CN101757039B - 一种守宫的仿生酶解产物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种守宫的仿生酶解产物及其用途，属中药领域。其特征是采用仿生酶解的方法，取守宫，加水匀浆后，在适当的条件下，先以胃蛋白酶保温酶解，再以胰酶或胰蛋白酶保温酶解，所得的酶解物按不同的制剂要求制成制剂。本发明产物治疗肿瘤、心脑血管疾病及小儿疳积具有良好效果。

Description

一种守宫的仿生酶解产物及其用途

技术领域

本发明涉及一种守宫的仿生酶解产物，以及该酶解产物的药物用途。属中药领域。

背景技术

守宫，别名盐蛇干、壁虎、蝎虎、天龙，味咸性寒，功能祛风，定惊，散结，解毒。守宫作为药材始见于《本草经集注》，《本草纲目》称其能治“瘰疬初起……血积成痞，反胃膈气，痈疮大痛”。其可入血分透筋达络，既善破血散结解毒，又能通经活络而止痛。由于现代研究表明，守宫具有抗肿瘤、破瘀散结、降痰解毒等药理活性，人们对守宫的关注度日益提高。

守宫传统入药方式上通常采用原药材粉碎后直接服用，或水提、醇提后服用，亦有鲜品直接匀浆离心等方法，其所采取的提取方法比较传统。目前临床疗效确切的制剂如金龙胶囊、复方守宫散等，守宫药材利用率较低，活性物质没有获得充分的利用。经现代研究证明，守宫中的肽类成分的疗效越来越受到关注。人体经口服守宫后，经胃蛋白酶及胰酶的酶解、消化，以小分子肽类成分吸收入血发挥疗效。小分子的寡肽类物质和小肽类物质很容易被小

吸收，而大分子的蛋白类在小肠里很难被吸收。传统的原粉直接服用，原药粉中的大分子蛋白，只有少量在体内经过胃肠道的分解，变成小分子的寡肽或小肽而被吸收，其余大部分大分子蛋白由于药材粉碎的细度、胃肠道pH的变化及口服食物的影响等造成其水解的不完全，因而被吸收率很低，造成疗效的降低和大量药材的浪费。而传统的水提、醇提、水提醇沉的提取工艺又会使得蛋白质受热变性而不溶于水，最终被滤过除去，仅有极少数溶于水的低肽类成分被吸收，造成大量的药材浪费，疗效同样大大降低。

将动物蛋白进行体外酶解是一种获取小分子肽的有效方法，发明人提出了一种仿生的酶解方法——在生物自然进化过程的被确证有效的，模拟人体消化过程的仿生酶解法。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种更有效的，安全的守宫仿生酶解产物；本发明的第二目的是提供该提取物在治疗肿瘤，心脑血管疾病以及小儿疳积药物中的应用。

发明人提供一种守宫的酶解产物，该药物采用仿生酶解的方法制备：

取守宫，加水匀浆，调节pH至1.0～3.0，加入胃蛋白酶于35～45℃保温酶解0.5～6小时，再调节pH至7.5～8.5，加入胰酶或胰蛋白酶于40～50℃保温酶解2～8小时，即得。

进一步优化为：

取守宫，加2～5倍量水匀浆，调节pH至1.5～2.5，加入守宫量0.5％～5％的胃蛋白酶于35～45℃保温酶解1～3小时，再调节pH至7.5～8.5，加入守宫量0.5％～5％的胰酶或胰蛋白酶于40～50℃保温酶解3～6小时，即得。

较优的制备方法为：

取守宫，加1～4倍量水匀浆，加入适量的45℃的水，调节pH至2.0，加入守宫量1％～2％的胃蛋白酶于40℃保温酶解1～3小时，再调节pH至8.0，加入守宫量1％～2％的胰酶或胰蛋白酶于50℃保温酶解3～6小时，即得。

发明人经过试验筛选，守宫药材加水匀浆后，可预先加热至80～100℃，保温15～30分钟，再放冷至酶解所需温度，按以上操作酶解，其效果更强。按本发明技术方案进行酶解，当胃蛋白酶的酶活力达到1200U/g，胰蛋白酶的酶活力达到2500U/mg，胰酶的酪蛋白转化力达到25.0时，效果较为充分；酶活力越高，酶解速度越快、效果越好。

