JP3023693B2 - Ｅｄｆ結合蛋白質 - Google Patents
Ｅｄｆ結合蛋白質Info
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- JP3023693B2 JP3023693B2 JP2194085A JP19408590A JP3023693B2 JP 3023693 B2 JP3023693 B2 JP 3023693B2 JP 2194085 A JP2194085 A JP 2194085A JP 19408590 A JP19408590 A JP 19408590A JP 3023693 B2 JP3023693 B2 JP 3023693B2
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- Japan
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- edf
- amino acid
- protein
- binding protein
- acid sequence
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はEDFとの結合能を有するブタ、ラット、ウシ
又はヒト等由来の蛋白質（以下、EDF結合蛋白質と称す
る。）、各種EDF結合蛋白質を含有するEDF検査薬及び各
種EDF結合蛋白質を用いるEDFの精製法に関する。
又はヒト等由来の蛋白質（以下、EDF結合蛋白質と称す
る。）、各種EDF結合蛋白質を含有するEDF検査薬及び各
種EDF結合蛋白質を用いるEDFの精製法に関する。
EDF（Erythroid Differentiation Factor）はポリペ
プチドであって赤芽球分化因子であり、本発明者らによ
って既に単離されて分子量、アミノ末端部のアミノ酸配
列等が解明されている（特開昭62−240700号公報、この
特許公報ではBUF−３と命名されている。）。ところ
で、EDFはブタ、ヒト、ラット及びウシのいずれにおい
ても同一の構造を有する蛋白質である。EDFは赤芽球の
分化生成を促進する作用を有するほか腫瘍細胞を正常細
胞に分化、成熟させる作用も有しており、癌治療薬及び
貧血治療薬として期待されているものである。このEDF
と特異的に結合する蛋白質の存在はまだ知られていな
い。
プチドであって赤芽球分化因子であり、本発明者らによ
って既に単離されて分子量、アミノ末端部のアミノ酸配
列等が解明されている（特開昭62−240700号公報、この
特許公報ではBUF−３と命名されている。）。ところ
で、EDFはブタ、ヒト、ラット及びウシのいずれにおい
ても同一の構造を有する蛋白質である。EDFは赤芽球の
分化生成を促進する作用を有するほか腫瘍細胞を正常細
胞に分化、成熟させる作用も有しており、癌治療薬及び
貧血治療薬として期待されているものである。このEDF
と特異的に結合する蛋白質の存在はまだ知られていな
い。
EDFと特異的に結合する蛋白質が見出されればEDFの精
製及び分析が容易になってEDFの精製及び利用両面での
開発を大きく促進させることができる。また、体内のED
Fを測定することによって妊娠可能性、糖尿病等の診断
材料とすることができる。EDFと特異的に結合する蛋白
質がEDFの生物活性を特異的に阻害することがわかれ
ば、EDFが作用しうる全ての生体内反応を抑制する調節
物質として利用することができる。
製及び分析が容易になってEDFの精製及び利用両面での
開発を大きく促進させることができる。また、体内のED
Fを測定することによって妊娠可能性、糖尿病等の診断
材料とすることができる。EDFと特異的に結合する蛋白
質がEDFの生物活性を特異的に阻害することがわかれ
ば、EDFが作用しうる全ての生体内反応を抑制する調節
物質として利用することができる。
本発明は以上の用途に有用なブタ、ラット、ウシ又は
ヒト等のEDFと特異的に結合する蛋白質を取得すること
を目的としている。
ヒト等のEDFと特異的に結合する蛋白質を取得すること
を目的としている。
本発明者らは上記目的を達成するべく鋭意検討の結
果、各哺乳動物の卵巣、脳下垂体等の臓器をホモジナイ
ズして、各種プロテアーゼインヒビターを加えた緩衝液
を用いて臓器から蛋白質を抽出し、この抽出液をEDFを
担体に固定化した固定化物に接触させることによってED
Fとの結合能を有する蛋白質の取得に成功し、これに基
づいて本発明を完成するに至った。
果、各哺乳動物の卵巣、脳下垂体等の臓器をホモジナイ
ズして、各種プロテアーゼインヒビターを加えた緩衝液
を用いて臓器から蛋白質を抽出し、この抽出液をEDFを
担体に固定化した固定化物に接触させることによってED
Fとの結合能を有する蛋白質の取得に成功し、これに基
づいて本発明を完成するに至った。
本発明のEDFとの結合能を有する蛋白質は下記の理化
学的性質を有する。
学的性質を有する。
（１）分子量が30kd〜40kd（SDS−PAGE、未還元条件
下）であり、ペプチド鎖のアミノ酸残基数が、303又は3
04であり、糖鎖を有する分子種もある。
下）であり、ペプチド鎖のアミノ酸残基数が、303又は3
04であり、糖鎖を有する分子種もある。
（２）ペプチド鎖のアミノ酸配列は、下記のアミノ酸配
列からなり、または下記アミノ酸配列において１ないし
数個程度のアミノ酸残基が欠失・置換もしくは付加され
ている。
列からなり、または下記アミノ酸配列において１ないし
数個程度のアミノ酸残基が欠失・置換もしくは付加され
ている。
上記のアミノ酸配列はブタ由来のものであり、ラット
由来のもののペプチド鎖のアミノ酸配列は次の通りであ
る。
由来のもののペプチド鎖のアミノ酸配列は次の通りであ
る。
また、ヒト由来のもののペプチド類のアミノ酸配列は
次の通りである。
次の通りである。
これらのペプチドはいずれもＣ末端のアスパラギン酸
残基が欠落したアミノ酸残基数が303のものも存在す
る。
残基が欠落したアミノ酸残基数が303のものも存在す
る。
ブタ由来のペプチド鎖をラット由来及びヒト由来のも
のと比較すると、 相違点があるのは上記X1〜X8の８箇所である。これを下
表に示す。
のと比較すると、 相違点があるのは上記X1〜X8の８箇所である。これを下
表に示す。
従って、ブタ由来のペプチド鎖とラット由来のペプチ
ド鎖とではアミノ酸が相違している箇所は７箇所であ
り、これは全アミノ酸数の2.3％に相当する。また、ブ
タ由来のペプチド鎖と由来のペプチド鎖とでは４箇所が
相違しており、これは全アミノ酸数の1.3％に相当す
る。
ド鎖とではアミノ酸が相違している箇所は７箇所であ
り、これは全アミノ酸数の2.3％に相当する。また、ブ
タ由来のペプチド鎖と由来のペプチド鎖とでは４箇所が
相違しており、これは全アミノ酸数の1.3％に相当す
る。
（３）糖鎖を有する分子種である。
（４）EDFのFSH分泌促進作用を抑制する。
（５）EDFの卵巣顆粒膜細胞LH受容体発現促進作用を抑
制する。
制する。
（６）EDFのフレンド細胞分化誘導作用を抑制する。
（７）EDFの造血作用を抑制する。
上記の蛋白質は各種哺乳動物の臓器等から抽出するこ
とができる。臓器の種類は限定されないが、卵巣、脳下
垂体、肝臓、胎盤、精巣、腎臓、脳、子宮等を利用でき
る。これらの臓器を抽出するに先立って当該動物に女性
ホルモン、性腺刺激ホルモン等を投与することによって
EDF結合蛋白質を誘導し、臓器のEDF結合蛋白質の含有量
を大幅に高めることができる。上記ホルモンは合成ホル
モンであってもよい。女性ホルモンの例としてはジエチ
ルスティルベステロール等、そして、性腺刺激ホルモン
の例としてはウマ絨毛性ゴナドトロピン、ヒト絨毛性ゴ
ナドトロピン、卵胞刺激ホルモン等を挙げることができ
る。上記ホルモンは一方のみでもよいが両方を投与する
ことが望ましい。投与量はホルモンの種類等によって異
なるが１〜100mg/体重kg程度を２〜10日の間に１〜10数
回程度行えばよい。
とができる。臓器の種類は限定されないが、卵巣、脳下
垂体、肝臓、胎盤、精巣、腎臓、脳、子宮等を利用でき
る。これらの臓器を抽出するに先立って当該動物に女性
