JP6045678B1 - アワビのβグルカン結合タンパク質から誘導された抗菌ペプチド、これをコーディングする核酸及びこれらの用途 - Google Patents

Abstract

【課題】抗菌及び／または抗癌活性を有する新規ペプチド、新規ペプチドをコーディングする核酸及び新規ペプチドをコーディングする核酸が挿入されている再組合発現ベクターの提供。新規ペプチドを有効成分として含有する抗菌用及び／または抗癌用組成物としての薬学組成物、化粧品組成物及び／又は食品添加補助剤の提供。【解決手段】抗菌特性及び新しい生理学的活性として抗癌特性を有するペプチド、これをコーディングする核酸及びこのペプチド若しくは核酸の応用に関するものである。合成されたペプチド若しくはこのペプチドをコーディングする核酸が挿入されたベクターを有効成分に用い、抗菌及び／または抗癌組成物、例えば薬学的組成物、化粧品組成物及び／または食品添加剤に活用することができる。【選択図】図３Ａ

Description

本発明は、新規ペプチドに関するものであり、さらに詳細には抗菌活性及び／または抗癌活性を有する新規ペプチド、これをコーディングする核酸及びこれらの産業的応用のような用途に関するものである。

外部病原体に対する防衛システムとしての免疫システムは、生命体によって異なる。すべての免疫システムは自己（ｓｅｌｆ）と非自己（ｎｏｎ−ｓｅｌｆ）を区別し、外部分子を認識（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）、処理（ｄｉｓｐｏｓａｌ）、伝達（ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）するシステムで構成され得る。生命体における外部病原体に対する免疫システムは、病原体がはじめて侵入したとき、これを直ちに感知して反応する先天性免疫システム（ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ）と、同一病原体が侵入したとき、これを記憶し、効率的に病原体に対する防衛システムを構築する後天性免疫システムである適応性免疫システム（ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ）に大きく分けられる。

適応性免疫システムが発達した脊椎動物と異なり、無脊椎動物は抗体がなく、適応性免疫システムがないか或いは不十分である。その代わりに無脊椎動物は、侵入する病原体に対する防衛システムとして非常に効率的な先天性免疫系を有している。特に、海底環境では病原体となり得る微生物が豊かに生息するが、海洋無脊椎動物は、かかる微生物の豊かな環境で生息し、増殖するため、陸上の無脊椎動物に比べてより効率的な先天性免疫系が発達した。

海洋無脊椎動物をはじめとする生命体における先天性免疫反応の第１段階は、生体内に侵入しようとする病原菌を認識することである。代表的な病原体の一つである微生物の細胞壁は、脂質多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ、ＬＰＳ）、β‐１，３‐グルカン（β‐１，３−ｇｌｕｃａｎ）及びペプチドグリカン（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎｓ）といった糖タンパク質からなる病原体関連分子パターン（ｐａｔｈｏｇｅｎ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎｓ、ＰＡＭＰｓ）を有しているが、これらは宿主には存在しないか、或いは様々な方法で隠されている。かかる病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）は、無脊椎動物の先天性免疫システムを構成する特定タンパク質、例えばパターン認識受容体（ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＰＲＲｓ）若しくはパターン認識タンパク質（ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＰＲＰｓ）によって認識することができる。

ＰＲＰｓとＰＡＭＰｓは複合体を形成し、一連の活性化された免疫反応を誘導する。それぞれのＰＲＰｓは、多細胞生物にはなく、病原体微生物の表面にのみ存在する適切なＰＡＭＰｓを認識・結合し、食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）、ノジュール形成（ｎｏｄｕｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、被包化（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）、プリテイナーゼカスケード（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｃａｓｃａｄｅ）活性化及び抗菌ペプチドの合成といった一連の免疫反応を誘発する。例えば、ペプチドグリカン認識タンパク質（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＰＧＲＰｓ）、Ｃ‐型レクチン（ｌｅｃｔｉｎｓ）、脂質多糖類結合タンパク質（ＬＰＳ‐ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、β‐１，３‐グルカン結合タンパク質（β‐ｇｌｕｃａｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、βＧＢＰ）などといった脂質多糖類及びグルカン結合タンパク質（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｎｄ ｇｌｕｃａｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＬＧＢＰ）に代表される様々な形の無脊椎動物由来のＰＲＰｓが報告されている。

微生物の細胞壁に存在するＰＡＭＰｓは、無脊椎動物の防衛細胞の機能を直接に活性化させるが、無脊椎動物のＰＲＰｓによって引き起こされる一連の刺激を増幅させる免疫反応は、脊椎動物における抗体の２次的な活性と類似する。特に、プロフェノールオキシダーゼ（ｐｒｏｐｈｅｎｏｌｏｘｙｄａｓｅ、ｐｒｏ‐ＰＯ）活性システムは、極めて様々な無脊椎動物において重要な防衛メカニズムを見せる。この免疫システムは、酵母及び菌類（ｆｕｎｇｕｓ）のような真菌類の細胞の主要成分として存在するＬＰＳ、ペプチドグリカン及びβ‐１，３‐グルカンのような細菌性抗原（糖類部位、ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｍｏｉｅｔｙ）を認識するのに基づく。

水棲生物において一部のＬＧＢＰがクローニング・分析された。例えば、ウチダザリガニ（Ｐａｃｉｆａｓｔａｃｕｓ ｌｅｎｉｕｓｃｕｌｕｓ ＬＧＢＰ）、クルマエビ（Ｍａｒｓｕｐｅｎａｅｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａｓ ＬＧＢＰ）、コウライエビ（Ｆｅｎｎｅｒｏｐｅｎａｅｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ＬＧＢＰ）、アズマニシキ（Ｃｈｌａｍｙｓ ｆａｒｒｅｒｉ ＬＧＢＰ）、クロアワビ（Ｈａｌｉｏｔｉｓ ｄｉｓｃｕｓ ＢＧＲＰ）、アコヤガイ（Ｐｉｎｃｔａｄａ ｆｕｃａｔａ ＬＧＢＰ）などが報告された。特に、ウチダザリガニ（Ｐａｃｉｆａｓｔａｃｕｓ ｌｅｎｉｕｓｃｕｌｕｓ ＬＧＢＰ）は、プロフェノールオキシダーゼ（ｐｒｏＰＯ）の活性に重要な役割を果たすことが知られている。

一般的に、ＬＧＢＰは、多糖類結合モチーフ（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）とβグルカン認識モチーフ（ｂｅｔａ ｇｌｕｃａｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）の二つの多糖類認識部位を含んでいる。無脊椎動物は、すべての酵母及び菌類細胞の主要成分として存在するＬＰＳ、ペプチドグリカン及びβ‐１，３‐グルカンのような細菌抗原（糖類部位）を認識する。

ＬＰＳの結合若しくは認識ドメインに基づいて設計された抗菌ペプチドが知られている。現在、様々な甲殻類から得られた抗リポ多糖因子（ａｎｔｉ‐ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆａｃｔｏｒ、ＡＬＦ）の相応する合成ＬＰＳ‐結合ドメインペプチドで抗菌活性が報告されている。例えば、非ヘム鉄（ｎｏｎ−ｈｅｍｉｃ ｉｒｏｎ）結合糖タンパク質であるラクトフェリン（ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ）は、そのＬＰＳ‐結合ドメインが抗菌活性を有している。グラム陰性結合タンパク質３（Ｇｒａｍ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ３、ＧＮＢＰ３）の再組合Ｎ‐末端ドメインは、β‐１，３‐グルカンに結合し、抗菌活性を見せる。

しかし、新型の抗菌ペプチドを開発し、これらの新しい生理学的な活性を研究する必要がある。

本発明の目的は、抗菌及び／または抗癌活性を有する新規ペプチド、新規ペプチドをコーディングする核酸及び新規ペプチドをコーディングする核酸が挿入されている再組合発現ベクターを提供することである。

本発明の他の目的は、新規ペプチドを有効成分として含有する抗菌用及び／または抗癌用組成物としての薬学組成物、化粧品組成物及び／または食品添加補助剤を提供することである。

本発明は、抗菌特性及び新しい生理学的活性として抗癌特性を有するペプチド、これをコーディングする核酸及び応用に関するものである。

本発明の一側面によると、本発明は下記式（１）で表される配列を有するペプチドを提供する。

[式１]
（Ｎ‐末端）‐ＷＬＷＫＡＩＷＫＬＬＸ‐（Ｃ末端）…（１）

式（１）中、Ｘはリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）で構成される群から選択される塩基性アミノ酸であるか、或いはセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラジン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）で構成される群から選択される極性アミノ酸である。

