KR102420699B1 - 강도다리 유래의 신규한 항균 펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

강도다리 유래의 신규한 항균 펩티드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 강도다리(Platichthys stellatus) 유래의 항균 펩티드 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 상기 항균 펩티드는 어류에 대한 항생제 대체 물질로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

강도다리 유래의 신규한 항균 펩티드 및 이의 용도{Novel antimicrobial peptide from starry flounder and uses thereof}
본 발명은 강도다리(Platichthys stellatus) 유래의 Prosaposin-like 단백질에서 항균활성이 예상되는 아미노산 서열을 기반으로 제작된 신규한 항균 펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다.
프로사포신(Prosaposin, PSAP)은 처음에 사포신(Saposin, SAP) A, B, C 및 D로 알려진 4개의 리소좀 활성제 단백질의 전구체로서 확인되었고, 리소좀 단백질 및 분비형 단백질로 알려졌다. 또한, PSAP는 뇌척수액, 정액, 젖, 췌장액(pancreatic fluid) 및 담즙을 포함하는 많은 분비물에서 확인되는 분비 인자이며, 세포 생존, 신경돌기(neurite) 성장 및 분화를 촉진할 수 있으며 콜린성 세포주에서 신경보호 활성을 나타내는 향신경성 인자(neurotrophic factor)로 알려졌다. 이러한 기능들은 녹아웃 생쥐의 뉴런 및 생식기 발달에 음성적으로 영향을 미쳤고, PSAP는 다양한 암 세포에서 과발현되는 것이 보고되었다. NK-lysin 및 granulysin을 포함하는 일부 SAP-like 단백질 패밀리의 멤버들은 세포막을 침투하여 세균을 죽이는 강력한 항균 활성을 나타낸다.
오늘날 의약, 식품 및 농업 분야에 있어서 과도한 항생제의 사용은 세균의 저항성을 증가시켰고, 이러한 세균 감염에 의한 사망 또한 증가되고 있다. 항균 펩티드(Antimicrobial peptide, AMP)는 선천면역의 중요한 구성요소로, 광범위한 항세균, 항진균, 항바이러스 및 항암 활성을 가지는 천연의 물질로 항생제의 직면한 문제인 약물 저항성을 극복할 수 있을 것으로 사료되고 있다. 그러나, 이러한 장점에도 불구하고, 천연의 AMPs는 높은 생산 단가, 짧은 생체 내 반감기 및 체내 독성 때문에 항생제를 대체하기에 문제가 있고, 상기와 같은 문제점들을 극복할 수 있는 AMP의 개발이 요구되고 있다. 현재, 20,000개 이상의 AMP 서열이 DRAMP (Data Repository of Antimicrobial Peptides, http://dramp.cpu-bioinfor.org/) 데이터베이스에 등록되어 있으나, 0.4% 미만의 AMP만 임상적으로 실험되고 있다.
어류 양식 산업에서, 공중보건에 대한 관심 증가 및 항생제 사용의 규제로 인해 AMP가 주목받고 있다. 어류는 다양한 병원체에 노출되는 환경에 서식하므로 새로운 항균 펩티드를 발견하는데 중요한 자원으로 사용될 수 있고, 어류에서 발견된 항균 펩티드에는 Pardaxin, misgurin, cathelicidin, defensin, NK-lysin, hepcidin, 및 piscidin 등이 있다.
강도다리(Platichthys stellatus)는 남한 및 중국의 동해안 근처에서 유망한 양식 어종으로, 북태평양 지역에서 레저어획(leisure fishing)을 위한 인기있는 어종이다. 하지만 강도다리는 상대적으로 수산양식 역사가 짧고 비교적 수요가 적은 수산양식 어종으로, 특히 면역학적 연구에 관한 사례 연구가 부족하다.