发明人所用的守宫可以是壁虎科动物蹼趾壁虎Gekko subpalmatus Guenther及同属多种壁虎的新鲜或干燥全体，鲜体可直接加水匀浆，干体可先粉碎成60～300目粉或超微粉，再加水匀浆。按本发明的方法操作，守宫的补肺益肾、纳气定喘、助阳益精、活血化瘀等活性大大增强，优于以往常用的守宫原粉、水提液、醇提液及水提醇沉液。

人体经口服守宫后，经胃蛋白酶及胰酶的酶解、消化，以小分子肽类成分吸收而发挥疗效。发明人参照人体口服守宫等动物药的过程，创造性的在体外采用人体仿生酶解的方法，完全模拟人体条件，先后对原料进行胃蛋白酶、胰蛋白酶或胰酶酶解，和人体直接口服药材原粉比较，所得吸收物质群相似，但体外酶解选择较优的试验条件，酶解的更充分，药效更强。经过试验筛选，单独以胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶等单一蛋白酶酶解守宫，效果均优于原粉直接口服，但都低于本发明方法。本发明完全模拟人体仿生酶解法，与前述方法有本质区别。本法所得小肽更多、分子量更小，疗效更高。本发明方法在很大程度上增强了守宫等动物药的疗效，而且由于以小分子寡肽的形式入药，可以通过粘膜直接进入血液，更好地发挥其药效作用，如果制成口服制剂(片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂等)，则在小肠内更易于吸收而发挥更好的疗效；若制为外用制剂(膏剂、湿敷剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、滴眼剂等)，则透皮吸收快而起效迅速；若制为注射剂(水针剂粉针剂等)，由于分子量小，应用时没有引入异蛋白，极大减小了毒副作用。

本领域技术人员可以方便地将本发明小分子寡肽物质群，配合适当的辅料，制备成口服制剂、外用制剂及注射剂等，如：

a、将酶解液直接喷雾干燥，加入适量的常规辅料如淀粉、乳糖、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠等制成胶囊剂或片剂。

b、将酶解液加热至85℃杀酶后，滤过，滤液以超滤膜超滤，分取截留分子量5kD以下的溶液，可加入等渗调节剂、pH调节剂、防腐剂等制成注射液；也可加入甘露醇、乳糖等冻干制成冻干粉针剂。

c、将酶解液滤过，滤液以超滤膜超滤，截留分子量10kD以下的溶液，或滤液直接加卡波姆、壳聚糖等常规药用辅料，制成凝胶剂或喷雾剂。

本发明提供的守宫仿生酶解产物可以单独使用，也可以与其他药物成分联合使用，即：在药物活性成分中，可以只有该产物，还可以是其与其他药物的混合物，达到配合治疗、辅助治疗的目的。

本发明守宫仿生酶解产物不仅可以用于治疗肿瘤，还可以用于心脑血管疾病以及小儿疳积疾病的治疗。

有益效果

为进一步验证本发明产物的治疗作用，发明人进行了系列验证实验，实验中的“仿生酶解组”即为按本发明技术方案制得的守宫酶解产物：

实验1：对S180荷瘤小鼠的体内抑瘤作用和免疫器官的影响

1、材料

1.1动物　昆明种小鼠，雌雄各半，体重20g±2g购自山东中医药大学实验动物中心。

1.2药品　未酶解组：取守宫药材细粉(80目)50g，加入10倍量生理盐水，匀浆30分钟，搅匀，取1/4量，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得；

胃蛋白酶酶解组：取1/4匀浆液，加入1％胃蛋白酶，同时调节pH至2.0，温度为40℃±2℃，保温同时搅拌酶解2h，85℃保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得；

胰蛋白酶酶解组：取1/4匀浆液，加入1％胰蛋白酶，同时调节pH至8.0，温度为50℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得；

仿生酶解组：取1/4匀浆液，加入1％胃蛋白酶，同时调节pH至2.0，温度为40℃±2℃，保温同时搅拌酶解2h，然后调pH至8.0，加入1％胰蛋白酶，温度为50℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得；