例えば、前記式（１）のペプチドは、配列番号：３若しくは配列番号：５のアミノ酸配列で構成される。

例示的な実施形態において、前記式（１）で表されるペプチドのＣ‐末端は、アミド化されている。

前記ペプチドは、抗菌活性及び抗癌活性から選択される少なくとも一つの生理的活性を有することができる。

本発明の他の側面によると、本発明は、前述したペプチドをコーディングする核酸を提供する。

例えば、前記核酸は、配列番号：４若しくは配列番号：６の塩基配列で構成されるヌクレオチドを含むことができる。

本発明のさらに他の側面によると、本発明は、前述したペプチドをコーディングする核酸が挿入された再組合発現ベクターを提供する。

本発明のさらに他の側面によると、本発明は、前述したペプチドを有効成分として含む抗癌用薬学組成物を提供する。

例えば、前記ペプチドは、子宮癌、子宮頸癌及び肺癌で構成される群から選択される少なくとも一つの癌を治療するための薬学組成物として用いられる。

本発明のさらに他の側面によると、本発明は、前述したペプチドを有効成分として含む抗菌用薬学組成物を提供する。

例えば、前記ペプチドは、グラム陽性菌、グラム陰性菌及び酵母に対して抗菌活性を示す。

本発明のさらに他の側面によると、本発明は、前述したペプチドを有効成分として含む抗菌用化粧品組成物を提供する。

本発明のさらに他の側面によると、本発明は、前述したペプチドを有効成分として含む抗菌用食品添加剤を提供する。

本発明によって得られるペプチド変異体は、様々な病原体に対し、効率的な抗菌活性を示す。さらに、本発明によって合成されるペプチドは、抗菌活性の他、別の生理的活性として様々な癌細胞株に対する抗癌活性を見せる。

したがって、本発明によって合成されるペプチドは、抗菌、抗生用組成物及び／または抗癌用組成物の有効成分として応用することができる。例えば、本発明によって合成されるペプチドは、抗癌用及び／または抗菌用薬学組成物の有効成分としてはもちろん、化粧品保存剤として抗菌用化粧品組成物の有効成分や抗菌用食品添加剤の有効成分として活用できることが期待される。

本発明の例示的な実施例により、アワビ（ａｂａｌｏｎｅ）から由来した脂質多糖類及びβ‐１，３‐グルカン結合タンパク質（ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ）の全長アミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列を示した図面である。信号ペプチド配列とポリ‐（Ａ）信号部位は、それぞれ下線で表し、インテグリン結合モチーフとＮ‐糖化部位は、灰色の四角形で囲んで強調している。そして、多糖結合モチーフは、赤いイタリック体及び下線で表す。 本発明の例示的な実施例により、アワビから由来した脂質多糖類及びβ‐１，３‐グルカン結合タンパク質（ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ）を構成するペプチド及び天然ペプチドから一部のアミノ酸を置換し、合成したペプチド変異体に対するＳｃｈｉｆｆｅｒ‐Ｅｄｍｕｎｄｓｏｎのヘリカルホイールダイアグラムである。矢印は、天然ペプチド（ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ）で置換されたアミノ酸残基を表し、ペプチドを構成する疎水性アミノ酸残基と親水性アミノ酸残基は、四角形で囲んである。 本発明の例示的な実施例によって合成されたペプチド変異体であるＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１の抗菌活性を測定したグラフである。微生物の成長は、ペプチドのない状態で観察された最大吸光度（ＯＤ）に対するパーセントで表す。データは、３回の独立的な実験により得られたものであり、平均±標準偏差（ＳＤ）値で表す。 本発明の例示的な実施例によって合成されたペプチド変異体であるＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２の抗菌活性を測定したグラフである。微生物の成長は、ペプチドのない状態で観察された最大吸光度（ＯＤ）に対するパーセントで表す。データは、３回の独立的な実験により得られたものであり、平均±標準偏差（ＳＤ）値で表す。 本発明の例示的な実施例によって合成されたペプチド変異体の加熱処理後の抗菌活性を示す写真である。図中、Ｎは非加熱処理ペプチドの放射拡散分析の結果を、Ｈは１００℃で１０分間加熱処理したペプチドの放射拡散分析の結果を示す。 本発明の例示的な実施例によって合成されたペプチドの塩濃度による抗菌活性を示す写真である。 本発明の例示的な実施例によって合成されたペプチド変異体であるＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１を、ＨｅＬａ細胞株とＡ５４９細胞株に対し、異なる濃度で処理した後の細胞形態を、位相差顕微鏡を用いて撮影した写真である。図中、上側がＨｅＬａ細胞株に対する分析結果であり、下側がＡ５４９細胞株に対する分析結果である。 本発明の例示的な実施例によって合成されたペプチド変異体であるＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２を、ＨｅＬａ細胞株とＡ５４９細胞株に対し、異濃度で処理した後の細胞形態を、位相差顕微鏡を用いて撮影した写真である。図中、上側がＨｅＬａ細胞株に対する分析結果であり、下側がＡ５４９細胞株に対する分析結果である。 本発明の例示的な実施例によって合成されたペプチド変異体であるＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１を、ＨｅＬａ細胞株、Ａ５４９細胞株及び正常細胞株に対し、３７℃で２４時間処理した後、各細胞株の生存力を測定したグラフである。 本発明の例示的な実施例によって合成されたペプチド変異体であるＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２を、ＨｅＬａ細胞株、Ａ５４９細胞株及び正常細胞株に対し、３７℃で２４時間処理した後、各細胞株の生存力を測定したグラフである。 酢酸で２４時間処理し、Ａｎｎｅｘｉｎ‐Ｖ‐ＦＩＴＣ／ＰＩで染色したＨｅＬａ細胞における細胞膜の構造維持及びホスファチジルセリンの露出度合いを測定したＦＡＣＳ分析結果を示すグラフである。 本発明の例示的な実施例によって合成されたペプチド変異体であるＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１（濃度１μｇ／ｍｌ）で２４時間処理し、Ａｎｎｅｘｉｎ‐Ｖ‐ＦＩＴＣ／ＰＩで染色したＨｅＬａ細胞における細胞膜の構造維持及びホスファチジルセリンの露出度合いを測定したＦＡＣＳ分析結果を示すグラフである。 本発明の例示的な実施例によって合成されたペプチド変異体であるＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１（濃度５μｇ／ｍｌ）で２４時間処理し、Ａｎｎｅｘｉｎ‐Ｖ‐ＦＩＴＣ／ＰＩで染色したＨｅＬａ細胞における細胞膜の構造維持及びホスファチジルセリンの露出度合いを測定したＦＡＣＳ分析結果を示すグラフである。 本発明の例示的な実施例によって合成されたペプチド変異体であるＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１（濃度１０μｇ／ｍｌ）で２４時間処理し、Ａｎｎｅｘｉｎ‐Ｖ‐ＦＩＴＣ／ＰＩで染色したＨｅＬａ細胞における細胞膜の構造維持及びホスファチジルセリンの露出度合いを測定したＦＡＣＳ分析結果を示すグラフである。 本発明の例示的な実施例によって合成されたペプチド変異体であるＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１（濃度２０μｇ／ｍｌ）で２４時間処理し、Ａｎｎｅｘｉｎ‐Ｖ‐ＦＩＴＣ／ＰＩで染色したＨｅＬａ細胞における細胞膜の構造維持及びホスファチジルセリンの露出度合いを測定したＦＡＣＳ分析結果を示すグラフである。 酢酸で２４時間処理し、Ａｎｎｅｘｉｎ‐Ｖ‐ＦＩＴＣ／ＰＩで染色したＨｅＬａ細胞における細胞膜の構造維持及びホスファチジルセリンの露出度合いを測定したＦＡＣＳ分析結果を示すグラフである。 本発明の例示的な実施例によって合成されたペプチド変異体であるＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２（濃度１μｇ／ｍｌ）で２４時間処理し、Ａｎｎｅｘｉｎ‐Ｖ‐ＦＩＴＣ／ＰＩで染色したＨｅＬａ細胞における細胞膜の構造維持及びホスファチジルセリンの露出度合いを測定したＦＡＣＳ分析結果を示すグラフである。 本発明の例示的な実施例によって合成されたペプチド変異体であるＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２（濃度５μｇ／ｍｌ）で２４時間処理し、Ａｎｎｅｘｉｎ‐Ｖ‐ＦＩＴＣ／ＰＩで染色したＨｅＬａ細胞における細胞膜の構造維持及びホスファチジルセリンの露出度合いを測定したＦＡＣＳ分析結果を示すグラフである。 本発明の例示的な実施例によって合成されたペプチド変異体であるＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２（濃度１０μｇ／ｍｌ）で２４時間処理し、Ａｎｎｅｘｉｎ‐Ｖ‐ＦＩＴＣ／ＰＩで染色したＨｅＬａ細胞における細胞膜の構造維持及びホスファチジルセリンの露出度合いを測定したＦＡＣＳ分析結果を示すグラフである。 本発明の例示的な実施例によって合成されたペプチド変異体であるＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２（濃度２０μｇ／ｍｌ）で２４時間処理し、Ａｎｎｅｘｉｎ‐Ｖ‐ＦＩＴＣ／ＰＩで染色したＨｅＬａ細胞における細胞膜の構造維持及びホスファチジルセリンの露出度合いを測定したＦＡＣＳ分析結果を示すグラフである。 本発明の例示的な実施例によって合成されたペプチド変異体のＤＮＡに対するゲル遅延度アッセイの結果を示す写真である。アガロースゲルを用い、商業的な分子量マーカーであるλ‐Ｈｉｎｄ IIIで切断されたＤＮＡ（５０ｎｇ）の遅延度を測定し、ＤＮＡに対するペプチドの結合を測定した。 本発明の例示的な実施例によって合成されたペプチド変異体のＤＮＡ重合酵素の抑制分析結果を示す写真である。ＤＮＡ重合酵素に対するペプチドの効果は、 Ｅ．ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒＤＮＡを増幅したＰＣＲを用いてテストした。