한편, 한국공개특허 제2018-0039393호에는 '극지 어류 유래의 신규한 항생 펩타이드'가 개시되어 있고, 한국제2013-0109543호에는 '황다랑어 유래의 새로운 항미생물성 펩타이드 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 강도다리 유래의 신규한 항균 펩티드 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 강도다리(Platichthys stellatus) 유래의 Prosaposin-like 단백질(PsPSAPL)로부터 항균 활성이 있을 것으로 예측되는 2개의 합성 펩티드(PsPSAPL-1 및 -2)를 제작하여 항균활성 및 숙주의 적혈구에 대한 세포독성을 확인한 결과, 상기 두 종의 강도다리 유래 항균 펩티드가 다양한 그람 양성균 및 그람 음성균에 대해 항균활성을 나타내며, 숙주의 적혈구에 대해서는 약한 용혈활성을 나타냄을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 강도다리(Platichthys stellatus) 유래의 항균 펩티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 항균 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 과발현시키는 단계를 포함하는 항균 펩티드의 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 항균 펩티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩티드를 유효성분으로 함유하는 어류용 사료첨가제를 제공한다.
본 발명에 따른 강도다리 유래의 신규한 항균 펩티드는 다양한 어류 병원균에 대해 우수한 항균활성을 가질 뿐만 아니라, 숙주세포에 대한 세포독성은 거의 나타내지 않기 때문에, 어류의 기존 항생제 대체 물질로 사용하거나, 양식 어류에 대한 사료첨가제 등으로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 강도다리(Platichthys stellatus) 유래의 Prosaposin-like 단백질(PsPSAPL)의 다중 정렬 분석 결과 및 계통수를 보여준다.
도 2는 건강한 강도다리 어체의 각 조직에서 PsPSAPL의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 3은 VHSV(A) 또는 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis PH0710, B)를 인공 감염시킨 후 강도다리 어체의 각 조직에서 PsPSAPL의 발현 수준 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 PsPSAPL-1 및 -2 항균 펩티드의 생물막 형성 억제능을 확인한 결과이다.
도 5는 PsPSAPL-1 및 -2 항균 펩티드의 항기생충능을 확인한 결과이다.
도 6은 PsPSAPL-1 및 -2 항균 펩티드의 세포 독성을 알아보기 위한 적혈구 용혈 실험 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 강도다리(Platichthys stellatus) 유래의 항균 펩티드를 제공한다.
본 발명자는 강도다리(Platichthys stellatus) 유래의 Prosaposin-like 단백질(GenBank accession No. MT044467)에서 항균활성이 예상되는 아미노산 서열을 기반으로 각각 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 두 가지 항균 펩티드를 제작하였으며 이를 각각 PsPSAPL-1 및 PsPSAPL-2로 명명하였다.
본 발명에 따른 강도다리 유래의 항균 펩티드의 범위는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 펩티드 및 상기 펩티드의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩티드를 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 항균 활성을 의미한다.
본 발명은 또한, 상기 항균 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 항균 펩티드를 코딩하는 DNA 또는 RNA일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함하며, DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다. 진핵세포에서 이용가능한 번역 조절 요소인 인핸서(enhancer), 리보솜 결합 부위, 종결신호, 폴리아데닐레이션 신호 및 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 상기 발현 벡터는 당업계에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부의 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, 대장균의 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파지(λ)의 좌향 프로모터(pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. 한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 대장균(E. coli) JM109, 대장균 BL21, 대장균 RR1, 대장균 LE392, 대장균 B, 대장균 X1776, 대장균 W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 사람 세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 원핵세포인 경우, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)) 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하여 항균 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 과발현하는 단계를 포함하는 항균 펩티드의 생산방법 및 상기 방법에 의해 생산된 항균 펩티드를 제공한다.
본 발명의 항균 펩티드를 생산하는 방법은 형질전환체를 공지된 기술을 이용하여 재조합 단백질(펩티드)의 생산에 적합한 배지에서 배양한다. 예를 들어, 세포들은 적합한 배지와 단백질이 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건 하에 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 또는 대규모 발효, 쉐이크 플라스크 배양에 의해서 배양될 수 있다. 배양은 공지기술을 사용하여 탄소, 질소원 및 무기염을 포함하는 적합한 배지에서 일어난다. 적합한 배지는 상업적으로 입수하거나 예를 들면, ATCC(American Type Culture Collection)의 카탈로그와 같은 간행물에 기재된 성분 및 조성비에 따라 제조할 수 있다.
