CZ292689B6 - Rekombinantní lektin z jmelí - Google Patents

Abstract

Řešení se týká molekul nukleové kyseliny kódující preproteiny, které po dozrání vykazují biologickou aktivitu dimerů lektinu z jmelí, vektorů, které tyto molekuly nukleové kyseliny obsahují, hostitelů těmito vektory transformovaných a polypeptidů, případně dimerů polypeptidů, které jsou těmito molekulami nukleové kyseliny kódované. Polypeptidy podle řešení jsou terapeuticky všestranně použitelné. Dále se týká imunotoxinů jakož i léků, které obsahují polypeptidy případně dimery polypeptidů, jakož i diagnostických souprav, které obsahují molekuly nukleové kyseliny, polypeptidy, případně dimery polypeptidů podle řešení anebo priméry, které specificky hybridizují s molekulou nukleové kyseliny. Konečně se též týká prostředků na ochranu rostlin, které obsahují polypeptidy případně dimery uvedených polypeptidů.ŕ

Description

Vynález se týká molekul nukleové kyseliny kódující preproteiny, které po dozrání vykazují biologickou aktivitu dimerů lektinu z jmelí, vektorů, které tyto molekuly nukleové kyseliny obsahují, hostitelů těmito vektory transformovaných a polypeptidů, případně dimerů polypeptidů, které jsou těmito molekulami nukleové kyseliny kódované. Polypeptidy podle vynálezu jsou terapeuticky všestranně použitelné. Tím se vynález dále týká imunotoxinů jakož i léků, které obsahují polypeptidy případně dimery polypeptidů podle vynálezu. Dále se vynález týká diagnostických souprav, které obsahují molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu, polypeptidy případně dimery polypeptidů podle vynálezu anebo priméry, které specificky hybridizují s molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu. Konečně se vynález týká prostředků na ochranu rostlin, které obsahují polypeptidy případně dimery polypeptidů·podle vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Extrakty z jmelí se terapeuticky používaly po staletí. Od počátku tohoto století se používaly preparáty z jmelí k terapii rakoviny s různým úspěchem (Bocci, 1993; Gabius aj., 1993; Gabius a Gabius., 1994; Ganguly aDas, 1994). Hajto aj. (1989, 1990) mohli ukázat, že terapeutické účinky jsou zprostředkovány zvláště tak zvanými lektiny z jmelí (viscuminy, Viscum album Agglutinine. VAA). Dnes se diskutuje vedle cytostatického účinku zvláště (nespecifické) imunostimulace, jejíž positivní účinek se využívá k podpůrné terapii a následné péči o rakovinové pacienty. Zvýšení kvality života takových pacientů je možná působeno uvolňováním tělu vlastních endorfinů (Heiny a Beuth, 1994).

Četaé studie in vitro (Hajto aj., 1990; Mánnel aj., 1991; Beuth aj. 1993) a in vivo (Hajto, 1986; Hajto aj., 1989; Mannel aj., 1991; Beuth aj., 1991; Beuth aj., 1992), jakož i klinické studie (Beuth aj., 1992) dokládají zvýšené uvolňování zánětových cytokinů (TNF-a. IL-1, IL-6), jakož i aktivaci buněčných složek imunitní soustavy (TH-buňky. TK- buňky).

Jako aktivní složka extraktů zjmelí se dnes považuje 60kDA lektinový protein (ML) zjmelí, kteiý lze získat z extraktů bichemickou cestou (Franz aj., 1977, Gabius aj., 1992). ML-protein se skládá ze dvou podjednotek spojených kovalentně S-S mostem, jejichž A-řetězec vyvolává enzymatickou deaktivaci ribosomů (Endo aj., 1988) a jejichž B- řetězec vyvolává uhlovodíkovou vazbu. Biologická aktivita je podle dosavadního stavu znalostí odvozena hlavně od lektinové aktivity B-řetězce (Hajto aj., 1990).

Znalost závislostí mezi strukturou a účinkem lektinů zjmelí (ML) je však dosud nepatrná. Tak je nejasný přínos jednotlivých řetězců a jejich rozdílné bichemické a enzymatické účinky, případně terapeutické účinky. Analýza závislostí mezi strukturou a účinkem je ztížena znečištěním preparátů jinými látkami obsaženými v jmelí (Stein aBerg, 1994). Diskutuje se závislost aktivity extrakčních preparátů na různém složení preparátů (Hiilsen áj., 1986), které opět závisí na hostitelských stromech (například jabloň, borovice, topol). Podobné účinky se postulují jak pro viskotoxiny (Garcia-OImedo aj., 1993; Mendez aj., 1990), tak pro další viscuminy (například ML-2, ML-3) (Eifler aj. 1994). Dokonce i ML preparáty vyčištěné bichemickou cestou na vysokou čistotu (afinitní chromatografie) vykazují významnou heterogenitu (obrázek 8). Tato heterogenita se vztahuje na bichemicky měřitelnou aktivitu řetězců, na účinky vyvolané in vitro a in vivo, jakož i na samotnou strukturu proteinů. Variace struktury se diskutuje jak pro A i Břetězce ML, tak pro variace v řetězcích. Gabius aj. (1992) aDietrich aj. (1992) ukazují variabilitu řetězců Al a A2 u ML-1.

-1 CZ 292689 B6

Aby se mohly terapeutické účinky lektinů z jmelí blíže studovat, je žádoucí jejich čistá příprava jako strukturně homogenní látky. Dále je pro odborný svět zajímavá možnost připravit lektin z jmelí nebo jeho součásti ve velkém množství v čisté formě, aby se mohl například nasadit jako účinná látka v léčivech. Tyto cíle nemohly být při současném stavu techniky dosaženy známými způsoby. Při izolaci z rostlinného materiálu se podle současného stavu techniky dostává heterogenní směs látek.

Heterogenita rostlinných preparátů lektinů z jmelí je působena mimo jiné potranslačním zpracováním ML-1 do izoforem ML-2 aML-3, takže preparáty lektinů z jmelí v závislosti na metodice izolace nebo době fermentace vykazují měnící se obsah ML-1, ML-2 aML-3 (Jaggy aj., 1995). Každá z uvedených izoforem mimo to vykazuje dále jdoucí mikroheterogenitu, která je ukázána na obrázku 8 na příkladu ML-1 izoelektrickou fokuzací chromatografu.

Podstata vynálezu

Úkolem vynálezu je tedy poskytnout lektin z jmelí v čisté formě v množství, které umožní zhodnocení ve velkém technickém měřítku. Úkol se řeší provedeními charakterizovanými v nárocích.

Tím se vynález se týká molekuly nukleové kyseliny, která (a) kóduje preprotein, který po dozrání vykazuje biologickou aktivitu dimerů lektinů z jmelí a který vykazuje na obrázku 4c ukázaný řetězec nukleotidů, (b) fragment preproteinu kódovaný podle (a), přičemž je fragment biologicky aktivní částí dimerů lektinů z jmelí, (c) se liší od molekuly nukleové kyseliny podle (a) nebo (b) degenerací genetického kódu molekuly nukleové kyseliny podle (a) nebo (b), nebo (d) za stringetních podmínek hybridizuje s molekulou nukleové kyseliny podle (a), (b) nebo (c) a kóduje polypeptid s v (a) nebo (b) udanou biologickou funkcí nebo aktivitou.

Expresí genového řetězce lektinů z jmelí se mohou po prvé získat, vycházeje z tohoto řetězce, rekombinantní vysoce čisté jednotlivé řetězce (rMLA, rMLB), které se mohou reasociovat in vitro a tak dát rML-holoprotein, protein, který je homogenní chemicky, enzymaticky a strukturně. Reasociovaný rekombinantní protein nevykazuje žádnou variabilitu a mikroheterogenitu, zejména vzhledem na primární strukturu a potranslační modifikace (glykosylace, fosforylace) a je zvlášť vhodný jako holoprotein, jako část řetězce a ve formě subfragmentu pro terapeutické použití.

Podle vynálezu se rozumí pod fragmentem preproteinu lektinů z jmelí každý fragment, tedy nejen přirozeně se vyskytující fragment, který je biologicky aktivní součástí dimerů lektinů z jmelí. Pro osvětlení se poukazuje na to, že odborník samozřejmě považuje za biologicky aktivní součásti dimerů lektinů z jmelí také takové součásti, které jsou součástí jednotlivých řetězců dimerů. Tím jsou předmětem vynálezu také jednotlivé řetězce a fragmenty, které jsou součástí na obrázku 4c zobrazeného řetězce.

Termín přirozeně ve spojení se součástí lektinů z jmelí znamená podle vynálezu, že takto označený fragment buď představuje řetězec dimerů lektinů ze jmelí, nebo je subfragmentem takového řetězce, který se přirozeně vyskytuje v řetězci. Tyto fragmenty jsou výhodně biologicky aktivní.

