JPH0314521A - 抗腫瘍性物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、貝類の煮汁の乾燥粉末または濃縮物からクロ
マトグラフ吸着を利用して水溶性含糖蛋白質からなる抗
腫瘍性物質を分離する方法の改良に関する。

〔従来の技術及び発明が解決すべき課題〕従来の抗腫瘍
性物質の大部分は低分子化合物であり、その主たる作用
は癌細胞に対する直接細胞毒性によるものであり、した
がって宿主である生体に対する一般毒性が強く、生体の
受ける障害が大きいという問題がある。そのため分子量
が比較的大きく毒性の低い、しかも免疫賦活作用をもつ
抗腫瘍性物質である多糖類などを植物、微生物等から抽
出して粗粉末の形で使用しているがこれらは抗癌スペク
トルが狭く、臨床的な利用に限界がある。

これを解決する一手段として、本発明者らはさきに貝類
の煮汁の乾燥粉末又は濃縮物から水溶性含糖蛋白質より
なる新規な抗腫瘍性物質を分離することに戒功した（た
とえば特開昭５９−　２７８２９号公報参照）。代表的
なかかる抗腫瘍性物質は、貝類の煮汁の乾燥粉末または
濃縮物を原料とし、これを塩基性陰イオン交換体を使用
するイオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過ゲルを
用いるゲル濾過に付することによって分離される、分子
量１０，０００〜３００，０００の範囲内の水溶性含糖
蛋白質からなるものである。

しかしながら、上記した製造法では、抗腫瘍性物質の含
有量が少ない原料から有効成分を効率よく分取すること
が困難で、収率及び精製度に難点があった。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、前述したごとき従来技術的に十分解決されて
いなかった問題点を解決する抗腫瘍性物質の製造法を開
発することを目的とする。すなわちより具体的にいえば
、貝類の煮汁の乾燥粉末又は濃縮物からクロマトグラフ
吸着法を利用して水溶性含糖蛋白質からなる抗腫瘍性物
質をより高収率かつ高精製度で効率よく分取し得る抗腫
瘍性物質の製造法を開発することを目的とする。

本発明者らは、前述の課題を解決すべく種々検討した結
果、クロマトグラフ吸着法として疎水クロマトグラフィ
ー及びそれに続くイオン交換クロマトグラフィーの組合
せを用いると既知、慣用的なこの種の精製方法と比較し
て抗腫瘍性物質が予想外の高収率、高精製度で効率よく
分取できることを見出して本発明を完威した。

したがって本発明は、貝類の可食部分を熱水性溶媒で蒸
煮もしくは加熱加工する際に得られる煮汁の乾燥粉末又
は濃縮物からクロマトグラフ吸着を利用して水溶性含糖
蛋白質からなる抗腫瘍性物質を分離する際、（ａ）疎水
基をゲルに固定化した疎水クロマトグラフィー及びそれ
に続く（ｂ）塩基性陰イオン交換体を使用するイオン交
換クロマトグラフィーの処理の組合せを用いることを特
徴とする抗腫瘍性物質の製造法を提供するものである。

本発明で原料とする貝頚の煮汁の乾燥粉末または濃縮物
は、既知のごとく、典型的には特開昭５９−　２７８２
９号公報に開示されている貝類の煮汁の乾燥粉末または
濃縮物の製造方法に準拠して製造することができる。ま
た利用し得る貝類の種類も該公報に記載の範囲の任意の
ものであり得る。

本発明においては、かく得られる貝類煮汁の乾燥粉末又
は濃縮物から有効戒分をクロマトグラフ吸着法を利用し
て分離・採取して抗腫瘍剤として使用するものであるが
、本発明者らは驚くべきことに、前記工程（ａ）及び（
ｂ）を記載の順序で併用する場合に限り、後記実施例等
によって実証されるとおり、目的生成物の抗Ｍ！１！瘍
性を損なうことなしに該抗Ｉｆｆ！瘍性物質を予想をは
るかに超える高収率かつ高純度で効率的に取得できる事
実を見出したものである。

疎水クロマトグラフィーによる処理を行なった後に実施
する塩基性陰イオン交換体を使用するイオン交換クロマ
トグラフィーは一回の処理でもよいが、粒子径の大きい
ゲルで粗精製を行なった後、粒子径の小さいゲルを用い
た高速液体クロマトグラフィーで再精製を行なうことが
好ましい。

疎水クロマトグラフィーによる処理においては、約１．
０〜３．０モル濃度、好適には約１．０〜２．０モル濃
度、最適には約１．３〜１．８モル濃度の塩化ナトリウ
ムを含有する水溶液で疎水基をもつゲルに吸着させた後
、滅菌水等を溶出液として用いることが望ましい。

塩基性陰イオン交換体を使用するイオン交換クロマトグ
ラフィーによる処理においては、約０．１〜０．７モル
濃度、好適には約０．１〜０．６モル濃度、最適には約
０．２〜０．５モル濃度の塩化ナトリウムを含有する水
溶液を溶出液として用いることが望ましい。

