JPS6122021A - 抗腫瘍性多糖体ｎｒｐ−１およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はヒトデから抽出される新規な抗腫瘍性多糖体Ｎ
ＲＰ−１およびその製造法に関する。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは、新規な制癌剤の検索を目的として微生物
以外の起源から抗腫瘍性物質を見出すべく種々研究を続
けた結果、ヒトデから抽出された物質がサルコーマ１８
０腹水型、ＩＭＣカルチノ−マ腹水型マウス移殖腫瘍に
対し、強い延命効果を有することを知った。上記の抗腫
瘍性物質は、その理化学的性質上から多糖体であり、い
ずれの文献に未載の物質であることから、と及あえず、
本物質を抗腫瘍性多糖体ＮＲＰ−１と命名した。

（問題点を解決するための手段） 本発明は上記の知見に基匹て完成されたものであシ、次
の理化学的性質を有する抗腫瘍性多糖体ＮＲＰ−１であ
る。

■元素分析；少くとも炭素、水素、窒素、酸素および硫
黄を含み、元素分析値； Ｃ３２，０７１、Ｈ４，７４％、Ｎ ７、６９　ｇ６、Ｓ　Ｏ，９７優、ハロゲン（Ｃｌ換算
’）　、４．１８％、灰分０．１９４％、 ■分子量　；１万芝ｌＯ万（セファデックスＧ−ｉｏｏ
でボイド容量の２．５倍の フラクションを中心に単一のピー クを与える）、 ■融点　　；１１５℃で一部融解、２６０℃で褐色、 ■紫外線吸収スペクトル；第１図のとおシであって、オ
ー；２６２．５ ■赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）；第２図のとおシ
であって、３４００（３４５０ 〜３３５０）、２９５０．１６６０ （１６６０〜１６４０Ｌ　１４０５ （１４１０〜１４００）、１２２０ （１２３０〜１２１０）、１０６５ （１０８０〜１０５５）、９９０． ８１０（８２０〜７８０）、、−１ に各吸収帯を有する。

■溶剤に対する溶解性；　ｌＮ食塩水によくｍけ、水、
ＩＮ塩酸に可溶、濃アンモ ニア水、ｌＮ硝酸にや＼難 溶、エタノール、アセトン、 酢酸エチル、クロロホルム、 ジエチルエーテル、ベンゼ ン、ヘキサンに可溶、 ■呈色反応；硝酸銀反応に強く陽性、アンスロン反応、
ニンヒドリン反応にｔｉｌｌ、、ドラツゲンド°ルア反
応、塩化第一 鉄反応、塩化アンチモン反応、エ ーリツヒ反応、キサンプロティン 反応、デイツシエ反応に陰性、 ■塩基性、酸性、中性の区別；弱酸性５＃／Ｍ水溶液で
ｐＨ６，７１゜ ■物質の色；淡灰褐色粉末、 ■糖含量　；ｉｏ、ｓ＊＜アンスロン硫酸法）、＠構成
ｓ　　；グルコース、マンノース、７２クト〜ス等、 本発明は、またヒトデを蛋白０分解酵素処理し、得られ
た処理物を熱水抽出して抽水物を得、次いで該抽水物を
イオン交換処理およびゲル濾過処理によりある騒はその
繰９返し手段によシ抗腫瘍性多糖体ＮＲＰ−１を採取す
ることを特徴とする抗腫瘍性多糖体ＮＲＰ−１の製造法
も包含される。

本発明の原料であるヒトデは、学名をヒトデ（Ａｓｔｅ
ｒｉａｓ　ａｍｕｒｅｎｓｉａ　）といい、５１１．ま
れに６輻の大型轢皮動物であるが、日本沿岸に産するも
のは幅径ＬＯｃｍ以下で、背面はふくらみ、腹面は肩平
である。抗腫瘍性多糖体ＮＲＰ−１を採取するにあなり
ては、ヒトデの全部または一部が使用される。使用する
にあたっては、そのま＼の形状で使用してもよｈが１、
通常は細断して使用するのが好ましｂｏ 本発明においては、先ずヒトデを蛋白分ｍ酵素処理する
のであるが、それに先立ち、適当な有機溶媒で前処理し
、不要成分を予め除去しておくことが望ましい。上記の
有機溶媒としては、メタノール、エタノール、グロパノ
ール、ブタノールなどの低級アルコール、アセトン、メ
チルインブチルケトンなどのケトン系溶媒、ベンゼン、
トルエン、キシレンなどのエステル系溶媒、ジクロ日メ
タン、クロロホルム、四塩化炭素などのクロロホルム系
溶媒、ジエチルエーテルなどのエーテル系溶媒、ピリジ
ン、ヘキサンなどが挙げられる。上記前処理によシ脂質
成分が除去される。