＜定義＞
本明細書において、用語「アミノ酸」は最も広い意味で用いられ、自然発生Ｌ-アミノ酸若しくは残基を含むものと意図される。自然発生アミノ酸に対し、通常用いられる１-及び３‐文字略語が本明細書に用いられる（文献［Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２ｄ ｅｄ．、ｐｐ．７１−９２、（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７５］）。アミノ酸はＤ‐アミノ酸のみならず、化学的に変形されたアミノ酸、例えばアミノ酸類似体、通常はタンパク質に混入されない自然発生アミノ酸、例えば、ノルロイシン及び当業界に公知されたアミノ酸の特性を有する、化学的に合成された化合物を含む。例えば、天然フェニルアラニン（Ｐｈｅ）若しくはプロリン（Ｐｒｏ）と同一のペプチド化合物の立体形態の制限を許容するフェニルアラニン若しくはプロリンの類似体若しくは模倣体がアミノ酸の定義内に含まれる。かかる類似体及び模倣体は、本明細書においてアミノ酸の「機能的均等物」として称される。アミノ酸の他の例は、文献［Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｖｅｌｌａｃｃｉｏ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｄｓ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｈｏｆｅｒ、Ｖｏｌ．５、ｐ．３４１（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．：Ｎ．Ｙ．１９８３）］に列挙されている。

例えば、標準固体相合成技術により合成された合成ペプチドは、遺伝子によってコーディングされるアミノ酸に制限されず、それによって与えられたアミノ酸に対し、より広範囲に様々な置換を許容する。遺伝子コードによってコーディングされないアミノ酸は、本明細書において「アミノ酸類似体（ａｎａｌｏｇ）」として称され、例えばＷＯ９０／０１９４０に記載されている。例えば、アミノ酸類似体は、Ｇｌｕ及びＡｓｐに対する２‐アミノアジピン酸（Ａａｄ）；Ｇｌｕ及びＡｓｐに対する２‐アミノピメリン酸（Ａｐｍ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ及び他の脂肪族アミノ酸に対する２‐アミノ酪酸（Ａｂｕ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ及び他の脂肪族アミノ酸に対する２‐アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）；Ｇｌｙに対する２‐アミノ酪酸（Ａｉｂ）；Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅに対するシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；Ａｒｇ及びＬｙｓに対するホモアルギニン（Ｈａｒ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓに対する２、３‐ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａに対するＮ‐エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ａｓｎ及びＧｌｎに対するＮ‐エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）；Ｌｙｓに対するヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）；Ｌｙｓに対するアロヒドロキシリシン（ＡＨｙｌ）；Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＴｈｒに対する３‐（及び４‐）ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ）；Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＶａｌに対するアロイソロイシン（ＡＩｌｅ）；Ａｒｇに対する４‐アミジノフェニルアラニン；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａに対するＮ‐メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ、サルコシン）；Ｉｌｅに対するＮメチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸に対するノルバリン（Ｎｖａ）；Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸のためのノルロイシン（Ｎｌｅ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓに対するオルニチン（Ｏｒｎ）；Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎに対するシトルリン（Ｃｉｔ）及びメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；及びＰｈｅに対するＮ‐メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、トリメチルフェニルアラニン、ハロ‐（Ｆ‐、Ｃｌ‐、Ｂｒ若しくはＩ‐）フェニルアラニン若しくはトリフルオリルフェニルアラニンを含む。

本明細書において、用語「ペプチド」は、自然に存在するものから分離、または組換え技術（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）によって若しくは化学的に合成されたタンパク質、タンパク質の断片及びペプチドを全て含む。特定の実施様態において、化合物の変異体、例えば１つ以上のアミノ酸置換を有するペプチド変異体が提供される。本明細書において、「ペプチド変異体（ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｒｉａｎｔｓ）」とは、１つまたはそれ以上のアミノ酸がペプチドのアミノ酸配列に置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）、欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）、添加（ａｄｄｉｔｉｏｎｓ）及び／または挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ）されており、且つ本体のアミノ酸で構成されたペプチドと略同一の生物学的機能を発揮するものを示す。ペプチド変異体は、元々のペプチドと７０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有しなければならない。かかる置換体として「保存性」と知られたアミノ酸置換体を含むことができる。変異体はまた非保存性（ｎｏｎｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）の変化を含むこともできる。一つの例示的な実施様態において、変異体ポリペプチドの配列は、５つまたはそれ以下のアミノ酸が置換、欠失、添加または挿入されることにより、本来の配列と異なるようになる。変異体はまたペプチドの免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）、２次構造（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）及び水治療性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）に最小限の影響を与えるアミノ酸の欠失または添加により変化することができる。

「保存性」置換とは、１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたときにもポリペプチドの２次構造及び水治療性などの特性に大きな変化がないことを意味する。かかる保存性置換に関し、アミノ酸変異は、アミノ酸の側鎖置換体の相対的な類似性、例えば極性（ｐｏｌａｒｉｔｙ）、電荷（ｃｈａｒｇｅ）、水溶性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）、親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）及び／または両親和性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）などの類似性に基づいて得ることができる。

例えば、アミノ酸は共通の側鎖の特性により、i）疎水性（ロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、イソロイシン）、ii）中性親水性（システイン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン）、iii）酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、iv）塩基性（ヒスチジン、リシン、アルギニン）、v）鎖方向に影響を与える残基（グリシン、プロリン）、vi）芳香族（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン）に分類することができる。保存的置換は、これらそれぞれのクラスのうち、１つの構成員を同一クラスの他の構成員に置換することを伴う。

アミノ酸の側鎖置換体のサイズ、形及び種類に対する分析により、アルギニン、リシン及びヒスチジンは全て陽電荷を帯びる残基であり、アラニン、グリシン及びセリンは類似したサイズを有し、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは類似した形を有することが分かる。したがって、かかる点に基づき、アルギニン、リシン及びヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、生物学的に機能均等物であると言える。

変異を導入するにおいて、アミノ酸の疎水性インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｉｎｄｅｘ）を考慮することができる。それぞれのアミノ酸は、疎水性と電荷によって疎水性インデックスが与えられており、それぞれ、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リシン（−３．９）、アルギニン（−４．５）である。疎水性アミノ酸インデックスは、タンパク質の相互的な生物学的機能を付与するにおいて非常に重要である。類似した生物学的活性を保持するためには、類似した疎水性インデックスを有するアミノ酸で置換しなければならないということは公知の事実である。疎水性インデックスを参照し、変異を導入する場合、±２以内、好ましくは±１以内、さらに好ましくは±０．５以内の疎水性インデックス差を持つアミノ酸同士で置換される。

一方、類似した親水性値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ ｖａｌｕｅ）を有するアミノ酸間の置換が、均等な生物学的活性を有するタンパク質をもたらすことも知られている。米国特許、第４５５４１０１号に開示されているように、次のような親水性値がそれぞれのアミノ酸残基に与えられている。アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、リシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。新水性インデックスを参照し、変異を導入する場合、±２以内、好ましくは±１以内、さらに好ましくは±０．５以内の新水性インデックス差を持つアミノ酸同士で置換される。

分子の活性を全体的に変更させないタンパク質におけるアミノ酸交換は、当該分野に公知されている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ、Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７９）。最も通常的に行なわれる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。

本発明書において「ポリヌクレオチド」若しくは「核酸」は交換可能に用いられ、任意の長さのヌクレオチドの重合体を称し、ＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む。核酸分子の構成単位である「ヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、変形されたヌクレオチド若しくはヌクレオチド、及び／若しくはその類似体、ＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼにより、重合体内に混入できたり、合成反応により重合体内に混入できる任意の気質であり得る。ポリヌクレオチドは、変形されたヌクレオチド、糖若しくはヌクレオチドが変形された類似体（ａｎａｌｏｇ）、例えばメチル化ヌクレオチド及びその類似体を含むことができる（Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０：５４３−５８４（１９９０））。

ヌクレオチドにおける変異は、タンパク質で変異を齎さないものもある。かかる核酸は、機能的に均等なコドンまたは同一のアミノ酸をコーディングするコドン、または生物学的に均等なアミノ酸をコーデシングするコドンを含む核酸分子を含む。また、ヌクレオチドにおける変異がタンパク質そのものに変化を齎すこともできる。タンパク質のアミノ酸に変化を齎す変異の場合においても、本発明のタンパク質と略同一の活性を示すものが得られ得る。

本発明のペプチド、またはこれをコーディングする核酸が持つ特徴、例えば抗菌及び／または癌を治療する効果を有する範囲において、本発明のペプチド及び核酸分子が、配列目録に記載されたアミノ酸配列若しくはヌクレオチド配列に限定されないことは通常の技術者にとって自明である。例えば、本発明のペプチドに含まれ得る生物学的機能均等物は、本発明のペプチドと均等な生物学的活性を発揮するアミノ酸配列の変異を有するペプチドであり得る。

一般に、本明細書に言及されているペプチド（融合タンパク質を含む）及びポリヌクレオチドは、分離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）されたものである。「分離された」ペプチド若しくはポリヌクレオチドとは、本来の環境から除去されたものである。例えば、自然状態に存在するタンパク質は、その状態で共に存在する物質の全部或いは一部を除去することで分離される。かかるポリペプチドは、少なくとも９０％以上の純度を有しなければならず、好ましくは９５％、さらに好ましくは９９％以上の純度を有しなければならない。ポリヌクレオチドはベクター内でクローニングさせることにより分離される。