ホルモン、性腺刺激ホルモン等を投与することによって
EDF結合蛋白質を誘導し、臓器のEDF結合蛋白質の含有量
を大幅に高めることができる。上記ホルモンは合成ホル
モンであってもよい。女性ホルモンの例としてはジエチ
ルスティルベステロール等、そして、性腺刺激ホルモン
の例としてはウマ絨毛性ゴナドトロピン、ヒト絨毛性ゴ
ナドトロピン、卵胞刺激ホルモン等を挙げることができ
る。上記ホルモンは一方のみでもよいが両方を投与する
ことが望ましい。投与量はホルモンの種類等によって異
なるが１〜100mg/体重kg程度を２〜10日の間に１〜10数
回程度行えばよい。
摘出した臓器を抽出しやすいようにまずホモジナイザ
ーで破砕する。ホモジナイザーは組織や細胞の破砕に使
用される通常のものを使用すればよく、例えばワーリン
グブレンダー、ボールミル、その他各種のホモジナイザ
ーを利用できる。抽出剤は水でよいが、緩衝液あるいは
生理食塩溶液を用いることが好ましい。また、抽出液中
のEDF結合蛋白質の分解を防止するためにプロテアーゼ
インヒビターを加えておくことが好ましい。プロテアー
ゼインヒビターの例としては、フェニルメチルスルホニ
ルフルオライド、ジイソプロピルフルオロホスフェー
ト、ベンザミジン塩酸塩、Ｎ−エチルマレイミド、エチ
レンジアミンテトラ酢酸、アプロチニン、ロイペプチ
ン、アンチパイン等を挙げることができる。臓器に存在
が予想されるプロテアーゼをなるべく多く失活させうる
ように複数のプロテアーゼインヒビターを組合せて添加
しておくことが望ましい。抽出剤は臓器をホモジナイズ
後に加えてもよく、あるいはホモジナイズ前に加えてお
いてもよい。抽出工程の収率を高めるために抽出を複数
回繰り返すことができる。
ーで破砕する。ホモジナイザーは組織や細胞の破砕に使
用される通常のものを使用すればよく、例えばワーリン
グブレンダー、ボールミル、その他各種のホモジナイザ
ーを利用できる。抽出剤は水でよいが、緩衝液あるいは
生理食塩溶液を用いることが好ましい。また、抽出液中
のEDF結合蛋白質の分解を防止するためにプロテアーゼ
インヒビターを加えておくことが好ましい。プロテアー
ゼインヒビターの例としては、フェニルメチルスルホニ
ルフルオライド、ジイソプロピルフルオロホスフェー
ト、ベンザミジン塩酸塩、Ｎ−エチルマレイミド、エチ
レンジアミンテトラ酢酸、アプロチニン、ロイペプチ
ン、アンチパイン等を挙げることができる。臓器に存在
が予想されるプロテアーゼをなるべく多く失活させうる
ように複数のプロテアーゼインヒビターを組合せて添加
しておくことが望ましい。抽出剤は臓器をホモジナイズ
後に加えてもよく、あるいはホモジナイズ前に加えてお
いてもよい。抽出工程の収率を高めるために抽出を複数
回繰り返すことができる。
抽出剤を加えて抽出を行った後は懸濁物を除去して抽
出液を得る。懸濁物を除去する手段は問わないが例えば
遠心すればよい。
出液を得る。懸濁物を除去する手段は問わないが例えば
遠心すればよい。
抽出後はEDFを担体に固定した固定化物に接触させる
ことによってアフィニティーを利用してEDF結合蛋白質
を選択的に吸着させる。EDFを固定化する担体は例えば
固定化酵素用の担体である、多糖類誘導体、アミノ酸共
重合物、ポリアクリルアミド誘導体等を利用できる。ED
Fを担体に結合する方法も酵素を担体に結合する方法に
従って行えばよい。接触は固定化物をカラムに充填して
クロマトグラフィーさせる形式で行ってもよく、EDF結
合蛋白質含有溶液にEDF固定化物を投入してもよい。EDF
結合蛋白質をEDF固定化物に吸着させたら液部を除去
し、必要により、水、緩衝液等で洗浄する。EDF結合蛋
白質の溶離は例えばグアニジン塩酸溶液で行えばよく、
溶離液は脱塩後凍結乾燥することによってEDF結合蛋白
質を高純度で取得できる。また、抽出液にトリトンＸ−
100のような非イオン性界面活性剤を加え、アフィニテ
ィクロマトグラフィーを界面活性剤存在下で実施するこ
とにより、EDF結合蛋白質の回収率を更に高めることが
できる。
ことによってアフィニティーを利用してEDF結合蛋白質
を選択的に吸着させる。EDFを固定化する担体は例えば
固定化酵素用の担体である、多糖類誘導体、アミノ酸共
重合物、ポリアクリルアミド誘導体等を利用できる。ED
Fを担体に結合する方法も酵素を担体に結合する方法に
従って行えばよい。接触は固定化物をカラムに充填して
クロマトグラフィーさせる形式で行ってもよく、EDF結
合蛋白質含有溶液にEDF固定化物を投入してもよい。EDF
結合蛋白質をEDF固定化物に吸着させたら液部を除去
し、必要により、水、緩衝液等で洗浄する。EDF結合蛋
白質の溶離は例えばグアニジン塩酸溶液で行えばよく、
溶離液は脱塩後凍結乾燥することによってEDF結合蛋白
質を高純度で取得できる。また、抽出液にトリトンＸ−
100のような非イオン性界面活性剤を加え、アフィニテ
ィクロマトグラフィーを界面活性剤存在下で実施するこ
とにより、EDF結合蛋白質の回収率を更に高めることが
できる。
本発明のEDF結合蛋白質を用いることによってEDFの精
製及び分析が容易になる。EDFの精製に利用する場合に
は、EDF結合蛋白質を担体に固定化して用いる。担体及
び固定化方法は酵素の固定化と同様でよい。EDF結合蛋
白質固定化物をEDF溶液と接触させることによりEDFを選
択的に吸着させることができる。このEDF結合蛋白質固
定化物を用いた精製方法は前述のそして実施例に記載さ
れたEDF固定化物を利用したEDF結合蛋白質の精製方法と
同様にして実施することができる。EDFの分析に利用す
る場合には、EDF結合蛋白質をそのまま緩衝液に溶解し
て用いる。例えば、放射性ヨウ素で標識したEDFの一定
量のEDF結合蛋白質に対する結合が、EDFを含む検体によ
ってどの程度競合的に阻害されるかを定量的に測定する
ことによりEDFの分析ができる。すなわち、既知の各濃
度のEDFによって求められたEDF結合阻害曲線を検量線と
して検体中のEDF量とその結合阻害率から換算して定量
することができる。
製及び分析が容易になる。EDFの精製に利用する場合に
は、EDF結合蛋白質を担体に固定化して用いる。担体及
び固定化方法は酵素の固定化と同様でよい。EDF結合蛋
白質固定化物をEDF溶液と接触させることによりEDFを選
択的に吸着させることができる。このEDF結合蛋白質固
定化物を用いた精製方法は前述のそして実施例に記載さ
れたEDF固定化物を利用したEDF結合蛋白質の精製方法と
同様にして実施することができる。EDFの分析に利用す
る場合には、EDF結合蛋白質をそのまま緩衝液に溶解し
て用いる。例えば、放射性ヨウ素で標識したEDFの一定
量のEDF結合蛋白質に対する結合が、EDFを含む検体によ
ってどの程度競合的に阻害されるかを定量的に測定する
ことによりEDFの分析ができる。すなわち、既知の各濃
度のEDFによって求められたEDF結合阻害曲線を検量線と
して検体中のEDF量とその結合阻害率から換算して定量
することができる。
EDFの検査薬としては妊娠可能性、糖尿病等の診断材
料として利用できる。すなわち、EDFは卵胞刺激ホルモ
ンの分泌を促進する作用があり、EDFの体液中の濃度は
妊娠のしやすさと関連している。また、EDFは血糖降下
作用があり、少ないと血糖値が上昇する。そこで、血中
のEDF濃度を測定することよって糖尿病の診断材料とす
ることができる。
料として利用できる。すなわち、EDFは卵胞刺激ホルモ
ンの分泌を促進する作用があり、EDFの体液中の濃度は
妊娠のしやすさと関連している。また、EDFは血糖降下
作用があり、少ないと血糖値が上昇する。そこで、血中
のEDF濃度を測定することよって糖尿病の診断材料とす
ることができる。
EDF結合蛋白質の活性測定法 クロラミンＴ法により放射性ヨウ素（125I）で標識し
たEDF（125I−EDF）〔Sugino.H.et.al.,J.Biol.Chem.26
3.15249〜152152（1988）〕を用いて、EDF結合蛋白質の
活性を測定する。0.1％BSA及び0.15M NaClを含むトリス
／塩酸（pH7.2）（BSA−TBS）で希釈調製した検体100μ