上記の蛋白質分解酵素処理は、通′７＃前処理したヒト
デを水または蛋白分解酵素の至適ｐＨの範囲のｐＨを有
する緩衝液中で行われる。該酵素の反応温度は該酵素が
失活しなｈ温度の範囲内であれば適宜選択されるが、通
常は３０〜４０℃の温度条件下で行われる。反応時間は
該酵素活性の強さ、原料の品質などによシ適宜決定され
るが、通常は１〜４８時間である。この際、ヒトデの腐
敗を防止するため、例えばトルエンの如き有機溶媒を添
加して酵素処理することもできる。上記酵素反応中に後
から適宜蛋白分解酵素を添加してもよい。

上記酵素反応に使用される蛋白分解酵素としては、微生
物、植物、動物などいずれの起源の酵素でもよいが、通
常植物起源のプロナーゼ、パパイン、プロメリンなどが
用いられる。上記酵素処理によりヒトデ中の不要の蛋白
質が低分子に分解される。

次に、このようにして得られた処理物を熱水抽出して本
発明の有効成分を得るのであるが、この抽出処理は通常
８０〜ｌＯＯ℃の加熱下で行われる。加熱時間は蛋白質
分Ｍ酵素処理時間の長短によシ適宜決定されるが、通常
は１〜２４時間である。上記の加熱処理により蛋白質分
解酵素の失活化も同時に行われる。

このよ゛うにして得られた抽出物は、濾過または遠心分
離あるいはこれらを組合せすることによシ固液分離され
る。分離された抽出液には多量の不純物が含まれるので
、この抽出液から抗腫瘍性多糖体ＮＲＰ−１を分離精製
するには、水溶性多糖体を分離精製する公知の方法、例
えばイオン交換処理、ゲル濾過処理などの方法により行
われる。

本発明にお込ては、イオン交換処理を行う前に予め、上
記抽出液をアルコール沈澱法によシ精製するのが好まし
ｈｏ例えばメタノール、エタノールなどのアルコールを
加え、生成した沈澱物を公知の方法、例えば遠心分離に
よシ採取される。得られた沈澱物は、所望によシ、残存
する蛋白質、核酸などを除去する目的で、水に再溶解し
、トリクロロ酢酸処理を行ってもよい。この処理液は中
和後、生成した塩類、緩衝液に由来する塩類、その他低
分子不純物を除去するために、透析膜法、限外濾過法な
どにより精製するのが好ましい。

上記の方法により精製された抽出液は、公知の方法によ
り減圧濃縮または凍結乾燥により濃縮され、イオン交換
処理およびゲル濾過処理される。

イオン交換処理は、陰イオン交換体を充填したカラムに
通し、塩類溶液°、例えば０．５〜２Ｍ塩化ナトリウム
水溶液で溶出させることにより実施される。このように
して得られた活性画分は透析膜法、限外ヂ過法などによ
シ塩類を除去し、減圧濃縮法、凍結乾燥法により濃縮さ
れる。

次に、上記イオン交換処理により得られｆｃ濃縮物はゲ
ル濾過処理により精製される。ゲル濾過処理は、上記濃
縮物をゲル濾過剤を充填したカラムに通し、溶出する画
分から分子量１万〜ｌＯ万の多糖体を採取することによ
シ実施される。上記−のゲル濾過剤としては、分画分子
量が約ＩＸＩ♂のゲル濾過剤が用いられる。例えばデキ
ストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、親水性ポリビ
ニル系ゲル、多孔質ガラスピーズなどのゲル濾過剤が挙
げられ、例えばセファデックスＧ−１００、Ｇ−２００
、セファクリルＳ−３００（以上ファルマシア社製）、
バイオグルＰ−１００〜Ｐ−３００（バ４イオラツド社
製）、トヨバールＨＷ−５，０、ＨＷ−５’５（東洋１
達工業社製）、ＣＰＧ−１０（エレクトロ・タフレオニ
ック社製）などの製品名で市販されているゲル濾過剤を
用いるのが好ましい。上記のゲルー過により目的の活性
画分は第２の両分から採取される。この両分を減圧乾固
または凍結乾燥することにより、所望の抗腫瘍性多糖体
ＮＲＰ−１が得られる。