Pod biologicky aktivní se podle vynálezu rozumí, že tyto fragmenty vykazují alespoň jednu biologickou funkci řetězce nebo dimerů, jak je v této přihlášce popsaná nebo jinou biologickou funkci jednotlivého řetězce nebo dimerů. Mimo to se rozumí pod biologicky aktivní také farmakologická a imunologická aktivita.

-2CZ 292689 B6

Pomocí rekombinantního ML-proteinu je mimo to poprvé možný výzkum přínosu jednotlivých domén a subdomén. Rekombinantní ML-proteiny a rekombinantní podjednotky/části řetězce jsou základem odpovídajících definovaných preparátů sjednotlivými látkami jako náhrada extrakčních preparátů a standardizovaných extraktů.

Klonování genu kódujícího lektin z jmelí se mohlo překvapivě uskutečnit na bázi nové klonovací strategie poté, kdy selhaly konvenční klonovací strategie.

O lektinu z jmelí ML-1 je známa řada chemických proteinových údajů. Jsou to údaje o molekulové hmotnosti a struktuře podjednotek, zejména krátkých peptidů na N-konci, jejich sekvence aminokyselin byla nezávisle popsaná Dietrichem aj. (1992) aGabiusem aj. (1992) (viz také DE 4221836). Prakticky je nemožné připravit syntetické oligonukleotidy vycházeje zN-terminálních peptidů A- nebo B-řetězce na podkladě složení jejich aminokyselin astím spojeným stupněm degenerace, jejichž stupeň degenerace je dostatečně nízký, aby se došlo při skreeningu genomických knihoven genů k identifikace fragmentů ML-genů. To platí i pro cDNA-banky genů, které se připravily vycházeje z Viscum album poly-(A+) RNA.

Polymerázová řetězová reakce umožňuje amplifikaci úseků DNA, které leží mezi zmámými úseky (Erlich aj., 1988). Vycházeje ze stejnosmyslného oligonukleotidu od N-konce MLA a protismyslného oligonukleotidu od N-konce MLB by byla myslitelná amplifikace mezilehlého úseku genu za předpokladu volnosti intronu ML-genu (obrázek la). V praxi ukazuje analýza N-terminální sekvence B-řetězce, že stupeň degenerace myslitelné kombinace oligonukleotidů pro úspěšné provedení tohoto základu je příliš vysoký. To se zakládá zvláště na N-terminální sekvenci B-řetězce nepříznivé pro konstrukci oligonukleotidu, pročež amplifikace sekvence MLgenu vycházející ze známých úseků aminokyselin není praktikovatelná (obrázek lb).

Ke klonování ML-genu pomocí změněné PCR-strategie se proto zkoušelo nechat proudit ke konstrukci amplifikačního oligonukleotidu další proteinové údaje, zejména na základě příbuzenských vztahů lektinů z jmelí kribosomy dezaktivovaným proteinům typu 1 a typu 11 (RIPs) (Stirpe aj., 1992). Na základě četných seskupování (a) RIP proteinů typu 1 a A- řetězců ricinu, jakož (b) B- řetězců abrinu a ricinu se identifikovalo celkem 8 sekvencí konservativních oblastí. Vycházeje ze sekvencií těchto oblastí a při použití tabulek využití kodonů příbuzných druhů se konstruovalo celkem 21 oligonukleotidů a použily se v různých kombinacích kviče než 200 amplifikačním pokusům. V žádném případě však se nemohly získat specifické produkty, ačkoliv se měnily podmínky PCR, jako anelační teplota, obsah Mg²⁺, jakož i parametry cyklů v širokých mezích.

Jak skreening genomických acDNA-bank tak také použití PCR-technik tedy nedovolily na základě uvedených úvah dosažení specifických ML-DNA-řetězců.

Hledaly se tedy nové cesty, jak nechat proudit ke konstrukci amplifikačního oligonukleotidu další strukturní vlastnosti abrinu a ricinu.

Protože zde nebyl vyloučen enzymatický mechanismus ribosomy dezaktivovaných proteinů (RIPs), zde zejména RIP- ricinu typu Π, kterému se rovná ML (Endo aj., 1988a, 1988b), takže také strukturní souhlasy na hladině funkčních primárních a terciárních strukturních oblastí. Vycházeje z krystalické struktury ricinu (Katzin aj., 1991, Rutenber aRobertus, 1991, Weston aj., 1994) dala analýza flexibility řetězce v řetězci A-ricinu návod na malou mobilitu Arg 180, kteiý leží uvnitř konservované oblasti řetězce. Dále se provedla analýza na základě sterického uspořádání páteře řetězce možné substituce aminokyselin v této oblasti aktivního centra s ohledem na vzájemný vliv substrátu. Výsledky těchto úvah se nyní doplnily vyhodnocením porovnání řetězce A-ricinu a dalších RIPs typu 1.

S rozšířením výsledků porovnání sekvence o zavedení strukturních údajů se tak dostaly pravděpodobnostní údaje o zastoupení určitých aminokyselin v určitých polohách. Tím se umožnilo postulovat řadu teoretických ML- sekvencí aminokyselin pro tuto oblast a na jejich podkladě konstruovat odpovídající neobyčejně nepatrně degenerovaný oligonukleotid (RMLA2) (obrázek lc).

Nyní se mohly získat kombinací RMLA1 (degenerovaný oligonukleotid, který je odvozen z N-terminální sekvence aminokyselin, srovnej (obrázek lb)) a podle shora uvedených úvah konstruovaný oligonukleotid s aktivním místem RMLA2 při definovaných PCR-parametrech vycházeje z komplexních genomických ML-DNA fragmentů, potom kdy všechny k tomu vedoucí alternativní pokusy zůstaly bez výsledku, jak je popsané shora.

Doplnění sekvenční informace genu se nyní provedlo pomocí specifického nedegenerovaného oligonukleotidového priméru, odvozeného klonováním a sekvenováním fragmentu a (obrázek 3) dostupné genové části sekvence MLA a degenerovaných oligonukleotidů odvozených z RIP 1 aricin/arabin sekvenčních uspořádání, s pomocí dalších PCR-amplifikací. Ke konstrukci degenerovaného oligonukleotidu pro B-řetězec se použilo sekvenční uspořádání B-řetězců ricinu a abrinu, kde se rovněž našly některé vysoce konservované oblasti.

K expresi 5'- a 3-konců holoproteinu, se syntetizovaly další fragmenty B-řetězce, jakož i 5'- a 3'-netranslatované úseky začínajíc izolovanou cDNA získanou reversní transkripcí chmelové RNA a s pomocí techniky RACE (Frohman aj., 1988) na izolované RNA analogy cDNA z jmelí syntetizované reversní transkripcí. Když bylo k dispozici více vždy se překrývajících fragmentů genu (obrázek 3), potom se exprimovaly úplné genové úseky A-řetězců a B-řetězců, vždy vycházeje z úplné genomické DNA z jmelí, opět pomocí specifické PCR. Genové úseky rMLA a rMLB opatřené koncovými modifikacemi jsou ukázány na obrázcích 4a a 4b. Úplná genová sekvence ML zahrnující také netranslatované 5'- a 3'-oblasti a také genové úseky kódující endopeptidy a signální peptidy jsou ukázány na obrázku 4c.

V jedné výhodné formě provedení molekuly nukleové kyseliny dle vynálezu je fragment A-řetězce lektinu z jmelí, který je kódován sekvencí nukleotidů ukázanou na obrázku 4a (MLA).

V další výhodné formě provedení molekuly nukleové kyseliny dle vynálezu je fragment B-řetězce lektinu z jmelí, který je kódován sekvencí nukleotidů ukázanou na obrázku 4b (MLB).

Další výhodná forma provedení vynálezu se tyká molekuly nukleové kyseliny, kterou je molekula DNA.

Podle vynálezu se rozumí DNA molekulou jak genomická, tak také cDNA molekula nebo (polo)syntetická DNA molekula. Způsoby přípravy těchto různých DNA molekul jsou odborníkovi na základě poučení podle vynálezu známé.

V další výhodné formě provedení vynálezu je molekulou nukleové kyseliny molekula RNA.

Vynález se dále týká molekuly nukleové kyseliny, kterou je protismyslný řetězec k dříve popsané molekule nukleové kyseliny. Takový protismyslný řetězec se může nasadit například za účelem inhibice transkripce a tím pro studie exprese nebo regulace v rostlině.

Vynález se dále týká vektoru, který obsahuje alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny dle vynálezu.