상기 생산 방법에서는 목적 유전자에 의해 발현된 단백질(펩티드)을 당업계에 공지된 단백질 분리방법을 이용하여 회수할 수 있다. 예를 들어 단백질은 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 방법에 의해서 영양배지로부터 분리될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 더 나아가 단백질은 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.
본 발명의 상기 항균 펩티드는 전술한 바와 같으며, 그람 양성균 또는 그람 음성균 등의 세균에 대한 생육 저해 활성을 가진 항균 펩티드이다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물을 제공한다. 상기 항균 조성물은 어류용 항균 조성물로 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
"항균(antimicrobial)"의 의미는 어떤 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미하며, 바람직하게는 항세균(anti-bacterial)을 의미할 수 있으며, 상기 세균은 그람 양성균 또는 그람 음성균일 수 있으며, 바람직하게는 상기 그람 양성균은 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) 또는 스트렙토코커스 파라우베리스(S. parauberis)이고, 그람 음성균은 비브리오 알기노리티커스(Vibrio alginolyticus), 비브리오 앙귈라룸(V. anguillarum), 비브리오 캄프벨리(V. campbellii), 비브리오 할베이(Vibrio harveyi) 또는 비브리오 오르달리(Vibrio ordalii)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 항균 펩티드를 유효성분으로 함유하는 어류용 사료첨가제를 제공한다. 상기 사료첨가제는 항균 활성을 가지는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 함유하며, 어류의 면역증강 효과를 유도할 수 있다.
본 발명의 사료첨가제에는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병 예방제와 같은 첨가제가 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 사료첨가제는 분말 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 사료 첨가용 부형제로는 예를 들어, 탄산칼슘, 말분, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 사료첨가제는 하나 이상의 효소 제제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 리파제와 같은 지방 분해 효소, 피틴산(phytic acid)을 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제, 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 말토오스를 두 분자의 글루코스로 가수분해하는 말타제 및 사카로스를 가수분해하여 글루코스-프룩토스 혼합물을 만드는 전환효소 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 사료첨가제는 어류에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 상기 사료 첨가용 조성물에는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 섭취량 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. PsPSAPL 유전자의 확인 및 클로닝
PsPSAPL (Platichthys stellatus Prosaposin-like) 유전자의 ORF(open reading frame) 서열은 서브 클로닝 및 이전의 연구에서 획득한 서열 기반의 생어 시퀀싱을 통해 확인하였다. 간단하게, PsPSAPL의 ORF 서열은 PCR을 통해 증폭하고 pGEM T-easy 벡터(Promega, USA)로 라이게이션한 후, E.coli JM109 균주로 형질전환 하였다. 상기 대장균 균주를 배양하고 플라스미드를 추출한 후 생어 시퀀싱을 통해 서열을 결정하였다.
2. 다중 정렬 및 계통발생 분석
획득한 PsPSAPL의 cDNA 서열은 GENETYX software version 8.0 (SDC Software Development, Japan)을 사용하여 예측하였고, 관련있는 PSAPL의 서열은 BLAST 알고리즘을 이용하여 NCBI 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)로부터 획득하였다. 다중 정렬을 통해 확인한 아미노산 서열은 ClustalX2 알고리즘을 이용한 GeneDoc을 통해 시각화하였고, 도메인 및 모티프 예측은 PROSITE profile 데이터베이스(http://www.expasy.org/tools/scanprosite/)를 사용하여 확인하였다. 계통수는 neighbour-joining 방법을 이용하여 1,000 부스트트랩 반복수로 ClustalW를 통해 구축하고, MEGA software version 6.0을 사용하여 시각화하였다.
3. In vivo 유전자 발현 프로파일링
3-1. 어류 및 병원성 미생물
건강한 강도다리(weight: 128.7 ± 18.2 g, body length: 21.5 ± 1.3 cm)는 포항 소재의 사설양식장에서 구매하였으며, 바닷물 조건에서 2주 동안 순치하였다. 주요 질병 진단을 위해서 바닷물에 익숙해진 강도다리 중에서 무작위로 선택하였고, PCR을 이용한 임상학적 검사를 통해 건강 상태를 확인한 후 실험에 사용하였다.