次に、本抗腫瘍性多糖体ＮＲＰ−１の各種の腫瘍に対す
る延命効果について述べる。

試験例　ｌ ザルコーマ１８０腹水癌に対する効果 ｌ）試料調製 生理的食塩水（９，０９６ＮａＣｌ溶液）に所定濃度と
なるように試料を溶解させた。

■　ザルコーマ１８０癌細胞移殖 ＮＣＲマウス腹腔中で継代培養したザルコーマ１８０癌
細胞を、腹水とともに取シ出し、Ｅａｇｌｅ’ｓ　　Ｍ
　Ｅ　Ｍ培養液で細胞数が５×１０個／　ｍｌとなるよ
うに稀釈調整した。この細胞懸濁液のＯ，ｌｄ’ｒ、５
週令雌ｌＣＲマウスの腹腔へ注射器を用いて移殖した。

３）試料投与 ザルコーマ１８０癌細胞を移殖した翌日から１日１回連
続９日間腹腔に０．１ｒｎｌ！／１０，９体重となるよ
うに投与した。ｌ試料ｌ濃度にりき７匹のマウスを使用
した。対照は、試料の溶剤として用吟た生理的食塩水を
同様に投与したものとした。投与量の表示は、マウス体
重１Ｆ４１日当如のダ数とした。

４）効果判定法 各試料投与群の中間死亡マウスの生存日数と苅照群のそ
れを比べ、各試料投与群の延命率（ＩＬＳ％）として効
果の判定を作った。

以上の結果は第１表の通りである。

第　　１　　表 ＩＭＣ力ルチノーマに対する効果 ｌ）試料調整 試験例１に同じ ２）ＩＭＣカルチノーマ癌細胞移殖 ＣＤＦ１マウス膜腔中で継代培養したＩＭＣカルチノー
マを用ｈ１細胞懸濁液の調整は前記の試験例１と同様に
行った。又移殖も５週令雌ＩＣＲマウスに対し同様に行
った。

３）試料投与 試験例１と同様に行った。

４）効果判定法 試験例１と同様に行った。

以上の結果は第２表の通シである。

試験例３ ＭｅｔｈＡフィブロザルコーマに対する効果ｌ）試料の
調整 試験例１．２と同様に調整した試料液をメンブランフィ
ルタ−（ポアサイズ０．４５μ、ミリボア社製）を用い
て済過滅菌し投与に供した。

２）　　ＭｅｔｈＡフィブロザルコーマの移殖試験例１
と同様に調整したガン細胞懸濁液を５週令雌ＩＣＲマウ
ス腋下部皮下に０．１　ｍ移殖した。

３）　試料投与 ＭｅｔｈＡフィブロザルコーマｔ［ＭＬｆｃ２日後から
１日１回８日間、尾静脈より血管内に連続投与した。対
照は試料の溶剤として用いた生理的食塩水を同様に濾過
滅菌したものを同様に投与したものとした。試料投与量
の表示は、マウス体重ＩＫｆ１日当りのダ数とし、試料
液投与量は１日マウス尚シ０．１　ｍとなるように試料
濃度を調整した。

４）効果判定方法 移殖２２日後の腫瘍の大きさを長径×短径として表わし
、各投与群の腫瘍の大きさの平均値をｔ検定によシ統計
学的に比較した。その結果は第３表に示す通りである。

＊＊ｐ（０，０１で有意差あり。

次に、実施例を挙げて本発明の製造例について具体的に
説明する。

（１）脱脂および蛋白質分解酵素処理 ヒトデ８００ｇをワーりングプレンダーによシ破砕し、
破砕物にアセトン８ノを加えて室温で１時間振とうした
。これを遠心分離（１８００Ｑｒ、ｐ、ｍ）ｌ、、、得
られた沈澱物にＯ，ｌ　Ｍ　トリス塩酸緩衝液（１）Ｈ
７，８）８／を加え、８０℃で１時間加熱処理した♂放
冷後、この処理液にプロｆ−ゼＥ　Ｃ科研Ｈ薬社１１１
）１．２３２１ｖｔ”添加し、ｌＯｌジャーファーメン
タ−中で３０℃で４８時間撹拌した。処理中腐敗を防止
す−るため、トルエン１ｍｌ添加した。酵素処理後、全
量を８０℃で１時間保持して酵素を失活させた後、遠心
分７１１　（１８、０００ｒ−ｐ−ｒｎ　）　Ｉ、て上
清液７．０７７を得麿。

