, 아르기닌), ⅴ) 쇄 방향에 영향을 미치는 잔기 (글리신, 프롤린), ⅵ) 방향족 (트립토판, 티로신, 페닐알라닌)으로 분류될 수 있다. 보존적 치환은 이들 각각의 클래스 중 하나의 구성원을 동일한 클래스의 다른 구성원으로 교환하는 것을 수반할 것이다.

아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 리신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루탐산 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르트산 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5). 단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, ±2 이내, 바람직하게는 ±1 이내, 더욱 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환된다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르트산(+3.0±1); 글루탐산(+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 리신(-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). 친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, ±2 이내, 바람직하게는 ±1 이내, 더욱 바람직하게는 ±0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환된다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

본 명세서에서 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 교환 가능하게 사용되며, 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고 DNA(예컨대 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함한다. 핵산 분자의 구성단위인 "뉴클레오티드"는 디옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드, 및/또는 그 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제(polymerase)에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 당 또는 뉴클레오티드가 변형된 유사체(analogue), 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그 유사체를 포함할 수 있다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

뉴클레오티드에서의 변이는 단백질에서 변이를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다. 또한, 뉴클레오티드에서의 변이가 단백질 자체에 변화를 가져올 수도 있다. 단백질의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명의 단백질과 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다.

본 발명의 펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산이 가지는 특징, 예를 들어 항균 및/또는 암을 치료하는 효과를 갖는 범위에서, 본 발명의 펩타이드 및 핵산 분자는 서열목록에 기재된 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열에 한정되지 않는다는 것은 통상의 기술자라면 쉽게 인식할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 펩타이드에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 펩타이드와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 가지는 펩타이드일 수 있다.

일반적으로, 본 명세서에 언급되어 있는 펩타이드들(융합 단백질 포함) 및 폴리뉴클레오티드들은 분리된(isolated) 것이다. "분리된(isolated)" 펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드란 원래의 환경으로부터 제거된 것이다. 예를 들어, 자연 상태로 존재하는 단백질은 그 상태에서 함께 존재하는 물질들 전부 혹은 일부를 제거함으로써 분리되는 것이다. 이러한 폴리펩타이드는 적어도 90% 이상의 순도를 지녀야 하며, 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 순도를 가져야 한다. 폴리뉴클레오티드는 벡터 내에서 클로닝 시킴으로써 분리된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "벡터"는 숙주세포에 전달이 가능하며 바람직하게는 하나 이상의 목적 유전자 또는 핵산 서열의 발현이 가능하도록 만들어진 구조물을 의미한다. 예를 들면 벡터에는 바이러스 벡터(viral vectors), DNA 또는 RNA 발현 벡터(expression vectors), 플라스미드(plasmid), 코스미드(cosmid) 또는 파지벡터(phage vectors), CCA(cationic condensing agents)와 연결된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀(liposomes)으로 포장된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 프로듀서 세포(producer cells)와 같은 특정 진핵세포(eukaryotic cells) 등이 포함된다.

본 명세서에서 "발현 조절 서열(expression control sequence)"은 핵산의 전사(transcription)를 조절하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 조절 서열에는 구조 프로모터(constitutive promoter) 또는 유도 프로모터(inducible promoter)와 같은 프로모터 또는 인핸서(enhancer) 등이 있다. 발현 조절 서열은 전사될 핵산 서열에 연결되어 있다. 본 명세서에서 용어 "작동가능하게 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "약학적 유효량" 또는 "치료학적 유효량"이란, 유효 성분인 펩타이드 또는 그 단편 및/또는 이들을 코딩하는 핵산의 효능 또는 활성을 달성하는데 충분한 양을 의미한다. 예를 들어 본 발명에 따른 펩타이드를 함유하는 약학적 조성물은 항균제, 항생제 및/또는 항암제의 유효 성분으로 활용될 수 있다.

펩타이드 , 핵산, 벡터

항균 펩타이드의 작용기작은 크게 두 가지로 분류된다. 첫째, 대부분의 항균 펩타이드들은 균의 세포막의 투과성을 증가시켜 막전위를 파괴하고 세포대사를 멈추게 하는 작용기작을 갖는다. 둘째, 이 외의 소수의 항균 펩타이드들은 균주 세포 내로 침투하여 DNA 또는 RNA와 결합하여 전사 또는 번역을 억제하는 강력한 작용기작을 나타낸다. 이들 항균 펩타이드들의 활성에 중요하다고 알려진 구조적인 요소로서는 다음과 같은 것들이 있다. 첫째, 양친매성 나선구조(amphipathic helix), 둘째, 상기 나선구조를 안정화시키는 잔기들의 분포, 셋째, 염기성 잔기들의 분포, 넷째, 소수성 잔기들의 분포, 다섯째, 전하를 띠는 잔기들과 나선구조의 쌍극자 간의 상호작용, 및 여섯째, 반대 전하를 띠는 잔기들 간의 염다리를 들 수 있다.

본 발명자들은 생리적 활성으로서 항균 활성 및/또는 항암 활성을 가지는 펩타이드를 합성하기 위하여 참전복(Haliotis discus hannai)에서 유래한 펩타이드 변이체를 합성하고, 그 활성을 확인하였다. 참전복의 유전자 중에서 병원성 관련 분자 유형(PAMPs)을 인식하는 유형 인식 단백질로서, 지질다당류 및 글루칸 결합 단백질(LGBP, lipopolysaccharides and glucan binding proteins)을 코딩하는 전장 cDNA 서열을 분석하고, 그로부터 발현되는 전장 단백질의 아미노산 서열을 확인하였다. 본 발명은 참전복 유래의 전장 cDNA로부터 발현되는 LGBP 전장 단백질의 아미노산 서열 중에서 병원균을 인식하는 모티프 또는 도메인 영역을 구성하는 짧은 펩타이드의 일부 아미노산 서열을 치환한 펩타이드 변이체가 항균 활성 및/또는 항암 활성을 갖는다는 점에 근거한다.

따라서 본 발명의 일 측면에 따르면, 생리적 활성을 가지는 변이체로서의 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 측면에 따라 변이체로서의 펩타이드는 하기 일반식 Ⅰ의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.