Vektor dle vynálezu může například obsahovat jedinou molekulu nukleové kyseliny dle vynálezu, která kóduje celý preprotein lektinu z jmelí. Protože tento vektor je expresní vektor, může se preprotein zpracovat ve vhodně transformovaném hostiteli a monomemí jednotky se

-4CZ 292689 B6 mohou spojit na dimer lektinu z jmelí in vivo nebo in vitro. V jiné formě provedení je vektorem dle vynálezu vektor, který je používán jen k propagaci nukleové kyseliny dle vynálezu.

Ve výhodné formě provedení vynálezu obsahuje vektor dle vynálezu jak molekulu nukleové kyseliny, která odtud kóduje A-řetězec lektinu z jmelí nebo jeho fragment, tak molekulu nukleové kyseliny, která odtud kóduje B-řetězec lektinu z jmelí nebo jeho fragment. Výhodně jsou fragmenty monomeru biologicky aktivní.

V jiné výhodné formě provedení vynálezu je vektor dle vynálezu expresním vektorem. Odborníkovi je jasné, jak dá k dispozici vhodné expresní vektory pro různé hostitelské organismy.

Dle vynálezu by se při heterologní expresi exprimovala kódující sekvence A-řetězce lektinu z jmelí specifickou PCR vycházeje z úplné genomické DNA z jmelí. Přes nekomplementámí oblasti použitého oligonukleotidového priméru se při tom přidaly kontrolní prvky translace, jakož i rozlišovací sekvence restrikčních nukleáz, čímž se umožnilo klonování a oddělená exprese A-řetězce lektinu z jmelí vycházeje z genomicky přístupného genu prelektinu z jmelí.

5'-Oblast kódující rMLA sekvenci odpovídající aminokyselinovým zbytkům tyrosin-tyrosin¹⁷ (Dietrich aj., 1992, Gabius aj., 1992) se exprimovala za zapojení translačního startovacího kodonu jako syntetický fragment genu hybridizací a klonováním dvou oligonukleotidů. Tím se umožnila optimalizace sekvence genu s ohledem na výběr kodonu, jak je popsána pro silně exprimovaný gen vEscherichia coli (Gribskov aj., 1984). Na 3-konec syntetického fragmentu rMLA-genu a také na 5'-konec fragmentu genu rMLA exprimovaného pomocí PCR se zavedlo cílenou výměnou kodonu tyrosin¹⁷ z TAT na TAT SspI restrikční místo, které umožnilo fúzi obou fragmentů genu rMLA při exprimování vektoru pML4-17 (obrázek 5). Sekvence kódující rMLA se potvrdila sekvenováním DNA (obrázek 4a). K expresi rMLA v Escherichia coli se izolovala genová sekvence z vektoru pML4-17 a vložením do expresního vektoru pl7-7 (Studier a Moffart, 1986) pod kontrolu promotora T7-RNA polymerázy se začlenil transkripční terminátor. S vzniklým expresním vektorem pl7-MLA (obrázek 5) se transformoval expresní kmen BL21 Escherichia coli. Indukce genové exprese je charakterizována vystoupením proteinového pásu odpovídajícího neglykosylovanému rekombinantnímu A-řetězci lektinu z jmelí, který má relativní molekulovou hmotnost 25 kDa. Důkaz a identifikace rekombinantního produktu exprese se provedly Westem-Blot analýzou s použitím specifické anti-MLA-protilátky (obrázek 7).

K heterologní expresi B-řetězce lektinu z jmelí se amplifikovala úplná kódující sekvence MLB specifickou PCR vycházeje z úplné genomické DNA z jmelí. Při tom se zavedly přes nekomplementámí oblasti použitého oligonukleotidového priméru kontrolní prvky translace, jakož i sekvence rozeznávané restrikčními nukleázami (obrázek 6). Vzniklý 0,8 kDa produkt se zavedl po klonování v TA-klonovacím vektoru pCRH insercí do expresního vektoru pT7-7 pod kontrolu translačních kontrolních prvků a vzniklým expresním vektorem pT7-MLB se transformoval do expresního kmenu BL21 Escherichia coli.

Integrita kódující sekvence MLB se potvrdila sekvenováním DNA (obrázek 4b). Důkaz exprese se provedl Westernovou blotovou analýzou s použitím specifické anti-MLB-protilátky (TB33, Tonevitsky aj., 1995), přičemž 2 hodiny po indukci genové exprese se objevil imunoreaktivní protein s relativní molekulovou hmotností 31 kDa, odpovídající neglykosylovanému rekombinantnímu B-řetězci lektinu z jmelí (obrázek 7b). Analýza buňkové frakce po úplném rozkladu buněk Escherichia coli ukázala rozdělení syntetizovaného rMLB-řetězce mezi rozpustný podíl zbytku, a nerozpustné inklusní částice. 4 hodiny po indukci tvořil podíl v sedimentu rozkladu buněk Escherichia coli, a nerozpustný podíl 50 % celkového výtěžku (obr. 7b).

Dále se vynález týká hostitele, který je transformován alespoň jedním vektorem dle vynálezu.

-5CZ 292689 B6

Podle určení cíle odborníkem se může pomocí hostitele dle vynálezu připravit pouze jeden zobou monomerů nebo kombinace obou monomerů, svýhodou jako asociovaný dimer. Hostitelem dle vynálezu může být eurokaryontní nebo prokaryontní buňka, transgenní rostlina nebo transgenní zvíře.

Hostitelem dle vynálezu může být s výhodou savčí buňka, rostlinná buňka, bakterie, buňka houby, hmyzí buňka nebo transgenní rostlina.

Ve zvlášť výhodném provedení je hostitelem dle vynálezu bakterie Escherichia coli, buňka houby Aspergillus nebo hmyzí buňka Spodoptera, s výhodou buňka Spodoptera frugiperda.

Vynález se dále týká polypeptidu, který je kódován molekulou nukleové kyseliny dle vynálezu nebo vektorem dle vynálezu a neboje produkován hostitelem dle vynálezu.

Polypeptid dle vynálezu vykazuje s výhodou biologickou aktivitu A-řetězce nebo B-řetězce lektinu z jmelí. V jiných formách provedení však může polypeptid dle vynálezu vykazovat jen část biologické aktivity nebo dokonce žádnou biologickou aktivitu. Pod částí biologické aktivity se podle vynálezu rozumí buď zmenšená aktivita, anebo řada aktivit z biologického aktivitního spektra. Polypeptidem dle vynálezu také může být fragment A-řetězce nebo B-řetězce, který má shora uvedené vlastnosti.

Studium vlastností rMLA, rMLB a rML-holoproteinu (I) Relativní molekulová hmotnost a struktura

Relativní molekulové hmotnosti se stanovily elektroforézou na SDS-polyakryamidovém gelu za redukčních podmínek a následujícím barvením proteinů stříbrem, případně Coomasiovou briliantní modří, případně imunologickým barvením v rámci Westernové skvrnové analýzy.

Přitom se překvapivě zjistilo, že rekombinantní neglykosylovaný A-řetězec lektinu z jmelí má relativní molekulovou hmotnost 25 kDa a tím se významně liší od přírodních A- řetězců lektinu z jmelí A] s 31 kDa a A₂ s 29 kDa. Tento rozdíl v relativní molekulové hmotnosti je překvapující především proto, že ve stavu techniky se vycházelo z toho, že A-řetězec není glykosylovaný. Rekombinantní B-řetězec lektinu z jmelí má relativní molekulovou hmotnost 31 kDa a tím je významně lehčí než glykosylovaný přírodní B-řetězec lektinu z jmelí s 36 kDa (obrázek 7).

Heterogenita vyskytující se u přírodních ML-proteinů na základě glykosylace anebo variací řetězců, které se ukazují v SDS-gelu jako široké pásy, se v žádném případě neobjevuje u rekombinantních druhů.

Relativní molekulové hmotnosti rMLA/rMLB holoproteinů (rML) se sčítají na 56 kDa ve srovnání k těžkému nMl s 65-67 kDa.

(Π) Izoelektrická homogenita rMLA se ukazuje jako izoelektricky homogenní protein s izoelektrickým bodem 6, 8 na rozdíl k vysoce čistým přírodním A-řetězcům lektinu z jmelí, které se dělí na 4 typy s izoelektrickými body 5,2, 5,4,5,7 a 6,2 (obrázek 8).

rMLB se ukazuje jako izoelektricky homogenní protein s izoelektrickým bodem 5,1 na rozdíl k vysoce čistému přírodnímu B-řetězci lektinu z jmelí, který se dělí nejméně na 2 typy s izoelektrickými body 7,1 a 7,3 (obrázek 8).

-6CZ 292689 B6

Tím se ukazuje u přírodního ML-holoproteinu řada variací a kombinací molekul (obrázek 8 níže), zatím co u rekombinantních proteinů lektinu z jmelí se ukazuje jednotná mobilita při LEF chromatofokusaci, což dokumentuje homogenitu rML na rozdíl k mikroheterogenitě přírodních druhů proteinu.