空白对照组：即生理盐水组。

1.3试剂　胃蛋白酶，购自国药基团化学试剂有限公司，批号：F20080108；胰蛋白酶，购自国药基团化学试剂有限公司，批号：F20071218。

2、方法与结果

2.1试验方法：取健康昆明种小鼠，从S180传代第七天小鼠抽取腹水液，用生理盐水

成瘤细胞悬液，细胞数为(1～2)×10⁷/ml，每鼠右腋皮下接种0.2ml，随机分组：空白组、5-Fu对照组、未酶解样品组、胃蛋白酶酶解样品组、胰蛋白酶酶解样品组、仿生酶解样品组，每组10只。5-Fu对照组以5-Fu(3g/L)0.2ml腹腔注射给药，空白组以0.2ml生理盐水灌胃给药，样品组分别对应以0.2ml样品液灌胃给药，持续10天，第11天处死小鼠，立即分离胸腺和脾脏，剔除周围结媂组织，用滤纸吸干表面水分，称重，计算脏器指数；剥瘤，称重，计算抑瘤率。

指数＝重量(mg)/体重(g)

抑瘤率％＝(空白组瘤重均值-样品组瘤重均值)/空白组瘤重均值×100％。

2.2试验结果　对S180荷瘤小鼠的体内抑瘤作用见下表1；对S180荷瘤小鼠免疫器官的影响见表2。

表1　对S180荷瘤小鼠的体内抑瘤作用(X±S，n＝10)

 

组别	瘤重(g)	抑瘤率(％)
			未酶解样品组	1.45±0.36	22.0
胃蛋白酶酶解样品组	1.24±0.28*	33.3*
			胰蛋白酶酶解样品组	1.12±0.35*	39.8*
仿生酶解样品组	0.87±0.26**	53.2**
			空白组	1.86±0.52	0
5-Fu对照组	0.71±0.25**	61.8**

注：与空白组比较，^*P<0.05，^**P<0.01。

以上试验结果表明，仿生酶解样品抑瘤效果明显优于其余三组，与空白组比较具有显著性差异。

表2  对S180荷瘤小鼠免疫器官的影响(X±S，n＝10)

 

组别	胸腺指数(mg/g)	脾脏指数(mg/g)
			未酶解样品组	2.15±0.76	7.37±1.54
胃蛋白酶酶解样品组	2.18±0.53	7.13±0.95
			胰蛋白酶酶解样品组	2.03±0.66	6.96±1.62
仿生酶解样品组	2.24±0.81	7.27±2.18

 

空白组	2.31±0.87	7.53±1.51
			5-Fu对照组	1.46±0.63*	5.42±0.87*

注：与空白组比较，^*P<0.01。

以上试验结果表明，守宫各样品组胸腺指数、脾脏指数与空白组无明显差异，而5-Fu组两者均有明显降低，说明与抗肿瘤西药相比，守宫能很好的保护小鼠的免疫机能，利于改善机体状态，为守宫治疗肿瘤的优势之一。

实验2：对H₂₂肝癌细胞的体外杀伤作用的影响

1、材料

1.1动物　昆明种小鼠，体重20g±2g，购自山东中医药大学实验动物中心；H₂₂肝癌细胞株，在小鼠体内常规方法传代。

1.2药品　各供试品溶液的制备方法同上。

2、方法与结果

2.1试验方法　无菌抽取出生7天的小鼠腹腔肿瘤细胞，用含100g/L胎牛血清的RPMI1640培养液调整肿瘤细胞浓度至1×10⁷/L_接种于96孔板，每孔100μL，实验设空白组、5-Fu对照组、未酶解样品组、胃蛋白酶酶解样品组、胰蛋白酶酶解样品组、仿生酶解样品组，每组设10个复孔。各样品液先加入等体积的2×1640培养液，后加入一定量的胎牛血清，使血清终浓度为10％，每孔加入150μL，5-Fu对照组每孔加入3g/L的5-Fu液25μL，各孔加入100g/L胎牛血清的RPMI1640培养液使总体积均为250μL。培养板置于37℃，50ml/L的CO₂的孵箱中培养72h后，每孔加入浓度为5g/L的MTT液25μL，继续孵育4h后终止培养，