にBSA−TBS50μ或いはBSA−TBSに溶解した未標識ED
F（５μg/ml）50μを加え全量を150μとした後、
125I−EDF（20ng/ml、〜20,000cpm/ng）100μを加え
て室温で放置した。１時間後、BSA−TBS50μ、５％ウ
シγ−グロブリン〔2mM EDTA及び0.02％NaN3を含む20mM
トリス／塩酸（pH7.2）に溶解〕100μ及び25％ポリエ
チレングリコール6000〔0.02％NaN3を含む20mMトリス／
塩酸（pH7.2）に溶解〕400μを順次加え激しく撹拌す
る。４℃で3000rpm、20分間遠心し、得られた沈澱の放
射活性を測定する（全結合量）。なお、125I−EDFと50
倍量の未標識EDFを同時に添加した時に得られた沈澱の
放射活性を非特異的結合量とし、全結合量から非特異的
結合量を差し引いた値を特異的結合量とした。全EDF結
合蛋白質の含量は125I−EDFの特異的結合量から換算し
て表示した。
たEDF（125I−EDF）〔Sugino.H.et.al.,J.Biol.Chem.26
3.15249〜152152（1988）〕を用いて、EDF結合蛋白質の
活性を測定する。0.1％BSA及び0.15M NaClを含むトリス
／塩酸（pH7.2）（BSA−TBS）で希釈調製した検体100μ
にBSA−TBS50μ或いはBSA−TBSに溶解した未標識ED
F（５μg/ml）50μを加え全量を150μとした後、
125I−EDF（20ng/ml、〜20,000cpm/ng）100μを加え
て室温で放置した。１時間後、BSA−TBS50μ、５％ウ
シγ−グロブリン〔2mM EDTA及び0.02％NaN3を含む20mM
トリス／塩酸（pH7.2）に溶解〕100μ及び25％ポリエ
チレングリコール6000〔0.02％NaN3を含む20mMトリス／
塩酸（pH7.2）に溶解〕400μを順次加え激しく撹拌す
る。４℃で3000rpm、20分間遠心し、得られた沈澱の放
射活性を測定する（全結合量）。なお、125I−EDFと50
倍量の未標識EDFを同時に添加した時に得られた沈澱の
放射活性を非特異的結合量とし、全結合量から非特異的
結合量を差し引いた値を特異的結合量とした。全EDF結
合蛋白質の含量は125I−EDFの特異的結合量から換算し
て表示した。
実施例１ ブタ卵巣EDF結合蛋白質の単離と性質 ブタ卵巣139gに氷冷した緩衝液Ａ〔20mM Tris/HCl（p
H7.2）,0.15M NaCl,20％glycerol,2mM EDTA,5mM benzam
idine・HCl,1mM phenylmethy lsulfonyl fluoride（PMS
F）,1mM N−ethylmaleimide（NEW）,2mM diisopropyl f
luorophosphate（DFP）〕530mlを加え、氷冷下、ポリト
ロン型高速ホモジナイザーで30秒間、３回ホモジナイズ
した後、3000rpm、10分間遠心して上清を回収した。沈
澱はさらに400mlの緩衝液Ａを加えて同様にホモジナイ
ズして、遠心上清を回収した。この操作をさらにもう一
度繰り返し、計３回の抽出操作によって得られた上清を
卵巣抽出液として集めた。次に、卵巣抽出液1300mlに等
量の緩衝液Ｂ〔20mM Tris/HCl（pH7.2）,0.15M NaCl,25
％polrethylene glycol6000、2mM EDTA,5mM benzamidin
e・HCl,1mM PMSF,1mM NEW,2mM DFP〕を加え30分間、４
℃で撹拌した後、10,000rpm、１時間遠心して沈澱を集
めた。得られた沈澱からEDF結合蛋白質を抽出するため
に、氷冷した緩衝液A650mlを加え軽くホモジナイズして
沈澱を懸濁させた後、最終濃度が２％になるようにトリ
トンＸ−100を加え、スターラーを用いて４℃で充分に
撹拌した。撹拌１時間後、懸濁液を４℃で10,000rpm、
１時間遠心して660mlの上清液を得た。
H7.2）,0.15M NaCl,20％glycerol,2mM EDTA,5mM benzam
idine・HCl,1mM phenylmethy lsulfonyl fluoride（PMS
F）,1mM N−ethylmaleimide（NEW）,2mM diisopropyl f
luorophosphate（DFP）〕530mlを加え、氷冷下、ポリト
ロン型高速ホモジナイザーで30秒間、３回ホモジナイズ
した後、3000rpm、10分間遠心して上清を回収した。沈
澱はさらに400mlの緩衝液Ａを加えて同様にホモジナイ
ズして、遠心上清を回収した。この操作をさらにもう一
度繰り返し、計３回の抽出操作によって得られた上清を
卵巣抽出液として集めた。次に、卵巣抽出液1300mlに等
量の緩衝液Ｂ〔20mM Tris/HCl（pH7.2）,0.15M NaCl,25
％polrethylene glycol6000、2mM EDTA,5mM benzamidin
e・HCl,1mM PMSF,1mM NEW,2mM DFP〕を加え30分間、４
℃で撹拌した後、10,000rpm、１時間遠心して沈澱を集
めた。得られた沈澱からEDF結合蛋白質を抽出するため
に、氷冷した緩衝液A650mlを加え軽くホモジナイズして
沈澱を懸濁させた後、最終濃度が２％になるようにトリ
トンＸ−100を加え、スターラーを用いて４℃で充分に
撹拌した。撹拌１時間後、懸濁液を４℃で10,000rpm、
１時間遠心して660mlの上清液を得た。
あらかじめ、0.1M NaHCO3で充分洗浄したアフィゲル1
0（バイオラッド社）、5gを0.1M NaHCO3（pH8.0に調
整）2.5mlに懸濁させた。この懸濁液にEDF、5mgを溶解
させた1mM HCl0.5mlを加えて一夜４℃で静かに撹拌し
た。ゲルを小さなカラムに充填し、8M尿素及び2M NaCl
を含む0.1M NaHCO3（pH8.0）で充分に洗浄した。得られ
たゲルをEDF固定化ゲルとして用いた。
0（バイオラッド社）、5gを0.1M NaHCO3（pH8.0に調
整）2.5mlに懸濁させた。この懸濁液にEDF、5mgを溶解
させた1mM HCl0.5mlを加えて一夜４℃で静かに撹拌し
た。ゲルを小さなカラムに充填し、8M尿素及び2M NaCl
を含む0.1M NaHCO3（pH8.0）で充分に洗浄した。得られ
たゲルをEDF固定化ゲルとして用いた。
得られた上清100mlに上記EDF固定化ゲル〔EDF−アフ
ィゲル10（EDF1mg/アフィゲル10 1ml）〕4ml及び最終濃
度が1Mとなるように尿素とを加えて、４℃で一夜ゆっく
りと撹拌した。ゲルをガラスフィルターで濾過して集
め、緩衝液Ｃ〔20mMTris/HCl（pH7.2）,0.15M NaCl,20
％glycerol,2mMEDTA,5mM benzamidine・HCl,0.1％Trito
nX−100〕100ml及び緩衝液Ｄ〔50mM Sodium acetate（p
H4.0）,0.15M NaCl,20％glycerol,2mM EDTA,5mM benzam
idine・HCl,0.1％TritonX−100〕100mlで充分に洗浄し
た後、ゲルを再び緩衝液Ｃに懸濁した。ゲル緩衝液をポ
リプロピレン製カラム（φ１×5cm）に充填し、2Mグア
ニジン−塩酸を含む緩衝液Ｃを用いてEDF結合蛋白質を
カラムから溶出した。溶出液は、直ちに緩衝液Ｃで平衡
化したバイオゲルＰ−10カラム（φ1.5×15cm）を用い
るゲル濾過によりグアニジン−塩酸を除き、EDF−アフ
ィゲル10カラム（φ0.8×4cm）による二度目のアフィニ
ティークロマドクラフィーに供した。バイオゲルＰ−10
カラムからの溶出液13mlをEDF−アフィゲル10カラムに
流速6ml/時で通した後、カラムを緩衝液C20ml、緩衝液D
10ml及び緩衝液C10mlで順次洗浄した。EDF結合蛋白質の
溶出は2Mグアニジン−塩酸を含む緩衝液Ｃで行い、溶出
液は直ちに0.001％SDSで予め平衡化しておいたバイオゲ
ルＰ−10カラム（φ1.5×15cm）により脱塩し、凍結乾
燥して最終精製品とした。