본 발명에 사용된 병원성 세균은 다음과 같다: 에드워드시엘라 피스시시다(Edwardsiella piscicida) FSW910410, 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5228, 스트렙토코커스 파라우베리스(S. parauberi) KSP28, 스트렙토코커스 파라우베리스 PH0710, 비브리오 알기노리티커스(Vibrio alginolyticus) KCCM2928, 비브리오 앙귈라룸(V. anguillarum) TR14001NF, 비브리오 캄프벨리(V. campbellii) KCCM40684, 비브리오 할베이(Vibrio harveyi) ATCC14126 및 비브리오 오르달리(Vibrio ordalii) KCCM41669. 상기 병원성 세균은 국립수산과학원에서 제공받아 사용하였다.
3-2. 시료 준비 및 조직 수집
PsPSAPL mRNA의 발현 프로파일링은 임상적으로 건강한 강도다리의 다양한 조직(뇌, 눈, 아가미, 두신(head kidney), 심장, 장, 간, 근육, 피부, 이자, 위 및 몸통 신장(trunk kidney))으로부터 측정하였다. 미부정맥으로부터 혈액을 수집한 후, 퍼콜(Sigma-Aldrich, USA) 농도 구배를 통해 PBLs(peripheral blood leukocytes)와 RBCs(red blood cells)를 분리하였다. 준비한 조직 시료들은 총 RNA 추출 전까지 -80℃에 보관하였다.
병원균 인공 감염 실험은, 스트렙토코커스 파라우베리스 PH0710(1 Х 103 CFU/fish) 또는 VHSV(Viral Hemorrhagic Septicemia virus, 1 Х 106 copies/fish)를 각각 감염시킨 후 17 또는 25℃에서 양식시켰다. 주요 조직은 인공 감염 후 1시간, 12시간, 1일, 3일, 5일 및 7일째에 수집하고 총 RNA 추출 전까지 -80℃에 보관하였다.
3-3. 총 RNA 추출 및 cDNA 합성
각각의 조직은 균질화한 후, RNAiso Plus 시약(Takara, Japan)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 총 RNA를 추출하였다. 추출 과정 동안, DNase I kit (Takara)를 사용하여 게노믹 DNA의 오염을 제거하였다. 추출한 총 RNA의 품질은 NanoVue 분광광도계(GE Healthcare, USA)를 사용하여 측정하였으며, PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara)를 사용하여 cDNA를 합성하였다.
3-4. 정량적 실시간 PCR (Quantitative real-time PCR)
PsPSAPL mRNA의 발현 수준은 SYBR green 방법으로 분석하였으며, Thermal Cycler Dice® Real Time System Ⅲ (Takara)를 사용하였다. 상대적 발현 분석을 위해, PsPSAPL 특이적 프라이머[forward: CTGCACCTGGCTCCTAACTC (서열번호 3) 및 reverse: TCCCAAAACCTTCTGCAGTC (서열번호 4)]와 PsEF1α 특이적 프라이머[forward: GTGGCAAGTCCACCACCA (서열번호 5) 및 reverse: GCTTGTCCAGCACCCAGG (서열번호 6)]를 사용하였고, 2-△△CT 방법을 사용하여 계산하였다.
4. 펩티드 합성
항균 활성이 있을 것으로 예측된 PsPSAPL의 아미노산 서열은 펩트론(Daejeon, South Korea)에 의뢰하여 합성하였다. 합성된 펩티드(항균 펩티드)는 다음과 같으며, PSB (phosphate-buffered saline) 버퍼에 녹여 실험에 사용하였다: PsPSAPL-1: YLPKVLHQTPGHLKP (서열번호 1) 및 PsPSAPL-2: FTKIYGSRLQKVLGN (서열번호 2).
5. 최소저해농도(Minimal inhibitory concentration, MIC) 분석
합성한 2개의 항균 펩티드의 항균 활성을 평가하기 위해서, MIC 값을 분석하였다. BHI (brain heart infusion; BD Biosciences, USA) 배지에서 배양한 세균(E. piscicida, S. iniae, S. parauberis KSP28, S. parauberis PH0710, V. alginolyticus, V. anguillarum, V. campbellii, V. harveyi 및 V. ordalii)을 mueller-hinton (MH; BD Biosciences) 배지에 1 Х 106 CFU/㎖이 되도록 희석하고, 2배씩 연속으로 희석한 항균 펩티드(0 to 500 ㎍/㎖)를 각각의 세균 용액에 동량 혼합하였다. 그 후 혼합물을 96웰 플레이트로 옮긴 후, 28℃에서 8시간 동안 배양하고 VICTOR3 plate reader (PerkinElmer, USA)를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.