本明細書において用いられる用語「ベクター」は、宿主細胞に伝達可能であり、好ましくは１つ以上の目的遺伝子、若しくは核酸配列の発現ができるように作られた構造物を意味する。例えば、ベクターには、ウイルスベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ）、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ）、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）、コスミド（ｃｏｓｍｉｄ）若しくはファージベクター（ｐｈａｇｅ ｖｅｃｔｏｒｓ）、ＣＣＡ（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）と連結されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）で包装されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ発現ベクター、プロデューサー細胞（ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌｓ）のような特定真核細胞（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）などが含まれる。

本発明書において「発現調節配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、核酸の転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を調節する核酸配列を意味する。発現調節配列には、構造プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）若しくは誘導プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｏｒ）のようなプロモーター、またはエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）などがある。発現調節配列は、転写される核酸配列に連結されている。本明細書において「作動可能に結合された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、核酸調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列若しくは転写調節因子の結合位置アレイ）と別の核酸配列との間の機能的結合を意味する。前記調節配列は、これによって前記別の核酸配列の転写及び／翻訳を調節する。

本明細書において「薬学的有効量」若しくは「治療学的有効量」とは、有効成分であるペプチド若しくはその断片及び／またはこれらをコーディングする核酸の効能または活性を達成するのに十分な量を意味する。例えば、本発明にかかるペプチドを含む薬学的組成物は、抗菌剤、抗生剤及び／または抗癌剤の有効成分として活用することができる。

＜ペプチド、核酸、ベクター＞
抗菌ペプチドの作用機作は、大きく二つに分けられる。その一つは、殆どの抗菌ペプチドは菌の細胞膜の透過性を増加させて膜電位を破壊し、細胞代謝を止めることである。他の一つは、その他の少数の抗菌ペプチドは菌株細胞内に浸透し、ＤＮＡ若しくはＲＮＡと結合し、転写若しくは翻訳を抑制する強力な作用機作を示すことである。これら抗菌ペプチドの活性に重要であると知られた構造要素としては、次のようなものがある。第１に両親媒性へリックス構造（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｈｅｌｉｘ）、第２に前記ヘリックス構造を安定化させる残基の分布、第３に塩基性残基の分布、第４に疎水性残基の分布、第５に電荷を帯びる残基とヘリックス構造の双極子との間の相互作用、第６に反対電荷を帯びる残基同士の塩橋が挙げられる。

本発明者は、生理的活性として抗菌活性及び／または抗癌活性を有するペプチドを合成するため、エゾアワビ（Ｈａｌｉｏｔｉｓ ｄｉｓｃｕｓ ｈａｎｎａｉ）から由来したペプチド変異体を合成し、その活性を確認した。エゾアワビの遺伝子の中から病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）を認識するパターン認識タンパク質として、脂質多糖類及びグルカン結合タンパク質（ＬＧＢＰ、ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｎｄ ｇｌｕｃａｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）をコーディングする全長ｃＤＮＡ配列を分析し、そこから発現される全長タンパク質のアミノ酸配列を確認した。本発明は、エゾアワビ由来の全長ｃＤＮＡから発現されるＬＧＢＰ全長タンパク質のアミノ酸配列のうち、病原菌を認識するモチーフ若しくはドメイン領域を構成する短いペプチドの一部アミノ酸配列を置換したペプチド変異体が、抗菌活性及び／または抗癌活性を有することに基づく。

したがって、本発明の一側面によると、本発明は、生理的活性を有する変異体としてのペプチドに関するものである。本発明の一側面により、変異体としてのペプチドは下記式（１）のアミノ酸配列で表すことができる。

[式２]
（Ｎ‐末端）‐ＷＬＷＫＡＩＷＫＬＬＸ‐（Ｃ末端）…（１）

式（１）中、Ｘはリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）で構成される群から選択される塩基性アミノ酸であるか、或いはセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラジン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）で構成される群から選択される極性アミノ酸である。

一つの例示的な実施形態において、式（１）のアミノ酸中、Ｃ‐末端を構成するＸはリシン若しくはトレオニンであり得るが、この場合、式（１）のペプチドは、配列番号：３若しくは配列番号：５のアミノ酸配列で構成される。必要によって、本発明のペプチドの一部のアミノ酸をリン酸化などで修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）することができ、Ｃ‐末端に位置するカルボキシル基をアミド化することもできる。一つの例示的な実施形態で、本発明のペプチドは、様々な細菌または酵母に対して強力な抗菌活性を示し、例えば子宮癌、子宮頸癌及び肺癌を誘発する様々な腫瘍細胞株に対して活性を示すことから、抗癌活性があることが確認された。

例えば、本発明の例示的な実施例によって合成された配列番号：３若しくは配列番号：５で表されるペプチドは、様々なグラム陽性菌株・陰性菌株及び酵母に対し、抗菌活性を示す（図３Ａ及び図３Ｂを参照）。例えば、本発明のペプチドは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＲＭ４２２０ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ＦＰ５２２９及びＳ．ｍｕｔａｎｓを含むグラム陽性菌と、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＫＣＴＣ２００４，Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ，Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉを含むグラム陰性菌と、酵母Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＫＣＴＣ７９６５などに対し、良好な抗菌活性を有するが、本発明のペプチドがこれら特定菌株に対してのみ抗菌活性を有すると限定されるものではない。特に、本発明によって合成されたペプチドは、高温の加熱処理及び高濃度の塩処理によってもその活性が低下しない（図４及び図５を参照）。

本発明にかかるペプチドは、組換え方法（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｅａｎｓ）若しくは化学的合成を通じて製造することにより、分離することができる。例示的に本明細書に言及された核酸配列により発現されるペプチドは、公知されている多くの発現ベクターのうち、何れを用いても公知の方法で容易く製造することができる。発現は、ペプチドをコーディングするＤＮＡ配列を含む発現ベクターに形質転換された適切な宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）内で実現できる。適切な宿主細胞には、原核細胞（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ）、酵母（ｙｅａｓｔ）及び真核細胞（ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ）が含まれる。大腸菌、酵母若しくは哺乳動物の細胞株（Ｃｏｓ若しくはＣＨＯなど）を宿主細胞に用いることが好ましい。タンパク質の精製のためには、まず、水溶性の宿主／ベクターシステムで得られた、培養液に分泌された再組合タンパク質を含む上澄液を市販のフィルターを用いて濃縮させる。次に、上記で得られた濃縮液を、親和マトリクス（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ）若しくはイオン交換樹脂（ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｒｅｓｉｎ）などの適切な精製マトリクス（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｘ）を用いて精製する。最後に、一段階若しくは多段階の逆相（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｈａｓｅ）ＨＰＬＣを行なうことにより、純水なタンパク質を得ることができる。

１００個以下、一般的には５０個以下のアミノ酸で構成された断片や変異体は、合成により製造することができる。例えば、かかるポリペプチドは常用化されている固相技法（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、即ち、成長するアミノ酸鎖にアミノ酸を順次付加させるメリフィールド固相法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ）で合成することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６３、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４６−２１４９）。ポリペプチドの自動合成のための装備は、供給者から購入することができ、供給者のマニュアルに沿って操作可能である。

例えば、微生物から発現される、本明細書に記載されたペプチドは、宿主細胞の周辺細胞質に分泌され、そこから回収することができる。一般的にタンパク質の回収は、浸透圧衝撃、超音波処理若しくは溶解のような手段により、微生物を粉砕することを含む。細胞が破壊されると、細胞残骸若しくは前細胞を遠心分離若しくは濾過により除去することができる。タンパク質は、例えば親和性樹脂クロマトグラフィーによって追加精製を行なうことができる。代替案として、タンパク質を培養培地に移し、そこから分離することができる。細胞を培養物から除去し、培養上澄液を濾過・濃縮し、生産されたタンパク質を追加精製することができる。発現されたポリペプチドは、通常、公知された方法、例えば免疫親和性若しくはイオン交換カラム上の分別蒸留；エタノールの沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ若しくは陽イオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ上のクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウムの沈殿；例えばセファデックスＧ‐７５を用いるゲル濾過；疎水性親和度樹脂、マトリクス上に固定された適合な抗原を用いるリガンド親和度及びウェスタンブロッド検定を利用し、追加に分離及び確認することができる。

システム、生産されたペプチドは、追加検出及び実質的に均質な製剤を取得するため精製することができる。当業界に公知された標準タンパク質の精製方法を用いることができる。例えば、免疫親和性若しくはイオン交換カラム上の分別蒸留、エタノールの沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ若しくは陽イオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウムの沈殿、及び例えばセファデックスＧ‐７５を用いるゲル濾過などがある。

また、本発明の他の側面によると、本発明は、前述した式（１）で表されるペプチドをコーディングする核酸に関するものである。一つの例示的な実施形態において、本発明にかかるペプチドをコーディングする核酸は、配列番号：４若しくは配列番号：６の塩基配列で構成されるヌクレオチドを含む。

本発明によって式（１）のペプチドをコーデシングする核酸（例えば、配列番号：４若しくは配列番号：６のヌクレオチド）は、適切なベクター内に含まれ得る。また、ベクターは、本発明のポリヌクレオチドと連結された発現調節配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むことができる。それぞれのベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅若しくは発現のどちらか、若しくは両方）及びベクターが存在する特定宿主細胞との相溶性によって様々な成分を含む。一般にベクター成分は複製起点（特にベクターが原核細胞に挿入される場合）、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、信号配列、異種核酸挿入物及び転写終結配列を含むが、これに制限されるものではない。例えば、本発明の再組合ベクターは、タンパク質の発現に影響を与え得る発現調節配列、例えば開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー、膜標的化、若しくは分泌のための信号配列などを含むことができる。ベクターの一類型は、追加のＤＮＡ切片がその内部にライゲーションできる環状二本鎖ＤＮＡを称する「プラスミド」がある。また、他の類型のベクターは、ファージベクターである。さらに他の類型のベクターは、追加のＤＮＡ切片がウイルスゲノム内にライゲーションできるウイルスベクターである。本発明のベクターシステムは、当業界に公知された様々な方法で構築することができ、これに対する具体的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に開示されている。

発現ベクターにサブクローンされた配列を増幅させる様々な試験管内増幅技法（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）が知られている。かかる技法にはＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＬＣＲ（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、Ｑβ‐複製酵素増幅（ｒｅｐｌｉｃａｓｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び他のＲＮＡ重合酵素を利用した技法がある（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ）１−３；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，６８３，２０２；ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ １９９０．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ａｒｅ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，４２６，０３９）。

本発明のベクターは、発現されるペプチドの精製を容易にするため、他の配列と融合することもできる。融合される配列は、例えば、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）及び６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）などがあり、最も好ましくは６ｘ Ｈｉｓである。前記精製のための追加配列のため、宿主で発現されたペプチドは、親和性クロマトグラフィーを通じて迅速、且つ容易に精製される。必要な場合、これらペプチドの細胞外分泌を促進できるよう、Ｆｃ切片をコーディングする配列を融合することもできる。

本発明の例示的な実施形態によると、式（１）のペプチドをコーディングするヌクレオチド配列が含まれているベクターによって発現されたペプチドは、親和性クロマトグラフィーを通じて精製される。例えば、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼが融合された場合には、この酵素の基質であるグルタチオンを利用することができ、６ｘ Ｈｉｓが利用された場合には、Ｎｉ‐ＮＴＡ Ｈｉｓ‐結合レジンカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）を利用し、希望するペプチドを迅速、且つ容易に得ることができる。前述したベクターを安定、且つ連続的にクローニング及び発現できる宿主細胞は、当業界に公知されており、いずれの宿主細胞も用いることができる。

＜組成物＞
本発明によって合成されたペプチドは、様々な細菌株及び酵母細胞株に対しても抗菌活性を示し（図３Ａないし図３Ｂを参照）、高温の加熱処理によっても抗菌活性が低下せず（図４を参照）、高濃度の塩を加えてもその活性を失わない（図５を参照）。それだけではなく、本発明のペプチドは、正常細胞には毒性を示さないが、癌細胞株に対しては選択的に毒性を発揮し（図６Ｃないし図６Ｄを参照）、癌細胞株のアポトーシスを誘導し、抗癌活性を見せた（図７Ａないし図７Ｅ及び図８Ａないし図８Ｅを参照）。

したがって、本発明によって合成されたペプチドは、抗菌及び／または抗癌活性が求められる様々な組成物の有効成分として活用することができる。例えは、本発明のペプチドは、抗菌及び／または抗癌用薬学的組成物に活用するか、或いは抗菌特性が求められる化粧品組成物若しくは食品添加剤の有効成分に応用することができる。

一つの例示的な実施形態において、本発明は、前述の式（１）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの薬学的有効量、及び必要によって薬学的に許容される担体を含む抗菌用若しくは抗癌用薬学的組成物に関するものである。例えば、前記有効成分の有効容量は、０．０１ないし１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．１ないし５００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．１ないし１００μｇ／ｍｌであり、有効成分は、一日に一回ないし三回投与することができる。

本発明により、薬学的組成物の有効成分として用いられるペプチドは、任意の適当な手段、例えば、経口、局所（頬側及び舌下を含む）、直腸、膣、経皮、非経口、皮下、腹腔内、肺内、皮内、硬膜内および硬膜外、鼻腔内、そして希望する場合は局部治療、病変内投与のための手段によって投与することができる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内若しくは皮下投与を含む。本発明の有効成分である化合物は、任意の便利な投与形態、例えば錠剤、粉末、カプセル、溶液、分散液、懸濁液、シロップ、噴霧剤、坐剤、ゲル、エマルジョン、パッチなどで投与することができる。かかる組成物は、薬剤に通常用いられる成分、例えば希釈剤、担体、ｐＨ調整剤、甘味剤、充填剤及び追加の活性剤を含むことができる。

例えば、本発明にかかる薬学的組成物の有効成分であるペプチドは、非経口の様々な剤形で投与することができるが、製剤化する場合には、通常用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤若しくは賦形剤を用いて調剤することができる。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどを用いることができる。坐剤の基剤には、ウィテップゾール、マクロゴール、トウィーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを用いることができる。

必要な場合、本発明のペプチドは、生理食塩水若しくは有機溶媒のように薬学的に許容された様々な担体と混合して用いることができ、安定性や吸収性を増加させるため、グルコース、スクロース若しくはデキストランといった炭水化物、アスコルビン酸若しくはグルタチオンのような抗酸化剤、キレート剤、低分子タンパク質若しくは他の安定化剤と共に用いることができる。

一方、本発明は、式（１）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含む抗菌用化粧品組成物に関するものである。例えば、本発明のペプチドは、化粧品組成物中に保存剤として用いることができる。化粧品組成物は、皮膚科学的に許容された媒質、即ち皮膚、粘膜、頭髪及び頭皮に適合な媒質を含む。これは局所的用に適当なすべての薬剤学的投与形態であって、特に水性、水性／アルコール性、若しくは油性溶液、または水生、水性／アルコール性、若しくは油性ゲル、または固体若しくは混練無水生成物、または、水相に油相を分散させて得られたエマルジョン（Ｏ／Ｗ）若しくはその反対（Ｗ／Ｏ）、または懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球、イオン型（リポソム）及び／若しくは非イオン型の素嚢分散剤の形で提供することができる。例えば、化粧品組成物を製造するための溶媒として、エタノール、グリセリン、ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセレス‐２６、メチルグルセス‐２０、ミリスチレン酸イソセチル、オクタン酸イソセチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、オクチルドデカノール、イソステアリルイソステアレート、オクタン酸セチル及びネオペンチルグリコールジカプラートからなる群から選択された１種以上を用いることができる。

本発明の化粧品には、必要によって前記成分と共に、通常、化粧品に配合される別の成分を配合することができる。添加できる配合成分としては、油脂成分、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、有機・無機顔料、着色剤、有機粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、抗酸化剤、植物抽出物、ｐＨ調整剤、アルコール、発泡剤、充填剤、ゲル化剤若しくは濃縮剤、香料、冷感剤、血行促進剤、制汗剤、精製水などが挙げられる。

また、本発明は、前述の式（１）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分に含む抗菌用食品添加剤に関するものである。本発明のペプチドを食品添加物に用いる場合、前記ペプチドをそのまま添加してもよく、別の食品成分と共に用いてもよく、通常の方法によって適切に用いてもよい。有効成分の混合量は、使用目的によって適切に決めることができる。一般的に本発明のペプチドは、原料に対し１５重量部以下、好ましくは１０重量部以下で添加される。しかし、長期間摂取の場合、前記量は前記範囲以下の量であってもよく、安定性の面から何ら問題もないので、有効成分は前記範囲以上の量を用いてもよい。

前記食品の種類は、特に制限されない。前記物質を添加できる食品例には、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含めた酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、通常の意味の食品をすべて含む。

以下、例示的な実施例を通じ、本発明を詳細に説明するが、本発明が下記実施例に記載された発明に限定されるものではない。

＜実施例１：アワビＬＧＢＰ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｎｄ ｇｌｕｃａｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の全長ｃＤＮＡ及び全長ペプチドの配列分析＞
３年生のエゾアワビから得られた７つの組織からｃＤＮＡライブラリを構築し、発現された配列タグを分析した。エゾアワビの発現された配列決定タグである非相補的なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及びクロアワビとの高い類似性を有するクローンを使用し、エゾアワビ由来の脂質多糖類及びβ‐１，３‐グルカン結合タンパク質（ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ）を分離した。消化管ｃＤＮＡライブラリから得られた一つのＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ）クローン（ＤＧＴ‐１５１）は、他の種のＬＧＢＰと相同性があり、このクローンから６３２‐ｂｐの核酸配列を得た。

ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ遺伝子の全長ｃＤＮＡを得るため、製造社の指示に従ってＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、ｃＤＮＡ末端の５´‐及び３´‐ランダム増幅（ＲＡＣＥ、ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）のための消化管ｃＤＮＡをそれぞれ合成した。ＤＧＴ‐１５０クローンの部分塩基配列に基づき、５´‐ＲＡＣＥ及び３´‐ＲＡＣＥのための遺伝子特異的プライマーを設計し、遺伝子特異的プライマーを用いるＲＡＣＥ方法を採択して、アミノ末端のコーディング配列を得た。５´‐ＲＡＣＥにより３８０ｂｐの断片が増幅され、配列分析の結果、ＥＳＴ配列と重なり、これに基づいてエゾアワビ由来のＬＧＢＰ（ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ）をコーディングする全長ｃＤＮＡ配列を合成した。増幅された断片をｐＧＥＭ‐Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）内部へサブクローニングし、ＡＢＩ３１０３自動ＤＮＡ配列分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列を分析した。ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ ｃＤＮＡ全長配列を完了するため、５´‐末端、３´‐末端及びＤＧＴ‐１５１の部分配列を組み合わせ、ＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．０（ＳＤＣ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて整列した。

続いて、コンピュータプログラムを用いて、配列を分析した。得られた全長ｃＤＮＡからアミノ酸配列を類推し、ＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．０（ＳＤＣ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて分子量及び等電点を計算した。また、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）でＢＬＡＳＴＰプログラムを使用し、他の配列との配列類似度を分析した。

シグナルペプチドの存在は、ＳｉｇｎａｌＰ３．０で予測し、ドメイン検索はＮＣＢＩ内のＣＤ‐ｓｅａｒｃｈとＰｆａｍ配列検索で行なった。

ＨＤＨ‐ＬＧＢＰの全長ｃＤＮＡ配列及びそれから発現されるアミノ酸配列が図１に示される。ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ ｃＤＮＡの全体配列は、３１‐ｂｐの５´‐非翻訳領域（５´‐ＵＴＲ）、ポリ（Ａ）テールを有する１６２ｂｐの３´‐ＵＴＲ、予想分子量が４７．８ｋＤａであり、理論的等電点が５．２７である４２０個のアミノ酸で構成されるポリペプチドをコーディングする１２６３ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）で構成された。得られたＨＤＨ‐ＬＧＢＰ全長遺伝子は、最初２０個のアミノ酸残基の推定信号配列を含む。したがって、成熟したＨＤＨ‐ＬＧＢＰは、４００個のアミノ酸で構成され、測定されたタンパク質部分の分子量は、４５４６７Ｄａ、予想等電点は４．９３である。

ＳＭＡＲＴ分析により、未成熟ペプチドの１８４番目残基から３２１番目残基のアミノ酸領域は、グリコシドヒドロラーゼファミリーに属するものであることが明らかになった。成熟したタンパク質の配列でＮ‐ｌｉｎｋｅｄ炭水化物鎖と関連する５つの推定される糖化部位（Ａｓｎ‐Ｘａａ‐Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、ＮＸＳ／Ｔ）が、成熟ペプチドを基準にＡｓｎ‐２８、‐９９、‐２６５、‐３１０、‐３５０に存在する。ＨＤＨ‐ＬＧＢＰのＮ‐ｌｉｎｋｅｄ糖化部位は、β‐グルカン認識モチーフの近くに位置するため、この部位での糖化は、β‐グルカンに対する結合能力に影響を与える。１つの短い推定的細胞付着部位とインテグリン結合部位、Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｒ／ＫＧＤ）が成熟ペプチドのＬｙｓ‐１８９からＡｓｐ‐１９１までの配列に存在する。ＨＤＨ‐ＬＧＢＰは、成熟ペプチドのＴｒｐ‐２０９、Ｇｌｕ‐２１４、Ｉｌｅ‐２１５及びＡｓｐ‐２１６の活性残基を有するβ‐１，３‐グルカナーゼ部位を有している。

＜実施例２：ペプチドの設計、構造予測及び合成＞
（１）抗菌活性ペプチドの設計及び生理化学的特性
ＨＤＨ‐ＬＧＢＰの多糖類‐結合ドメインに相応するアミノ酸配列に基づき、抗菌活性があるものと予想される天然ペプチドと、天然ペプチドとを比較し、一部のアミノ酸が異なって置換されたペプチド変異体を設計した。ペプチド変異体は、ＨＤＨ‐ＬＧＢＰの多糖類結合モチーフに位置するアミノ酸配列に基づいて設計された。配列番号：１のアミノ酸配列（図１の成熟全長ペプチドで１９２‐２０２アミノ酸残基）を有する天然ペプチド（ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ｎ）と、天然ペプチドの一部のアミノ酸を置換した配列番号：３のアミノ酸配列を有するペプチド変異体（ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１）及び配列番号：４のアミノ酸配列を有するペプチド変異体（ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２）が抗菌活性があるものと予想された。

天然ペプチド及びペプチド変異体の分子量及びペプチド活性に影響を与えるｐＩ値、純電荷値、Ｂｏｍａｎ Ｉｎｄｅｘ値及び２次構造を評価した。ＥｘＰＡＹｓサーバーで理論等電点（ｐ．Ｉ．）と純電荷（ｎｅｔ ｃｈａｒｇｅ）を評価した。Ｂｏｍａｎ Ｉｎｄｅｘ値は、オンラインＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｖ２．３４（ＡＤＰ２）により計算した。

これらペプチドのｐ．Ｉ．値、純電荷値、疎水性及びＢｏｍａｎ Ｉｎｄｅｘ値などが下記表１に示される。疎水性、純電荷、タンパク質‐結合能（ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ、Ｂｏｍａｎ ｉｎｄｅｘ）などの因子は、ペプチド活性に影響を与えることができる。Ｂｏｍａｎ ｉｎｄｅｘは、ペプチドが別の受容体のような別のタンパク質に結合できる能力を評価するものであって、アミノ酸残基の側鎖の自由エネルギーの和を、アミノ酸残基の総数で割った値と定義される。豊富なＷとＰを有する天然ペプチドは、酸性ＰＩ値が５．５２であり、純電荷値が０であり、低いＢｏｍａｎ ｉｎｄｅｘ値を見せる。さらに、２つの選択されたペプチド変異体は、相対的に高い純電荷値と低いＢｏｍａｎ ｉｎｄｅｘ値を示し、抗菌活性があるものと予想される。

ペプチドの２次構造は、ＧＯＲ方法［１７ＥｘＰＡＳｙ］を用いて予測した。人為的に変形させた２つのペプチド変異体の２次構造で疎水性領域及び親水性領域、αヘリックス構造を予測するため、Ｓｃｈｉｆｆｅｒ・Ｅｄｍｕｎｄｓｏｎのヘリカルホイールプロジェクションを利用した。ヘリカルホイールダイアグラムは、ＥＭＢＯＳＳ ｐｅｐｗｈｅｅｌ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を利用し、２次構造を予測した。その結果を図２に示し、２次構造を表１に示す。

表１中、^＊はＣ‐末端アミド化を示し、^＊＊はβターンを示し、^＊＊＊はランダムコイルを示し、^＊＊＊＊はαヘリクスを示す。

（２）ペプチド変異体合成
抗菌活性が確認された天然ペプチド（ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ｎ）と、この天然ペプチドの一部のアミノ酸を置換した二つのペプチド変異体（ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１、ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２）を設計し、これらペプチドを９５％以上の純度で、Ｐｅｐｔｒｏｎ Ｉｎｃ．（大韓民国・大田）で商業的に合成した。これらペプチドは、ＡＳＰ４８Ｓ（Ｐｅｐｔｒｏｎ Ｉｎｃ．大韓民国・大田）を使用し、ＦｍｏＣ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いて合成し、Ｖｙｄａｃ Ｅｖｅｒｅｓｔ Ｃ１８カラム（２５０ｍｍ×２２ｍｍ、１０μｍ；Ｇｒａｃｅ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いる高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製した。溶離は、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含む水・アセトニトリル直線勾配（アセトニトリル３〜４０％（ｖ／ｖ））を用いて行なった。精製されたペプチドの分子量は、液状クロマトグラフィー／質量分析器（ＬＣ／ＭＳ； ＨＰ１００ ｓｅｒｉｅｓ； Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて確認した。合成されたすべてのペプチドを０．０１％酢酸に溶解し、１０００μｇ／ｍｌの貯蔵溶液を得た。