ィゲル10（EDF1mg/アフィゲル10 1ml）〕4ml及び最終濃
度が1Mとなるように尿素とを加えて、４℃で一夜ゆっく
りと撹拌した。ゲルをガラスフィルターで濾過して集
め、緩衝液Ｃ〔20mMTris/HCl（pH7.2）,0.15M NaCl,20
％glycerol,2mMEDTA,5mM benzamidine・HCl,0.1％Trito
nX−100〕100ml及び緩衝液Ｄ〔50mM Sodium acetate（p
H4.0）,0.15M NaCl,20％glycerol,2mM EDTA,5mM benzam
idine・HCl,0.1％TritonX−100〕100mlで充分に洗浄し
た後、ゲルを再び緩衝液Ｃに懸濁した。ゲル緩衝液をポ
リプロピレン製カラム（φ１×5cm）に充填し、2Mグア
ニジン−塩酸を含む緩衝液Ｃを用いてEDF結合蛋白質を
カラムから溶出した。溶出液は、直ちに緩衝液Ｃで平衡
化したバイオゲルＰ−10カラム（φ1.5×15cm）を用い
るゲル濾過によりグアニジン−塩酸を除き、EDF−アフ
ィゲル10カラム（φ0.8×4cm）による二度目のアフィニ
ティークロマドクラフィーに供した。バイオゲルＰ−10
カラムからの溶出液13mlをEDF−アフィゲル10カラムに
流速6ml/時で通した後、カラムを緩衝液C20ml、緩衝液D
10ml及び緩衝液C10mlで順次洗浄した。EDF結合蛋白質の
溶出は2Mグアニジン−塩酸を含む緩衝液Ｃで行い、溶出
液は直ちに0.001％SDSで予め平衡化しておいたバイオゲ
ルＰ−10カラム（φ1.5×15cm）により脱塩し、凍結乾
燥して最終精製品とした。
こうして、ブタ卵巣139gより80μｇのEDF結合蛋白質
を得た。精製したEDF結合蛋白質をSDS−PAGE〔Laemmli,
U.K.,Nature227,680〜685（1970）〕により分析した。
精製標品３μｇを還元及び未還元条件下、12.5％ゲルで
電気泳動し、クマシーブリリアントブルーＲ−250で染
色して蛋白質バンドを検出した。得られた泳動パターン
を第１図に示す。図中、左列は標準蛋白質混合物の、左
から２列目は未還元条件下での、そして中央は還元条件
での精製標品の泳動パターンである。同図に示すように
精製標品は未還元下では分子量30,000〜40,000の位置
に、そして還元条件下では分子量40,000〜50,000の位置
にそれぞれ複数のバンドを呈した。
を得た。精製したEDF結合蛋白質をSDS−PAGE〔Laemmli,
U.K.,Nature227,680〜685（1970）〕により分析した。
精製標品３μｇを還元及び未還元条件下、12.5％ゲルで
電気泳動し、クマシーブリリアントブルーＲ−250で染
色して蛋白質バンドを検出した。得られた泳動パターン
を第１図に示す。図中、左列は標準蛋白質混合物の、左
から２列目は未還元条件下での、そして中央は還元条件
での精製標品の泳動パターンである。同図に示すように
精製標品は未還元下では分子量30,000〜40,000の位置
に、そして還元条件下では分子量40,000〜50,000の位置
にそれぞれ複数のバンドを呈した。
次に、HPLCにより単離したＰ−Ｉ−１、Ｐ−Ｉ−２、
Ｐ−Ｉ−３、Ｐ−II−１及びＰ−II−２のEDF結合活性
をポリエチレングリコール沈澱法により測定した。いず
れの標品からも典型的なリガンド飽和曲線が得られ、解
離定数（Kd）はいずれも1.0±0.6nMと算出された。
Ｐ−Ｉ−３、Ｐ−II−１及びＰ−II−２のEDF結合活性
をポリエチレングリコール沈澱法により測定した。いず
れの標品からも典型的なリガンド飽和曲線が得られ、解
離定数（Kd）はいずれも1.0±0.6nMと算出された。
そこで５種類の精製標品の違いを知る目的で、各標品
をＮ−グリカナーゼで処理した後、SDS−PAGEゲル上で
の挙動を検討した。各精製標品４μｇを、0.1M 2−メル
カプトエタノールを含む0.5％SDSに溶解し、95℃で３分
間加熱した。これに0.55Mリン酸緩衝液（pH8.6）5.4μ
及び7.5％ノニデットＰ−40 2.5μを加え、さらに
Ｎ−グリカナーゼ（Genzyme社）を最終濃度54u/mlとな
るように添加して37℃で反応させた。反応15時間後、非
還元条件下のSDS−PAGEにより反応生成物を分析した。
その結果、いずれの酵素処理標品も32,000±1000にほぼ
単一のバンドを示した。以上の結果は５種類のブタ卵巣
EDF結合蛋白質の蛋白質部分は同じであり、その違いは
糖鎖の数あるいは種類の違いに起因していることを示し
ている。
をＮ−グリカナーゼで処理した後、SDS−PAGEゲル上で
の挙動を検討した。各精製標品４μｇを、0.1M 2−メル
カプトエタノールを含む0.5％SDSに溶解し、95℃で３分
間加熱した。これに0.55Mリン酸緩衝液（pH8.6）5.4μ
及び7.5％ノニデットＰ−40 2.5μを加え、さらに
Ｎ−グリカナーゼ（Genzyme社）を最終濃度54u/mlとな
るように添加して37℃で反応させた。反応15時間後、非
還元条件下のSDS−PAGEにより反応生成物を分析した。
その結果、いずれの酵素処理標品も32,000±1000にほぼ
単一のバンドを示した。以上の結果は５種類のブタ卵巣
EDF結合蛋白質の蛋白質部分は同じであり、その違いは
糖鎖の数あるいは種類の違いに起因していることを示し
ている。
精製標品のNH2末端のアミノ酸配列を分析した。各標
品を非還元条件下、12.5％ゲル上で電気泳動し、ポリビ
ニリデンフルオライド（PVDF）膜（ミリポア社）に電気
的に転写し、蛋白質バンドをクマシーブリリアントブル
ーで染色し、各バンドを切り出して直接気相シークエン
サー（ABI社）にかけてNH2末端アミノ酸配列を分析し
た。その結果いずれの標品の配列もGly−Asn−Ｘ−Trp
−Leu−Arg−Gln−Ala−Lys−Asn−Gly−Arg−Ｘ−Gln
（X:未同定アミノ酸残基）であった。この配列は脳下垂
体FSH分泌の抑制因子として既に明らかにされているホ
リスタチンと同一であった。ホリスタチンは、脳下垂体
からのFSHの分泌抑制因子として、ブタやウシの卵胞液
から精製された糖蛋白質である〔Ueno,N.,et al.（198
7）Proc.Natl.Acad.Sci USA 84,8282〜8286;Robertson,
D.M.,et al.（1987）Biochem.Biophys Res.Commun.149,
744〜749〕。その後、ブタ、ヒト、ラットのcDNAも単離
され、全アミノ酸配列も明らかにされている〔Esch,F.,
et al.（1987）Mol.Endcrinol.１,849〜855;Shimasaki,
S.,et al.（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,4218〜4
222;Shimasaki,S.,et al.（1989）Mol.Endcrinol.３,65
1〜659〕。
品を非還元条件下、12.5％ゲル上で電気泳動し、ポリビ
ニリデンフルオライド（PVDF）膜（ミリポア社）に電気
的に転写し、蛋白質バンドをクマシーブリリアントブル
ーで染色し、各バンドを切り出して直接気相シークエン
サー（ABI社）にかけてNH2末端アミノ酸配列を分析し
た。その結果いずれの標品の配列もGly−Asn−Ｘ−Trp
−Leu−Arg−Gln−Ala−Lys−Asn−Gly−Arg−Ｘ−Gln
（X:未同定アミノ酸残基）であった。この配列は脳下垂
体FSH分泌の抑制因子として既に明らかにされているホ
リスタチンと同一であった。ホリスタチンは、脳下垂体
からのFSHの分泌抑制因子として、ブタやウシの卵胞液
から精製された糖蛋白質である〔Ueno,N.,et al.（198
7）Proc.Natl.Acad.Sci USA 84,8282〜8286;Robertson,
D.M.,et al.（1987）Biochem.Biophys Res.Commun.149,
744〜749〕。その後、ブタ、ヒト、ラットのcDNAも単離
され、全アミノ酸配列も明らかにされている〔Esch,F.,
et al.（1987）Mol.Endcrinol.１,849〜855;Shimasaki,