（２）　　エタノール沈澱およびトリクｑ口酢１あ理。

前記の（１）で得た上清液を約１．２　／　ＩＣまで減
圧濃縮し、この濃縮液にエタノール４．９６１　ｔ−加
え、撹拌した後、５℃で２４時間放置した。次りで、遠
心分離（１８，０００ｒ−ｐ−ｍ）して淡灰色粘土状の
沈澱物を得た。これを水８００１１Ｌｌに溶かし、水冷
下トリクロロ酢酸１００．！ｉｉを水ｔｏｏｙに溶解し
た溶液を加えた後、５℃で２４時間放置した。トリクロ
ロ酢酸処理液を０℃下、１０，０ＯＯＸ、９で１５分間
遠心分離して沈澱物を除去した。得られた上滑液を５Ｎ
水酸化ナトリウム水溶液゛で中和しｆＣ後、セルａ　−
ス膜で２４時間流水中で透析を行った。内液を真空凍結
乾燥して淡褐色の粉末２４．２０．９を得喪。

（３）除蛋白 前記の（２）で得た粉末１０．　ｌ　８．９を水２０（
１４！に溶かし、これにクロロホルム４０ｄ１ブタノー
ル８４を加え、１０分間振とうし光後、分液し、水層を
真空凍結乾燥して淡褐色粉末９．５ｇを得た。

（４）　　イオン交換処理 前記の（３）で得た粉末７．５．９　ｔ−０，０１Ｍ　
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６，７）　３５３ＩＩＣ溶かし
、コレをＱＡＥセファデックスＡ−２５（７アルマシア
社ＩＥりを充填し六カラム（２，５伽φＸ　１１ｍ）に
チャージし７を後、上記と同じ緩衝液７６０ｍ／を流し
、非吸着画分を除去しｆｃ後、ＩＭ塩化ナトリゆム水溶
液で溶出した１、溶出液を分取し、各分画をアンスロン
硫酸法によって検出される糖両分（小さなテーリングシ
ョルダーをもつ単一ピーク）を分取し、これを集めてセ
ルロース膜を用すて流水中で２４時間透析しｋ＝内液を
真空凍結乾燥し゛Ｃ淡白褐色の粉末６９２ダを得た。