6. 미생물의 생물막 분석
본 발명의 항균 펩티드(PsPSAPL-1 및 -2)가 세균의 생물막(biofilm) 형성에 미치는 영향을 크리스탈 바이올렛 어세이를 통해 분석하였다. BHI 배지에 세균(S. iniae, S. parauberis PH0710, V. alginolyticus, V. campbellii, V. harveyi 및 V. ordalii)을 배양하고, M9 최소 배지(Welgene, South Korea)에 1 Х 107 CFU/㎖ 농도로 각각 희석한 후, 항균 펩티드(125 to 250 ㎍/㎖)와 혼합한 후 28℃에서 반응시켰다. 24시간 후, 상층액을 거두고 에탄올로 고정하였다. 그 후 상층액을 PBS로 3회 세척하고 1% 크리스탈 바이올렛 용액으로 10분간 염색시켰다. 증류수로 5회 세척하고, 30% 아세트산 용액을 첨가하여 10분간 반응시키고, 생물막 형성 여부를 595 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.
7. 항기생충(Antiparasitic) 분석
PsPSAPL-1 및 -2의 항기생충 활성을 측정하기 위해, 배양한 스쿠티카충(Miamiensis avidus)을 PBS에 희석하고, 650Хg에서 5분간 원심분리하였다. 세척 후, PBS에 1 Х 105 cells/㎖의 농도로 희석하고 항균 펩티드를 혼합한 후, 혼합물을 24웰 플레이트로 옮기고 20℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 스쿠티카충의 사멸을 propidium iodide (Sigma-Aldrich) 및 유세포분석기를 사용하여 측정하였다.
8. 세포독성 분석
항균 펩티드의 세포독성을 분석하기 위해서, 분리한 강도다리 RBCs를 PBS 버퍼에 4%의 비율로 희석하고 항균 펩티드(0 to 500 ㎍/㎖)와 혼합한 후 96웰 플레이트에 2배씩 연속적으로 단계 희석하며 분주하였다. 양성 대조구는 항균 펩티드대신 0.1% 트리톤 X-100을 혼합하였으며, 30분간 반응시켰다. 그 후, 1,000Хg에서 10분간 원심분리하여 상층액을 회수한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
9. 통계분석
모든 시료는 3반복으로 수행하였으며, 결과는 평균±표준편차로 보고하였다. 통계 분석은 SPSS 소프트웨어 version 19(IBM, USA)를 사용하여 수행하였으며, 결과는 ANOVA(one-way analysis of variance)를 사용하여 검증하고, 결과값 간의 비교를 위해 Tukey's test를 사용하였다(*p < 0.05 및 **p < 0.01).
실시예 1. PsPSAPL의 확인 및 아미노산 서열 분석
본 발명자는 강도다리(Platichthys stellatus) 유래의 Prosaposin-like 단백질 유전자(PsPSAPL)의 cDNA 및 아미노산 서열을 NCBI 데이터베이스에 등록시켰다(accession No. MT044467). PsPSAPL cDNA의 ORF 서열은 987 bp이고, 328개의 아미노산을 코딩하고 있다. 다른 어종의 PSAPL 아미노산 서열과 PsPSAPL의 다중 정렬 결과, 3개의 사포신 B 유형 도메인(36~117, 148~229 및 237~317번째 아미노산)이 매우 높은 수준으로 보존되어 있는 것이 확인되었다(도 1A). 강도다리의 PSAPL는 넙치(olive flounder)의 PSAPL과 가장 높은 상동성을 보였으며(85.2%), 그 뒤를 이어 바라문디(77.5%), 잿방어(75.9%)의 순으로 확인되었다.
계통수는 강도다리 PSAPL이 어류 PSAPL과 구분되는 클러스터에 속하는 것을 보여주었고, 넙치의 PSAPL과 유사성에서 가장 가까운 것을 보여주었다(도 1B).