S.,et al.（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,4218〜4
222;Shimasaki,S.,et al.（1989）Mol.Endcrinol.３,65
1〜659〕。
各標品のHPLCによるペプチドマッピングを試みた。精
製標品をそれぞれ常法に従って還元アルキル化後、1/70
量（w/w）のアクロモバクタープロテアーゼ−１を用
い、0.14M Tris/HCl緩衝液（pH8.6）中、37℃、一夜反
応させて酵素消化を行った。反応液を70％蟻酸でpH2に
調整して、RP−300カラム（2.1×100mm）を用いる逆相H
PLCにより分析した。あらかじめ0.09％TFAで平衡化した
カラムに試料をかけた後、0.09％TFAをベースにしてア
セトニトリルの濃度を１％／分の割合で増加させ、流速
0.2ml/分でHPLCを行った。得られたクロマトグラフィー
のパターンは互いに本質的には極めてよく似ていた。各
ペプチドピークは下表の通りである。
製標品をそれぞれ常法に従って還元アルキル化後、1/70
量（w/w）のアクロモバクタープロテアーゼ−１を用
い、0.14M Tris/HCl緩衝液（pH8.6）中、37℃、一夜反
応させて酵素消化を行った。反応液を70％蟻酸でpH2に
調整して、RP−300カラム（2.1×100mm）を用いる逆相H
PLCにより分析した。あらかじめ0.09％TFAで平衡化した
カラムに試料をかけた後、0.09％TFAをベースにしてア
セトニトリルの濃度を１％／分の割合で増加させ、流速
0.2ml/分でHPLCを行った。得られたクロマトグラフィー
のパターンは互いに本質的には極めてよく似ていた。各
ペプチドピークは下表の通りである。
各ピークフラグメントを常法に従ってアミノ酸分析
し、これを接続すると下記のようなアミノ酸配列になっ
た。
し、これを接続すると下記のようなアミノ酸配列になっ
た。
上記のように、各ペプチド断片のアミノ酸組成は、ホ
リスタチンを同様に処理した時に生成することが推定さ
れるペプチド断片のそれとよく一致した。但し、Lys（8
2）、Asn（83）−Lys（84）、Cys（135）−Lys（13
6）、Lys（137）、Cys（210）−Ile−Lys（212）、Ala
（213）−Lys（214）、Lys（226）のアミノ酸及びペプ
チドは上記のHPLCでは回収されなかった。又、いずれの
標品のプロテアーゼ消化物中にもＰ−20及びＰ−21は検
出されたが、ペプチドHis（283）−Trp（315）あるいは
ペプチドTyr（305）−Trp（315）は認められなかった。
以上の結果はブタ卵巣から精製した５種類のEDF結合蛋
白質のＣ末端がいずれもGln（303）あるいはAsp（304）
であることを示している。すなわち、EDF結合蛋白質の
アミノ酸配列はホリスタチンのＮ末端残基（Gly）から3
03残基（Gln）あるいは304残基（Asp）までの配列と同
一であることが分かった。
リスタチンを同様に処理した時に生成することが推定さ
れるペプチド断片のそれとよく一致した。但し、Lys（8
2）、Asn（83）−Lys（84）、Cys（135）−Lys（13
6）、Lys（137）、Cys（210）−Ile−Lys（212）、Ala
（213）−Lys（214）、Lys（226）のアミノ酸及びペプ
チドは上記のHPLCでは回収されなかった。又、いずれの
標品のプロテアーゼ消化物中にもＰ−20及びＰ−21は検
出されたが、ペプチドHis（283）−Trp（315）あるいは
ペプチドTyr（305）−Trp（315）は認められなかった。
以上の結果はブタ卵巣から精製した５種類のEDF結合蛋
白質のＣ末端がいずれもGln（303）あるいはAsp（304）
であることを示している。すなわち、EDF結合蛋白質の
アミノ酸配列はホリスタチンのＮ末端残基（Gly）から3
03残基（Gln）あるいは304残基（Asp）までの配列と同
一であることが分かった。
実施例２ （１）ラット卵巣EDF結合蛋白質の誘導 幼若（生後３週令）ウイスター雌性ラットにジエチル
スティルベステロール（Diethystilbestrol;DES）及び
ウマ絨毛性ゴナドトロピン（equine chorionic gonadot
ropin;eCG）を投与し、卵巣中のEDF結合蛋白質の誘導を
試みた。ラット一頭あたりDES2mg/日を３日間背部皮下
に投与後、４日目に０〜100単位のeCGを背部皮下に投与
して、その２日後に屠殺して卵巣を採取した。eCG投与
量に伴う卵巣１個あたりの総蛋白量の変化（黒丸）と
125I−EDFの結合量の変化（白丸）を同時に測定した。
得られた結果を第２図に示す。同図に示すように、30単
位以上のeCG投与により、総蛋白量及び125I−EDF結合量
はいずれも無投与時の４〜５倍に上昇した。この結果を
もとにラット卵巣EDF結合蛋白質の精製にはDES2mg/日を
３日間及び50単位のeCGを投与したラットを用いること
とした。
スティルベステロール（Diethystilbestrol;DES）及び
ウマ絨毛性ゴナドトロピン（equine chorionic gonadot
ropin;eCG）を投与し、卵巣中のEDF結合蛋白質の誘導を
試みた。ラット一頭あたりDES2mg/日を３日間背部皮下
に投与後、４日目に０〜100単位のeCGを背部皮下に投与
して、その２日後に屠殺して卵巣を採取した。eCG投与
量に伴う卵巣１個あたりの総蛋白量の変化（黒丸）と
125I−EDFの結合量の変化（白丸）を同時に測定した。
得られた結果を第２図に示す。同図に示すように、30単
位以上のeCG投与により、総蛋白量及び125I−EDF結合量
はいずれも無投与時の４〜５倍に上昇した。この結果を
もとにラット卵巣EDF結合蛋白質の精製にはDES2mg/日を
３日間及び50単位のeCGを投与したラットを用いること
とした。
（２）ラット卵巣EDF結合蛋白質の抽出と精製 実施例１のブタ卵巣EDF結合蛋白質の精製法に従っ
て、上記のホルモン投与ラットより採取した卵巣188
（質量21g）よりEDF結合蛋白質を２回のEDF−アフィゲ
ル10カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー
により精製した。
て、上記のホルモン投与ラットより採取した卵巣188
（質量21g）よりEDF結合蛋白質を２回のEDF−アフィゲ
ル10カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー
により精製した。
二回のアフィニティクロマトグラフィーによりEDF結
合蛋白質の精製度は約22,000倍にまで上昇した。得られ
た結果を以下に示す。
合蛋白質の精製度は約22,000倍にまで上昇した。得られ
た結果を以下に示す。
ラット卵巣188個からの活性の回収率は約44％で、収
量は24μｇであった。なお、蛋白質の定量は色素結合法
〔Bradford,M.M.,Anal.Biochem.72,248〜254（1976）〕
により、EDF結合蛋白質の活性測定は前述の方法により
それぞれ行った。
量は24μｇであった。なお、蛋白質の定量は色素結合法
〔Bradford,M.M.,Anal.Biochem.72,248〜254（1976）〕
により、EDF結合蛋白質の活性測定は前述の方法により
それぞれ行った。
（３）EDF結合蛋白質の化学的性質 （２）で得られた精製EDF結合蛋白質の純度及び分子
量はSDS−PAGEにより分析した。精製標品３μｇを還元
及び未還元条件下、12.5％ゲルで電気泳動し、クマシー
ブリリアントブルーＲ−250で染色して蛋白質バンドを
検出した。得られた泳動パターンを第３図に示す。図
中、左列は標準蛋白質混合物の、中列は未還元条件下で
の、そして右列は還元条件での精製標品の泳動パターン
である。
量はSDS−PAGEにより分析した。精製標品３μｇを還元
及び未還元条件下、12.5％ゲルで電気泳動し、クマシー
ブリリアントブルーＲ−250で染色して蛋白質バンドを
検出した。得られた泳動パターンを第３図に示す。図