また疎水クロマトグラフィー処理に先立って貝類の煮汁
から得られる水溶液から不溶解部を除去しておくことが
望ましくまたイオン交換クロマトグラフィー処理の前に
は無機塩も除去することが処理の円滑化のために望まし
い。また、本発明の製造方法においては、透析、限外濾
過、ゲル濾過等公知の蛋白質性物質分離精製手段を適宜
併用することができる。以下これら工程の詳細について
述べる。また得られた物質の抗ＩＩ！Ｔ！瘍活性の検定
方法は、特記しない限りつぎの方法で行なった。

抗１１ｆｉ瘍活性の検定方法 ６週令のマウス（ｉｃＲ系雌）腹腔内にサルコーマ（Ｓ
ａｒｃｏｍａ）　１８０腫瘍細胞を接種し、１週間後に
増殖した腫瘍細胞を腹水と共に抜き取り、この細胞４Ｘ
１０ｂ個を他の６週令マウス（ＩＣＲ系雌）のそけい部
皮下に移植する。１週間後固形腫瘍が形威されているこ
とを確認して、所定の濃度となるように生理食塩水に溶
解した検定試料をその腫瘍内もしくはその周囲に移植後
、５、７、９日目に隔日３回投与する。腫瘍移植５週間
後の固形腫瘍を摘出し、その重量を試料の代りに生理食
塩水を投与した対照区の場合と比較する。中間経過につ
いては固形腫瘍の直径を測定することによって調べた．
得られた結果を次の弐によって表示した．腫瘍阻止率（
χ）一 目的物質の分離方法につき詳述すると、貝類の煮汁から
得られる原料水溶液からまず不溶解分をたとえば遠心分
離、濾過あるいは傾瀉法により除去する。原料が乾燥粉
末の場合には、たとえばｐＨ約７．０〜７．５で濃度約
０．０１〜０．１モル濃度、好ましくは約０．０１〜０
．０５モル濃度のりん酸緩衝液等に原料粉末を溶解し、
前記の操作により不溶解分を除去する。こうして得られ
る溶液の塩化ナトリウム濃度は、約１．０〜３．０モル
濃度、好適には約１．０〜２，０モル濃度、最適には約
１．３〜１．８モル濃度に調整しておく。この溶液を排
除限界分子量（分画できる上限値）が充分大きい、たと
えば約５００，　０００〜１０，　０００，　０００の
疎水基をゲルに固定化した疎水クロマトグラフィー用ゲ
ル、好適には親水性水酸基をもつゲル濾過剤の水酸基部
にアルキル基又はフエニル基を導入した疎水クロマトグ
ラフイー用ゲル（たとえば東ソー社製の登録商標ＴＳＫ
ｇｅｌブチルトヨパール６５０Ｍ、これは親水性水酸基
をもつ排除限界分子ｍｓ，ｏｏｏ，ｏｏｏのポリビニル
系ゲル濾過剤の水酸基部にブチル基を導入した製品であ
る）を用いて吸着分離する。すなわち、前記の疎水クロ
マトグラフィー用ゲルを充填したカラムを約１．０〜３
．０モル濃度、好適には約１．０〜２．０モル濃度、最
適には約１、３〜１．８モル濃度の塩化ナトリウムを含
有するｐ＋１約７．０〜７．５で濃度約０．０１〜０．
５モル濃度、好ましくは約０．０１〜０．１モル濃度の
りん酸緩衝液で平衡化した後、前記の調製した試料溶液
をカラムに注入して吸着させる。この平衡化と前記の調
製試料の塩化ナトリウム濃度は同一であることが好まし
い。つぎに調製した試料溶液と同濃度の塩化ナトリウム
を含むりん酸緩衝液を徐々に流し込んで溶出液を紫外線
検出器等のモニターを利用して検出する。この塩化ナト
リウム濃度で脱離してくる両分の溶出後、溶出液として
滅菌水を注入し、滅菌水で溶出される両分を採取する。

この画分を凍結乾燥またはロータリーエバボレーター等
により濃縮した後、脱塩する。脱塩は、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、透析及び限外濾過等によって行なうこと
ができる。たとえばゲル濾過クロマトグラフィーによる
方法では、分子量が約５００〜５０００の分画範囲をも
つ濾過用ゲル（たとえばファルマシア・ファイン・ケミ
カルズ社製の登録商標セファデックスＧ２５；これはデ
キストランをエピクロルヒドリンで三次元的に架橋して
得られたゲルである）を充填したカラムに注入してゲル
濾過クロマトグラフィーを行ない、塩化ナトリウム等に
よる溶出液の電気伝導度が上昇する前の両分を取得する
。こうして得られた溶液を凍結乾燥すると淡微黄色粉末
が得られる。この操作により塩化ナトリウムなど無機塩
は高分子量の有機物質を主とする画分から分離すること
ができる。

この操作においては高分子の有機物と無機塩の画分の分
離の判定は電気伝導度の差によって行なったが、このよ
うな分離を確認する手段としてはその他いかなる検出器
を用いてもよい。この疎水クロマトグラフィー処理にお
ける目的物を分離する塩濃度の決定は、つぎの実験結果
に基づいて行なった。

ロマ　グーフ　ー　　の ホタテ貝煮汁の乾燥粉末５ｇをｐ１１７．５　、０．０
１モル濃度のりん酸緩衝液２０／ｄに溶解し、遠心分離
により不溶解分を除去した上清液を疎水クロマトグラフ
ィーにより分離した。すなわちカラムに充填したＴＳＫ
ｇｅｌプチルトヨパール６５０Ｍに５．０モル濃度の塩
化ナトリウムを含有するｐＨ１．５、０．１モル濃度の
りん酸緩衝液をポンプで注入することにより平衡化して
おき、あらかじめバイパスさせておいた上清液をバルブ
を切りかえることによりポンプを用いてカラムに注入す
る。その後ｐＨ７．５、０．１モル濃度のりん酸緩衝液
をベースとして、二液用グラジエントポンプを用いて塩
化ナトリウム濃度を５．０モル濃度からＯモル濃度へと
徐々に変化させる。

第１図は、その溶出パターンの結果を示し、横軸は溶出
液の百分ナンバーを表わし、白丸は各百分の糖の含有量
の指標、すなわちフェノール硫酸法で発色させ、４９０
ｎｍ波長の吸光度（光学密度）を、黒丸は各両分の蛋白
質含有量の指標すなわちロウリ−（Ｌｏ−デｒｙ）法で
発色させ、その７５０ｎｍの波長の吸光度（光学密度）
を、点線は塩化ナトリウムの溶出濃度（モル／ｌ）を表
わす．（以下の溶出パターンについても同様とする．）
第Ｉ図に示すようなＡ，Ｂ，ＣおよびＤの４つの画分に
なるように溶出液を集め、それぞれ凍結乾燥により濃縮
し、セファデックスＧ２５にて脱塩を行ない、凍結乾燥
により水分を除去してそれぞれＨ−Ａ，Ｈ−Ｂ，Ｈ−Ｃ
，およびＨ−Ｄの淡微黄色粉末を得た。それぞれの両分
の腫瘍内局所投与での抗腫瘍活性の結果を第ｌ表に示す
。

」毘」一１一 第１表より画分Ｈ−Ｃおよび画分Ｈ−Ｄが高い抗腫瘍活
性を示していることがわかる。これより、疎水性の強い
百分が高い抗独瘍活性を示し、約１．０〜３．０モル濃
度、好適には約１．０〜２．０モル濃度、最適には約１
．３〜１．８モル濃度の塩化ナトリウムを含有するリン
酸緩衝液で、この濃度で離脱する画分を溶出した後、滅
菌水で溶出してくる両分を分取すると高い抗腫瘍活性を
示す抗腫瘍性物質を分取できることがわかる。

こうして精製した目的物含有混合物の精製度を更にあげ
るためには、塩基性陰イオン交換体を使用するイオン交
換クロマトグラフィーを用いて分離する。分離は、一回
でもよいが、粒子径の大きなゲルで粗精製を行なった後
、粒子径の細かいゲルを用いた高速液体クロマトグラフ
ィーで精製を行なうのが好ましい。

粒子径の大きなゲルで行なう粗精製は、粒子径の大きい
、たとえば約３０〜３００ミクロンの塩基性陰イオン交
換ゲル、好適には解離基としてジエチルア箋ノエチル基
あるいはアミノエチル基等を有する陰イオン交換ゲル（
たとえばファルマシア・ファイン・ケξカルズ社製の登
録商標ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ；これはアガ
ロースを２，３ジブ口モプ口パノールを用いて三次元架
橋したものにジエチルアミノエチル基をエーテル結合で
結合したもので、対イオンとしてクロルイオンを持ち、
排除限界分子量は約１×１０ｂ、総交換容量は１５±２
ｍｅｑ／１００　ｒｒｄｌゲルである）を充填したカラ
ムを用いて吸着分離する。すなわち前記の塩基性陰イオ
ン交換ゲルを充填したカラムを約０．０１〜０．１モル
濃度、好適には約０．０１−０．０９モル濃度、最適に
は約０．０１〜０．０８モル濃度の塩化ナトリウムを含
有するｐＨ約７．０〜７．５で濃度約０．０１〜０．１
モル濃度、好ましくは約０．０１〜０．０５モル濃度の
りん酸緩衝液で平衡化した後、平衡化した緩衝液と同一
の緩衝液に溶解した試料をカラムに注入して、吸着され
ない物質を素通りさせて取り除き吸着性物質をイオン交
換体上に吸着させる。つぎに同一緩衝液を徐々に注入し
ながら紫外線検出器等のモニターを使用してこのイオン
濃度で溶出する画分が完全に流出したのを確認後、約０
．１〜０．４モル濃度、好適には約０．１〜０．３モル
濃度、最適には０．２〜０．３モル濃度の塩化ナトリウ
ムを含有するｐＨ約７．０〜７．５、濃度約０．０１〜
０．１モル濃度、好ましくは約０．０１〜０．０５モル
濃度のりん酸緩衝液からなる溶出剤で脱離・溶出してく
る両分を採取する． この画分を凍結乾燥またはロータリーエバポレーター等
により濃縮した後、脱塩する．脱塩後、凍結乾燥を行な
って、淡微黄色粉末を得る。

この粒子径の大きなゲルで行なうイオン交換クロマトグ
ラフィー処理における目的物を分離する塩濃度の決定は
、つぎの実験結果に基づいて行なった。

ホタテ貝煮汁の乾燥粉末を原料とし、ＴＳκｇｅｌプチ
ルトヨバール６５０Ｍをカラムに充填した疎水クロマト
グラフィー処理を行なった後、セファデックスＧ２５で
脱塩処理を行ない、凍結乾燥して得られた乾燥粉末を試
料とした。この乾燥粉末５ｇをｐｌ１７．０　、０．０
１モル濃度のりん酸緩衝液２０ｔｄに溶解した試料液を
、試料を溶解したのと同じりん酸緩衝液で平衡化させた
ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６　Ｂゲル力ラムに添加
する。塩化ナトリウムの連続的濃度勾配をＯ〜０．４モ
ルとした溶出剤を用いてクロマトグラフィーを行なうと
第２図に示す溶出パターンが得られた。

それぞれ第２図に示すようなＡ，Ｂ，ＣおよびＤの４つ
の両分に溶出液を集め、凍結乾燥により濃縮し、セファ
デックスＧ２５にて脱塩を行なった後、凍結乾燥により
水分を除去してそれぞれＤＡ，Ｄ−Ｂ，Ｄ−ＣおよびＤ
−Ｄの粉末標品を得た．これらの両分のＩＩＩ　７Ｂ内
局所投与での抗ＩＩ！ｌ！瘍活性の結果を第２表に示す
。

］ＬＬ哉一 第２表より画分Ｄ−ＣおよびＤ−Ｄが高い抗肺瘍活性を
示している．この結果から塩化ナ１・リウム濃度約０．
０１−　０．１モル濃度の緩衝液で吸着させた両分を塩
化ナトリウム濃度約０．１〜０．４モル濃度の溶出液で
溶出すると目的物質が効果的に得られることがわかる。

こうして精製された目的物含有混合物の精製度をさらに
高めるためには、粒子径の小さい塩基性陰イオン交換体
を使用する高速液体クロマトグラフィーで精製するのが
好ましい．すなわちたとえば約５〜２０ミクロン粒度の
塩基性陰イオン交換ゲル、好適には解離基としてトリメ
チルアミノメチレン基又はアミノメチレン基等を有する
陰イオン交換ゲル（たとえばファルマシア・ファイン・
ケごカルズ社の登録商標ＭｏｎｏＱ　：これは親水性ポ
リエーテル樹脂にトリメチルアミノメチレン基をエーテ
ル結合で結合して得られたゲルである）を充填したカラ
ムを用いて高速液体クロマトグラフィーにより吸着分離
する。前記の塩基性陰イオン交換ゲルを充填したカラム
をｐＨ約７．０〜？　．　５，′ａ度約０．０１〜０．
１モル濃度、好ましくは約０．０１〜０．０５モル濃度
のりん酸緩衝液で平衡化した後、平衡化した緩衝液と同
一の緩衝液中に溶解した試料をカラムに注入して吸着性
物質をイオン交換体上に吸着させる．つぎに同一緩衝液
をカラムに徐々に注入しながら紫外線検出器等のモニタ
ーを使用して溶出する両分が完全に流出したことをｆｌ
ｉ認後、約０．１〜０．７モル濃度、好適には約０．１
〜０．６モル濃度、最適には約０．２〜０．５モル濃度
の塩化ナトリウムを含有するｐＨ約７。０〜７．５、濃
度約０．０１〜０．１モル濃度、好ましくは約０６０ｌ
〜０．０５モル濃度のりん酸緩衝液からなる溶出剤で脱
離、溶出してくる両分を採取する。この高速液体クロマ
トグラフィーによる分離精製においては、精製度を上げ
るために前記のカラムに吸着させた有効戒分を約０．１
〜０．３モル濃度、好適には約０．１〜０．２５モル濃
度、最適には０、２〜０．２５モル濃度の塩化ナトリウ
ムを含有するｐ｝１約７．０〜７．５、濃度約０．０１
〜０．１モル濃度、好ましくは約０．０１〜Ｏ．ＯＳモ
ル濃度のりん酸緩衝液で脱離、溶出してくる画分を採取
した後、さらに約０．３〜０．７モル濃度、好適には約
０．３〜０．６モル濃度、最適には０．４〜０．６モル
濃度の塩化ナトリウムを含有するｐＨ約７．０〜７．５
、濃度約０．０１〜０．１モル濃度、好ましくは約０．
０１〜０．０５モル濃度のりん酸緩衝液で脱離、溶出し
てくる両分を採取して、２つの画分を採取してもよい。

こうして得られた両分を凍結乾燥又はロータリーエバボ
レーター等により濃縮した後脱塩する。

脱塩後、凍結乾燥を行なって淡微黄色粉末を得る。

この粒子径の小さい塩基性陰イオン交換ゲルを用いる高
速液体クロマトグラフィー処理において、目的物を分離
する塩濃度の決定はつぎの実験結果に基づいて行なった
。

ホタテ貝煮汁の乾燥粉末を原料とし、ＴＳＫｇｅｌプチ
ルトヨパール６５０Ｍをカラムに充填した疎水クロマト
グラフィー処理、セファデックスＧ２５による脱塩処理
、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ　−　６８をカラムに充
填したイオン交換クロマトグラフィー処理及びセファデ
ックスＧ２５による脱塩処理を行なった後、凍結乾燥し
て得られた乾燥粉末を試料とした。この乾燥粉末５ｇを
ｐｔｔ　７．０の０．０１モル濃度りん酸緩衝液２０ｄ
に溶解した試料液を試料を溶解させたのと同一のりん酸
緩衝液で平衡化させたＭｏｎｏＱゲルカラムに添加する
。溶出剤に塩化ナトリウムの連続的濃度勾配Ｏ〜０．５
モル濃度をつけて高速液体クロマトグラフィーを行なう
と第３図に示す溶出パターンが得られ、これを塩化ナト
リウム濃度がそれぞれ０，０−０．２５、０．２５〜０
．５モル濃度で２容出してくるＡ，Ｂ，Ｃの３画分に分
画した。凍結乾燥により濃縮してからセファデックスＧ
２５ゲルによる脱塩後、凍結乾燥して粉末標品ＦＰ−Ａ
、ＦＰ−Ｂ，ＦＰ−Ｃを得た。これらの両分の腫瘍内局
所投与での抗腫瘍活性の結果を第３表に示す。

二燵二Ｌｔ この結果から塩化ナトリウム濃度約０．１〜０．７モル
濃度の溶出液で溶出すると目的物質が効果的に得られる
ことがわかる。

本発明の製造法によって得られる水溶性含琺蛋白質から
なる抗腫瘍性質の典型的な理化学的性質はつぎのとおり
である。

（１）分子量： ＳＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量
は３０．０００〜３００　，　０００の範囲であった。

（２）融点： ２３５゜Ｃ以上で分解しはじめ、明確な融点は示さない
。

（３）紫外線吸収スペクトル： 水溶液における吸収スペクトルを第４図に示す。λｌ｛
ａｇ　２８０ｎ＠附近に吸収を示す。

（４）赤外線吸収スペクトル： ＫＢｒ錠により測定したスペクトルを第５図に示す。吸
収は３３００、２９００，　１６５０、１５４０，１４
００ｃｍ−’附近に特性吸収がみられる。

（５）溶剤に対する溶解性： 水に易溶。メタノール、エタノール、アセトン等の有機
溶剤に不溶。

（６）呈色反応： ビウレット反応、キサントプロテイン反応、フェノール
試薬による反応、アンスロン硫酸反応、フェノール硫酸
反応は陽性。システイン硫酸反応は偽陽性。

（７）物質の色及び外観： 白色〜淡微黄色、固体粉末状。

（８）加水分解物中のアミノ酸： ６Ｎ塩酸中、１０５〜１１０゜Ｃで２４時間の加水分解
により少なくともつぎのアミノ酸が認められた。

アスパラギン酸、ハイドロブロリン、スレオニン、セゾ
ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、シ
ステイン、パリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシ
ン、チロシン、フェニルアラニン、リジン、アルギニン
、ヒスチジン、ハイドロキシリジン。

（９）加水分解物中の糖： ２Ｎ塩酸中、８０　−　９０゜Ｃで１０時間の加水分解
を行ない、イオン交換によりアミノ酸を除いたものを還
元した中に少なくともつぎの糖が認められた。

フルクトース、マンノース、フコース、イノシトール、
ガラクトース。

以上のような諸性質について、貝類から得た抗腫瘍性物
質は、特開昭５９　−　２７８２９号公報に記載の抗Ｉ
Ｉ！ｌＳ性物質の性質と比べて極めて近い性状を有して
いる。

本発明による抗腫瘍剤の製造方法においては、従来の方
法に比べて、目的とする抗腫瘍剤を抗腫瘍活性を失うこ
となく著しく高収率でしかも工業的規模で製造すること
ができる。その一例を第４表に示す。

第４表において１，２、３、１′　２′及び３′は本発
明の製造方法に従って実施した場合であり、４は従来法
の例として特開昭５９−　２７８２９号公報に開示され
ている製造方法で実施した場合である。

また５は、本発明と精製順序を逆にした場合である。１
、２及び３は、ホタテ貝の煮汁から得られた乾燥粉末を
原料として、疎水クロマトグラフィー及びそれに続く粒
子径の大きなイオン交換クロマトグラフィーで処理した
場合であり、１′　　２′及び３′はそれをさらに粒子
径の小さいイオン交換高速液体クロマトグラフィーで処
理した場合である。一方、４は同一原料を粒子径の大き
なクロマトグラフィー及びそれに続くゲルクロマトグラ
フィーで処理した場合である。また５は、同一原料を粒
子径の大きなクロマトグラフィー及びそれに続く疎水ク
ロマトグラフィーで処理した場合である。

各クロマトグラフィーの処理条件はつぎのとおりである
。

（１）　　疎水クロマトグラフィー ■　使用ゲル ＴＳＫｇｅｌプチルトヨパール６５０Ｍ■　吸着条件 １．５モル濃度の塩化ナトリウムを含有するｐｌｌ７．
５　、０．０１モル濃度のりん酸緩衝液で吸着する戒分
を吸着 ■　溶出条件 滅菌水で溶出 （２）粒子径の大きなイオン交換クロマトグラフィー ■　使用ゲル ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ ■　吸着条件 ０．０７モル濃度の塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．
５　、０．０１モル濃度のりん酸緩衝液で吸着する成分
を吸着 ■　溶出条件 ０．２５モル濃度の塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．
５　、０．０１モル濃度のりん酸緩衝液で溶出 （３）粒子径の小さいイオン交換高速液体クロマトグラ
フィー ■　使用ゲル Ｍｏｎｏ　Ｑ ■　吸着条件 ０．２５モル濃度の塩化ナ１・リウムを含有するｐＨ７
．５　、０．０１モル濃度のりん酸緩衝液で吸着する戒
分を吸着 ■　溶出条件 ０．５モル濃度の塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．５
　、０．０１モル濃度のりん酸緩衝液で？容出 （４）ゲルクロマトグラフィー ■　使用ゲル セファデックスＧ−７５　（ファルマシア・ファイン・
ケミカルズ社製の登録商標名）■　精製条件 ｐｌｌ７．５　、０．１モル濃度のりん酸緩衝液にてク
ロマトグラフィーを実施して得られる最初の高分子量の
ピークを取得 また収率は、ホタテ貝の煮汁から得られた乾燥粉末に対
する収率（％）を示し、腫瘍阻止率は腫瘍内局所投与（
３回投与）での阻止率を示し、（　）内は１回の投与量
（■／匹）を示す。

第４表から本発明の製造法によれば、従来法と比較して
はるかに高収率で、しかも抗ＩＩＩ瘍活性の著しく高い
抗１ｔ！！！瘍剤を製造することができることは明らか
である。

また本発明の製造方法によって得られる水溶性含糖蛋白
質からなる抗腫瘍性物質は細胞毒性もなく、広い抗腫瘍
スペクトルを示し、腫瘍内、静脈内、腹腔内、皮下等の
種々の投与法によっても著しいＩＩＩＩ縮退効果を示す
きわめてすぐれた抗腫瘍剤である。さらに本発明によっ
て得られる抗腫瘍剤は他の抗腫瘍剤と併用することもで
きる。免疫学的効果の増強をもたらすような併用は特に
効果的である。

〔実施例〕

以下実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、こ
れらは単に例示の目的で示すものであってなんら本発明
を限定するものではない。

実施例１ 生ホタテ貝に対し０．１０重量倍の量の１０５〜１１０
゜Ｃの熱スチームを生ホタテ貝に直接吹き付け、１０分
間９０〜１００゜Ｃに蒸煮することにより有効戒分が凝
縮水に溶けた一番煮汁を得た。原料としたホタテ貝には
その重量の約０．１倍量のフジ貝が付着していた。一番
煮汁は７時間で９０゜Ｃから５０゛Ｃに徐冷した後、熱
風入口温度２８０゜Ｃ、出口温度１２５゜Ｃの噴霧乾燥
器により滞留時間４５秒で瞬間的に乾燥して有効或分を
粉末標品（１ａ〉として得た。この粉末の収率は貝に対
して０．２７重量％であった。

一番煮汁を取得した後の加熱ホタテ貝から貝柱部分のみ
を取り出しこれを原料とした。沸騰している食塩水（塩
濃度１０重景％）　４５０　ｋｇの中へ貝柱５０ｋｇを
浸漬した。浸漬により液温は７０″Ｃになるが２０分間
加熱して再度沸騰させ、この時点で貝柱を食塩水から引
き揚げた。得られた煮汁中で上記と同様にして貝柱５０
ｋｇずつをさらに３回処理した。

こうして得られた二番煮汁を１５時間で９０’Ｃから４
０゜Ｃに徐冷した後、一番煮汁の乾燥と同じ条件で噴霧
乾燥器により有効或分を粉末として得た。この粉末標品
（１ｂ）の収率は貝に対して０．２０重量％であった。

一番煮汁から得た粉末２重量部と二番煮汁から得た粉末
ｌ重量部とを混合して混合粉末の標品（１ｃ）を調合し
た。

この混合物粉末（ｌｃ）４９．３　ｇにその１０重量倍
のｐｕ７．５　、０．０１モル濃度のりん酸緩衝液を加
えて懸濁液とし、この懸濁液を１０，ＯＯＯＧ、５゜ｃ
で２０分間遠心分離して沈殿物を除いた上清液を得た。

この上清液の塩化ナトリウム濃度は１．５モル濃度であ
った。この上清液を、疎水クロマトグラフィー用ゲルＴ
ＳＫｇｅｌプチルトヨバール６５０Ｍを充填したのちｐ
Ｈ７．５　、０．１モル濃度のりん酸緩衝液に１．５モ
ル濃度の塩化ナトリウムを加えた溶出液で平衡化したカ
ラムヘチャージした後、平衡化と同じ組成の溶出液で溶
出させ、素通りする画分を取り除き、充分に素通り画分
がなくなったことを紫外線モニターで確認したのち、溶
出液を滅菌水に替えて同じカラムへ導入し、これによっ
て溶出する百分を取得した。この両分を凍結乾燥により
濃縮し、この溶液を、ゲル濾過用セファデックスＧ２５
を膨潤させて充填したのち滅菌水で平衡化したカラムヘ
チャージした後、滅菌水で溶出させ、溶出液の電気伝導
度が塩などの溶出によって上昇しはじめる前の両分を採
り、これを凍結乾燥して１．６ｇの粉末標品（ｌｄ）を
得た。この粉末標品１ｄの腫瘍内局所投与での抗腫瘍活
性効果を第５表に示す。