心弃上清液，每孔加入200μL的DMSO，震荡10分钟后溶解沉淀，混匀后以酶标仪于570nm波长处读取各孔吸光度，计算抑制率，抑制率％＝(空白孔 A均值-样品孔 A均值)/空白孔A均值×100％。

2.2试验结果  对H₂₂肝癌细胞的体外杀伤作用的影响见表3。

表3  对H₂₂肝癌细胞的体外杀伤作用的影响(X±S，n＝10)

 

组别	A均值	抑瘤率(％)
			未酶解样品组	0.846±0.075*	17.1*
胃蛋白酶酶解样品组	0.673±0.031**	34.0**
			胰蛋白酶酶解样品组	0.618±0.106**	39.5**
仿生酶解样品组	0.476±0.088***	53.4***
			空白组	1.021±0.102	0

 

5-Fu对照组

0.405±0.063***

60.3***

注：与空白组比较，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

以上试验结果表明，仿生酶解样品组、胃蛋白酶酶解样品组、胰蛋白酶酶解样品组均可明显抑制H₂₂肝癌细胞，且仿生酶解样品组优于其余两组，与空白对照组比较具有显著性差异，较未酶解样品组效果好。

实验3：对大鼠静脉血栓形成的影响

1、材料

1.1动物　Wister大鼠50只，雌雄各半，体重200±20g。购自山东中医药大学实验动物中心。

1.2药品　各供试品溶液的制备方法同上。

2、方法与结果

2.1试验方法　取Wister大鼠50只，雌雄各半，体重200±20g，随机分为空白组、未酶解样品组、胃蛋白酶酶解样品组、胰蛋白酶酶解样品组、先胃蛋白酶后胰蛋白酶酶解样品组共5组，每组10只，灌胃给药，每天1次，给药剂量分别为10ml/kg，空白对照组灌胃给予同体积生理盐水，连续7天。末次给药后1h，各组动物腹腔注射3.5％戊巴比妥钠麻醉，剖腹分离下腔静脉，于左肾静脉下穿一丝线结扎下腔静脉管，造成淤血，关闭腹腔。6h后，打开腹腔，于结扎下方2cm处夹闭血管，纵行剖开，取出血栓，记录血栓有无并称重。

2.2试验结果　结果见表4。

表4　对大鼠静脉血栓形成的影响(X±S，n＝10)

 

组别	动物数(只)	血栓湿重(mg)
			未酶解样品组	10	17.62±3.16*
胃蛋白酶酶解样品组	10	16.47±2.13**
			胰蛋白酶酶解样品组	10	15.89±2.65**
仿生酶解样品组	10	11.43±1.66***
			空白对照组	10	23.41±4.38

注：与空白对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

以上试验结果表明，仿生酶解样品组、胃蛋白酶酶解样品组、胰蛋白酶酶解样品组均可抑制血栓的形成，且仿生酶解样品组优于其余两组，与空白对照组比较具有显著性差异，对于心脑血管疾病患者可达到活血化瘀的效果。

上述实验结论，提示本发明酶解产物对于肿瘤、心脑血管疾病、及小儿疳积具有较好的治疗效果。

具体实施方式

下面列举实施例，进一步说明本发明，各实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明：

实施例1

取干燥守宫1000g，粉碎成80目细粉，加10倍量水匀浆，加热至90℃并保温15分钟后再降至40℃，调节pH至2.5，加入守宫量0.5％的胃蛋白酶于40℃保温酶解2小时，调节pH至8.0，加入守宫量1％的胰酶或胰蛋白酶于50℃保温酶解3小时，加热至85℃保温15分钟，滤过，滤液以超滤膜超滤，分取截留分子量1kD以下的溶液，过纳滤膜，收集分子量大于200部分，加入甘露醇，冷冻干燥，制成冻干粉针剂，即得。

实施例2

取新鲜守宫10kg，加10倍量水匀浆，加热至100℃并保温60分钟后，再降至40℃，调节pH至2.0，加入守宫量2％的胃蛋白酶于40℃保温酶解1小时，调节pH至8.0，加入守