中、左列は標準蛋白質混合物の、中列は未還元条件下で
の、そして右列は還元条件での精製標品の泳動パターン
である。
次に、これら複数バンドのうちいずれかがEDF結合蛋
白質のバンドかを明からにするために、SDS−PAGE後、
蛋白質バンドを切り出し、蛋白質を抽出して、EDFの活
性を測定した。即ち、0.5μｇの精製標品を未還元条件
下、12.5％ゲルで泳動した後、ゲルを2mm幅に切り、各
断片を１％トリトンＸ−100、１％BSA及び0.15M NaClを
含む20mMトリス／塩酸緩衝液（pH7.2）に４℃で、一夜
浸漬して、その抽出液中の125I−EDF結合活性を測定し
た。
白質のバンドかを明からにするために、SDS−PAGE後、
蛋白質バンドを切り出し、蛋白質を抽出して、EDFの活
性を測定した。即ち、0.5μｇの精製標品を未還元条件
下、12.5％ゲルで泳動した後、ゲルを2mm幅に切り、各
断片を１％トリトンＸ−100、１％BSA及び0.15M NaClを
含む20mMトリス／塩酸緩衝液（pH7.2）に４℃で、一夜
浸漬して、その抽出液中の125I−EDF結合活性を測定し
た。
得られた結果を第４図に示す。図の左側に同じ条件下
でSDS−PAGEを行った後、銀染色法で得られた泳動パタ
ーンを示す。同図に示すSDS−PAGEゲル上、分子量30,00
0〜40,000の幅広い領域にわたって見られるいずれのバ
ンドにもEDF結合活性が認められた。
でSDS−PAGEを行った後、銀染色法で得られた泳動パタ
ーンを示す。同図に示すSDS−PAGEゲル上、分子量30,00
0〜40,000の幅広い領域にわたって見られるいずれのバ
ンドにもEDF結合活性が認められた。
また、このことはリガンドブロット法によっても確認
された。即ち、SDS−PAGE後、20％エタノールを含む25m
Mトリス（塩基）−192mMグリシン緩衝液（pH8.3）中、
５時間60Vの電圧を加えてEDF結合蛋白質をPVDF膜に転写
した。膜は10％スキムミルク及び0.15M NaClを含む20mM
トリス／塩酸緩衝液（pH7.2）に浸漬し、室温で一夜振
盪した後、緩衝液Ｅ〔１％TritonX−100,0.2％BSA,0.15
M NaCl,2mM EDTA,5mM benzamidine.HClを含む20mM Tris
/HCl緩衝液（pH7.2）〕中で５時間振盪して洗浄した。
次に、未標識EDF（500ng/ml）の存在下及び非存在下でP
VDF膜を125I−EDF（19ng/ml）と緩衝液Ｅ中、室温で２
時間反応させた。反応後、PVDF膜を緩衝液Ｅで３回充分
に洗浄して、膜に結合した125I−EDFをオートラジオグ
ラフィーにより調べた。得られた結果を第５図に示す。
図中、左列はクマシーブリリアントブルーＲ−250で染
色して得られた標準蛋白質混合物の泳動パターンであ
り、中央は未標識EDFの非存在下での、そして右列は未
標識EDFの存在下での125I−EDF結合活性パターンを示し
ている。同図に示すように、この結果も30,000〜40,000
の分子量領域に見られる蛋白質バンドはいずれもEDF結
合活性を持っていることを示している。また、125I−ED
Fの結合が50倍量の未標識EDFの共存下で完全に阻害され
たことは、この結合が特異的な結合であることを示して
いる。
された。即ち、SDS−PAGE後、20％エタノールを含む25m
Mトリス（塩基）−192mMグリシン緩衝液（pH8.3）中、
５時間60Vの電圧を加えてEDF結合蛋白質をPVDF膜に転写
した。膜は10％スキムミルク及び0.15M NaClを含む20mM
トリス／塩酸緩衝液（pH7.2）に浸漬し、室温で一夜振
盪した後、緩衝液Ｅ〔１％TritonX−100,0.2％BSA,0.15
M NaCl,2mM EDTA,5mM benzamidine.HClを含む20mM Tris
/HCl緩衝液（pH7.2）〕中で５時間振盪して洗浄した。
次に、未標識EDF（500ng/ml）の存在下及び非存在下でP
VDF膜を125I−EDF（19ng/ml）と緩衝液Ｅ中、室温で２
時間反応させた。反応後、PVDF膜を緩衝液Ｅで３回充分
に洗浄して、膜に結合した125I−EDFをオートラジオグ
ラフィーにより調べた。得られた結果を第５図に示す。
図中、左列はクマシーブリリアントブルーＲ−250で染
色して得られた標準蛋白質混合物の泳動パターンであ
り、中央は未標識EDFの非存在下での、そして右列は未
標識EDFの存在下での125I−EDF結合活性パターンを示し
ている。同図に示すように、この結果も30,000〜40,000
の分子量領域に見られる蛋白質バンドはいずれもEDF結
合活性を持っていることを示している。また、125I−ED
Fの結合が50倍量の未標識EDFの共存下で完全に阻害され
たことは、この結合が特異的な結合であることを示して
いる。
精製標品をレクチン（wheat germ agglutinin）カラ
ム（Vector Laboratories,Inc.Burlingame,CA,USA）に
かけたところ、カラム素通り画分及び0.5M N−アセチル
グルコサミン溶出画分にEDF結合活性が検出されたこと
から、EDF結合蛋白質標品には糖鎖を持つ蛋白分子種と
糖鎖を持たない蛋白分子種が含まれていることがわかっ
た。
ム（Vector Laboratories,Inc.Burlingame,CA,USA）に
かけたところ、カラム素通り画分及び0.5M N−アセチル
グルコサミン溶出画分にEDF結合活性が検出されたこと
から、EDF結合蛋白質標品には糖鎖を持つ蛋白分子種と
糖鎖を持たない蛋白分子種が含まれていることがわかっ
た。
分子量的に多様性を示す精製EDF結合蛋白質の各アミ
ノ末端のアミノ酸配列を分析した。20μｇのEDF結合蛋
白質を未還元条件下、10％ゲル上で電気泳動した後、PV
DF膜に電気的に転写し、各バンドを切り出して直接気相
シークエンサー（アブライド・バイオシステム社）によ
り各アミノ末端のアミノ酸配列を分析した。その結果、
いずれの蛋白質バンドのアミノ末端アミノ酸配列もGly
−Asn−X1−Trp−Leu−Arg−Gln−Ala−Lys−Asn−Gly
−Arg−X2−Gln（X1、X2:未同定アミノ酸残基）であっ
た。
ノ末端のアミノ酸配列を分析した。20μｇのEDF結合蛋
白質を未還元条件下、10％ゲル上で電気泳動した後、PV
DF膜に電気的に転写し、各バンドを切り出して直接気相
シークエンサー（アブライド・バイオシステム社）によ
り各アミノ末端のアミノ酸配列を分析した。その結果、
いずれの蛋白質バンドのアミノ末端アミノ酸配列もGly
−Asn−X1−Trp−Leu−Arg−Gln−Ala−Lys−Asn−Gly
−Arg−X2−Gln（X1、X2:未同定アミノ酸残基）であっ
た。
次に、このEDF結合蛋白質を実施例１と同様にしてア
ミノ酸配列を分析し前記の構造を有するものであること
を確認した。
ミノ酸配列を分析し前記の構造を有するものであること
を確認した。
実施例３ （１）EDFのFSH分泌促進作用に対するEDF結合蛋白質の
中和作用 EDFにはラット脳下垂体培養細胞からのFSHの分泌を促
進する作用がある〔Kitaoka,M.,et al.（1987）Bioche
m.Biophys.Res.Commun.146,1382〜1385〕。EDAのFSH分
泌促進作用に及ぼすEDF結合蛋白質の効果を長谷川らの
方法〔Hasegawa,Y.,et al.（1986）Endocrinol.Jpn.33,
645〜654〕に従って検討した。すなわちラット脳下垂体
から採取した細胞を96穴組織培養用マイクロプレートに
6X104個／穴となるようにまき、EDF結合蛋白質10、30、
100、300ng/mlと各種濃度のEDFとを反応させた後、各穴
に加えて炭酸ガスインキュベーター中、37℃で培養し
た。三日間培養した後、培養上清中に分泌されたFSHをR
IAにより定量した。結果を第６図に示す。図中○は0ng/
ml、●は10ng/ml、▲は30ng/ml、■は100ng/mlそして▼
は300ng/mlの場合をそれぞれ示す。同図に示すようにED