＜実施例３：抗菌性能のための高感度の放射拡散アッセイ（Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｒａｄｉａｌ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）＞
高感度の放射拡散アッセイ（ＵＲＤＡ）を通じ、前述の合成されたペプチド変異体の抗菌活性を測定した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＲＭ４２２０，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ＦＰ５２２９及びＳ．ｍｕｔａｎｓを含むグラム陽性菌と、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＫＣＴＣ２００４、Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉを含むグラム陰性菌と、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＫＣＴＣ７９６５酵母を対象に、合成ペプチドの抗菌特性をテストした。テスト対象の菌株を適切な温度（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＳ．ｉｎｉａｅは２５℃、その他は３７℃）で、脳心臓・浸出液培地（ＢＨＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）で成長させた。酵母菌株であるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＫＣＴＣ７９６５は、２５℃の酵母培地（ＹＭ）で成長させた。１６〜１８時間、恒温培養した後、菌及び酵母の懸濁液を微生物に対して〜１０^８ＣＦＵ／ｍｌ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対して〜１０^６ＣＦＵ／ｍｌに相応する０．５マクファーランド濁度基準（ＭｃＦａｒｌａｎｄ ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ ０．５、Ｖｉｔｅｋ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｅｒ ＃５２‐１２１０；Ｈａｃｈ、Ｌｏｖｅｌａｎｄ、ＣＯ、ＵＳＡ）に希釈した。希釈された細菌若しくはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ懸濁液１／２ｍｌを、０．０３％ＴＳＢ（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ）若しくは０．０３％ＳＤＢ（Ｓｏｙｂｅａｎ ｐｏｗｄｅｒ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ）及び１％Ｔｙｐｅ Ｉ（ｌｏｗ ＥＥＯ）アガロースが備えられた１０ｍＭのリン酸バッファー（ＰＢ； ｐＨ６．６）に溶解された５×１０^６ＣＦＵ／ｍｌ若しくは５×１０^４ＣＦＵ／ｍｌを含むアンダーレイゲル９．５ｍｌに添加した。精製されたペプチドを酸性化水（０．０１％ＨＡｃ）５μｌで２つを連続希釈し、それぞれの希釈液を厚さ１ｍｍのアンダーレイゲルで製造された直径２．５ｍｍのウェルに添加した。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓ．ｉｎｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対して２５℃、その他の菌株に対して３７℃で、それぞれ３時間、恒温培養した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ６．６）１０ｍＭを用いて、６％のＢＨＩ若しくは６％のＹＭを含むダブル・ストレングス・オーバーレイゲル１０ｍｌで、１％のアガロースで細菌若しくは酵母サスペンションを覆った。プレートをさらに１８〜２４時間恒温培養した後、透明部位の直径を測定した。ウェルの直径を除き、透明部位の直径をユニット（０．１ｍｍ＝１Ｕ）で表した。

ＵＲＤＡを用いて、グラム陽性菌、グラム陰性菌及び酵母に対して最小有効濃度（ＭＥＣｓ）を測定し、合成されたＨＤＨ‐ＬＧＢＰペプチド変異体に対する抗菌活性を測定した。ペプチド濃度のｌｏｇ１０値に対するユニット図表のｘ‐切片として、合成ペプチドの最小有効濃度（ＭＥＣ、μｇ／ｍｌ）を計算した。この抗菌分析を３回行い、結果の平均を求めた。実験結果を表２、図３Ａ及び図３Ｂにそれぞれ示す。ＨＤＨ‐ＬＧＢＰペプチド変異体は、特にＢ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ及びＳ．ｉｎｉａｅのようなグラム陽性菌（ＭＥＣｓ ０．００８〜１．９２μｇ／ｍｌ）及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのようなグラム陰性菌（ＭＥＣｓ １．９２〜２．１２μｇ／ｍｌ）に対し、優れた抗菌活性を示す。また、これらペプチド変異体は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ酵母に対しても潜在的な抗菌活性を示す（ＭＥＣｓ ２．１１〜２．１６μｇ／ｍｌ）。かかる結果に基づき、ＨＤＨ‐ＬＧＢＰペプチド誘導体は、広範囲の抗菌活性を有することが確認された。

＜実施例４：抗菌活性に対する温度及び塩の影響＞
温度及び塩がペプチド変異体（ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１、ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２）の抗菌活性に与える影響を研究するため、細菌株Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｉｎｉａｅ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及び酵母Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓを対象に、高感度放射拡散アッセイ（ＵＲＤＡ）を用いて抗菌活性をテストした。熱安定性を探求するため、２つのペプチド変異体をそれぞれ１０分間１００℃で恒温培養した。加熱処理後、ペプチドを冷却させ、実施例３で記述したようにＵＲＤＡに使用した。熱安定性に対する分析結果を図４に示す。これらペプチドの抗菌活性は、加熱処理によって深刻に影響されない。特に、２つのペプチド変異体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのような微生物菌株に対し、強い抗菌活性を示す。熱安定性分析により、ＨＤＨ‐ＬＧＢＰペプチド変異体が熱に安定するということが確認された。

一方、塩に対する安定性を確認するため、２つのペプチド変異体を異なる濃度の塩（０．５％、１％、２％）で３０分間、恒温培養した。具体的に、塩に対するこれらペプチド変異体の敏感度を研究するため、ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ由来のペプチド変異体を異なる濃度のナトリウム（ＮａＣｌ、０．５％、１％、２％）で恒温培養して抗菌活性を評価し、ＵＲＤＡを用いて比較した。処理後、ペプチドを前述のようにＵＲＤＡに使用した。分析結果を図５に示す。これらペプチド変異体の抗菌活性は、高濃度に大きく影響されなかった。ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ由来のペプチド変異体は高い塩抵抗性を有することが確認された。

＜実施例５：ペプチド変異体の細胞毒性効果＞
２つのヒト癌細胞株（ＨｅＬａとＡ５４９）及び正常細胞株（ヒト臍帯静脈内皮細胞、Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ、ＨＵＶＥＣ）に対し、位相差顕微鏡検査と、ミトコンドリアの脱水素化酵素の活性に基づいて生きている細胞を測定するＭＴＳ分析とを用い、合成されたＨＤＨ‐ＬＧＢＰペプチド変異体の毒性効果を研究した。ＨｅＬａ（ヒト子宮頚部腺癌腫）及びＡ５４９（ヒト肺癌腫）細胞株を、米国の微生物保存センター（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ、ＵＳＡ）で購入した。ＨＵＶＥＣ細胞株は、ジョン博士（国立プサン大学・分子生物学科、プサン、韓国）から提供を受けた。すべての細胞を５％ＣＯ２の３７℃のインキュベーターで、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）と１００Ｕ／ｍｌの抗生／抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ‐ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、Ｗｅｌｇｅｎｅ）培地で培養した。

培養されたＨｅＬａ及びＡ５４９細胞（４×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６‐ウェルプレートで一晩、３７℃で培養した。続いて、抗菌ペプチド（ＡＭＰｓ）としての様々な濃度（１、５、１０、２５、５０μｇ／ｍｌ）のＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１及びＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２ペプチド変異体を用いて、細胞を２４時間、３７℃で恒温培養した。位相差顕微鏡で、ペプチド変異体の処理による細胞形態を分析した。分析結果を図６Ａ及び図６Ｂにそれぞれ示す。未処理の対照群細胞は、通常の単層形状を見せ（図６Ａ及び図６Ｂの左側パネル）、濃度１〜５μｇ／ｍｌのペプチド処理によって大きく影響されなかった。しかし、ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ由来のペプチド変異体を１０μｇ／ｍｌ濃度で処理したら、細胞数は減少し、丸い形状の細胞が増加し、細胞の収縮が増加しはじめた（図６Ａ及び図６Ｂ）。特に５０μｇ／ｍｌのペプチド変異体で処理したら、５分以内に細胞分離、スウェリング及び損傷がＨｅＬａ細胞とＡ５４９細胞で探知された（結果は図示しない）。かかる結果は、ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ由来のペプチド変異体が一定濃度、例えば５０μｇ／ｍｌで細胞膜を直接崩壊させ、細胞を溶解させることができることを示す。

続いて、製造社の指示に従い、ＭＴＳ分析を利用し、正常細胞株であるＨＵＶＥＣ（Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）と、癌細胞株であるＨｅＬａ及びＡ５４９細胞のそれぞれの細胞毒性を測定した。ＨＵＶＥＣ、ＨｅＬａ及びＡ５４９細胞（４×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６ウェルプレートで一晩、３７℃で培養した。続いて、抗菌ペプチド（ＡＭＰｓ）としての様々な濃度（１、５、１０、２５、５０μｇ／ｍｌ）のＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１及びＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２ペプチド変異体を用いて、細胞を２４時間、３７℃で恒温培養した。細胞毒性に関する処理の最後の段階で、テトラゾリウム化合物、３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル）‐５‐（３‐カルボキシメトキシフェニル）‐２‐（４‐スルホフェニル）‐２Ｈ‐テトラゾリウム（ＭＴＳ）及び電子カップリング試薬であるフェナジンメトサルフェイト（ＰＭＳ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の混合物を２０μｌ添加し、細胞を３７℃で４時間恒温培養した。４９０ｎｍで吸光度を検出するため、マイクロタイタープレートリーダーを使用した。３つの独立的な実験のため、すべてのデータを３回繰り返した。結果は生存可能な細胞の抑制パーセンテージで表し、実験結果から０．０１％の酢酸処理群（陰性対照群）の値を除外した。

ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１ペプチドは、濃度依存的に癌細胞の生存力を減少させた。特に、ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１ペプチドはＨｅＬａ細胞に対して毒性を示し、濃度１０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌのＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１ペプチドに晒されたとき、ＨｅＬａ細胞における非生存率が、それぞれ３５％、９９％、９５％であった。同様に、濃度１０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌのＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１ペプチドに晒されたとき、Ａ５４９細胞の２５％、９９％、９７％が損傷した（図６Ｃを参照）。また、ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２ペプチドの場合、それぞれ濃度１０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌのＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１ペプチドに晒されたとき、ＨｅＬａ細胞に対する細胞毒性は、それぞれ１６％、９９％、９８％であった。同様に、濃度１０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌのＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２ペプチドに晒されたとき、Ａ５４９細胞に対する細胞毒性は、それぞれ１３％、９９％、９９％であった（図６Ｄを参照）。

一方、５０μｇ／ｍｌの高濃度でも正常細胞（ＨＵＶＥＣ）は、細胞生存力を発揮し、 ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１及びＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２に晒された場合の生存力は、それぞれ３２．８％、４７．９％であった。かかる結果から、本発明によって合成されたペプチド変異体は、子宮癌腫及び肺腺癌の成長を９０％以上抑制できることが確認された。これは、本発明によって合成されたペプチド変異体が潜在的な抗癌効果を有することを意味する。