量3％的胰酶或胰蛋白酶于50℃保温酶解4小时，喷雾干燥，加入适量的淀粉，制粒，干燥，整粒，填装胶囊，即得。

实施例3

取干燥守宫5kg，粉碎成100目细粉，加5倍量水匀浆，加热至80℃并保温30分钟后，再降至40℃，调节pH至2.5，加入守宫量1％的胃蛋白酶于40℃保温酶解2小时，调节pH至7.6，加入守宫量2％的胰酶或胰蛋白酶于50℃保温酶解4小时，喷雾干燥，加入适量的微晶纤维素，制粒，干燥，整粒，压制成片，即得。

实施例4

取实施例2所制胶囊治疗非小细胞肺癌患者25例。治疗方案：患者TP化疗后口服守宫胶囊，每次2粒，每日3次。连续服用30天后肿瘤原发灶的缩小、生活质量的改善、免疫能力的改变、临床症状的缓解以及不良反应，结果：总有效率71.4％。可见，守宫胶囊可明显提高NSCLC患者生活质量、提高免疫力，明显改善临床症状。

实施例5

取实施例2所制胶囊观察守宫治疗晚期癌症临床效果。治疗方案：50例患者分为两组，守宫胶囊+化疗组25人，单服守宫胶囊组25人，每次2粒，每日3次。结果：在显效病例中守宫胶囊+化疗组有效率(74.3％)明显高于单药组(31.8％)，守宫胶囊对患者血色素、免疫指标有一定提升作用，对肿瘤指标(CEA)有一定抑制作用，较明显地提高了癌症患者的生活质量，可见，守宫胶囊可作为化疗增效药，对临床症候改善有益。

实施例6

取实施例2所制胶囊治疗缺血性中风患者32例。治疗方案：口服，每次2粒，每日3次，连服30天。疗效标准分为治愈(症状消失，活动自如，功能恢复)、显效(症状基本消失或明显改善，但仍有部分功能有待康复治疗)、无效(患者主要症状仍未见明显改善)三个等级。结果，治愈14例，治愈率为43.8％；显效17例，显效率为53.1％；无效1例；总有效率96.9％。

Claims (7)

1.一种中药守宫的仿生酶解产物，其特征在于该产物是按以下方法制备的：

取守宫，加水匀浆，加热至80～100℃并保温15～30分钟，放冷，调节pH至1.0～3.0，加入胃蛋白酶于35～45℃保温酶解0.5～4小时，再调节pH至7.5～8.5，加入胰酶或胰蛋白酶于40～50℃保温酶解2～8小时，即得。

2.根据权利要求1所述的守宫仿生酶解产物，其特征在于该产物是按以下方法制备的：

取守宫，加水匀浆，加热至80～100℃并保温15～30分钟，放冷，调节pH至1.5～2.5，加入守宫量0.5％～5％的胃蛋白酶于35～45℃保温酶解1～3小时，再调节pH至7.5～8.5，加入守宫量0.5％～5％的胰酶或胰蛋白酶于40～50℃保温酶解3～6小时，即得。

3.根据权利要求2所述的守宫仿生酶解产物，其特征在于该产物是按以下方法制备的：

取守宫，加水匀浆，加热至80～100℃并保温15～30分钟，放冷，调节pH至2.0，加入守宫量1％～2％的胃蛋白酶于40℃保温酶解1～3小时，再调节pH至8.0，加入守宫量1％～2％的胰酶或胰蛋白酶于50℃保温酶解3～6小时，即得。

4.根据权利要求1至3中任一所述的守宫仿生酶解产物，其特征在于所用的胃蛋白酶的酶活力不低于1200U/g，胰蛋白酶的酶活力不低于2500U/mg，胰酶的酪蛋白转化力不低于25.0。

5.权利要求1至4中任一所述的守宫仿生酶解产物在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。

6.权利要求1至4中任一所述的守宫仿生酶解产物在制备用于治疗心脑血管疾病的药物中的应用。

7.权利要求1至4中任一所述的守宫仿生酶解产物在制备用于治疗小儿疳积的药物中的应用。