Fにより亢進したFSHの分泌はEDF結合蛋白質の添加によ
り用量依存的に抑制された。
中和作用 EDFにはラット脳下垂体培養細胞からのFSHの分泌を促
進する作用がある〔Kitaoka,M.,et al.（1987）Bioche
m.Biophys.Res.Commun.146,1382〜1385〕。EDAのFSH分
泌促進作用に及ぼすEDF結合蛋白質の効果を長谷川らの
方法〔Hasegawa,Y.,et al.（1986）Endocrinol.Jpn.33,
645〜654〕に従って検討した。すなわちラット脳下垂体
から採取した細胞を96穴組織培養用マイクロプレートに
6X104個／穴となるようにまき、EDF結合蛋白質10、30、
100、300ng/mlと各種濃度のEDFとを反応させた後、各穴
に加えて炭酸ガスインキュベーター中、37℃で培養し
た。三日間培養した後、培養上清中に分泌されたFSHをR
IAにより定量した。結果を第６図に示す。図中○は0ng/
ml、●は10ng/ml、▲は30ng/ml、■は100ng/mlそして▼
は300ng/mlの場合をそれぞれ示す。同図に示すようにED
Fにより亢進したFSHの分泌はEDF結合蛋白質の添加によ
り用量依存的に抑制された。
（２）EDFの卵巣顆粒膜細胞LH受容体発現促進作用に対
するEDF結合蛋白質の中和作用 FSHはin vitroでラット卵巣顆粒膜細胞上のLH受容体
の発現量を増加させるが、EDFはそのFSHの作用を更に促
進することが明らかにされている〔Sugino,H.,et al.
（1988）Biochem.Biophys.Res.Commun.153,281〜28
8〕。EDFのLH受容体発現促進作用に及ぼすEDF結合蛋白
質の効果を杉野らの方法〔Sugino,H.,et al.（1988）Bi
ochem.BiophyS.Res.Commun.153,281〜288〕に従って検
討した。すなわち、ラット卵巣から採取した顆粒膜細胞
をイムロン２リム−バウエルマイクロプレートに1X105
個／穴となるようにまき、EDF100ng/ml及びFSH30ng/ml
と各種濃度のEDF結合蛋白質とを各穴に加えて炭酸ガス
インキュベーター中、37℃で培養した。３日間培養した
後、培養上清をすて、細胞上のLH受容体を125I−hCGを
用いて定量した。第７図に示したように、EDF100ng/ml
によって促進されたLH受容体の発現量はEDF結合蛋白質
の添加により用量依存的に抑制された。
するEDF結合蛋白質の中和作用 FSHはin vitroでラット卵巣顆粒膜細胞上のLH受容体
の発現量を増加させるが、EDFはそのFSHの作用を更に促
進することが明らかにされている〔Sugino,H.,et al.
（1988）Biochem.Biophys.Res.Commun.153,281〜28
8〕。EDFのLH受容体発現促進作用に及ぼすEDF結合蛋白
質の効果を杉野らの方法〔Sugino,H.,et al.（1988）Bi
ochem.BiophyS.Res.Commun.153,281〜288〕に従って検
討した。すなわち、ラット卵巣から採取した顆粒膜細胞
をイムロン２リム−バウエルマイクロプレートに1X105
個／穴となるようにまき、EDF100ng/ml及びFSH30ng/ml
と各種濃度のEDF結合蛋白質とを各穴に加えて炭酸ガス
インキュベーター中、37℃で培養した。３日間培養した
後、培養上清をすて、細胞上のLH受容体を125I−hCGを
用いて定量した。第７図に示したように、EDF100ng/ml
によって促進されたLH受容体の発現量はEDF結合蛋白質
の添加により用量依存的に抑制された。
（３）EDFのフレンド細胞分化誘導作用に対するEDF結合
蛋白質の中和作用 マウスの赤芽球系白血病細胞フレンド細胞は、EDF共
存下の培養で、ヘモグロビン合成細胞へと分化する。フ
レンド細胞を25ng/mlのEDF存在下で、種々の濃度のEDF
結合蛋白質とともに６日間培養し、細胞をジアニシジン
染色してヘモグロビン陽性細胞数を計測し、分化率を求
めた。第８図に示すように、EDF結合蛋白質無添加で
は、約50％の分化率が認められたが、約60ng/ml以上のE
DF結合蛋白質添加で分化が完全に抑制された。以上よ
り、EDF結合蛋白質がEDFのフレンド細胞に対する分化誘
導活性を中和する活性を有することが明らかになった。
蛋白質の中和作用 マウスの赤芽球系白血病細胞フレンド細胞は、EDF共
存下の培養で、ヘモグロビン合成細胞へと分化する。フ
レンド細胞を25ng/mlのEDF存在下で、種々の濃度のEDF
結合蛋白質とともに６日間培養し、細胞をジアニシジン
染色してヘモグロビン陽性細胞数を計測し、分化率を求
めた。第８図に示すように、EDF結合蛋白質無添加で
は、約50％の分化率が認められたが、約60ng/ml以上のE
DF結合蛋白質添加で分化が完全に抑制された。以上よ
り、EDF結合蛋白質がEDFのフレンド細胞に対する分化誘
導活性を中和する活性を有することが明らかになった。
（４）EDFの造血作用に対するEDF結合蛋白質の中和作用 EDFの赤血球造血作用に対するEDF結合蛋白質の添加効
果をCFU−Ｅコロニー形成を指標に用いて以下のように
検討した。マウスの骨髄細胞を2X105/mlの細胞密度で2u
/mlのEPO（アムジェン社、ヒト・リコンビナントEPO）
を含むメチルセルロース培地にまきこみ、５％CO2、37
℃で２日間培養後にCFU−Ｅコロニー数を計測した。第
９図に示すように、EDF（25ng/ml）を添加するとCFU−
Ｅコロニー数は増加したが、EDF結合蛋白質（120ng/m
l）をさらに加えるとEDFの効果は完全に消失した。以上
より、EDF結合蛋白質がEDFの赤血球造血作用に対する中
和活性を有することが明らかになった。
果をCFU−Ｅコロニー形成を指標に用いて以下のように
検討した。マウスの骨髄細胞を2X105/mlの細胞密度で2u
/mlのEPO（アムジェン社、ヒト・リコンビナントEPO）
を含むメチルセルロース培地にまきこみ、５％CO2、37
℃で２日間培養後にCFU−Ｅコロニー数を計測した。第
９図に示すように、EDF（25ng/ml）を添加するとCFU−
Ｅコロニー数は増加したが、EDF結合蛋白質（120ng/m
l）をさらに加えるとEDFの効果は完全に消失した。以上
より、EDF結合蛋白質がEDFの赤血球造血作用に対する中
和活性を有することが明らかになった。
実施例４ ウシ脳下垂体EDF結合蛋白質の単離と性質 ウシ脳下垂体ホモジネートのEDF結合活性を前述の方
法に従って測定したところ、ブタ卵巣ホモジネートに認
められたのとほぼ同程度の活性が検出された。そこで、
実施例１に示した方法に従って、ウシ脳下垂体からEDF
結合蛋白質の単離を試みた。２回のEDF−アフィゲル10
カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによ
り、ウシ脳下垂体55gから約８μｇの精製標品が得られ
た。
法に従って測定したところ、ブタ卵巣ホモジネートに認
められたのとほぼ同程度の活性が検出された。そこで、
実施例１に示した方法に従って、ウシ脳下垂体からEDF
結合蛋白質の単離を試みた。２回のEDF−アフィゲル10
カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによ
り、ウシ脳下垂体55gから約８μｇの精製標品が得られ
た。
SDS−PAGE分析の結果を第１図右側２列に示す。図
中、右から２列目は未還元条件下での、そして最右列は
還元条件での精製標品の泳動パターンである。同図に示
すように、ウシ脳下垂体EDF結合蛋白質も複数の分子種
からなる混合物であり、その分子量も未還元条件下では
30,000〜40,000と算出され、ラット及びブタ卵巣のもの
とよく一致した。
中、右から２列目は未還元条件下での、そして最右列は
還元条件での精製標品の泳動パターンである。同図に示
すように、ウシ脳下垂体EDF結合蛋白質も複数の分子種
からなる混合物であり、その分子量も未還元条件下では
30,000〜40,000と算出され、ラット及びブタ卵巣のもの