실시예 2. PsPSAPL 의 유전자 발현 프로파일링
건강한 강도다리에서 PsPSAPL mRNA는 근육, 아가미 및 RBCs에 비해 뇌 조직에서 풍부하게 발현되는 것이 확인되었다(도 2).
VHSV를 인공 감염시킨 경우 PsPSAPL의 mRNA 발현 수준은 대부분의 조직에서 하향 조절되었으며, 아가미와 간 조직에서의 발현 수준은 일정 수준이 유지되는 것으로 확인되었다(도 3A). 반면, 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)를 인공 감염시킨 경우 PsPSAPL의 mRNA 발현 수준은 심장, 간 및 장 조직에서 의미있게 상향 조절되었으며, 아가미와 이자 조직에서는 최저 수준으로 하향 조절되는 것이 확인되었다(도 3B).
실시예 3. 항균 활성 분석
항균 활성 분석에 사용한 합성한 PsPSAPL-1 및 -2 항균 펩티드의 순도는 98%였다. 그람 양성 및 그람 음성균에 대한 PsPSAPL-1 및 -2 항균 펩티드의 MIC 값은 하기 표 1과 같다.
Figure 112020065695085-pat00001
PsPSAPL-1은 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5228, 스트렙토코커스 파라우베리스(S. parauberi) PH0710, 비브리오 할베이(Vibrio harveyi) ATCC14126의 성장을 저해하는 것으로 확인되었으며, PsPSAPL-2는 광범위한 세균 종(S. iniae, S. parauberis PH0710, V. alginolyticus, V. anguillarum, V. campbellii, V. harveyi 및 V. ordalii)에 대하여 항균 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 4. 생물막 형성 억제능 및 항기생충능
PsPSAPL-1 및 -2 펩티드는 실험에 사용된 세균들의 생물막 형성을 유의적으로 감소시키는 것으로 확인되었다(도 4).
또한, PsPSAPL-1 및 -2 펩티드는 농도 의존적으로 항기생충 활성을 보여주었는데(도 5), 항균 활성과 다르게 PsPSAPL-1 펩티드가 PsPSAPL-2 펩티드에 비해 항기생충능이 우수한 것이 확인되었다.
실시예 5. 세포 독성 분석
본 발명자는 RBCs를 이용하여 PsPSAPL-1 및 -2 펩티드의 용혈 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 6에서 확인되는 것과 같이 PsPSAPL-1 및 -2 항균 펩티드는 최고 처리 농도인 500 ㎍/㎖에서도 용혈활성이 전혀 나타나지 않는 것으로 확인되어, 세포 독성이 없는 항균 펩티드임을 알 수 있었다.
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Novel antimicrobial peptide from starry flounder and uses thereof <130> PN20097 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Platichthys stellatus <400> 1 Tyr Leu Pro Lys Val Leu His Gln Thr Pro Gly His Leu Lys Pro 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Platichthys stellatus <400> 2 Phe Thr Lys Ile Tyr Gly Ser Arg Leu Gln Lys Val Leu Gly Asn 1 5 10 15 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctgcacctgg ctcctaactc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcccaaaacc ttctgcagtc 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gtggcaagtc caccacca 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcttgtccag cacccagg 18

Claims (10)

  1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 강도다리(Platichthys stellatus) 유래의 항균 펩티드.
  2. 제1항의 항균 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  4. 제3항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  5. 제3항의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 항균 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 과발현시키는 단계를 포함하는 항균 펩티드의 생산방법.
  6. 제5항의 방법에 의해 생산된 항균 펩티드.
  7. 제1항 또는 제6항의 항균 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 그람 양성 및 그람 음성의 병원균에 대하여 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 그람 양성 병원균은 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) 또는 스트렙토코커스 파라우베리스(S. parauberis)이며, 그람 음성 병원균은 비브리오 알기노리티커스(Vibrio alginolyticus), 비브리오 앙귈라룸(V. anguillarum), 비브리오 캄프벨리(V. campbellii), 비브리오 할베이(Vibrio harveyi) 또는 비브리오 오르달리(Vibrio ordalii)인 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
  10. 제1항 또는 제6항의 항균 펩티드를 유효성분으로 함유하는 어류용 사료첨가제.
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