일반식 Ⅰ

(N-말단)-WLWKAIWKLLX-(C 말단)

하나의 예시적인 실시형태에서, 일반식 Ⅰ의 아미노산 중에서 C-말단을 구성하는 X는 리신 또는 트레오닌일 수 있으며, 이 경우 일반식 Ⅰ의 펩타이드는 서열번호:3 또는 서열번호:5의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 필요에 따라, 본 발명의 펩타이드의 일부 아미노산은 인산화(phophorylation) 등으로 변형(modification)될 수 있으며, C-말단에 위치하는 카르복시기는 아미드화(amidation)될 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서 본 발명의 펩타이드는 다양한 세균 또는 효모에 대하여 강력한 항균 활성을 보이며, 예를 들어 자궁경부암, 폐암, 자궁암을 유발하는 다양함 종양 세포주에 대한 활성을 보여서 항암 활성이 있는 것으로 확인되었다.

예를 들어, 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 합성된 서열식별번호:3 또는 서열식별번호:5로 표시되는 펩타이드는 다양한 그람 양성 균주, 음성 균주 및 효모에 대하여 항균 활성을 나타낸다(도 3a 및 도 3b 참조). 예를 들어, 본 발명의 펩타이드는 Bacillus cereus, Staphylococus aureus RM4220, Streptococcus iniae FP5229 및 S. mutans를 포함하는 그람-양성 세균; Pseudomonas aeruginosa KCTC2004, Vibrio anguillarum, Vibrio harveyi을 포함하는 그람-음성 세균; 및 효모 Candida albicans KCTC7965 등에 대하여 양호한 항균 활성을 가지지만, 본 발명의 펩타이드가 이들 특정 균주에 대해서만 항균 활성을 가지는 것으로 한정되는 것은 아니다. 특히, 본 발명에 따라 합성된 펩타이드는 고온의 열처리 및 고농도의 염 처리에 의해서도 그 활성이 저하되지 않는다(도 4 및 도 5 참조).

본 발명에 따른 펩타이드는 재조합 방법(recombinant means) 또는 화학적 합성을 통해 제조함으로써 분리될 수 있다. 예시적으로 본 명세서에 언급된 핵산 서열에 의해 발현되는 펩타이드는 알려져 있는 많은 발현 벡터들 중 어느 것을 이용하든지 간에 공지의 방법으로 손쉽게 제조될 수 있다. 발현은 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 적절한 숙주 세포(host cell) 내에서 실현될 수 있다. 적절한 숙주 세포에는 원핵세포들(prokaryotes), 효모(yeast) 및 진핵세포들(eukaryotes)이 포함된다. 대장균, 효모 또는 포유동물 세포주(Cos 또는 CHO 등의)를 숙주세포로 이용하는 것이 바람직하다. 단백질의 정제를 위해서는 먼저 수용성의 숙주/벡터 시스템에서 얻은, 배양액으로 분비된 재조합 단백질을 포함하는 상등액을 시판되는 필터를 이용하여 농축시킨다. 다음 단계로 상기에서 얻은 농축액을 친화 매트릭스(affinity matrix) 또는 이온교환수지(ion exchange resin) 등의 적절한 정제 매트릭스(purification matrix)를 이용하여 정제한다. 마지막으로 한 단계 또는 여러 단계의 역상(reverse phase) HPLC 를 수행함으로써 순수한 단백질을 얻을 수 있다.

100개 이하, 일반적으로는 50개 이하의 아미노산으로 구성된 단편이나 변이체들은 합성에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 이러한 폴리펩타이드들은 상용화되어 있는 고상 기법(solid-phase techniques), 즉 성장하는 아미노산 사슬에 순차적으로 아미노산을 부가시키는 메리필드 고상법(Merrifield solid-phase synthesis method)으로 합성할 수 있다(Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2146-2149). 폴리펩타이드의 자동 합성을 위한 장비는 공급사로부터 구입할 수 있으며, 공급자의 매뉴얼에 따라 조작이 가능하다.

예를 들어 미생물에서 발현되는 본 명세서에 기재된 펩타이드는 숙주 세포의 주변 세포질로 분비되고 그로부터 회수될 수 있다. 전형적으로, 단백질 회수는 일반적으로 삼투압 충격, 초음파처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 미생물을 분쇄하는 것을 포함한다. 세포가 파괴되면, 세포 잔해 또는 전세포를 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 단백질은 예를 들어 친화성 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제할 수 있다. 대안적으로, 단백질을 배양 배지로 옮기고, 그로부터 분리할 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거하고, 배양 상등액을 여과하고 농축하여 생산된 단백질을 추가로 정제할 수 있다. 발현된 폴리펩티드는 통상적으로 공지된 방법, 예컨대 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼 상의 분별 증류; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온 교환수지, 예컨대 DEAE 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어 세파덱스 G-75를 사용하는 겔 여과; 소수성 친화도 수지, 매트릭스 상에 고정화된 적합한 항원을 사용하는 리간드 친화도 및 웨스턴 블롯 검정을 이용하여 추가로 분리 및 확인될 수 있다.

아울러, 생산된 펩타이드는 추가의 검정 및 용도를 위해 실질적으로 균질한 제제를 수득하기 위해 정제될 수 있다. 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법이 이용될 수 있다. 하기 절차는 적합한 정제 절차의 예이다: 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼 상의 분별 증류, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온-교환 수지, 예컨대 DEAE 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 및 예를 들어 세파덱스 G-75를 사용하는 겔 여과.

또한, 본 발명의 다른 측면에 따르면 본 발명은 전술한 일반식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 본 발명에 따른 펩타이드를 코딩하는 핵산은 서열번호:4 또는 서열번호:6의 염기 서열로 구성되는 뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명에 따라 일반식 Ⅰ의 펩타이드를 코딩하는 핵산(예를 들어 서열번호:4 또는 서열번호:6의 뉴클레오티드)은 적절한 벡터 안에 포함될 수 있다. 벡터는 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 연결된 발현조절서열(expression control sequence)을 포함할 수 있다. 각각의 벡터는 그의 기능(이종 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 다) 및 벡터가 존재하는 특정한 숙주 세포와의 상용성에 따라 다양한 성분을 함유한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 기점(특히 벡터가 원핵세포에 삽입되는 경우), 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS), 신호 서열, 이종 핵산 삽입물 및 전사 종결 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터는 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있는 발현 조절 서열, 예를 들어, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 등을 포함할 수 있다. 벡터의 한 유형은 추가의 DNA 절편이 그 내부에 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다.

발현 벡터에 서브클론된 서열을 증폭시키는 여러 가지 시험관내 증폭 기법들(in vitro amplification techniques)이 알려져 있다. 이러한 기법에는 PCR(polymerase chain reaction), LCR(ligase chain reaction), Qβ-복제효소 증폭(replicase amplification) 및 다른 RNA 중합효소를 이용한 기법들이 있다(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2nd Ed) 1-3; U.S. Patent No. 4,683,202; PCR protocols A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds. Academic Press Inc. San Diego, CA 1990. Improved methods of cloning in vitro amplified nucleic acids are described in U.S. Patent No. 5,426,039).