とよく一致した。
本発明の蛋白質を用いることにより癌治療薬、貧血治
療薬として期待されているEDFの精製及び分析を容易に
してその開発を促進することができる。また、体内のED
F濃度の測定を容易にして妊娠可能性、糖尿病の診断材
料を増加させる可能性をも提供するものである。
療薬として期待されているEDFの精製及び分析を容易に
してその開発を促進することができる。また、体内のED
F濃度の測定を容易にして妊娠可能性、糖尿病の診断材
料を増加させる可能性をも提供するものである。
第１図はブタ卵巣及びウシ脳下垂体から抽出したEDF結
合蛋白質を未還元下及び還元下で電気泳動して得られた
泳動パターンを示すものである。第２図は性腺刺激ホル
モンの投与量をラット卵巣の総蛋白量及びEDF結合蛋白
量の関係を示すグラフである。第３図はラット卵巣より
抽出されたEDF結合蛋白質を未還元下及び還元下で電気
泳動して作られた泳動パターンであり、第４図はその各
パターンのEDF結合蛋白質の活性分布を示すグラフであ
る。第５図は未還元下での泳動各パターンの活性をリガ
ンドブロット法で確認した結果を示すパターンである。 第６図はEDFのFSH分泌促進作用に対するEDF結合蛋白の
中和作用を示すグラフである。 第７図はEDFの卵巣顆粒膜細胞上のLH受容体発現促進作
用に対するEDF結合蛋白質の中和作用を示すグラフであ
る。 第８図はEDFのフレンド細胞分化誘導作用に対するEDF結
合蛋白質の中和作用を示すグラフである。 第９図はEDFの造血作用に対するEDF結合蛋白質の中和作
用を示すグラフである。
合蛋白質を未還元下及び還元下で電気泳動して得られた
泳動パターンを示すものである。第２図は性腺刺激ホル
モンの投与量をラット卵巣の総蛋白量及びEDF結合蛋白
量の関係を示すグラフである。第３図はラット卵巣より
抽出されたEDF結合蛋白質を未還元下及び還元下で電気
泳動して作られた泳動パターンであり、第４図はその各
パターンのEDF結合蛋白質の活性分布を示すグラフであ
る。第５図は未還元下での泳動各パターンの活性をリガ
ンドブロット法で確認した結果を示すパターンである。 第６図はEDFのFSH分泌促進作用に対するEDF結合蛋白の
中和作用を示すグラフである。 第７図はEDFの卵巣顆粒膜細胞上のLH受容体発現促進作
用に対するEDF結合蛋白質の中和作用を示すグラフであ
る。 第８図はEDFのフレンド細胞分化誘導作用に対するEDF結
合蛋白質の中和作用を示すグラフである。 第９図はEDFの造血作用に対するEDF結合蛋白質の中和作
用を示すグラフである。
フロントページの続き (72)発明者 江藤 譲 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１番１号 味の素株式会社中央研究所内 (72)発明者 柴井 博四郎 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１番１号 味の素株式会社中央研究所内 (56)参考文献 国際公開89／1945（ＷＯ，Ａ１) ＥＳＣＨ Ｆ．Ｓ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄ ｏｃｒｉｎｏｌ（1987）Ｖｏｌ．１，Ｎ ｏ．11，ｐ．849−855 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/47 G01N 33/50 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (9)
- 【請求項１】下記の理化学的性質を有するEDFとの結合
能を有する蛋白質 ペプチド鎖のアミノ酸残基数が303又は304であり、
下記のアミノ酸配列からなり、または下記のアミノ酸配
列において１ないし数個のアミノ酸残基が欠失・置換も
しくは付加されている。 分子量:30kd〜40kd（SDS−PAGE、未還元条件下） - 【請求項２】ブタ由来であり、ペプチド鎖のアミノ酸配
列が請求項（１）に記載されたものと同一である請求項
（１）に記載された蛋白質 - 【請求項３】ブタ由来であり、ペプチド鎖のアミノ酸配
列がＣ末端のアスパラギン酸残基が欠落しているほかは
請求項（１）に記載されたものと同一である請求項
（１）に記載された蛋白質 - 【請求項４】ラット由来であり、ペプチド鎖のアミノ酸
配列が下記のものである請求項（１）に記載された蛋白
質 - 【請求項５】ラット由来であり、ペプチド鎖のアミノ酸
配列がＣ末端のアスパラギン酸残基が欠落しているほか
は請求項（４）に記載されたものと同一である請求項
（１）に記載された蛋白質 - 【請求項６】ヒト由来であり、ペプチド鎖のアミノ酸配
列が下記のものである請求項（１）に記載された蛋白質 - 【請求項７】ヒト由来であり、ペプチド鎖のアミノ酸配
列がＣ末端のアスパラギン酸残基が欠落しているほかは
請求項（６）に記載されたものと同一である請求項
（１）に記載された蛋白質 - 【請求項８】請求項（１）、（２）、（３）、（４）、
（５）、（６）又は（７）に記載の蛋白質を含有するこ
とを特徴とするEDF検査薬 - 【請求項９】請求項（１）、（２）、（３）、（４）、
（５）、（６）又は（７）に記載の蛋白質を用いること
を特徴とするEDFの精製法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2194085A JP3023693B2 (ja) | 1989-08-24 | 1990-07-24 | Ｅｄｆ結合蛋白質 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1-216014 | 1989-08-24 | ||
| JP21601489 | 1989-08-24 | ||
| JP2194085A JP3023693B2 (ja) | 1989-08-24 | 1990-07-24 | Ｅｄｆ結合蛋白質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03255098A JPH03255098A (ja) | 1991-11-13 |
| JP3023693B2 true JP3023693B2 (ja) | 2000-03-21 |
Family
ID=26508295
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2194085A Expired - Fee Related JP3023693B2 (ja) | 1989-08-24 | 1990-07-24 | Ｅｄｆ結合蛋白質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3023693B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101758806B1 (ko) * | 2016-03-11 | 2017-07-18 | 주식회사수산중공업 | 유압 브레이커 |
-
1990
- 1990-07-24 JP JP2194085A patent/JP3023693B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＥＳＣＨ Ｆ．Ｓ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９８７）Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．１１，ｐ．８４９−８５５ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101758806B1 (ko) * | 2016-03-11 | 2017-07-18 | 주식회사수산중공업 | 유압 브레이커 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03255098A (ja) | 1991-11-13 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |