JPH09500262A - 毒素結合性バイオポリマーの製造、その使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は毒素結合性非毒性の修飾されたバイオポリマーの製造方法に関する。本発明はこれらのバイオポリマーの、敗血症性ショック、感染症及び中毒状態の治療への使用と、生物学的又は治療的に重要な物質（酵素又は薬物）をＦｃ受容体及び補体受容体を含む食細胞又は細胞中に運搬するためのキャリヤーとして及び細胞のための天然エネルギー源としてのそれらの使用とに関する。本発明によると、毒素結合性非毒性の構造的に修飾されたバイオポリマーは、２０〜３０℃の温度における、ｐＨ６．８〜７．４のバッファー溶液中での、グリコーゲンホスホリラーゼ酵素によって触媒される、α−１，４又は１，６結合含有多糖とグルコース−１−ホスフェートとの反応と、得られたバイオポリマーの周知方法での分離とによって製造される。

Description

【発明の詳細な説明】 毒素結合性バイオポリマーの製造、その使用 本発明は毒素結合性非毒性の、修飾された炭水化物バイオポリマーの製造方法 に関する。本発明はまた、敗血症性ショック、感染症及び中毒状態の治療のため のそれらの使用と、生物学的又は治療的に重要な物質（酵素又は薬物）を、Ｆｃ 受容体及び補体受容体を有する食細胞又は細胞中へ運搬するためのキャリヤーと してのそれらの使用とに関する。 カオリン、ケイ酸アルミニウム又は／及びケイ酸マグネシウムのような、大き い表面積を有する物質による、種々な毒性作用剤の吸着（ＧＵＴ３４，５１〜５ ５，１９９３）は解毒効果を生ずることができる。これらの吸着剤の欠点は、そ れらがヒト生物体に許容されないことである。細胞内又は生物体内で代謝される 非毒性吸着剤（本明細書中では毒素結合性非毒性バイオポリマー（ＴＢＮＴＢＰ ）と呼ぶ）はこの矛盾を解決することができる。 非毒性の、構造的に修飾されたバイオポリマーが合成経路によって製造可能で あり、これらのバイオポリマーが、生物体内で生理学的経路によって代謝される 生来のポリマーに類似することを、我々は発見している。 本発明によると、非毒性バイオポリマーをα−１，４又は１，６結合含有多糖 から製造することができる。本発明の方法によると、α−１，４又は１，６結合 含有多糖をＤ−グルコース−１−ホスフェートと、グリコーゲンホスホリラーゼ 酵素の存在下、ｐＨ６．８〜７．４のバッファー溶液中、２０〜３０℃の温度に おいて反応させて、得られたバイオポリマーを周知の方法によって分離させる。 有利には、グリコーゲン、アミロペクチン、デキストリン又はこれらの混合物で ある多糖（１，４又は１，６結合含有）は、受容体分子、連鎖延長プロセスのた めの“プライマー”として役立つことができる。 グリコーゲン、アミロペクチン及びデキストリンのほかに、ホモグリカン及び ヘテログリカンの他のポリマーも”プライマー”多糖として用いることができる 。一般に、α−１，４又は１，６結合型と共にグルコース単位を含む、あらゆる 種 類のグリカン分子が反応のための鋳型として役立つことができる。本発明のバイ オポリマー製造方法は、酵素グリコーゲンホスホリラーゼ”ａ”又は”ｂ”（Ｅ Ｃ２．４．１．１）と基質Ｄ−グルコース−１−ホスフェートとによる、溶解性 多糖（α−１，４又は１，６結合又はこれらの混合を有する、グリコーゲン及び 他のグリカン）の各鎖の酵素延長であり、１μｍ以下の平均サイズ（直径）を有 する、不溶性の“粗分散した(coarse disperse)”コロイド粒子を生じる。 ホスホリラーゼ“ａ”と”ｂ”の両方が側鎖延長反応のための触媒として用い ることができる（ホスホリラーゼ“ｂ”を用いる場合には、アデノシン−５’− モノホスフェート［ＡＭＰ］の添加も必要である）。 バイオポリマーは、ｐＨ６．８〜７．４バッファー溶液（例えば、ＥＤＴＡ、 β−メルカプトエタノール又はＮａＦ等を加えて完成する、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ又 はβ−グリセロリン酸ナトリウム）中、５０−５５ＩＵ／ｍｇの比活性を有する ホスホリラーゼの存在下、２５〜３０℃の温度において２０〜３０分間のインキ ュベーション時間中に製造することができる。 トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）によってポリマーを沈殿させ、バッファー中にペレ ットを再懸濁させた後に、低温エタノール処理の作用で最終的なバイオポリマー 粒子の沈殿が生ずる。 １，４又は１，６結合含有多糖１重量部が、Ｄ−グルコース−１−ホスフェー ト０．５〜１．５重量部と、ホスホリラーゼ酵素５０〜２００ＩＵの存在下で、 有利に反応する。 出発物質としてグリコーゲンと他の多糖との混合物を用いる場合には、これら の成分の重量割合は０．２：１〜２：１である。 本発明によると、サイトカイン、酵素、脂質メディエイタ(lipid mediator)、 ビオゲンアミン(biogen amine)、急性期タンパク質、毒素のような、多数の病理 学的物質(pathologic substance)及びメディエイタ作用因子(mediator agent)が 崩壊した循環中に同時に存在し、多発性の器官機能不全症候群の状態を表すのが 一般的である、敗血症性ショック、感染症、急性相反応及び中毒状態に、構造的 に修飾された、α−１，４又は１，６結合含有バイオポリマーが使用可能である ことが判明した。このような症例の治療には、１種又は２種の解毒薬の使用では 充分でありえない。しかし、グリコーゲンの構造的に修飾された誘導体のような 、毒素結合性バイオポリマーは多くの毒性の又は病理学的分子を同時に結合する ことができる。毒素結合性バイオポリマーはこれらの物質を食細胞のリソソーム 中に運搬することができ、これらのリソソームにおいて、病理学的分子と吸着性 キャリヤー分子の両方の生化学的分解が起こり得る。グリコーゲン誘導体の特別 な利点は、リソソーム分解によって形成されるそれらの最終生成物、グルコース が代謝無力化した(metabolically paralysed)細胞のためのエネルギー源として なお役立つことができることである。これらの吸着剤は血漿中の免疫グロブリン と補体因子（主としてＣ３ｂ）をも結合することができるので、Ｆｃ受容体及び 補体（主としてＣＲＩ）受容体を介して食細胞（又は他の細胞）に入る。 毒素結合性非毒性バイオポリマー（ＴＢＮＴＢＰ）は循環内に病理学的な濃度 で発生する一連の毒素又は他の分子を同時に結合し、それらを、毒素と他の分子 との生化学的分解が起こり得る、食細胞のリソソーム中に運搬することによって 、敗血症性ショック、重度の急性感染症及び中毒状態の良好な治療法を提供する ことができる。 本発明によって製造される、構造的に修飾されたバイオポリマーは生物体のた めの非毒性作用剤であるだけでなく、それらを飲み込む細胞のためのエネルギー 源として選択的に役立つことができる。これらの細胞の種類には、毒素で損傷し た食細胞又は白血球と、オプソニン作用(opsonized)粒子を内面化することがで きる、Ｆｃ受容体又は補体受容体を含む他の種類の細胞がある。 ＴＢＮＴＢＰの有用性は次のように要約することができる： （ａ）溶解性グリコーゲン又は他の多糖に比べて、大きい吸着容量； （ｂ）解毒効果を生ずる、毒性の病理学的分子に対するキャリヤー機能； （ｃ）細胞の正常な機能を修復するための生物学的又は治療的に重要な分子（酵 素又は薬物）に対するキャリヤー機能． 下記例によって、ＴＢＮＴＢＰの製造方法とその使用を説明する。 例１ グリコーゲン１ｇをＴＥＭバッファー（ＴＥＭバッファー：４０ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣｌ、ｐＨ７．２、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、２ｍＭ ＥＤＴＡ）１０ｍｌ中で、ＴＥＭ １０ｍｌに溶解したＤ−グルコース−１− ホスフェート０．７３ｇと混合し、３０℃において１５分間プレインキュベート する。ＴＥＭ１０ｍｌ中のホスホリラーゼａ １００ＩＵを加えて、反応を開始 させる。この溶液を混合した後に、３０℃において３０分間インキュベートする 。１０重量％ＴＣＡ １０ｍｌによってタンパク質を沈殿させ、沈殿したタンパ ク質を遠心分離（５０００ｘｇ、２０℃、１０分間）によって除去する。１．５ ｖｏｌ．の無水エチルアルコールを添加して、バイオポリマーを沈殿させ、溶液 を４℃に１時間維持する。遠心分離（３０００ｘｇ、４℃、１０分間）によって 、ペレットを回収する。グルコースの長い側鎖を有するバイオポリマーはＴＥＭ 中に懸濁させることができる。 ＴＥＭ中のこの懸濁液は４℃において１年間安定に保存することができる。使 用前に、バイオポリマーのペレットを遠心分離によって回収して、ＰＢＳ（生理 食塩水中のリン酸塩バッファー）生理的バッファー中に再懸濁させることができ る。 動物実験に関して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ使用のためのバイオポリマーの提案濃度 は約１〜２ｍｇ／ｍｌであり、ｉｎ ｖｉｖｏ用途のためには１０〜２０ｍｇ／ ｍｌである。 例２ 下記の点以外は例１による操作を実施する。ホスホリラーゼ”ｂ”１５０ＩＵ をＡＭＰ ２０ｍｇの存在下で用いる、４℃において無水エチルアルコールによ って沈殿させたペレットをアセトンによって洗浄し、乾燥させる。この粉末は室 温において保存することができ、使用前に、５ｍＭ ＥＤＴＡと２０ｍＭ β− グリセロリン酸ナトリウムと１０ｍＭ β−メルカプトエタノールと５０ｍＭ ＮａＦとの混合物である生理的バッファー中に懸濁させることができる。 例３ 次の点以外は例１による操作を実施する。グリコーゲン１ｇの代わりに、グリ コーゲン０．５ｇとアミロペクチン０．５ｇとの混合物が”プライマー”多糖で ある。 例４ 下記の点以外は例１による操作を実施する。グリコーゲン１ｇの代わりに、グ リコーゲン０．５ｇとデキストリン０．５ｇとの混合物が“プライマー”多糖で ある。 例５ 次の点以外は例１による操作を実施する。グリコーゲン１ｇの代わりに、グリ コーゲン０．６６ｇとデキストリン（分子量約５００，０００）０．３４ｇとの 混合物が”プライマー”多糖である。 例６ Ｗｉｒｓｕｎｇｉａｎｕｓ管中にオリーブ油を注入することによってイヌに誘 導した人工的急性膵炎において、例３によるＴＢＮＴＢＰのｉ．ｖ．投与（１０ ｍｇ／ｋｇ体重の一日量で３日間）は血漿中のリパーゼとアミラーゼの濃度の上 昇を低下させて、結果として膵臓の壊死を防止することができる。 例７ 酸素フリーラジカル生成の欠陥と細胞内ミエロペルオキシダーゼの消失とを含 む単球機能損傷を受けた患者の単球に例４によるＴＢＮＴＢＰのみをｉｎ ｖｉ ｔｒｏ添加すると、これらの細胞におけるスーパーオキシドアニオン産生の改良 が生じた。ヒトミエロペルオキシダーゼがＴＢＮＴＢＰに吸着され、損傷単球に 加えられると、フリーラジカル産生が、健康な対照に匹敵して、完全に修復した 。この一連の実験において、ＴＢＮＴＢＰは二重機能を有すると考えられる。Ｔ ＢＮＴＢＰはエネルギー源として役立つことができ、さらに、ミエロペルオキシ ダーゼを運搬することによって、細胞の正常機能を修復することができる。 例８ 内毒素性ショックのラットモデル Ｗｉｓｔａｒ雄ラット（２００ｇ）を、内毒素を含まない酢酸鉛５ｍｇのｉ． ｖ．注入によって内毒素に関して予備感作させた。ｉ．ｖ．大腸菌(E.coli)リポ 多糖（ＬＰＳ）のＬｄ₅₀は２μｇであると判明した。例１によるｉ．ｖ．ＴＢＮ ＴＢＰ ２１ｍｇ／ｋｇをＬＰＳの直前に投与した。１２時間後に、死亡率を評 価した。実験は５群のラット（１群は１２匹からなる）に対して実施した。 これらの実験の結果は表１に示す。 例９ 結合分析 ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験に基づいて、放射能標識した大腸菌LＰS、ヒト腫瘍壊死 因子α及びヒトホスホリパーゼＡ₂は、例１によるＴＢＮＴＢＰに用量依存的に 結合することが判明した。大腸菌ＬＰＳ（リポ多糖）とヒトＰＬＡ（ホスホリパ ーゼＡ₂）（１４ｋＤ）とはハンガリーのＤｅｂｒｅｃｅｎにおいて調製され、 精製された。^99mＴｃ標識の大腸菌、¹²⁵Ｉ標識のヒトＰＬＡ₂及びＴＮＦ−α（ 腫瘍壊死因子α）はハンガリーのＤｅｂｒｅｃｅｎにおいて調製された。上記化 合物をＰＢＳ（生理食塩水中のリン酸塩バッファー）中に溶解又は懸濁させた。 放射能はガンマカウンター（Ｇａｍｍａ Ｌｔｄ．，ハンガリーによって製造） によって検出した。 実験結果は表２、表３、表４に示す。 例１０ 血小板凝集の測定 ｉｎ ｖｉｔｒｏで用いた例１によるＴＢＮＴＢＰは、例えばアデノシンージ ホスフェート及び血小板活性化因子のような、凝集剤の迅速で効果的な結合によ る、血小板富化血漿中のヒト血小板凝集を阻止することができた。例１によるＴ ＢＮＴＢＰの存在下又は不存在下でのＡＤＰ（アデノシン−ジホスフェート）及 びＰＡＦ（血小板活性化因子）による血小板凝集に対してヒトクエン酸塩血小板 富化血漿(human citrate platelet rich plasma)０．４５ｍｌを用いた。血小板 凝集計（Ｍｉｃｒｏｎ Ｍ３０４、ハンガリーで製造）によって測定を実施した 。実験結果は表５と表６に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 47/48 7433−4Ｃ Ａ６１Ｋ 47/48 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＪＰ，ＫＲ，ＬＵ，ＬＶ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人 トス，ベラ ハンガリー国エイチ ― 4032 デブレセ ン，ドクジイ ジェイ．ユー．26 (71)出願人 フアルカス，イロナ ハンガリー国エイチ ― 4029 デブレセ ン，スザッパノス ユー 16／エー (71)出願人 バルナイ，カタリン ハンガリー国エイチ ― 1125 ブタペス ト，デイオサロク ユー 16／ザ サード (72)発明者 ボト，ギョルギイ ハンガリー国エイチ ― 4026 デブレセ ン，ベム ― テル 18／ビー (72)発明者 シプカ，サンドール ハンガリー国エイチ ― 4032 デブレセ ン，キュルトギヤルマト ユー 64 (72)発明者 ゲルゲリイ，パル ハンガリー国エイチ ― 4032 デブレセ ン，コムロッシイ ユー 64 (72)発明者 スゼゲデイ，ギュラ ハンガリー国エイチ ― 4032 デブレセ ン，イルイエス ユー 18 (72)発明者 トス，ベラ ハンガリー国エイチ ― 4032 デブレセ ン，ドクジイ ジェイ．ユー．26 (72)発明者 フアルカス，イロナ ハンガリー国エイチ ― 4029 デブレセ ン，スザッパノス ユー 16／エー (72)発明者 バルナイ，カタリン ハンガリー国エイチ ― 1125 ブタペス ト，デイオサロク ユー 16／ザ サード

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．毒素結合性非毒性の構造的に修飾されたバイオポリマーの製造方法におい て、２０〜３０℃の温度における、ｐＨ６．８〜７．４のバッファー溶液中での 、グリコーゲンホスホリラーゼ酵素によって触媒される、α−１，４又は１，６ 結合含有多糖とＤ−グルコース−１−ホスフェートとの反応と、得られたバイオ ポリマーの周知方法での分離とを含む前記方法。 ２．α−１，４又は１，６結合含有多糖１重量部とＤ−グルコース−１−ホス フェート０．５〜１．５重量部とをホスホリラーゼ酵素５０〜２００ＩＵの存在 下で反応させる請求項１記載の方法。 ３．多糖がグリコーゲンである請求項２記載の方法。 ４．多糖がグリコーゲンとアミロペクチンとの混合物である請求項２記載の方 法。 ５．多糖がグリコーゲンとデキストリンとの混合物である請求項２記載の方法 。 ６．多糖がグリコーゲンとデキストランとの混合物である請求項２記載の方法 。 ７．内毒素性ショック、急性感染症、及び任意の種類の中毒状態の治療におけ る種々な毒素、炎症メディエイタのｉｎ ｖｉｖｏ吸着剤としての、請求項１に 従って製造されたバイオポリマーの使用。 ８．食細胞中に浸透する、酵素及び他の物質を運搬するための、キャリヤーと しての、請求項１に従って製造されたバイオポリマーの使用。 ９．細胞の天然のエネルギー源としての、請求項１に従って製造されたバイオ ポリマーの使用。