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 펩타이드의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6x His이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다. 필요한 경우에 이들 펩타이드의 세포외 분비를 촉진할 수 있도록 Fc 절편을 코딩하는 서열이 융합될 수도 있다.

본 발명의 예시적인 실시형태에 따르면, 아이케이 인자 또는 그 부분 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 펩타이드는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 (Novagen, USA)을 이용하여 소망하는 펩타이드를 신속하고 용이하게 얻을 수 있다. 전술한 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있다.

조성물

본 발명에 따라 합성된 펩타이드는 다양한 세균 균주 및 효모 세포주에 대하여 항균 활성을 보여주었으며(도 3a 내지 도 3b 참조), 고온의 열처리에 의해서도 항균 활성이 저하되지 않으며(도 4 참조), 고농도의 염을 가하더라도 그 활성을 잃지 않는다(도 5 참조). 뿐만 아니라, 본 발명의 펩타이드는 정상 세포에는 독성이 없지만, 암 세포주에 대해서만 선택적으로 독성을 발휘하고(도 6c 내지 도 6d 참조), 암 세포주의 세포계획사(apoptosis)를 유도하여 항암 활성을 보여주었다(도 7a-7e 및 도 8a-8e 참조).

따라서 본 발명에 따라 합성된 펩타이드는 항균 및/또는 항암 활성이 요구되는 다양한 조성물의 유효 성분으로 활용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩타이드는 항균 및/또는 항암 약학적 조성물의 유효 성분으로 활용되거나, 항균 특성이 요구되는 화장품 조성물 또는 식품 첨가제의 유효 성분으로 응용될 수 있다.

하나의 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 전술한 화학식 Ⅰ로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 약학적 유효량; 및 필요에 따라 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항균용 또는 항암용 약학적 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, 상기 유효 성분의 유효 용량은 예를 들어 0.01 내지 1000 ㎍/㎖, 바람직하게는 0.1 내지 500 ㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 100 ㎍/㎖이며, 유효 성분은 1일 1회 내지 3회 투여될 수 있다.

본 발명에 따라 약학적 조성물의 유효 성분으로 사용되는 펩타이드는 임의의 적합한 수단, 예를 들어 경구, 국소 (협측 및 설하 포함), 직장, 질, 경피, 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 피내, 경막내 및 경막외 및 비강내, 및 원하는 경우에 국부 치료, 병변내 투여를 위한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 본 발명의 유효 성분인 화합물은 임의의 편리한 투여 형태, 예를 들어 정제, 분말, 캡슐, 용액, 분산액, 현탁액, 시럽, 분무제, 좌제, 겔, 에멀션, 패치 등으로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 제약 제제에 통상적인 성분, 예를 들어 희석제, 담체, pH 조정제, 감미제, 벌킹제 및 추가의 활성제를 함유할 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효 성분인 펩타이드는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

필요한 경우, 본 발명의 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약학적으로 허용된 여러 담체(carrier)와 혼합하여 사용할 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코오스, 수크로오스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타티온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)와 함께 사용될 수 있다.

한편, 본 발명은 일반식 Ⅰ로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 항균용 화장품 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 펩타이드는 화장품 조성물 중에 보존제로서 사용될 수 있다. 화장품 조성물은 피부과학적으로 허용된 매질, 즉 피부, 점막, 두발 및 두피에 적합한 매질을 함유한다. 이는 국소적용으로 적합한 모든 약제학적 투여 형태로, 특히 수성, 수성/알코올성 또는 유성 용액, 또는 수성, 수성/알코올성 또는 유성 겔, 또는 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀션(O/W) 또는 그 반대(W/O), 서스펜션, 마이크로에멀션, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 비이온형의 소낭 분산제의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어 화장품 조성물을 제조하기 위한 용매로서, 에탄올, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세레스-26, 메틸글루세스-20, 이소세틸미리스테이트, 이소세틸옥타노에이트, 옥틸도데실미리스테이트, 옥틸도데칸올, 이소스테아릴이소스테아레이트, 세틸옥타노에이트 및 네오펜틸글리콜디카프레이트 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 화장품에는 상기 성분과 더불어 필요에 따라 통상적으로 화장품에 배합되는 다른 성분을 배합할 수 있다. 첨가될 수 있는 배합 성분으로는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면활성제, 유기 및 무기 안료, 유기분체, 자외선흡수제, 방부제, 살균제, 산화방지제, 항산화제, 식물추출물, pH 조정제, 알코올, 발포제, 충전제, 자외선 흡수제, 안료, 착색제, 겔화제 또는 농축제, 향료, 혈행촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명은 전술한 일반식 Ⅰ로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 항균용 식품 첨가제에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드를 식품 첨가물로 사용하는 경우, 상기 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적절하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 펩타이드는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

이하, 예시적인 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예에 기재된 발명으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 전복 LGBP( lipopolysaccharides and glucan binding proteins)의 전장 cDNA 및 전장 펩타이드 서열 분석

3년생 참전복(Haliotis discus hannai)로부터 얻은 7개의 조직으로부터 cDNA 라이브러리를 구축하여, 발현된 서열 태그를 분석하였다. 참전복(Haliotis discus hannai)의 발현된 서열결정 태그(sequencing tag)인 비상보성 열린해독틀(ORF) 및 둥근전복(Haliotis discus discus)과의 높은 유사성을 가지는 클론을 사용하여, 참전복 유래의 지질다당류 및 베타-1,3-글루칸 결합 단백질(HDH-LGBP)을 분리하였다. 소화관 cDNA 라이브러리로부터 얻어진 하나의 EST(expressed sequence tag) 클론(DGT-151)은 다른 종의 LGBP와 상동성이 있었으며, 이 클론으로부터 632-bp의 핵산 서열을 얻었다.

HDH-LGBP 유전자의 전장 cDNA를 얻기 위하여, 제조사의 지시에 따라 SMART RACE cDNA 증폭 키트(BD Biosciences)를 사용하여, cDNA 말단의 5' - 및 3'- 무작위 증폭(RACE, random amplification of cDNA ends)을 위한 소화관 cDNA를 각각 합성하였다. DGT-150 클론의 부분 염기 서열에 근거하여, 5'-RACE 및 3'- RACE를 위한 유전자-특이 프라이머를 설계하였으며, 유전자 특이 프라이머를 사용한 RACE 방법을 채택하여 아미노 말단의 코딩 서열을 얻었다. 5'-RACE에 의해서 380 bp의 단편이 증폭되었으며, 서열분석 결과 EST 서열과 중첩되어, 이에 근거하여 참전복 유래의 LGBP(HDH-LGBP)를 코딩하는 전장 cDNA 서열을 합성하였다. 증폭된 단편을 pGEM-T Easy 벡터(Promega) 내부로 서브클로닝하고, ABI3103 자동 DNA 서열분석기(Applied Biosystems)를 사용하여 서열 분석하였다. HDH-LGBP cDNA 전장 서열을 완료하기 위하여, 5'- 말단, 3'- 말단 및 DGT-151의 부분 서열을 조합하고, GENETYX version 8.0(SDC Software Development, Tokyo, Japan)을 사용하여 align하였다.

이어서, 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열을 분석하였다. 얻어진 전장 cDNA로부터 아미노산 서열을 유추하고, GENETYX version 8.0(SDC Software Development, Tokyo, Japan)을 사용하여 분자량 및 등전점(isoelectric point), p.I)을 계산하였다. 또한, NCBI(http://www.ncbi.nim.nih.gov/blast/)에서 BLASTP 프로그램을 사용하여 다른 서열과의 서열 유사도를 분석하였다.

시그널 펩타이드의 존재는 SignalP 3.0(P/)로 예측하였으며, 도메인 검색은 NCBI 내의 CD-search와 Pfam 서열 검색()에서 수행하였다.

HDH-LGBP의 전장 cDNA 서열 및 이로부터 발현되는 아미노산 서열이 도 1에 표시되어 있다. HDH-LGBP cDNA의 전체 서열은 31-bp의 5'-비해독 영역(5'-UTR), 폴리 (A) 테일을 갖는 162 bp의 3'-UTR, 예상된 분자량이 47.8 kDa이고 이론적 등전점이 5.27인 420개의 아미노산으로 구성되는 폴리펩타이드를 코딩하는 1263 bp의 열린해독틀(ORF)로 구성되었다. 얻어진 HDH-LGBP 전장 유전자는 처음 20개의 아미노산 잔기(residue)의 추정되는 신호 서열(signal sequence)을 포함하고 있다. 따라서 성숙한 HDH-LGBP는 400개의 아미노산으로 구성되며, 측정된 단백질 부분의 분자량은 45,467 Da, 예상된 등전점은 4.93이다.

SMART 분석을 통해서, 미성숙 펩타이드의 184번째 잔기부터 321번째 잔기의 아미노산 영역은 glycoside hydrolase family에 속하는 것으로 밝혀졌다. 성숙한 단백질 서열에서 N-linked 탄수화물 사슬과 관련한 5개의 추정되는 당화 부위(Asn-Xaa-Ser/Thr, NXS/T)가 성숙 펩타이드를 기준으로 Asn-28, -99, -265, -310, -350에 존재한다. HDH-LGBP의 N-linked 당화 부위는 베타-글루칸 인식 모티프 인근에 위치하므로, 이 부위에서의 당화는 베타-글루칸에 대한 결합 능력이 영향을 미친다. 1개의 짧은 추정적 세포부착 부위와 인테그린(integrin) 결합 부위, Arg/Lys-Gly-Asp(R/KGD)가 성숙 펩타이드의 Lys-189에서 Asp-191까지의 서열에 존재한다. HDH-LGBP는 성숙 펩타이드의 Trp-209, Glu-214, Ile-215 및 Asp-216의 활성 잔기를 가지는 베타-1,3-글루카나아제 부위를 가지고 있다.

실시예 2: 펩타이드의 설계, 구조 예측 및 합성

(1) 항균 활성 펩타이드의 설계 및 생리 화학적 특성

HDH-LGBP의 다당류-결합 도메인에 상응하는 아미노산 서열을 근거로 항균 활성이 있을 것으로 예상되는 천연 펩타이드와, 천연 펩타이드와 비교하여 일부 아미노산이 다르게 치환된 펩타이드 변이체를 설계하였다. 펩타이드 변이체는 HDH-LGBP의 다당류 결합 모티프에 위치한 아미노산 서열에 근거하여 설계되었다. 서열번호:1의 아미노산 서열(도 1의 성숙 전장 펩타이드에서 192-202 아미노산 잔기)을 갖는 천연 펩타이드(HDH-LGBP-N)와, 천연 펩타이드의 일부 아미노산을 치환한 서열번호:3의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 변이체(HDH-LGBP-A1) 및 서열식변번호:4의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 변이체(HDH-LGBP-A2)가 항균 활성이 있을 것으로 예상되었다.

천연 펩타이드 및 펩타이드 변이체에 대한 분자량 및 펩타이드 활성에 영향을 미치는 pI 값, 순 전하값, 보만 인덱스 값(Boman Index) 및 2차 구조를 평가하였다. ExPAYs 서버(http://www.에서 이론 등전점(p.I.)과 순 전하(net charge)를 평가하였다. 보만 인덱스 값(Boman Index values)은 온라인 Antimicrobial Peptide Database v2.34(ADP2)에 따라 계산하였다.

이들 펩타이드에 대한 p.I 값, 순 전하 값, 소수성 및 보만 인덱스 등의 값이 하기 표 1에 표시되어 있다. 소수성, 순 전하, 단백질-결합능(protein-bining potential, Bowman index) 등의 인자는 펩타이드 활성에 영향을 미칠 수 있다. 보만 인덱스는 펩타이드가 다른 수용체와 같은 다른 단백질에 결합할 수 있는 능력을 평가하는 것으로, 아미노산 잔기의 곁사슬의 자유 에너지의 합을 아미노산 잔기의 총수로 나눈 값으로 정의된다. 풍부한 W와 P를 갖는 천연 펩타이드는 산성 PI 값(5.32)과 순 전하 값이 0이었으며, 낮은 보만 인덱스 값을 보여주었다. 아울러, 2개의 선택된 펩타이드 변이체는 상대적으로 높은 순 전하 값과 낮은 보만 인덱스 값을 나타내어 항균 활성이 있을 것으로 예상되었다.

펩타이드의 2차 구조는 GOR 방법[17ExPASy]을 사용하여 예측하였다. 인위적으로 변형시킨 2개의 펩타이드 변이체의 2차 구조에서 소수성 영역 및 친수성 영역 및 알파-나선 구조를 예측하기 위하여, 스키퍼-에드컨드슨 나선 휠 프로젝션(Schiffer-Edmundson helical wheel projection)을 이용하였다. 헬리컬 휠 다이어그램(helical wheel diagram)은 EMBOSS pepwheel(European Bioinformatics Institute, Cambridge, UK)을 사용하여 2차 구조를 예측하였다. 그 결과는 도 2에 표시되어 있으며, 2차 구조는 표 1에 표시되어 있다.

항균 펩타이드의 서열 및 생리 화학적 특성

No	펩타이드	아미노산서열	염기서열	M.W.	p.I.	순전하	보만 인덱스 (kcal/mol)	구조
1	HDH-LGBP-N	서열번호:1	서열번호:2	1413.7	5.52	0	-2.56	T^ & R^*
2	HDH-LGBP-A1	서열번호:3^*	서열번호:4	1457.8	10.0	+3	-1.34	H^****
3	HDH-LGBP-A2	서열번호:5^*	서열번호:6	1484.8	10.3	+4	-1.07	H

^*: C-말단 아미드화; ^**: beta-turn; ^***: random coil; ^****: alpha helix

(2) 펩타이드 변이체 합성

항균 활성이 확인된 천연 펩타이드(HDH-LGBP-N)와, 이 천연 펩타이드의 일부 아미노산을 치환한 2개의 펩타이드 변이체(HDH-LGBP-A1, HDH-LGBP-A2)를 설계하여, 이들 펩타이드를 >95%의 순도로 Peptron Inc.(대전, 대한민국)에서 상업적으로 합성하였다. 이들 펩타이드는 ASP48S(Peptron Inc. 대전, 대한민국)를 사용하여 FmoC solid phase 펩타이드 합성(SPPS)을 사용하여 합성하였으며, Vydac Everest C18 컬럼(250 ㎜ ㅧ 22 ㎜, 10 ㎛; Grace, Deerfield, IL, USA)을 사용한 역상 고성능 액상 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 정제하였다. 용리(elution)는 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산을 함유하는 물-아세토니트릴 직선 구배(아세토니트릴 3%-40% (v/v))를 사용하여 수행하였다. 정제된 펩타이드의 분자량은 액상 크로마토그래피/질량 분석기(LC/MS; HP100 series; Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 확인하였다. 합성된 모든 펩타이드를 0.01% 아세트산에 용해시켜 1000 ㎍/㎖의 저장 용액을 얻었다.

실시예 3: 항균 성능을 위한 고감도 방사확산 분석( Ultrasensitive Radial Diffusion Assay)

고감도 방사확산 분석(URDA)을 통하여, 위에서 합성된 펩타이드 변이체의 항균 활성을 측정하였다. Bacillus cereus, Staphylococus aureus RM4220, Streptococcus iniae FP5229 및 S. mutans를 포함하는 그람-양성 세균; Pseudomonas aeruginosa KCTC2004, Vibrio anguillarum, Vibrio harveyi을 포함하는 그람-음성 세균; 및 효모 Candida albicans KCTC7965를 대상으로 합성 펩타이드의 항균 특성을 시험하였다. 시험 대상 균주를 적절한 온도(P. aeruginosa와 S . iniae는 25℃; 나머지 균주는 37℃)에서 뇌심장-침출액 배지(BHI, BD Bioscience, USA)에서 성장시켰다. 효모 균주인 C. albicans KCTC7965는 25℃에서 효모 배지(YM)에서 성장시켰다. 16-18시간 항온 배양(incubation)한 뒤, 세균 및 효모의 서스펜션을 미생물에 대하여 ~10⁸ CFU/㎖, C. albicans에 대하여 ~10⁶ CFU/㎖에 상응하는 맥팔랜드 0.5 탁도 기준(McFarland turbidity standard of 0.5, Vitek Colorimeter #52-1210; Hach, Loveland, CO, USA)으로 희석하였다. 희석된 세균 또는 C. albicans 서스펜션 1/2 ㎖를, 0.03% TSB(Tryptic Soy Broth) 또는 0.03% SDB(oybean powder Dextrose Broth) 및 1% Type Ⅰ(low EEO) 아가로오스가 구비된 10 mM 인산 버퍼(PB; pH 6.6)에 용해된 5 × 10⁶ CFU/㎖ 또는 5 × 10⁴ CFU/㎖을 함유하는 언더레이 겔(underlay gel) 9.5 ㎖에 첨가하였다. 정제된 펩타이드를 산성화 물(0.01% HAc) 5 ㎕에서 2개로 연속 희석시키고, 각각의 희석액을 1-㎜ 두께의 언더레이 겔로 제조된 2.5-㎜ 직경의 웰(well)에 첨가하였다. (P. aeruginosa, S. iniae, C. albicans에 대해서) 25℃, (나머지 균주에 대해서) 37℃에서 각각 3시간 항온 배양한 뒤, 인산 완충 식염수 완충액(PBS, pH 6.6) 10 mM을 사용하여 6% BHI 또는 6% YM을 함유하는 이중 강 오버레이 겔(double-strength overlay gel) 10 ㎖로 1% 아가로스에서 세균 또는 효모 서스펜션을 덮었다. 플레이트를 추가적으로 18-24 시간 더 항온 배양한 뒤, 투명 부위(clearing zone)의 직경을 측정하였다. 웰의 직경을 제외한 뒤, 투명 부위 직경을 유닛(0.1 ㎜ = 1 U)으로 표시하였다.

URDA를 사용하여 그람-양성 세균, 그람-음성 세균 및 효모에 대하여 최소유효농도(MECs)를 측정하여 합성된 HDH-LGBP 펩타이드 변이체에 대한 항균 활성을 측정하였다. 펩타이드 농도의 log10 값에 대한 유닛 도표의 x-절편으로서 합성 펩타이드의 최소 유효 농도(minimal effective concentration, MEC, ㎍/㎖)를 계산하였다. 이 항균 분석을 3회 수행하였으며, 결과를 평균하였다. 실험 결과는 표 2, 도 3a 및 도 3b에 각각 표시되어 있다. HDH-LGBP 펩타이드 변이체는 특히 B. cereus, S. aureus, S . mutans 및 S. iniae와 같은 그람-양성 세균(MECs 0.008 - 1.92 ㎍/㎖) 및 P. aeruginosa와 같은 그람-음성 세균(MECs 1.92 - 2.12 ㎍/㎖)에 대하여 우수한 항균 활성을 보여주었다. 또한 이들 펩타이드 변이체는 효모 C. albicans에 대해서도 잠재적인 항균 활성을 보여주었다(MECs 2.11 - 2.16 ㎍/㎖). 이러한 결과를 토대로 HDH-LGBP 펩타이드 유도체는 광범위한 항균 활성을 가지고 있음을 확인하였다.

펩타이드 변이체의 항균 활성

대상 미생물	구분	최소 유효 농도 (㎍/㎖)
대상 미생물	구분	HDH-LGBP-A1	HDH-LGBP-A2
B. cereus	그람 양성(+)	1.9	1.8
S. aureus RM4220	그람 양성(+)	1.08	1.37
S. iniae FP5229	그람 양성(+)	0.57	1.79
S. mutans	그람 양성(+)	0.008	1.7
P. aeruginosa KCTC2004	그람 음성(-)	2.12	1.92
V. anguillarum	그람 음성(-)	-	-
V. harveyi	그람 음성(-)	-	-
C. albicans KCTC7965	yeast	2.11	2.16

실시예 4: 항균 활성에 대한 온도 및 염의 영향

온도 및 염이 펩타이드 변이체(HDH-LGBP-A1, HDH-LGBP-A2)의 항균 활성에 미치는 영향을 연구하기 위하여, 세균 균주 B. cereus, S. aureus, S. iniae, P . aeruginosa 및 효모 C. albicans를 대상으로 고감도 방사확산 분석(ultrasensitive radial diffusion assay, URDA)을 사용하여 항균 활성을 시험하였다. 열 안정성을 탐구하기 위하여, 2개의 펩타이드 변이체를 각각 10분 동안 100℃에서 항온 배양하였다. 열처리 후, 펩타이드를 냉각시키고, 실시예 3에서 기술한 것처럼 URDA에 사용하였다. 열 안정성에 대한 분석 결과는 도 4에 도시되어 있다. 이들 펩타이드의 항균 활성은 열처리에 의하여 심각하게 영향을 받지 않았다. 특히 2개의 펩타이드 변이체는 S. aureus, P. aeruginosa 및 C. albicans와 같은 미생물 균주에 대하여 강한 항균 활성을 보여주었다. 열 안정성 분석은 HDH-LGBP 펩타이드 변이체는 열에 안정하다는 것을 보여주었다.

한편 염에 대한 안정성을 알아보기 위하여, 2개의 펩타이드 변이체를 다른 농도의 염(0.5, 1, 2%)에서 30분 동안 항온 배양하였다. 구체적으로, 염에 대한 이들 펩타이드 변이체의 민감도를 연구하기 위하여, HDH-LGBP 유래의 펩타이드 변이체를 다른 농도의 나트륨 농도(NaCl 0.5, 1, 2%)에서 항온 배양하고, 항균 활성을 평가하고, URDA를 사용하여 비교하였다. 처리 후에 펩타이드를 위에서 기술된 것과 같이 URDA에 사용하였다. 분석 결과는 도 5에 도시되어 있다. 이들 펩타이드 변이체의 항균 활성은 고 농도에서도 크게 영향을 받지 않았다. HDH-LGBP 유래의 펩타이드 변이체가 높은 염 저항성을 가지고 있다는 것을 확인하였다.

실시예 5: 펩타이드 변이체의 세포독성 효과

2개의 인간 암 세포주(HeLa 및 A549)와 정상 세포주(인간 제대 정맥 내피세포, Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)에 대하여, 위상차 현미경 검사와, 미토콘드리아의 탈수소화 효소의 활성에 근거하여 살아 있는 세포를 측정하는 MTS 분석을 사용하여, 합성된 HDH-LGBP 펩타이드 변이체의 독성 효과를 연구하였다. HeLa(인간 자궁경부 선암종) 및 A549(인간 폐암종) 세포주를 미국미생물보존센터(ATCC; Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. HUVEC 세포주는 정 박사(국립부산대학교 분자생물학과, 부산, 대한민국)로부터 제공받았다. 모든 세포를 5% CO₂ 인큐베이터에서 37℃에서, 10% 우태아혈청(FBS, Gibco), 100 U/㎖ 항생/항진균제(antibiotics-antimycotics, Life Technologies)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium, Welgene) 배지에서 배양하였다.

배양된 HeLa 및 A549 세포(4 × 10³ cells/well)를 96-well 플레이트에서 밤새 37℃에서 배양하였다. 이어서 항균 펩타이드(AMPs)로서의 다양한 농도(1, 5, 10, 25, 50 ㎍/㎖)의 HDH-LGBP-A1 및 HDH-LGBP-A2 펩타이드 변이체를 사용하여, 세포를 24 시간 동안 37℃에서 항온 배양하였다. 위상차 현미경을 이용하여 펩타이드 변이체의 처리에 따른 세포 형태를 분석하였다. 분석 결과는 도 6a와 도 6b에 각각 도시되어 있다. 처리되지 않은 대조군 세포는 통상적인 단층 형상(monolayer appearance)을 보였으며(도 6a 및 도 6b의 좌측 패널), 1-5 ㎍/㎖ 농도의 펩타이드 처리에 의해서도 크게 영향을 받지 않았다. 하지만, HDH-LGBP 유래의 펩타이드 변이체를 10 ㎍/㎖ 농도로 처리하면, 세포수가 감소하고, 둥근-형상(round-shape) 세포가 증가하고, 세포 수축(cell shrinkage)이 증가하기 시작하였다(도 6a 및 도 6b). 특히 50 ㎍/㎖의 펩타이드 변이체로 처리하면, 5분 내에 세포 분리(cell detachment), 스웰링(swelling) 및 손상이 HeLa 세포와 A549 세포에서 탐지되었다(결과 미도시). 이러한 결과는 HDH-LGBP 유래의 펩타이드 변이체가 일정 농도, 예를 들어 50 ㎍/㎖에서 세포막을 직접 붕괴시켜 세포 용해(cell lysis)시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

계속해서, 제조사의 지시에 따라 MTS 분석을 사용하여 정상 세포주인 HUVEC(Human umbilical vein endothelial cells)과, 암세포주인 HeLa 및 A549 세포 각각에서의 세포 독성(cytotoxicity)을 측정하였다. HUVEC, HeLa 및 A549 세포(4 ㅧ 10³ cells/well)를 96-well 플레이트에서 밤새 37℃에서 배양하였다. 이어서 항균 펩타이드(AMPs)로서의 다양한 농도(1, 5, 10, 25, 50 ㎍/㎖)의 HDH-LGBP-A1 및 HDH-LGBP-A2 펩타이드 변이체를 사용하여, 세포를 24 시간 동안 37℃에서 항온 배양하였다. 세포 독성과 관련한 처리의 마지막 단계에서, tetrazolium 화합물, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium(MTS) 및 전자-커플링 시약인 phenazinemethosulfate(PMS, Promega, Mannheim, Germany)의 혼합물 20 ㎕를 첨가하고, 세포를 37℃에서 다시 4시간 동안 항온 배양하였다. 490 ㎚에서 흡광도를 검출하기 위하여 미량정량판 판독기(microtiter plate reader)를 사용하였다. 3개의 독립적 실험을 위하여 모든 데이터를 3회 반복하였다. 결과는 생존 가능한 세포의 억제 백분율로 표시하였으며, 실험 결과로부터 0.01% 아세트산-처리군(음성 대조군)의 값을 제하였다.

HDH-LGBP-A1 펩타이드는 농도 의존적으로 암세포의 생존력을 감소시켰다. 특히, HDH-LGBP-A1 펩타이드는 HeLa 세포에 대하여 독성을 나타내어, 10 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 농도의 HDH-LGBP-A1 펩타이드에 노출시켰을 때, HeLa 세포에서 비-생존율은 각각 35%, 99%, 95%이었다. 마찬가지로, 10 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 농도의 HDH-LGBP-A1 펩타이드에 노출시켰을 때, A549 세포의 25%, 99%, 97%가 손상되었다(도 6c 참조). 또한, HDH-LGBP-A2 펩타이드의 경우, 각각 10 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 농도의 HDH-LGBP-A1 펩타이드에 노출시켰을 때, HeLa 세포에 대한 세포 독성은 각각 16%, 99% 및 98%이었다. 마찬가지로 10 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 농도의 HDH-LGBP-A2 펩타이드에 노출시켰을 때, A549 세포에 대한 세포 독성은 각각 13%, 99%, 99%이었다(도 6d 참조).

반면, 50 ㎍/㎖의 높은 농도에서도 정상 세포(HUVEC)는 세포 생존력을 발휘하였으며, HDH-LGBP-A1 및 HDH-LGBP-A2에 노출시킨 경우의 생존력은 각각 32.8%, 47.9%이었다. 이러한 결과를 토대로, 본 발명에 따라 합성된 펩타이드 변이체는 자궁 암종 및 폐 선암의 성장을 90% 이상 억제할 수 있다는 것을 확인하였으며, 이는 본 발명에 따라 합성된 펩타이드 변이체가 잠재적인 항암 효과를 가지고 있다는 것을 의미한다.

실시예 6 : 암 세포막에 대한 펩타이드 변이체의 항암 효과 분석

본 실시예에서 Annexin Ⅴ-FITC/PI(propidium iodide) 염색법을 사용하여 HeLa 세포의 암 세포막에 대한 HDH-LGBP 펩타이드 변이체의 효과를 연구하였다. 세포막 구조유지(integrity) 및 세포-표면 포스파티딜세린(phosphatidylserine, PS)에 대한 HDH-LGBP의 효과를 평가하기 위하여, HeLa 세포를 35 ㎜ dish에 접종(seeding)하고, 24시간 동안 다양한 농도의 HDH-LGBP-A1 및 A2(1-50 ㎍/㎖)로 항온 배양하고, 음성 컨트롤로서 0.01% 아세트산으로 처리하였다. 일정 농도(1, 5, 10, 20 ㎍/㎖)의 펩타이드 변이체로 처리한 뒤, 트립신 분해(tryptic digestion)시켜 세포를 수확하고, 차가운 PBS로 세척하고, 결합 완충액(binding buffer, 0.01 M Hepes/NaOH, pH 7.4), 0.14 M NaCl, 2.5 mM CaCl₂로 재-현탁시켰다. 이어서, 세포를 제조사의 지시에 따라 FITC-annexin Ⅴ 및 PI로 염색하였다(FITC-Annexin V Apoptosis Detection Kit, BD Biosciences, USA). 염색된 세포를 약하게 혼합하고, flow cytometry, BeckmanCoulter FC500(BeckmanCoulter)으로 측정하였으며, 결과를 CellQuest software(BD Biosciences, USA)를 사용하여 분석하였다. 포스파티딜세린(PS)은 세포계획사(apoptosis)의 초기 단계에서 세포막(plasma membrane)의 내층(inner layer)로부터 외층(outer layer)로 이동한다. 칼슘-의존성 인지질 결합 단백질인 annexin Ⅴ는 높은 친화력으로 PS에 결합하는데, 이 결합은 세포계획사의 마커이다. 손상된 세포 또는 사멸 세포의 붕괴된(interrupt) 막은 PI를 통과시키는 반면, 파손되지 않은(intact) 막을 가지는 생존성 세포는 PI를 배제한다. Q1, Q2, Q3, Q4 게이트는 각각 사멸 세포(dead cell), 세포계획사의 후기 단계, 정상 세포 및 세포계획사의 초기 단계를 나타낸다.

HDH-LGBP-A1 펩타이드 변이체를 사용한 분석 결과는 도 7a 내지 도 7e에, HDH-LGBP-A2 펩타이드 변이체를 사용한 분석 결과는 도 8a 내지 도 8e에 각각 도시되어 있다. Q3 사분면에 포획된 생존 세포(정상 세포)는 펩타이드 변이체로 처리하면 감소하였으나, Q2 및 Q4 사분면에 포획된 세포(세포계획사 중인 세포)는 펩타이드 변이체로 처리하면 농도-의존적으로 증가하였다. HDH-LGBP-A1 펩타이드 변이체로 처리한 암세포의 생존 백분율은 90.5%(control)에서 86.13%(1 ㎍/㎖), 73.33%(5 ㎍/㎖), 68.01%(10 ㎍/㎖), 40.06%(20 ㎍/㎖)로 감소하였으며, HDH-LGBP-A2 펩타이드 변이체로 처리한 암세포의 생존 백분율은 86.89%(1 ㎍/㎖), 75.21%(5 ㎍/㎖), 51.55%(10 ㎍/㎖), 29.76%(20 ㎍/㎖)로 감소하였다. 반면에, Q2 또는 Q4 사분면에 포획된, 세포막의 구조가 손상되거나 상실된 비율은 농도 의존적으로 증가하였다.

도 7a 내지 도 7e 및 도 8a 및 도 8e는 10 ㎍/㎖ 농도의 펩타이드 변이체로 처리한 HeLa 세포에서 세포계획사 중인 세포의 분율이 크게 증가한 것을 보여준다. 이러한 결과로부터, 본 발명에 따라 합성된 펩타이드 변이체는 막 구조유지를 붕괴시키고(PS 노출), 막 투과성을 증가시킴으로써(세포 내부로의 PI의 uptake), HeLa 세포의 사멸을 유도할 수 있다. 또한, 막-붕괴 효과로 인하여 PS가 노출되고, 세포질 성분이 세포 외부로 방출될 수 있으므로, 이에 따라 세포 사멸이 유도된다.

실시예 7 : DNA 결합 및 DNA 중합효소 억제 분석

HDH-LGBP 펩타이드 변이체와 세포내 분자인 DNA와 DNA 중합효소 사이의 상호작용을 알아보기 위하여, 본 발명에 따라 합성된 HDH-LGBP 펩타이드 변이체를 사용하여, 전기영동 이동분석법(EMSA, electrophoretic mobility shift assay)과, DNA 중합효소 억제 분석(DNA polymerase inhibition assay)을 수행하였다. 본 실시예에 따른 시험에서, 아가로스 겔을 통과하는 DNA 밴드의 이동 속도(rate of migration) 억제를 검사하여, 펩타이드-DNA 결합을 평가하였다. 상업적인 분자량 마커인 λ-HindⅢ-분해 DNA(50 ng; Roche, Basel, Switzerland)를 0.01% 아세트산에 용해된 다양한 농도의 펩타이드(0, 0.157, 0.313, 0.625, 1.25, 2.5 ㎍)와 혼합하고, 상온에서 5분 동안 항온 배양한 뒤에, 0.5 ㎍/㎖의 ethidium bromide(EtBr)을 함유하는 1.0% 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 분석 결과는 도 9a에 도시되어 있다. 일반적으로 음 전하의 DNA는 전기장에서 양극으로 이동하여야 하는데, DNA가 양이온성 펩타이드로 밀집되어 있으면(compact), DNA는 로딩-웰에서 서서히 이동하거나 움직이지 않는다. 착체를 형성하지 않은 DNA와 비교해서 2.5 ㎍의 HDH-LGBP-A1에 의하여 이동도가 다소 억제되었다.

이어서, 펩타이드 변이체의 DNA 중합효소 활성 억제를 평가하기 위하여, 다양한 농도(2.5, 1.25, 0.625, 0.313 ㎍/㎖)의 펩타이드 변이체를 각각의 반응 혼합물에 첨가하였다. 다음의 프라이머 쌍을 사용하여, E. coli 유전체 DNA(genomic DNA)를 PCR을 위한 template로서 사용하였다. 16S-F1, 5'-CTCCTACGGGAGGCAGCAG-3', 16S-R3, 5'-CCAGGGTATCTAATCCTG-3'. 예측된 증폭산물(amplicon)은 길이가 ~1.5 kb이었다. 각각의 PCR은 90℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분씩의 30 사이클로 구성되었다. PCR 후에, 모든 증폭산물은 EtBr을 함유하는 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동하였다.

분석 결과는 도 9b에 도시되어 있다. 합성된 2개의 펩타이드 유사체는 모두 강한 DNA 중합효소 억제 활성을 보였으며, 특히, HDH-LGBP-A2 펩타이드가 HDH-LGBP-A1 펩타이드에 비하여 더욱 강한 DNA 중합효소 억제 활성을 나타냈다. 시험된 모든 농도(0.157 - 5 ㎍)에서 HDH-LGBP-A2에 의하여 DNA 중합효소의 활성이 완전히 억제되었으며, HDH-LGBP-A1의 경우 HDH-LGBP-A2와 비교해서, 0.313 ㎍의 농도에서 적은 억제 활성을 보여 주었다. 본 실시예의 실험 결과, HDH-LGBP 유래의 펩타이드 변이체가 DNA 단독인 경우보다 DNA 중합효소에 대한 친화력이 크다는 것을 암시하고 있다.

상기에서는 본 발명의 예시적인 실시형태 및 실시예에 기초하여, 본 발명을 설명하였으나, 본 발명이 전술한 실시형태 및 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되지 않는다. 오히려 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 전술한 실시형태 및 실시예에 기초하여 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고할 수 있을 것이다. 하지만, 이러한 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 사실은 첨부하는 청구의 범위를 통하여 더욱 분명해질 것이다.

<110> Republic of Korea(National Fisheries Research and Development Institute) <120> ANTIMICROBIAL PEPTIDE DERIVED FROM ABALONE LIPOPOLYSACCHARIDE AND BETA-GLUCAN BINDING PROTEIN, NUCLEIC ACID ENCODING THE PEPTIDE AND USES THEREOF <130> 2163 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Haliotis discus <400> 1 Trp Leu Trp Pro Ala Ile Trp Met Leu Pro Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Haliotis discus <400> 2 tggttgtggc ccgccatatg gatgctgccg acg 33 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant Peptide Derived from Haliotis discus <400> 3 Trp Leu Trp Lys Ala Ile Trp Lys Leu Leu Thr 1 5 10 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid Encoding Variant Peptide Derived from Haliotis discus <400> 4 tggttgtgga aagccatatg gaaactgttg acg 33 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant Peptide Derived from Haliotis discus <400> 5 Trp Leu Trp Lys Ala Ile Trp Lys Leu Leu Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid Encoding Variant Peptide Derived from Haliotis discus <400> 6 tggttgtgga aagccatatg gaaactgttg aaa 33

Claims

하기 일반식 Ⅰ의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드.
일반식 Ⅰ
(N-말단)-WLWKAIWKLLX-(C 말단)
(일반식 Ⅰ에서 X는 리신(K) 또는 트레오닌(T)임)
제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 항균 활성 및 항암 활성 중에서 선택되는 적어도 하나의 생리적 활성을 가지는 펩타이드.
제 1항에 있어서, 상기 일반식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드의 C-말단은 아미드화되어 있는 펩타이드.
제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 그람양성세균, 그람음성세균 및 효모에 대하여 항균 활성을 나타내는 펩타이드.
제 1항에 기재된 펩타이드를 코딩하는 핵산.
제 5항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호: 4 또는 서열번호: 6의 염기 서열로 구성되는 뉴클레오티드를 포함하는 핵산.
제 5항 또는 제 6항에 기재된 핵산이 삽입된 재조합 발현 벡터.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 하나의 항에 기재된 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 펩타이드는 자궁암, 자궁경부암 및 폐암으로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 암을 치료하는 항암용 약학 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 하나의 항에 기재된 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 항균용 약학 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 펩타이드는 그람양성세균, 그람음성세균 및 효모에 대하여 항균 활성을 나타내는 항균용 약학 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 하나의 항에 기재된 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 항균용 화장품 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 하나의 항에 기재된 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 항균용 식품 첨가제.