(ΙΠ) Enzymatická aktivita rMLA

Použitím rMLA preparátů vyčištěných imunoafinitně ve spojeném testu transkripce/translace se dokázala aktivita rMLA inhibující translaci (izolovaný z rozpustného podílu zbytku) a rMLA (izolovaný z podílu nerozpustných inklusních částic).

rMLA vykazuje na rozdíl k přírodnímu B-řetězci lektinu z jmelí rozdílnou potlačovací charakteristiku s ohledem na závislost inhibice translace na dávce a také s ohledem na neinhibovatelnou zbytkovou translační aktivitu v použitém lysátu retikulocytů, viz obrázek 9. Enzymatická vlastnost, která představuje základ toxického účinku ML-holoproteinů, je u rekombinantních druhů významně snížena.

(IV) Uhlovodíky vázající aktivita rMLB rMLB-řetězce, které se připravily renaturací a reoxidací z primárních expresních produktů, a také rMLA/rMLB, rMLA/MLB a MLA/rMLB holoproteiny vykazují aktivitu vázání na uhlovodíky, která se dá dokázat testem spojení enzymu s lektinem (ELLA) vazbou na uhlovodíkovou matrici asialofetuinu nebo fetuinu. Uhlovodíkovou specifitu rekombinantního rMLB-řetězce lze určit a kvantifikovat v ELLA soustavě za kopetitivních podmínek pro galaktózu, β-laktózu, N-acetyl-galaktosamin (GalNac) a kyselinu sialinovou (kyselinu N-acetyl-neuraminovou, NANA). Kopetitivní ELLA při tom ukazuje překvapivě rozdílnou uhlovodíkovou specifitu pro nMLB a rMLB. Vazebná afinita se při tom popsala specifickými pro soustavu hodnotami IC50 pro poloviční maximální vytěsnění proteinů z imobilizovaného ligandu asialofetuinu galaktózou (IC50 nMLB: 4,5 mM, IC50 rMLB: vzhledem k malé reaktivitě nebyla stanovitelná), β-laktózou (IC50 nMLB: 4,9 mM, IC50 rMLB: > 70 mM), N-acetyl-galaktosaminem (IC50 nMLB: 20,7 mM, IC50 rMLB: 109 mM), nebo z imobilizovaného ligandu fetuinu kyselinou sialinovou (IC50 nMLB: 49,8 mM, IC50 rMLB: 47,1 mM).

Zatímco nMLB-řetězec lektinu popsaný jako specifický pro galaktózou je podle očekávání kompetitivní s galaktózou a β-laktózou, neukazuje rekombinantní rMLB-řetězec připravený v Escherichia coli žádnou reaktivitu s β-laktózou. Rekombinantní rMLB má místo toho zřetelnou afinitu k N-acetylgalaktosaminu a kyselině sialinové a tím ukazuje ve srovnání s rostlinnou nMLB překvapivě zřetelný posun uhlovodíkové specifity k lektinu specifickému kN-acetyl-galaktosaminu a kyselině sialinové. S ohledem na biologickou aktivitu rMLB a holoproteinů obsažených v rMLB se naskýtá možnost pro rozšířené či rozdílné spektrum pro ligandy, receptory nebo cílové buňky ve srovnání k přírodním proteinům lektinu z jmelí.

V jedné výhodné formě provedení polypeptid dle vynálezu obsahuje alespoň jednu chemickou nebo enzymatickou modifikaci.

Tato modifikace může také měnit danou biologickou aktivitu polypeptidu, snižovat ji nebo zvyšovat. Taková modifikace může například nastat po translaci a izolaci polypeptidu. Na druhé straně lze takové modifikace zavést při chemické nebo polosyntetické přípravě polypeptidu dle vynálezu. Tyto modifikace může zavést odborník způsobem osobě známým, aby změnil biologickou aktivitu, s výhodou ji zvýšil.

V další výhodné formě provedení je polypeptid dle vynálezu fuzní protein. Fúzní protein vykazuje výhodně shora definovanou biologickou aktivitu.

-7CZ 292689 B6

Také tato forma provedení polypeptidu dle vynálezu je výhodně zaměřena na to, aby změnila farmakologické vlastnosti polypeptidu lektinu z jmelí pro další cíle na úrovni buňky, s výhodou ji zlepšila.

Dále se vynález týká dimeru polypeptidu s biologickou aktivitou lektinu z jmelí, přičemž oba monomery jsou kódovány molekulami nukleové kyseliny dle vynálezu.

Pod biologickou aktivitou lektinu z jmelí se rozumí každá biologická aktivita ze spektra všech biologických aktivit lektinu z jmelí. Jednou takovou funkcí je například farmakologický účinek lektinu z jmelí.

V četných lidských a myších rakovinných buňkách rostlinný lektin-1 indukoval smrt buněk apoptickými mechanismy (Janssen aj., 1993). Lektin-1 zjmelí případně samotný B-řetězec indukovaly uvolnění cytokinů z periferních mononukleámích buněk zdravých lidských dárců krve (Hajto, 1990). Lektin-1 zjmelí indukoval vylučování superoxidovaných aniontů z neutrofilních granulocytů pacientů s rakovinou (Timoshenko, 1993). Lektin-1 zjmelí indukoval expresi A-řetězce receptorů interleukinu-2 (CD25) případně HLA- DQ-antigenu periferních lymfocytů zdravých lidských dárců krve (Beuth, 1992). Po aplikaci lektinu-1 zjmelí u myší se měřil přírůstek počtu buněk brzlíku, počtu cytotoxických T-lymfocytů (Lyt-2+) a pomocných T-buněk (L3T4+) v brzlíku a počtu peritoneálních makrofágů, zvláště těch, které nesou značku aktivace MAC-3 (Beuth, 1994). Také se zvýšil u pokusných zvířat poměr L3T4+/Lyt2+ v brzlíku.

V periferní krvi myší se zvýšila po ošetření lektinem-1 zjmelí hustota obecně leukocytů, lymfocytů, monocytů, a speciálně lymfocytů, které exprimují receptor interleukinu-2 jako markér aktivace (Beuth, 1994). V krvi pacientů s rakovinou zvýšil lektin-1 zjmelí hustotu T-lymfocytů (CD4+,CD8+), přirozených zabijáckých buněk a B-lymfocytů (Beuth, 1992).

Dále se dokázalo zvýšení endogenních opiátových mediátorů β-endorfínu v krevní plasmě u pacientek s rakovinou prsu po aplikaci lektinu-1 zjmelí (Heiny, 1994). Mimo to se dokázalo, že lektin-1 zjmelí zvyšuje cytotoxický účinek periferních přirozených zabijáckých buněk proti rakovinným buňkám K-562 a hustotu velkých granulámích lymfocytů (LGL) v periferní krvi (Hejto, 1989). Antimetastázovou aktivitu lektinu-1 zjmelí na myší buňky sarkomu doložil Beuth (1991).

V jiné formě provedení vykazuje dimer polypeptidu dle vynálezu stejné spektrum biologických aktivit jako přirozený lektin zjmelí.

(V) Biologická aktivita rekombinantního lektinu zjmelí

Exprese rML-holoproteinu za použití odděleně rekombinantně syntetizovaných jednotlivých řetězců se podařila ze složených rozpustných řetězců nebo z denaturovaných rMLA- a rMLBřetězců v rámci společného složení, přičemž se výhodně rMLB reasocioval in vitro s molámím přebytkem rMLA v přítomnosti glutathionového redox systému a částečně v přítomnosti proteindisulfídové izomerázy, rML- holoprotein odpovídající heterodimeru se izoloval a čistil za oddělení volných rMLA- a rMLB-dimerů afinitní chromatografii na N-acetyl-galaktosamin-agaróze a laktosyl-agaróze z reasociované předlohy. Analogickým způsobem se připravily rMLA/rMLB (rML) a rMLA/nMLB heterodimery-holodimery.

Cytotoxická aktivita

Cytotoxický účinek se testoval jako příklad biologické aktivity reasociovaných holoproteinů na lidské linii leukemických monocytů (MOLT4). Jak A-řetězec (povrchová vazba), tak také B-řetězec (enzymatická dezaktivace ribosomů) mají přínos k pozorovanému cytotoxickému

-8CZ 292689 B6 účinku, rMLA/rMLB holoprotein reasociovaný in vitro a také rMLA/nMLB holoprotein reasociovaný in vitro se srovnávaly se dvěma šaržemi přírodního nML-holoproteinu. Rekombinantní rMLA/rMLB a rMLA/nMLB holoproteiny ukazují srovnatelně vysoké cytotoxické vlastnosti s hodnotami IC50 okolo 10-30 pg/ml (obrázek 11), což dokumentuje funkční integritu a biologickou aktivitu in vitro reasociovaných holoproteinů za použití rekombinantních řetězců. K výkonu cytotoxické aktivity je při tom potřeba funkční spojení B-řetězce s enzymaticky aktivním A- řetězcem, protože izolovaný rMLB-řetězec překvapivě neukazoval žádnou cytotoxickou aktivitu. Dosud diskutovaná cytotoxická aktivita přírodního B-řetězce lektinu z jmelí by se měla přičíst zbytkovému obsahu nML-holoproteinu. S rekombinantní expresí jednotlivých řetězců se tedy po prvé naskytla možnost odděleného popsání a použití aktivity vázání na uhlovodíky a enzymatické aktivity lektinu z jmelí.

Indukce apoptosy

Pro monocytovou buněčnou linii U937 se dokázala schopnost indukce apoptosy rekombinantním rML-holoproteinem jako příklad biologické aktivity lektinu z jmelí. Ošetřením buněk 70 pg/ml se při tom mohla dokázat indukce apoptosy rML-holoproteinem po 24 hodinách (obrázek 12). Při pokusech s lektinem z jmelí na buňky MOLT-4 a mononukleámí buňky se mohlo ukázat, že v oblasti nízkých dávek je základem cytotoxické aktivity lektinu z jmelí indukce apoptosních pochodů. Protože v koncentrační oblasti nízké cytotoxicity dochází k indukci cytokinů (obrázek 13, obrázek 14) je jasná korelace s aktivitou indukující apoptosu. Naproti tomu je v oblasti vysokých dávek a také při delší době inkubace apoptosa překryta nekrotickými účinky. Cytotoxicita jako následek apoptosy nemohla být při ošetření citlivých buněk MOLT-4 rekombinantním B-řetězcem zjištěna, takže biologická aktivita indukce apoptosy v oblasti nízkých dávek mohla být odvozenajen od účinků holoproteinů.

Aktivita stimulující imunitu

Účinky stimulující imunitu jako biologické aktivity rekombinantního holoproteinů lektinu z jmelí se ukázaly na příkladu indukce uvolnění nekrotického tumorového faktoru α (TNF-α) a interferonu-γ (EFN-γ) z lidských mononukleámích buněk zdravých dárců krve (PBMC-model) a také na příkladu indukce uvolnění interleukinu-ΐα (IL-la) a interleukinu-6 (IL-6) v společné kultuře lidských primárních keratinocytů a kožních fibroblast; (model kůže²- ZK.1200). Tak se ukázalo vPBMC-modelu na dávce závislé uvolnění TNF-a aIFN-γ po 3-48 ng/ml kombinantního rML-holoproteinu, v modelu kůže²- ZK1200 na dávce závislé uvolnění IL-la a IL-6 po 0,25-8 ng/ml kombinantního rML-holoproteinu.

Všechny jmenované cytokiny jsou relevantní stimulující mediátory lidské imunitní soustavy, kterým náleží centrální funkce především při aktivaci buněčné imunitní odpovědi.

Na rozdíl od dosavadního stavu znalostí, podle kterého je aktivita stimulující imunitu odvozena hlavně od lektinové aktivity B-řetězce (Hajto aj., 1990), nemohlo se indukovat samotným rekombinantním rMLB-řetězcem žádné shora uvedené uvolňování cytokinů. Stimulující aktivita se mohla dosáhnout v oblasti nízkých dávek pouze funkčně spojeným rML-holoproteinem. Tento překvapivý výsledek dovoluje závěr, že preparáty přírodního nMLB-řetězce stimulující imunitu obsahovaly ještě stopy nML-holoproteinu a stimulující účinek přičítaný nMLB-řetězci se musí přičíst zbytkovému obsahu nML. Zatím co dosud popsaný způsob preparace nMLB tedy neumožňuje kvantitativní oddělení holoproteinů, při rekombinantní expresi jednotlivých řetězců lektinu z jmelí se po prvé naskytla možnost studia a přípravy homogenních preparátů B-řetězce lektinu z jmelí. To po prvé dovoluje oddělené popsání a použití biologické aktivity A- aBřetězců a také rozlišení biologické aktivity jednotlivých řetězců a funkčně spojeného holoproteinů.

-9CZ 292689 B6 (V) Biologická aktivita rekombinantního B-řetězce lektinu z jmelí (rMLB)

Jako markér aktivace imunokompetentních buněk se studovala indukce proteinu CD69 na povrchu buněk. CD69 se objevuje jako jeden z prvých antigenů na povrchu buněk po aktivaci Tbuněk, B-buněk a zejména přirozených zabijáckých buněk (přirozené zabijácké buňky NK-buňky). CD69 při tom představuje markér aktivace shora uvedených imunokompetentních populací buněk, protože protein na povrchu buněk se neexprimuje na klidových lymfocytech. Mimo to se dokázala pro indukovatelný protein na povrchu buněk CD69 podpůrná funkce pro cytotoxickou aktivitu NK-buněk a TcRy/δ T-buněk (Moretta aj., 1991). Průtokovou cytometrií se mohla za použití anti-CD69-mAk zjistit v koncentrační oblasti 1-100 ng/ml aktivace mononukleárních buněk, jak s ohledem na objevení se CD69 na povrchu buněk, tak s ohledem na podíl CD69 positivních buněk. Při tom se ukázala zvonovitá křivka závislosti na dávce což ukazuje na nutnost sesíťování buněčných receptorů přes obě vazná místa pro ligandy rMLBřetězce. Cytotoxický účinek na zde studované PBMC se také nemohl dokázat při nejvyšší koncentraci 100 ng/ml rMLB.

Ve výhodné formě provedení se ukazuje dimer polypeptidů dle vynálezu jako alespoň na jednom z monomerů chemicky nebo enzymaticky modifikovaný polypeptid dle vynálezu nebo fúzní protein dle vynálezu.

Modifikacemi se mohou optimalizovat na silný účinek, také se mohou vypnutím jednotlivých kvalit účinku (například vazebná místa pro uhlovodíky B-řetězce či aktivita glykosidázová A-řetězce), které by rozšířily terapeutické možnosti použití při vyloučení případných vedlejších účinků. Polypeptidy se změněnými vlastnostmi by mohly sloužit také jako nástroje k objasnění mechanismu účinků. Pro určené terapie může být nutné zmenšit antigennost a imunogennost polypeptidů a nebo optimalizovat jejich farmakokinetické vlastnosti, což by bylo možné cílenou výměnou jednotlivých aminokyselin.

Mimo to se vynález týká protilátky nebo jejího fragmentu či derivátu, které specificky vážou polypeptid nebo dimer polypeptidů dle vynálezu. Tak nepoznávají přirozený lektin z jmelí nebo jeho jednotlivé řetězce. Výhodně protilátky dle vynálezu se vážou na epitopy, které se maskují glykosylací přírodního lektinu z jmelí. Protilátkami mohou být monoklonální, polyklonální nebo (polo)syntetické protilátky. Fragmenty mohou být například Fab-, F(ab)2- nebo Fv-fragmenty. Takové deriváty protilátek jsou podle stavu znalostí známé.

Vynález se dále týká způsobu přípravy polypeptidů nebo dimeru polypeptidů dle vynálezu, při kterém se pěstuje hostitel dle vynálezu za vhodných podmínek a tak získaný polypeptid nebo dimer polypeptidů se izoluje.

Odborníkovi jsou známé vhodné podmínky pro pěstování a izolaci hostitele. Tak se může například polypeptid nebo dimer polypeptidů dle vynálezu dostat z hostitele pomocí vhodné expresní soustavy a sbírat v médiu. Jindy mohou polypeptidy nebo dimery polypeptidů zůstat v buňce a izolovat se z ní. Nyní se představí další výhodná forma provedení vynálezu:

K izolaci rMLA šla celá sklizeň buněk Escherichia coli transformovaných vhodným expresním vektorem a rozpustné a nerozpustné části buněk se oddělí centrifugací. Analýza frakcí buněk ukázala, že rekombinantní A-řetězec lektinu z jmelí se akumuluje v závislosti na podmínkách exprese a době exprese na 5-50 % v rozpustné formě a na 50 až 95 % v nerozpustných proteinových agregátech inklusních částic.

Výskyt rozpustných a nerozpustných proteinů dává nejméně dva způsoby izolace rMLA. rMLA agregovaná na inklusní částice se rozpustila po promytí usazeniny pro odstranění proteinů

Escherichia coli (Babbitt aj., 1990) za denaturačních podmínek a90-násobným zředěním a znovu se složila v skládacím ústrojí (50 mM Tris-HCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 8,0).

Při této proceduře vznikly jednak rozpustné složené druhy proteinů, které jsou zcela enzymaticky aktivní jako renaturované, původně nerozpustné denaturované druhy rMLA, jak obrázek 9 ukazuje. Izolace renaturované rMLA a také izolace rozpustné rMLA se může provést imunoafmitní chromatografií s použitím specifické anti-MLA-protilátky TA5 (Tonevitsky aj., 1995).

S výskytem rMLB v rozpustné formě a také formě nerozpustných inklusních částic se dávají nejméně dva způsoby pro izolaci rMLB z rekombinantního B-řetězce lektinu z jmelí.

Pro izolaci rMLB z rozpustného B-řetězce ze silně redukčního prostředí cytoplasmy Escherichia coli, které vede ku vzniku intrachenámích disulfidových můstků se použila inkubace v přítomnosti redox-soustavy z redukovaného a oxidovaného glutathionu a také na stabilizaci aktivních produktů složení ligandů β-laktózy. Z násady pro složení se selektivně izoloval, případně čistil, vjednostupňovém způsobu aktivní rMLB-řetězec vázající uhlovodíky prostřednictvím afinitní chromatografií na laktosyl-agaróze nebo na N-acetyl-galaktosamin-agaróze.

K izolaci rMLB z nerozpustného, jako inklusní částice dostupného podílu expresního produktu se promyla usazenina celé sklizně buněk Escherichia coli pro odstranění proteinů (Babbitt aj., 1990) a rozpustila se za denaturačních a redukčních podmínek. Renaturace se dosáhla zředěním v přítomnosti redoxsoustavy z redukovaného a oxidovaného glutathionu a také ligandů β-laktózy, přičemž se zrenaturační násady selektivně izoloval, případně čistil, aktivní rMLB-řetězec vázající uhlovodíky afinitní chromatografií na N-acetylgalaktosaminagaróze nebo na laktosylagaróze.

Vynález se dále týká léku, který obsahuje polypeptid dle vynálezu, nebo dimeru polypeptidu dle vynálezu a nebo níže popsaného imunotoxinu případně s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Polypeptidy dle vynálezu, jejich asociáty nebo modifikace jsou vhodné pro všestranné použití při terapii rakoviny a infekcí s farmakologickými vlastnostmi odpovídajícímu přírodnímu lektinu z jmelí. Imunitu stimulující vlastnosti se mohou využít pro terapii tumorů, přičemž se přímou nebo nepřímou stimulací uschopní imunitní obrana vlastní tělu, aby účinněji bojovala s tumorem či eventuálními metastázami. Totéž platí i pro infekce, zejména virová onemocnění. Polypeptidy dle vynálezu se mohou podávat také podávat v kombinaci s jinými imunostimulanty, například interferony, cytokinovými kolonie stimulujícími faktory, aby se docílily synergické účinky případně se snížila dávka kombinačního partnera a tím se snížily vedlejší účinky.

V kombinaci s cytostatiky nebo ozařováním se dá zmírnit nebo zmenšit vedlejší účinek leukopenie/potlačení myela, takže se redukuje oslabení imunitní soustavy vyvolané těmito nyní obvyklými způsoby léčení.

Přímý cytotoxický účinek polypeptidu s glykosidázovou aktivitou vede k apoptose buněk tumorů a může se využít pro terapii. Tento princip se může využít specifičtěji při použití imunotoxinů, když se polypeptidy dle vynálezu vážou na vhodné protilátky. Tím se vynález dále týká imunotoxinů, které obsahují alespoň jeden polypeptid případně dimer polypeptidů podle vynálezu. Příkladně může jít o spojení aktivního A-řetězce nebo holoproteinu s protilátkou nebo její fragmentem způsoby proteinové chemie. Takové způsoby spojení jsou odborníkovi známé a odpovídající konjugáty jsou všestranně použitelné (Vitetta, 1993). Alternativně se mohou exprimovat také odpovídajícím způsobem konstruované konstrukty fuzních proteinů, které obsahují domény vázající antigen například z protilátek a mimo to cytotoxické fragmenty polypeptidu dle vynálezu.

- 11 CZ 292689 B6

Mimo to se může zabránit tvorbě metastáz, když se inhibuje vazba buněk tumorů na jiné buňky. Přes kompetitivní vazbu lektinu se může pomocí polypeptidů dle vynálezu zabránit této vazbě.

Vynález se dále týká priméru anebo páru primérů, které specificky hybridizují s molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu, případně k tomu hybridizují s komplementárním řetězcem.

Mimo to se vynález týká diagnostických souprav, které obsahují alespoň:

a) molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu,

b) primér anebo pár primérů, které specificky hybridizují s molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu, případně k tomu hybridizují s komplementárním řetězcem a nebo

c) polypeptid a nebo dimer polypeptidů podle vynálezu.

Diagnostická souprava podle vynálezu se může ve formě provedení, která obsahuje primér anebo pár primérů použít k tomu, aby se vyšetřily organismy na existenci genu lektinu a tak příkladně se našly nové geny lektinu, které by kódovaly farmakologicky zajímavé lektiny. Také molekula nukleové kyseliny podle vynálezu obsažená v diagnostické soupravě podle vynálezu se může použít, například v Southem-Blot analýze nebo Northem-Blot analýze, k tomu, aby se skrínovaly organismy na existenci odpovídajícího genu lektinu. Variací hybridizace se mohou mimo to vyhledávat příbuzné geny lektinu. Polypeptid a dimer polypeptidů se může použít například, k tomu, aby se generovaly protilátky nebo antiséra, se kterými by se mohly stanovit například o sobě známým způsobem odpovídající lektiny (z jmelí) v různých organismech.

Konečně se vynález týká prostředků na ochranu rostlin, které obsahují polypeptid případně dimer polypeptidů podle vynálezu. Polypeptidy dle vynálezu, jejich asociáty nebo modifikace se mohou použít v rámci ochrany rostlin odpovídajícím způsobem k funkci diskutované pro rostlinný lektin z jmelí. Při tom se funkce lektinu z jmelí diskutuje jak na podkladě vlastností toxinu jako volná ochrana rostliny, tak na podkladě vlastností, které působí na permeabilitu a konstituci.

Přehled obrázků na výkresech

Na výkresech značí: obr. 1 konstrukci primárního amplifikačního oligonukleotidů, obr. 2 primární ML-amplifikační produkt z Viscum album, obr. 3 klonovací strategii k expresi ML-genu, obr. 4 inserty v expresních vektorech pro rMLA a rMLB a úplná ML-genová sekvence, obr. 5 konstrukci expresního vektoru pro rMLA, obr. 6 konstrukci expresního vektoru pro rMLB, obr. 7 expresi rMLA a rMLB a imunologickou detekci, obr. 8 chromatografickou fokusaci rMLA a rMLB proti přírodní ML, obr. 9 enzymatickou aktivitu rMLA (RIP), obr. 10 uhlovodíkovou charakteristiku rMLB, obr. 11 MOLT4 cytotoxicita rML, obr. 12 indukci apoptosy pomocí rML, obr. 13 imunitu stimulující účinek rekombinantního lektinu z jmelí v PBMC-modelu, obr. 14 imunitu stimulující účinek rekombinantního lektinu z jmelí v modelu kůže²- ZK1200, obr. 15 indukci markru CD69 na povrchu buněk v PBMC- modelu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Konstrukce primárního amplifikačního oligonukleotidů

Lektin z jmelí (ML) patří k třídě ribosomy dezaktivovaných proteinů (Stirpe aj., 1992), které představují v rostlinách různého taxonomického původu široce rozšířenou rodinu proteinů. Ml

- 12CZ 292689 B6 byl na základě aktivit podjednotek přiřazen ribosomy dezaktivovaným proteinům typu Π (Endo aj., 1988a).

K určení sekvence genů je však dostupná knihovna cDNA z Viscum album a genomických bank genů nevhodná. Tak bylo nemožné určit specifické klony pro ML z Viscum album poly-(A+) RNA přes použití různých DNA sond. S domněnkou, že sekvence genů neobsahuje žádné introny, použila se PCR-strategie. Protože byla známá sekvence N-terminálních aminokyselin MLA- a také MLB-řetězce (Dietrich aj., 1992, Gabius aj., 1992), zdála se možná amplifíkace kódující oblasti MLA při použití degenerovaného amplifikačního oligonukleotidu (obr. la). Ačkoliv se použitelný oligonukleotid s malým stupněm degenerace dá odvodit z N-konce MLAřetězce (rMLAl, obr. lb), je nemožné konstruovat odpovídající oligonukleotidy s dostatečnou specifitou zN-konce MLB-řetězce (rMLBl, rMLB2, rMLB3, obr. lb).

Musely se tedy vyvinout alternativní strategie, které umožnily při zvážení proteinových údajů příbuzných proteinů odvození amplifikačního oligonukleotidu z ještě neznámých oblastí ML-řetězce. Tak ukázala analýza řetězce aminokyselin ribosomy dezaktivovaných proteinů typu I a typu Π řadu četných shod v konservativních oblastech s vysokým stupněm homologie. Obr. lc ukazuje vysoký stupeň příbuznosti typu I a typu Π RIP na příkladě aktivního centra ricinu. Uvnitř motivu řetězce MISEAARF se pro El77 a R180 diskutovala účast na enzymatickém mechanismu (Kim aj., 1992, Lord aj., 1994). Z toho se usoudilo, že by mohly být přítomné aspoň tyto oba zbytky ML-řetězce. Z dalších strukturních úvah ohledně přítomnosti jednotlivých zbytků, přičemž se bral ohled zvláště na zbytky s nízkým stupněm degenerace použitých kodonů, vznikla konstrukce amplifikačního oligonukleotidu RMLA2. Sekvenci tohoto oligonukleotidu ukazuje obr. lc.

Příklad 2

Exprese specifických DNA fragmentů ML-genu

Vysokomolekulámí genomická DNA se izolovala z čerstvých listů Viscum album (hostitelský strom Populus wilsoniť) způsobem podle Baura aj. (1993). K expresi specifických DNA fragmentů ML-genu prostřednictvím PCR se použilo 100 ng genomické DNA na amplifikační násadu. Amplifíkace se provedla v celkovém objemu 50 μΐ, obsahujícím PCR-ústoj (10 mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl², 50 mM KC1, 1,25 mM dNTP, pH 8,3), 78 pmol priméru RMLAl a 50pmol (templát 1) nebo 100 pmol (templát 2) RMLA2. PCR se uskutečnila sTaqDNApolymerázou (l,5E/násadu) od Boehringer Mannheim s termocyklovačem Biometra. Parametry PCR byly: 1 minuta denaturace 90 °C, 1 minuta anelace 50 °C, 1 minuta prodlužování 72 °C při celkem 30 cyklech. Produkty amplifíkace se analyzovaly elektroforézou na 5 % polyakryamidovém gelu a barvením ethidium bromidem (obr. 2). V templátě 2 obsažený specifický produkt amplifíkace s velikostí asi 500 bp se izoloval gelovou eluci a použil se pro klonování v TAvektorech.

Příklad 3

Klonovací strategie

Odvození amplifikačního oligonukleotidu použitého k primární PCR je ukázáno v příkladě 1 (obr. la), exprese primárního fragmentu ML-genu Viscum album, dále označeného jako a je ukázáno v příkladě 2 (obr. 2). Vycházeje z řetězce a a za předpokladu, že ML-gen neobsahuje žádné introny bylo nyní možné odvodit 5'-oligonukleotidy specifické pro sekvenci, se kterými se umožnila amplifíkace fragmentů b, c, d a e. Zatím co 3'-oligonukleotid pro c se rovněž

-13 CZ 292689 B6 odvodil zDNA-řetězce a, musela konstrukce degenerovaného 3'-priméru vést k amplifikací fragmentů genu b, d, e a g analýzou homologních oblastí typu I (b) a typu Π (d, e a g) proteinů RIP. Při tom se zase z porovnání sekvencí uvnitř rodin proteinů usoudilo na výskyt jednotlivých zbytků, přičemž se bral ohled zvláště na zbytky s malým stupněm degradace použití kodonu. Zejména se použily známé cDNA ricinu a abrinu a odvozené proteinové sekvence ke konstrukci asi 50 specifických kombinací oligonukleotidů. Na obrázku 3 jsou ukázány jen ty fragmenty genu, které byly klonovatelné jako specifické amplifikační produkty a mohly se přivést k další analýze. Vycházeje z jiných kombinací oligonukleotidů nemohly se generovat žádné další ML-specifické amplifikační produkty.

Exprese fragmentu genu f (kódující MLA-řetězce) a g (kódující MLB-řetězce) je podrobně popsaná v příkladě 5 a v příkladě 6.

K analýze 5'- a 3'-konců translatovaných a netranslatovaných sekvenčních oblastí ML-genu se vytvořily podmínky k 5'- a 3-RACE (Frohman aj., 1988), které vedly k fragmentům h, i a j. Amplifikace fragmentu j sRACE PCR je tak alternativou k expresi úplných fragmentů genu MLB. Reakce RACE se prováděly s použitím cDNA, která se připravila reversní transkripcí izolované celkové RNA z Viscum album listů jmelí (hostitelský strom Populus wilsonii).

Příklad 4

Sekvence DNA a produkty translace rMLA a rMLB

Inserty expresních vektorů pT7-MLA apT7-MLB se sekvenovaly standardním postupem strategií kráčení priméru (vyšetření zcela se překrývajících sekvencí obou řetězců) s použitím různých ML-specifických oligonukleotidů (obr. 4a, 4b). Podtržené oblasti sekvencí označují restrikční místa ke klonování expresních vektorů pT7. Oba fragmenty genu se modifikovaly podle konstrukčního schématu pro expresní vektory popsanému v příkladě 5 a v příkladě 6.

Obr. 4c ukazuje úplnou genovou sekvenci odvozenou z označených fragmentů genu. Obsahuje jak 5'- a 3'-netranslatované úseky tak genové úseky kódující endopeptidy a signální peptidy.

Příklad 5

Konstrukce expresního vektoru pT7-MLA

K heterologní expresi se exprimovala kódující sekvence A-řetězce lektinu z jmelí specifickou PCR vycházeje z úplné genomické DNA z jmelí a koncově se modifikovala. Přes nekomplementámí oblasti použitého oligonukleotidového priméru se přitom přidaly kontrolní prvky translace, jakož i rozlišovací sekvence restrikčních nukleáz, čímž se umožnilo klonování a oddělená exprese A-řetězce lektinu z jmelí vycházeje z genomicky přístupného genu prelektinu z jmelí.

Obr. 5 ukazuje expresi MLA-kódujících fragmentů genu pomocí PCR. K amplifikací MLAkódující sekvence genu se použilo 200 ng genomické DNA z Viscum album, 1,5 mM (tepmlát 1) nebo 2,5 mM (templát 2) chloridu hořečnatého, po 40 pmol obou oligonukleotidových primérů RLM16 aRLM17 vPCR-ústoji (10 mM Tris-HCl, 50mM KC1, 0,25 mM každého dNTP, pH 8,3) v celkovém objemu 50 μΐ. PCR se uskutečnila s použitím TaqDNA-polymerázy (l,5E/násadu, Boehringer Mannheim) s celkem 30 cykly teplotního profilu 1 minuta denaturace 94 °C, 1 minuta anelace 52 °C, 1 minuta prodlužování 72 °C. Produkty amplifikace se analyzovaly elektroforézou na 1 % agarózovém gelu a barvením ethidium bromidem (obr. 5b) gelovou eluci se nastavil pro klonování v TA-vektorech.

- 14CZ 292689 B6

5'-Oblast kódující rMLA sekvenci odpovídající aminokyselinovým zbytkům tyrosinLtyrosin¹⁷ (Dietrich aj., 1992, Gabius aj., 1992), se exprimovala za zapojení translačního startovacího kodonu jako syntetický fragment genu hybridizací a klonováním dvou oligonukleotidů. Tím se umožnila optimalizace sekvence genu s ohledem na výběr kodonu, jak je popsána pro silně exprimovaný gen v Escherichia coli (Gribskov aj., 1984). Na 3'-konec syntetického fragmentu rMLA-genu a také na 5'-konec fragmentu genu rMLA exprimovaného pomocí PCR se zavedlo cílenou výměnou kodonu tyrosin¹⁷ z TAT na TAT SspI restrikční místo Ssp I, které umožnilo fúzi obou fragmentů genu rMLA při exprimování vektoru pML4-l 7 (obrázek 5).

Generovaná úplná sekvence kódující rMLA se potvrdila sekvenováním DNA (obr. 4a). K expresi rMLA v Escherichia coli se určila genová sekvence izolovaná z vektoru pML4- 17 a vložila se do expresního vektoru pl7-7 pod kontrolu promotora T7-RNA polymerázy a také terminátorů transkripce. Se vzniklým expresním vektorem pl7-MLA (obr. 5) se transformoval expresní kmen BL21 Escherichia coli.

Příklad 6

Konstrukce expresního vektoru pT7-MLB

K heterologní expresi B-řetězce lektinu z jmelí se amplifikovala úplná MLB kódující sekvence specifickou PCR vycházeje z úplné genomické DNA z Viscum album. Při tom se zavedly přes nekomplementámí oblasti použitého oligonukleotidového priméru kontrolní prvky translace, jakož i rozlišovací sekvence restrikčních nukleáz.