（５）　　ゲル濾過 前ｄピ（４）で得た粉末５００　ｍ９を水２ｏ―に溶か
し、これをセファデックスＧ−１００（ファルマシア社
＃）ｔ−充填し７辷カラム（５ｃｒｎφＸ６０ｃ１ｎ）
にチャージし、水によりゲル濾過クロマドグ２フイーを
行った。溶出液を分取し、各分画をアンスロン硫酸法に
よって検出される楯のピークをボイドボリューム付近と
ボイドボリュームの３倍の流量付近にそれぞれ単一のピ
ークとして得られた。後者のピークの一分を集め、真空
凍結乾燥して抗腫瘍性多糖体の淡褐色粉末３３５　Ｆ、
９を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗腫瘍性多糖体Ｎ　ＲＰ　−１の紫外線吸収ス
ペクトル、第２図は抗腫瘍性多糖体ＮＲＰ−１の赤外線
吸収スペクトルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）、次の理化学的性質を有する抗腫瘍性多糖体ＮＲＰ
   −１ （１）元素分析；少くとも炭素、水素、窒素、酸素およ
   び硫黄を含み、元素分析 値；Ｃ３２．０７％、Ｈ４．７４％、 Ｎ７．６９％、Ｓ０．９７％、ハロ ゲン（Ｃｌ換算）４．１８％、灰 分０．１９４％、 （２）分子量；１万〜１０万（セフアデツクスＧ−１０
   ０でボイド容量の２．５ 倍のフラクシヨンを中心に単一 のピークを与える）、 （３）融点：１１５℃で一部融解、２６０℃で褐色、 （４）比旋光度；〔α〕＾２＾０＿Ｄ＋２°（Ｃ＝０．
   １％、水）、（５）紫外線吸収スペクトル；第１図のと
   おり、（６）赤外線吸収スペクトル；第２図のとおり、
   （７）溶剤に対する溶解性；１Ｎ食塩水によく溶け、水
   、１Ｎ塩酸に可溶、濃アンモ ニア水、１Ｎ硝酸にやゝ難 溶、エタノール、アセトン、 酢酸エチル、クロロホルム、 ジエチルエーテル、ベンゼ ン、ヘキサンに不溶、 （８）呈色反応；硝酸銀反応に強く陽性、アンスロン硫
   酸反応、ニンヒ ドリン反応に陽性、ドラツ ゲンドルフ反応、塩化第一 鉄反応、塩化アンチモン反 応、エーリツヒ反応、キサ ントプロテイン反応、デイ ツシエ反応に陰性、 （９）塩基性、酸性、中性の区別；５ｍｇ／ｍｌ水溶液
   でｐＨ６．７１、（１０）物質の色；淡灰褐色粉末。 ２）、ヒトデ（Ａｓｔｅｒｉａｓ　ａｍｕｒｅｎｓｉｓ
   　Ｌ■ｔｋｅｎ（Ａｓｔｅｒｉｉｄａｅ））を蛋白分解
   酵素処理し、得られた処理物を熱水抽出して抽出物を得
   、次いで該抽出物をイオン交換処理およびゲルろ過処理
   によりあるいはその繰り返し手段により次の理化学的性
   質を有する抗腫瘍性多糖体ＮＲＰ−１を採取することを
   特徴とする抗腫瘍性多糖体ＮＲＰ−１の製造法。 （１）元素分析；少くとも炭素、水素、窒素、酸素およ
   び硫黄を含み、元 素分析値；Ｃ３２．０７％、 Ｈ４．７４％、Ｎ７．６９％、 Ｓ０．９７％、ハロゲン（Ｃｌ 換算）４．１８％、灰分０．１ ９４％、 （２）分子量；１万〜１０万（セフアデツ クスＧ−１００でボイド容 量の２．５倍のフラクシヨン を中心に単一のピークを与 える）、 （３）融点；１１５℃で一部融解、２６０ ℃で褐色、 （４）比旋光度；〔α〕＾２＾０＿Ｄ＋２°（Ｃ＝０．
   １％、水）、（５）紫外線吸収スペクトル；第１図のと
   おり、（６）赤外線吸収スペクトル；第２図のとおり、
   （７）溶剤に対する溶解性；１Ｎ食塩水によく溶け、水
   、１Ｎ塩酸に可溶、濃アンモ ニア水、１Ｎ硝酸にやゝ難 溶、エタノール、アセトン、 酢酸エチル、クロロホルム、 ジエチルエーテル、ベンゼ ン、ヘキサンに不溶、 （８）呈色反応；硝酸銀反応に強陽性、アンスロン硫酸
   反応、ニンヒド リン反応に陽性、ドラツゲ ンドルフ反応、塩化第一鉄 反応、塩化アンチモン反応、 エーリツヒ反応、キサント プロテイン反応、デイツシ エ反応に陰性、 （９）塩基性、酸性、中性の区別；５ｍｇ／ｍｌ水溶液
   でｐＨ６．７１、（１０）物質の色；淡灰褐色粉末。 ３）、ヒトデがその細断物である特許請求の範囲第２項
   記載の製造法。 ４）、細断物が有機溶媒で処理した前処理物である特許
   請求の範囲第３項記載の製造法。 ５）、有機溶媒がメタノール、エタノール、プロパノー
   ル、ブタノール、アセトン、ピリジン、酢酸エチル、酢
   酸ブチル、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジエチルエ
   ーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素ま
   たはヘキサンである特許請求の範囲第４項記載の製造法
   。 ６）、蛋白分解酵素処理を水または蛋白分解酵素の至適
   ｐＨを保持する緩衝液中で蛋白分解酵素を作用させるこ
   とにより行う特許請求の範囲第２項記載の製造法。 ７）、蛋白分解酵素が、植物起源の蛋白分解酵素、動物
   起源の蛋白分解酵素または微生物起源の蛋白分解酵素で
   ある特許請求の範囲第６項記載の製造法。 ８）、植物起源の蛋白分解酵素がプロナーゼ、パパイン
   またはプロメリンである特許請求の範囲第７項記載の製
   造法。 ９）、抽出物がアルコール沈澱法による沈澱物である時
   特請求の範囲第２項記載の製造法。 １０）、イオン交換処理が陰イオン交換体を用いるクロ
   マトグラフィーによる処理である特許請求の範囲第２項
   記載の製造法。 １１）、ゲルろ過処理がデキストランゲル、ポリアクリ
   ルアミドゲル、親水性ポリビニル系ゲルまたは多孔質ガ
   ラスビーズを用いるクロマトグラフィーによる処理であ
   る特許請求の範囲第２項記載の製造法。