＜実施例６：癌細胞膜に対するペプチド変異体の抗癌効果分析＞
本実施例でＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ‐ＦＩＴＣ／ＰＩ（よう化プロピジウム）染色法を用いてＨｅＬａ細胞の癌細胞膜に対するＨＤＨ‐ＬＧＢＰペプチド変異体の効果を研究した。細胞膜の構造維持及び細胞表面のホスファチジルセリン（ＰＳ）に対するＨＤＨ‐ＬＧＢＰの効果を評価するため、ＨｅＬａ細胞を３５ｍｍディッシュに播種し、２４時間様々の濃度のＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１及びＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２（１〜５０μｇ／ｍｌ）で恒温培養し、陰性コントロールとして０．０１％の酢酸で処理した。一定濃度（１、５、１０、２０μｇ／ｍｌ）のペプチド変異体で処理した後、トリプシン消化させて細胞を収穫し、冷たいＰＢＳで洗浄し、結合緩衝液（０．０１Ｍ Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．４）、０．１４ＭのＮａＣｌ及び２．５ｍＭのＣａＣｌ２で再懸濁させた。続いて、細胞を製造社の指示に従い、ＦＩＴＣ‐ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ及びＰＩで染色した（ＦＩＴＣ‐Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）。染色した細胞を弱めに混合し、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ ＦＣ５００（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）でフローサイトメトリーを測定し、その結果をＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いて分析した。ホスファチジルセリン（ＰＳ）は、アポトーシスの初期段階で、細胞膜の内層から外層に移動する。カルシウム依存性のリン脂質結合タンパク質であるａｎｎｅｘｉｎ Ｖは、高い親和力でＰＳに結合するが、この結合はアポトーシスのマーカーである。損傷した細胞若しくは死滅細胞の崩壊された膜はＰＩを通過させる一方、破損していない膜を有する生存性細胞はＰＩを排除する。Ｑ１・Ｑ２・Ｑ３・Ｑ４ゲートは、それぞれ死滅細胞、アポトーシスの後期段階、正常細胞及びアポトーシスの初期段階を表す。

ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１ペプチド変異体を用いた分析結果を図７Ａないし図７Ｅに、ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２ペプチド変異体を用いた分析結果を図８Ａないし図８Ｅにそれぞれ示す。第三象限であるＱ３に捕獲された生存細胞（正常細胞）は、ペプチド変異体で処理したら減少したが、第一象限であるＱ２及び第四象限であるＱ４に捕獲された細胞（アポトーシス中の細胞）は、ペプチド変異体で処理したら濃度依存的に増加した。ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１ペプチド変異体で処理した癌細胞の生存パーセンテージは、９０．５％（コントロール）から８６．１３％（１μｇ／ｍｌ）、７３．３３％（５μｇ／ｍｌ）、６８．０１％（１０μｇ／ｍｌ）、４０．０６％（２０μｇ／ｍｌ）に減少し、ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２ペプチド変異体で処理した癌細胞の生存パーセンテージは、８６．８９％（１μｇ／ｍｌ）、７５．２１％（５μｇ／ｍｌ）、５１．５５％（１０μｇ／ｍｌ）、２９．７６％（２０μｇ／ｍｌ）に減少した。一方、Ｑ２若しくはＱ４に捕獲された、細胞膜の構造が損傷したり或いは喪失された割合は、濃度依存的に増加した。

図７Ａないし図７Ｅ及び図８Ａないし図８Ｅは、濃度１０μｇ／ｍｌのペプチド変異体で処理したＨｅＬａ細胞でアポトーシス中の細胞の分率が大きく増加したことを示す。かかる結果から、本発明によって合成されたペプチド変異体は、膜構造を崩壊させ（ＰＳ露出）、膜透過性を増加させることで（細胞内部へのＰＩ取り込み）、ＨｅＬａ細胞の死滅を誘導することができる。また、膜崩壊効果によってＰＳが晒され、細胞質成分が細胞外部へ放出できることにより、細胞死滅が誘導される。

＜実施例７：ＤＮＡ結合及びＤＮＡ重合酵素の抑制分析＞
ＨＤＨ‐ＬＧＢＰペプチド変異体と、細胞内分子であるＤＮＡ及びＤＮＡ重合酵素との間の相互作用を調べるため、本発明によって合成されたＨＤＨ‐ＬＧＢＰペプチド変異体を使用し、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ、ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ）と、ＤＮＡポリメラーゼ抑制アッセイ（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を行なった。本実施例によるテストで、アガロースゲルを通過するＤＮＡバンドの移動速度抑制を検査し、ペプチド‐ＤＮＡ結合を評価した。商業的な分子量マーカーであるλ‐Ｈｉｎｄ IIIで切断されたＤＮＡ（５０ｎｇ；Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を０．０１％の酢酸に溶解された様々な濃度のペプチド（０、０．１５７、０．３１３、０．６２５、１．２５、２．５μｇ）と混合し、常温で５分間恒温培養した後、０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）を含む１．０％のアガロースゲルで電気泳動した。分析結果を図９Ａに示す。一般的に陰電荷のＤＮＡは電場で陽極に移動するが、ＤＮＡが陽イオン性ペプチドで密集されていると、ＤＮＡはローディングウェルで徐々に移動するか、或いは動かない。着体を形成しないＤＮＡと比べ、２．５μｇのＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１によって移動度が多少抑制された。

続いて、ペプチド変異体のＤＮＡポリメラーゼ抑制活性を評価するため、様々な濃度（２．５、１．２５、０．６２５、０．３１３μｇ／ｍｌ）のペプチド変異体を、それぞれの反応混合物に添加した。次のプライマー対を使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝体ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）をＰＣＲのためのテンプレートとして用いた（１６Ｓ‐Ｆ１、５´‐ＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ‐３´、１６Ｓ‐Ｒ３、５´‐ＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧ‐３´）。予測された増幅産物は、その長さが〜１．５ｋｂであった。それぞれのＰＣＲは９０℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分ずつの３０サイクルで構成された。ＰＣＲ後、すべての増幅産物を、ＥｔＢｒを含む１．５％のアガロースゲルで電気泳動した。

分析結果を図９Ｂに示す。合成された２つのペプチド類似体は、すべて強いＤＮＡポリメラーゼ抑制活性を見せる。特に、ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２ペプチドがＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１ペプチドに比べ、より強いＤＮＡポリメラーゼ抑制活性を見せる。テストしたすべての濃度（０．１５７〜５μｇ）でＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２によってＤＮＡポリメラーゼの活性が完全に抑制された。ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ１の場合、ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ‐Ａ２に比べ、濃度０．３１３μｇで弱い抑制活性を見せた。本実施例のテスト結果は、ＨＤＨ‐ＬＧＢＰ由来のペプチド変異体がＤＮＡ単独の場合より、ＤＮＡポリメラーゼに対する親和力が大きいことを示す。

前述では、本発明の例示的な実施形態及び実施例に基づいて本発明を説明したが、本発明は、前述した実施形態及び実施例に記載された技術的思想に限定されるものではない。むしろ、本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者であれば、前述した実施形態及び実施例に基づき、様々な変形及び変更を容易に想定できるであろう。しかし、かかる変形及び変更がすべて本発明の権利範囲に属することは、請求の範囲からさらに明らかになるであろう。

Claims (13)

1. 下記式（１）のアミノ酸配列で表されるペプチド。
   [式１]
   （Ｎ‐末端）‐ＷＬＷＫＡＩＷＫＬＬＸ‐（Ｃ末端）…（１）
   （式（１）中、Ｘはリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）で構成される群から選択される塩基性アミノ酸であるか、或いはセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラジン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）で構成される群から選択される極性アミノ酸である。）
2. 前記式（１）のペプチドは、配列番号：３若しくは配列番号：５のアミノ酸配列で構成される、請求項１に記載のペプチド。
3. 前記式（１）で表されるペプチドのＣ‐末端は、アミド化されている、請求項１に記載のペプチド。
4. 前記ペプチドは、抗菌活性及び抗癌活性から選択される少なくとも一つの生理的活性を有する、請求項１に記載のペプチド。
5. 請求項１に記載のペプチドをコーディングする核酸。
6. 前記核酸は、配列番号：４若しくは配列番号：６の塩基配列で構成されるヌクレオチドを含む、請求項５に記載の核酸。
7. 請求項５または請求項６に記載の核酸が挿入された組換え発現ベクター。
   
8. 請求項１ないし請求項４のうち、いずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含む抗癌用薬学組成物。
9. 前記ペプチドは、子宮癌、子宮頸癌及び肺癌で構成される群から選択される少なくとも一つの癌を治療する、請求項８に記載の抗癌用薬学組成物。
10. 請求項１ないし請求項４のうち、いずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含む抗菌用薬学組成物。
11. 前記ペプチドは、グラム陽性菌、グラム陰性菌及び酵母に対して抗菌活性を示す、請求項１０に記載の抗菌用薬学組成物。
12. 請求項１ないし請求項４のうち、いずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含む抗菌用化粧品組成物。
13. 請求項１ないし請求項４のうち、いずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含む抗菌用食品添加剤。