前記と同様にして得られた粉末標品（ｌｄ）　１．０ｇ
ニｐｌ＋７．５　、０．０１モル濃度のりん酸緩衝液を
加えて悲濁液とし、コ（７）　′！ｆＡ濁液をｉｏ，ｏ
ｏｏｃ、５゜ｃで２０分間遠心分離して沈殿物を除き、
上清液をイオン交換クロマトグラフィーにより分離した
。すなわちこの上清液を、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ
−６Ｂを充填させたのちｐｌ１７．５　、０．０１モル
濃度のりん酸緩衝液に０．０７モル濃度の塩化ナトリウ
ムを加えた溶出液で平衡化したカラムヘチャージした後
、平衡化した溶液と同じ組成の溶出液で溶出させ、素通
りする画分を取り除き、充分に素通り画分がなくなった
ことを紫外線モニターで（Ｉ′ｌＩ認したのち、溶出液
をｐｌｌ７．５　、０．０１モル濃度のりん酸緩衝液に
０．２５モル濃度の塩化ナトリウムを加えた溶出液に替
えて同じ力ラムに導入し、これによって？容出する両分
を取得した．この画分を凍結乾燥により濃縮し、前記疎
水クロマトグラフィーで得た両分の処理と同様にしてセ
ファデックスＧ２５にまり脱塩を行ない、これを凍結乾
燥して粉末標晶（Ｉｅ）０．３２　ｇを得た。１ｅのＩ
ｔ！］！瘍内局所投与での抗１１ｆｆ！瘍効果を第６表
に示す。

実施例２ 実施例１と同様にして得られた粉末標品（ｌｅ）　１９
８■をｐＨ７．５　、０．０１モル濃度のりん酸緩衝液
に溶解し、０．２２μｍフィルターを通して不溶解分を
除去した溶液を高速液体クロマトグラフィーにより分離
した。すなわち高速液体クロマトグラフィー用プレパッ
ク力ラムＭｏｎｏ　ＱにポンプでｐＨ７．５　、０．０
１モル濃度のりん酸緩衝液を注入して平衡化した後、予
めバイパスに注入しておいた先の不溶解分を除去した溶
液をバルブを切りかえることにょりカラムに注入してカ
ラムに試料を吸着させた。ついでｐＨ７．５　、０．０
１モル濃度のりん酸緩衝液と塩化ナトリウムを０．５モ
ル濃度で含有するｐｌ！７．５　、０．１モル濃度のり
ん酸緩衝液をあらかじめ設定したプログラムに基づき二
液用グラジェントポンプを用いて第６図の点線で示す塩
化ナトリウム溶出濃度となるように注入して試料を溶出
した。

そのときの紫外線モニターで６′ｆｉＬ’２した試料溶
出のチャートを第６図に示す。この第３番目の画分Ｃを
採取し、凍結乾燥により濃縮した後、前記疎水クロマト
グラフィーで得た画分の処理と同様にしてセファデック
スＧ２５により脱塩を行ない、これを凍結乾燥して粉末
標品（２ｆ）２２．４ｍｇを得た。さきに示した本発明
の方法によって得られた水溶性含琺蛋白質からなる抗！
！ｆｆ！瘍性物質の理化学的諸性質は本粉末標品（２ｆ
）を使用して測定したものである。２ｒのＩＩＩ瘍内局
所投与での抗腫瘍効果を第７表に示す。

それらの腫瘍内局所投与での抗１１ｆｆｌＪ＆活性検定
結果を第８表に示す。

前記と同様な方法で得た粉末標晶（２ｆ）の除蛋白、糖
質分解、熱処理の各試験を行なって得られた物質（それ
ぞれ２ｇ、２ｈ、及び２１の抗腫瘍性効果を検討した。

粉末標品（２ｆ〉を蛋白分解酵素（ブロナーゼＥ）で、
生理食塩水中３７゜Ｃで２４時間処理した標品（２ｇ）
は良好な抗腫瘍性試験結果を示したが、メタ過ヨウ素酸
ナトリウムにて２０゜Ｃで２０時間処理して糖質を分解
して得られた標品（２ｈ）の抗Ｊｉｆｆ！　Ｈｉｆ性効
果は殆んど認められなかった。

また標品（２ｆ）をオートクレープ中１２５゜Ｃで２５
分間処理して得られた標品（２ｉ）は良好な抗腫瘍性効
果を示し、標品（２ｆ）は熱に対して安定であった。

前記と同様の方法によって得られた粉末標品（２ｒ）の
抗腫瘍活性をサルコーマ１８０固形腫瘍以外の各種マウ
ス固形腫瘍であるエールリッヒ癌、白血病性腹水腫瘍（
ＳＮ−３６）　、ＮＴＦ　ＩＩＩ網細胞肉腫（ＮＴＦ　
ｒｅｔ−ｉｃｕｌｕｍ　ｃｅｌｌ　ｓａｒｃｏｒｍａ）
、繊維肉腫（Ｆ　ｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ）について調
べた．繊維肉腫はＢａｌｂ／ｃ系マウスで、その他の腫
瘍はＩＣＲ系マウス雌６週令に、それぞれ同種の担癌マ
ウスから得た細胞４Ｘ１０ｂ個をそけい部皮下に移植し
た． ５日後、固形腫瘍が形成されていることを確認して、生
理食塩水に溶解した標品（２ｆ）を腫瘍内局所へ隔日３
回投与した。腫瘍移植５週間後の固形腫瘍を摘出し、そ
の重量を試料の代りに生理食塩水を投与した対照群の重
量と比較して腫瘍阻止率と完全治癒匹数／試験匹数を求
めた。投与量は０．５■／マウス×３回で行なった。

その抗腫瘍性効果を第９表に示す。

」毘Ｕ二 前記と同様にして得られた粉末標品（２ｆ）の投与方法
を腫瘍内局所投与から尾静脈投与及び腟腔内投与に代え
て抗腫瘍効果を調べたが、両方法とも十分な抗腫瘍効果
を示した。その結果を第１０表に示す。

二４ユＬｔ ４８時間後、細胞の生死を公知の方法に従いトリバンブ
ルーによる染色によって判定する。対照区として生理食
塩水添加区及び公知の抗腫瘍刑であるマイトマイシンＣ
添加区を設けた。第１１表に抗Ｉｌｉｌｉ１！！Ｉ性物
質の直接細胞毒性を示す。

前記、と同様の方法によって得られたわ｝未標品（２ｆ
）の直接細胞毒性をつぎの方法で調べた結果、細胞毒性
はＬ２められなかった。

マウス白血病（Ｌ　５１７８　Ｙ　Ｌｙｍｐｈｏｍａ）
細胞をｔｔｎａ培養用培地イーグル？ＩＥＭ　（仔牛血
清１５％含有）に５Ｘ　１０’個／ｄに！Ａ濁させ、検
定試料を添加して５％炭酸ガス含有空気流下、３７゜Ｃ
に置く。

実施例３ サザエを使い、実施例Ｉ及び２と同様にし７て白色粉末
を得た。本標品（３ｊ）の抗ＩＩ！Ｔ！瘍活性は０．５
ｍｇ／マウス×３回腫瘍内局所投与でＩＩＩ瘍阻止率７
３％であった。

実施例４ アワビを使い、実施例１及び２と同様にして白色粉末を
得た。本標品（４ｋ）の抗ＩＩＩ瘍活性は０．５■／マ
ウス×３回腫瘍内局所投与で腫瘍阻止率６９％であった
。

実施例５ ハマグリを使い、実施例１及び２と同様にして白色粉末
を得た。本標品（５ｌ）の抗腫瘍活性は０．５■／マウ
ス×３回腫瘍内局所投与で腫瘍阻止率６５％であった。

［発明の効果］ 本発明は貝類の可食部分を熱水性溶媒で蒸煮もしくは加
熱加工する際に得られる煮汁の乾燥粉末又は濃縮物を原
料とし、これからクロマトグラフ吸着を特定の工程の組
合せとして用いて抗腫瘍剤を製造する方法に関し、従来
法と比較して目的とする抗腫瘍剤を抗腫瘍活性を損なう
ことなく著しく高収率かつ高純度で製造し得るものであ
り、したがって工業的規模での実施に適合し得るもので
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図はホタテ貝煮汁粉末の水溶液をＴＳＫｇｅ　ｌプ
チルトヨパール６５０Ｍを用いた疎水クロマトグラフィ
ーに付して滅菌水で溶出した場合の溶出パターン、第２
図は疎水クロマトグラフィー処理後、ＤＥＡＥ−セファ
ロースＣＬ　−　６Ｂを用いたイオン交換クロマトグラ
フィーに付して塩化ナトリウム溶液で溶出した場合の溶
出パターン、第３図は疎水クロマトグラフィー及びそれ
に続く粒子径の大きいイオン交換クロマトグラフィー処
理後、Ｍｏｎｏ　Ｑを用いたイオン交換高速液体クロマ
トグラフィーに付して塩化ナトリウム溶液で溶出した場
合の溶出パターンを示す。第４図は本発明の方法で得ら
れた抗腫瘍性物質の紫外線吸収スペクトル図、第５図は
同抗腫瘍性物質の赤外線吸収スペクトル図（ＫＢｒ錠）
を示す。第６図は、実施例２において粉末標品（１ｅ）
をＭｏｎｏＱを用いたイオン交換高速液体クロマトグラ
フィーに付して塩化ナトリウム溶液で溶出した場合の溶
出パターンを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、貝類の可食部分を熱水性溶媒で蒸煮もしくは加熱加
   工する際に得られる煮汁の乾燥粉末又は濃縮物からクロ
   マトグラフ吸着を利用して水溶性含糖蛋白質からなる抗
   腫瘍性物質を分離する際、（ａ）疎水基をゲルに固定化
   した疎水クロマトグラフィー及びそれに続く（ｂ）塩基
   性陰イオン交換体を使用するイオン交換クロマトグラフ
   ィーの処理の組合せを用いることを特徴とする抗腫瘍性
   物質の製造法。 ２、工程（ｂ）が粒子径の大きい塩基性陰イオン交換体
   ゲルを用いるイオン交換クロマトグラフィー及びそれに
   続く粒子径の小さい塩基性陰イオン交換体ゲルを用いる
   高速液体クロマトグラフィーの組合せからなる請求項１
   記載の方法。