CN104740597A

CN104740597A - 壁虎蛆虫蛋白质在制备抗黑色素瘤药品中的应用

Info

Publication number: CN104740597A
Application number: CN201510092329.XA
Authority: CN
Inventors: 徐华民; 赵荣华
Original assignee: Harbin Institute of Technology
Current assignee: Harbin Institute of Technology
Priority date: 2015-03-02
Filing date: 2015-03-02
Publication date: 2015-07-01

Abstract

本发明公开了一种壁虎蛆虫蛋白质在制备抗黑色素瘤药品中的应用，所述壁虎蛆虫蛋白质制备方法如下：将壁虎蛆虫在常温膨化装置中膨化粉碎；然后加入到膨胀溶剂体系提取装置中提取出壁虎蛆虫蛋白质粗品；收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液并用微孔过滤器过滤去掉杂质；用超滤机超滤处理，收集壁虎蛆虫蛋白质超滤溶液；超滤液溶解在乙腈中用固相萃取柱分离，收集洗脱成分；将洗脱成分溶解在溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱分离纯化；用真空冷冻干燥机制备成冻干蛋白粉，可用于制备抗黑色素瘤药品。本发明分离的纯化壁虎蛆虫蛋白质为非均一蛋白质，相对分子量为10.9~12.6KPa，等电点为pH8.8~10.2，不含糖基，纯化的壁虎蛆虫蛋白质含量为96.7%。

Description

壁虎蛆虫蛋白质在制备抗黑色素瘤药品中的应用

技术领域

本发明涉及一种壁虎蛆虫蛋白质的新用途，尤其是壁虎蛆虫蛋白质在制备抗黑色素瘤药品中的应用。

背景技术

恶性黑素瘤是由皮肤和其它器官黑素细胞产生的肿瘤，皮肤黑素瘤表现为色素性皮损在数月或数年中发生明显改变。

由于黑色素细胞起源于神经嵴，广泛分布于皮肤、眼、黏膜表面和神经系统等，因此，恶性黑色素瘤可以在皮肤、口腔、消化道、生殖系统的黏膜、眼球的睫状体、虹膜、脉络膜以及脑膜等处发生。

恶性黑色素瘤大多是由良好黑色素痣转化而来。环境因素、遗传因素、严重的化学、光损害及药物侵蚀都可以引发生成恶性黑色素瘤。

治疗方案一般采用外科手术治疗、放疗、化疗、内分泌治疗、生物治疗、生物化学治疗，中医则将病症分为风湿热毒、外郁肌肤型，肝郁气虚、瘀毒凝滞型，肝肾阴虚、肌肤失养型三种类型，对症治疗。

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发明内容

本发明的目的是提供一种壁虎蛆虫蛋白质在制备抗黑色素瘤药品中的应用，根据黑色素瘤的病灶特性及壁虎蛆虫蛋白质生物活性特点，两者相结合制备的药剂具有适应性强、疗效好的特点。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

（1）将1000g壁虎蛆虫在常温膨化装置（200520108339.X）中常温条件下膨化粉碎。

本步骤中，所述膨化压力为0.1~5MPa，时间为10~60min。

（2）膨化粉碎后的物料加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076.6）中，加入膨胀溶剂并加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，提取出壁虎蛆虫蛋白质粗品。

本步骤中，所述膨胀溶剂由1~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH₃·H₂O组成或由1~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵组成。

本步骤中，所述提取温度为10~20℃，时间为10~30min。

（3）收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液并且用微孔过滤器过滤去掉杂质。

本步骤中，所述微孔过滤器的孔径为0.5~50μm。

（4）用超滤机超滤处理，收集含有相应分子量的壁虎蛆虫蛋白质超滤溶液。

本步骤中，所述超滤机的孔径为50~100nm。

（5）超滤液溶解在适宜的溶剂中用固相萃取柱分离，收集洗脱成分。

本步骤中，所述溶剂为乙腈。

（6）将洗脱成分溶解在合适的溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱（200920274485.8）分离纯化。

本步骤中，所述溶剂体系由正丁醇-乙酸乙酯-水（体积比1.25:3.75:5）组成或4.5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500（重量比）组成。

（7）纯化后的壁虎蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机制备成冻干蛋白粉。

本步骤中，所述真空冷冻干燥温度为-30~50℃、时间为18~26h。

（8）赋予不同的药用辅助材料，可用于制备抗黑色素瘤药品。

本技术方案中分离的纯化壁虎蛆虫蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳及琼脂聚糖免疫电泳谱上测得非均一蛋白质；用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法及葡聚糖凝胶G-75凝胶过滤法测得相对分子量为10.9~12.6KPa；用等电聚焦发测定其等电点为pH8.8~10.2；常规化学法分析结果表明其不含糖基；紫外分光光度法测定纯化的壁虎蛆虫蛋白质含量为96.7%。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限如此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

实施例1：

（1）将1000g壁虎蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X）中，对膨化装置内充入二氧化碳气体并加压至0.1~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，壁虎蛆虫被膨化成粉体；

（2）膨化粉碎后的壁虎蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076.6）中，加入1~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH₃·H₂O，加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，保持温度10~20℃，时间10~30min，壁虎蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成壁虎蛆虫蛋白质粗品与甲醇-NH₃·H₂O的混合液；

（3）收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径0.5~50μm的微孔过滤器过滤去处固体杂质；

（4）溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0.3~0.8MPa，温度为常温，收集含有相应分子量的壁虎蛆虫蛋白质超滤溶液；

（5）超滤溶液用20%乙腈溶解，C₁₈固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加0.02~0.1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的乙腈梯度脱洗，流速1~10mL/min，收集相关梯度的洗脱成分；

（6）将洗脱成分溶解在4.5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500（重量比）溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱（200920274485.8）分离纯化，超声波功率0.2~3.0KW，频率500~1000KHz，流速50~500mL/min，紫外检测器波长260~280nm；

（7）纯化后的壁虎蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~50℃、时间18~26h干燥制备成冻干蛋白粉。

实施例2：

（2）膨化粉碎后的壁虎蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076.6）中，加入5Kg液态二氧化碳、300mL甲醇及200gNH₃·H₂O，加压至5MPa，形成膨胀溶剂体系，保持温度15℃，时间20min，壁虎蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成壁虎蛆虫蛋白质粗品与甲醇-NH₃·H₂O的混合液；

（3）收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径30μm的微孔过滤器过滤去处固体杂质；

（4）溶液用孔径100nm的超滤机超滤处理，压力0.5MPa，温度为常温，收集含有相应分子量的壁虎蛆虫蛋白质超滤溶液；

（5）超滤溶液用20%乙腈溶解，C₁₈固相萃取柱用80%乙腈活化预处理，加0.05%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的乙腈梯度脱洗，流速5mL/min，收集相关梯度的洗脱成分；

（6）将洗脱成分溶解在4.5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500（重量比）溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱（200920274485.8）分离纯化，超声波功率1.0KW，频率500KHz，流速200mL/min，紫外检测器波长260nm；

（7）纯化后的壁虎蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~40℃、时间20h干燥制备成冻干蛋白粉。

实施例3：

（2）膨化粉碎后的壁虎蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076.6）中，加入1~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵，加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，保持温度10~20℃，时间10~30min，壁虎蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成壁虎蛆虫蛋白质粗品与乙醇-氯化铵的混合液；

（6）将洗脱成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水（体积比1.25:3.75:5）溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱（200920274485.8）分离纯化，超声波功率0.2~3.0KW，频率500~1000KHz，流速50~500mL/min，紫外检测器波长260~280nm；

实施例4：

（1）将1000g壁虎蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X）中，对膨化装置内充入二氧化碳气体并加压至2MPa，时间40min，然后迅速释放压力至常压，壁虎蛆虫被膨化成粉体；

（2）膨化粉碎后的壁虎蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076.6）中，加入6Kg液态二氧化碳、200mL乙醇及150g氯化铵，加压至6MPa，形成膨胀溶剂体系，保持温度20℃，时间10min，壁虎蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成壁虎蛆虫蛋白质粗品与乙醇-氯化铵的混合液；

（3）收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径50μm的微孔过滤器过滤去处固体杂质；

（5）超滤溶液用20%乙腈溶解，C₁₈固相萃取柱用60%乙腈活化预处理，加0.08%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的乙腈梯度脱洗，流速8mL/min，收集相关梯度的洗脱成分；

（6）将洗脱成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水（体积比1.25:3.75:5）溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱（200920274485.8）分离纯化，超声波功率2.0KW，频率1000KHz，流速300mL/min，紫外检测器波长280nm；

（7）纯化后的壁虎蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~50℃、时间18h干燥制备成冻干蛋白粉。

实施例5：

肠溶胶囊的制备：

取10~100g壁虎蛆虫蛋白质、500~2000g预凝胶淀粉及5~50g乳糖充分混合，填充入羟丙基甲基纤维素肠溶胶囊中制备成为壁虎蛆虫蛋白质肠溶胶囊。

实施例6：

肠溶胶囊的制备：

取50g壁虎蛆虫蛋白质、1000g预凝胶淀粉及30g乳糖充分混合，填充入羟丙基甲基纤维素肠溶胶囊中制备成为壁虎蛆虫蛋白质肠溶胶囊。

实施例7：

壁虎蛆虫蛋白质喷雾剂的制备：

取100~160g壁虎蛆虫蛋白质加入50~100g藻酸丙二醇酯混匀，加入5~10g丙三醇中研磨均匀；将5~20g葡萄糖溶于2000~5000L注射用水，再将前述研磨物放入配制好的葡萄糖溶液中混合均匀即成为药液。先将药液在室温下灌入喷雾容器内，再将阀门装上并扎紧，然后压装机压入1000~2000L二氧化碳作抛射剂并加压0.01~0.05MPa，分装20000~50000个喷雾剂瓶中。

实施例8：

壁虎蛆虫蛋白质喷雾剂的制备：

取130g壁虎蛆虫蛋白质加入80g藻酸丙二醇酯混匀，加入6g丙三醇中研磨均匀；将10g葡萄糖溶于3000L注射用水，再将前述研磨物放入配制好的葡萄糖溶液中混合均匀即成为药液。先将药液在室温下灌入喷雾容器内，再将阀门装上并扎紧，然后压装机压入1500L二氧化碳作抛射剂并加压0.03MPa，分装30000个喷雾剂瓶中。

实施例11：

黑色素瘤疾病分期：

级：瘤细胞限于基底膜以上的表皮内；

级：瘤细胞突破基底膜，侵犯到真皮乳头皮；

级：瘤细胞充满真皮乳头皮，并进一步向下侵犯，但未到真皮网状层；

级：瘤细胞已侵犯到真皮网状层；

级：瘤细胞已穿过真皮网状层，侵犯到皮下脂肪层。

治疗方法：

患者需严格限制用酒，按体重70Kg计，每天注射脂质体药剂1次，每次300~500μg，或每天喷气雾剂3次，每次2~3mL；或口服肠溶胶囊，每天2次，每次3粒。

治疗结果分级标准：

、近期疗效（40天末与治疗前比较）

（1）完全缓解：病灶完全消失，无新的病灶出现；

（2）部分缓解：病灶缩小到治疗前的50%或更小，无新的病灶出现，多灶性病变时没有一个病灶增大；

（3）稳定期：轻度缓解：病灶缩小面积30%或增大面积25%，自觉症状改善，体力基本状况上升；基本稳定：病灶缩小不到25%或增大面积不超过25%以上，自觉症状改善，体力基本状况上升。

（4）扩展：单个面积或多个病灶总面积比治疗前增大25%以上或出现新的病变，临床症状加重，体力基本状况下降。

、中期疗效（7周~1年）

（1）完全缓解：无瘤生存；

（2）部分缓解：癌体回变到治疗前的面积50%以上，或出现新的病灶；癌体无增大或缩小，病症改善或消失；体力基本状况上升。

（3）转移或扩展：病原灶扩大发展，出现新的转移灶，临床症状加重，体力状况下降。

、远期疗效（1~5年）

（1）无瘤生存；

（2）带瘤生存；

（3）死亡。

治疗结果：

Claims

1.一种壁虎蛆虫蛋白质在制备抗黑色素瘤药品中的应用。

2.根据权利要求1所述的壁虎蛆虫蛋白质在制备抗黑色素瘤药品中的应用，其特征在于所述壁虎蛆虫蛋白质的制备方法步骤如下：

（1）将1000g壁虎蛆虫在常温膨化装置中常温条件下膨化粉碎；

（2）膨化粉碎后的物料加入到膨胀溶剂体系提取装置中，加入由1~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH₃·H₂O组成或由1~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵组成的膨胀溶剂并加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，提取出壁虎蛆虫蛋白质粗品；

（3）收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液并且用微孔过滤器过滤去掉杂质；

（4）用超滤机超滤处理，收集壁虎蛆虫蛋白质超滤溶液；

（5）超滤液溶解在乙腈中用固相萃取柱分离，收集洗脱成分；

（6）将洗脱成分溶解在由正丁醇-乙酸乙酯-水按体积比1.25:3.75:5组成或由聚乙二醇-葡聚糖T500按重量比4.5:7组成的溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱分离纯化；

3.根据权利要求1所述的壁虎蛆虫蛋白质在制备抗黑色素瘤药品中的应用，其特征在于所述抗黑色素瘤药品的剂型为肠溶胶囊，制备方法如下：

取10~100g壁虎蛆虫蛋白质、500~2000g预凝胶淀粉及5-50g乳糖充分混合，填充入羟丙基甲基纤维素肠溶胶囊中，制备成为壁虎蛆虫蛋白质肠溶胶囊。

4.根据权利要求1所述的壁虎蛆虫蛋白质在制备抗黑色素瘤药品中的应用，其特征在于所述抗黑色素瘤药品的剂型为喷雾剂，制备方法如下：

取100~160g壁虎蛆虫蛋白质加入50~100g藻酸丙二醇酯混匀，加入5~10g丙三醇中研磨均匀；将5~20g葡萄糖溶于2000~5000L注射用水，再将前述研磨物放入配制好的葡萄糖溶液中混合均匀即成为药液；先将药液在室温下灌入喷雾容器内，再将阀门装上并扎紧，然后压装机压入1000~2000L二氧化碳作抛射剂并加压0.01~0.05MPa，分装20000~50000个喷雾剂瓶中。