Obr. 6 ukazuje expresi celých rMLB úplně kódujících fragmentů genu pomocí PCR. K amplifikaci rMLB-kódujícího fragmentu genu se použilo vždy 200 ng genomické DNA z Viscum album v PCR-reakcích s oligonukleotidovým primérem RLM25 a 30 pmol (templát 1) nebo 10 pmol (templát 2) s oligonukleotidovým primérem RLM26 v celkovém objemu 50 μΐ PCR-ústoje (10 mM Tris-HCl, 50mM KC1, 1,5 mM MgCl², 0,25 mM každého dNTP, pH 8,3). PCR se uskutečnila s použitím Taq-DNA-polymerázy (l,5E/templát. Boehringer Mannheim) s 30 cykly 1 minuta denaturace 94 °C, 1 minuta anelace 52 °C, 1 minuta prodlužování 72 °C. PCR-produkty se analýzovaly elektroforézou na 1 % agarózovém gelu a barvením ethidium bromidem. Vznikl 0,8 kDa produkt, který se izoloval gelovou eluci a použil se pro klonování v TAvektorech. Insercí do expresního vektoru pT7-7 se rMLB kódující fragment začlenil za kontroly kontrolními prvky translace a se vzniklým expresním vektorem pT7-MLB se transformoval expresní kmen BL21 Escherichia coli. Integrita vzniklé celé rMLB kódující sekvence se potvrdila sekvenováním DNA (obr. 4b).

Příklad 7

Exprese, imunologický důkaz, zpětné složení a in vitro reasociace rMLA a rMLB (I) Exprese rMLA v Escherichia coli

K expresi rekombinantního A-řetězce lektinu z jmelí se naočkovalo 1000 ml LBAmp-média v 2 1 třepatí baňce s překážkami s 5 ml stacionárně rostlé LBAmp-předkultury z Escherichia coli BL21/pT7-MLA a kultivovalo se při 37 °C za třepání, přičemž se růst sledoval měřením zákalu při 578 nm. Exprese genu se indukovala po dosažení hustoty buněk odpovídající OD₅₇₈ asi 0,91,0 přidáním 0,5 mM IPTG. Ke sklizni se buňky sedimentovaly 2 hodiny po indukci 20 minutovým odstřeďováním při 5000 otáčkách za minutu při 4 °C v rotoru GS-3 (Sorvall) a kultivační

- 15CZ 292689 B6 médium se dekantovalo, přičemž se z 1 1 kultivačního média izolovalo 3 až 4 g (vlhká hmotnost) buněčné hmoty.

Rozbití buněk se dosáhlo Frenchovým lisem (SLM Instruments). K tomu se sediment buněk znovu suspendoval v 20 ml osvětlovacího ústoje (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM KC1, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 1 mM PMSF, pH 8,0) a rozbil se dvěma průchody Frenchovým lisem při 10,335 MPa. Následujícím 30 minutovým odstřeďováním při 10 000 otáčkách za minutu při 4°C v rotoru SS-34 (Sorvall) se sedimentovaly nerozpustné zbytky buněk a také zachovale inklusní částice a oddělily se od zbytku rozpustných proteinů Escherichia coli, případně od rozpustných produktů exprese.

K analýze exprese se prohlédly stejné objemy frakcí rozbitých buněk elektroforézou na 12,5 % SDS-polyakryamidovém gelu a barvením Coomasiovou briliantní modří a také Westernovou blotovou analýzou s použitím MLA- specifického antiséra TA5 (obr. 7a). Monoklonální protilátky TA5 (Tonevitsky aj., 1995) dal k dispozici autor. Podobně jako jiné zde použité protilátky jsou představitelné standardním postupem s použitím odpovídajících imunogenů (v případě TA5 je to ML-1 nebo MLA). K důkazu exprese se prohlédly stejné objemy rozpustné frakce (stopa 2, 4, 6, 8) a také nerozpustné frakce inklusních částic (stopa 1, 3, 5, 7) rozbitých buněk Escherichia coli na obsah rMLA. K představení průběhu exprese se při tom nasadily vzorky (stopa 1 + 2), 2 hodiny (stopa 3 + 4), 4 hodiny (stopa 5 + 6) a 6 hodin (stopa 7-8) po zavedení genu exprese. Exprese se projevila již 1 hodinu po indukci objevením se imunoreaktivního 25 kDa produktu exprese, jehož maximum exprese se dosáhlo již 2 hodiny po indukci. Rozdělení rMLA na rozpustné frakce a případně nerozpustné frakce bylo 2 hodiny po indukci vždy asi 50 %, přičemž delší doba exprese vedla k rostoucí tvorbě nerozpustných inklusních částic.

(Π) Izolace rMLA z nerozpustných inklusních částic

Sediment rozbitých buněk Escherichia coli se promyl dvakrát po 20 ml STET-ústoje (50 mM Tris-HCl, 8 % (hmotnost/ objem) sacharózy, 50 mM EDTA, 1 % (objem/ objem) Triton X-100, pH 7,4) podle Babbit aJ. (1990), aby se odstranily nerozpustné proteiny. Zbylý sediment se Zachovalými inklusními částicemi se rozpustil v 20 ml denaturačního ústoje (6 M gvanidiumchlorid, 100 mM DTT, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) 16 hodinovou inkubací za třepání při pokojové teplotě.

K renaturaci rMLA se roztok proteinu v denaturačním ústoji pomalu přikapal do 90-násobného objemu skládacího ústoje (50 mM Tris-HCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 8,0) a 16 hodin se za míchání inkuboval při pokojové teplotě. Znovu složený protein se oddělil 30 minutovým odstřeďováním při 6000 otáčkách za minutu při 4 °C v rotoru GS-3 (Sorvall). Zbytek obsahující rMLA se zředil na 20 % (objem/objem) glycerinem a skladoval se při 4 °C.

(ΙΠ) Čistění rMLA imunoafinitní chromatografíí

K jednostupňovému čistění rMLA (rozpustný podíl produktu exprese nebo znovu složený protein) imunoafinitní chromatografíí se kovalentně imobilizovalo 260 pg monoklonální protilátky anti-nMLA-IgG zaměřené proti A-řetězci lektinu zjmelí (TA5, Tonevitsky aj., 1995) na protein-A-sefaróze CL4B (Sigma. Deisenhofen) podle způsobu Harlova aSpura (1988). Po inkubaci v imunoafinitní matrici se vzorkem rMLA apromytí matrice 10 objemy sloupce promývacího ústoje (1 M NaCl, 10 mM fosfátový ústoj, pH 7,0) a 10 objemy sloupce promývacího ústoje (10 mM fosfátový ústoj, pH 7,0) k odstranění nespecificky vázaných proteinů se eluovala specificky vázaná rMLA elučním ústojem (0,1 M glycin, pH 2,5). Eluce vedla k obnovení hodnoty pH v předloze na 1M fosfátový ústoj, pH 8,0.

(IV) Exprese rMLB v Escherichia coli

- 16CZ 292689 B6

K expresi rekombinantního B-řetězce lektinu z jmelí se naočkovalo 1000 ml LB^-média v 2 1 třepací baňce s překážkami s 5 ml stacionárně rostlé LBAmp-předkultury z Escherichia coli BL21/pT7-MLB a kultivovalo se při 37 °C za třepání, přičemž se růst sledoval měřením zákalu při 578 nm. Exprese genu se indukovala po dosažení hustoty buněk odpovídající OD_57g asi 0,91,0 přidáním 0,5 mM IPTG. Ke sklizni se buňky sedimentovaly 4 hodiny po indukci 20 minutovým odstřeďováním při 5000 otáčkách za minutu při 4 °C v rotoru GS-3 (Sorvall) a kultivační médium se dekantovalo.

Rozbití buněk se dosáhlo Frenchovým lisem(TM) (SLM Instruments). K tomu se sediment buněk znovu suspendoval v 20 ml osvětlovacího ústoje B (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 50 mM KC1, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 7,2) a rozbil se dvěma průchody Frenchovým lisem při 10,335 MPa. Následujícím 30 minutovým odstřeďováním při 10 000 otáčkách za minutu při 4 °C v rotoru SS34 (Sorvall) se sedimentovaly nerozpustné zbytky buněk a také Zachovalé inklusní částice a oddělily se od zbytku rozpustných proteinů Escherichia coli, případně od rozpustných produktů exprese.

K důkazu exprese se prohlédly stejné objemy frakcí rozbitých buněk elektroforézou na 12,5 % SDS-polyakryamidovém gelu a barvením Coomasiovou briliantní modří a také Westernovou blotovou analýzou s použitím MLA-specifického antiséra TB33 (obr. 7b). Monoklonální protilátky TB33 (Tonevitsky aj., 1995) dal k dispozici autor. Připravily se s použitím standardního postupu. Odpovídající protilátky jsou rovněž připravitelné odborníkem s použitím standardního postupu s ML-1 nebo MLB imunogenu. K důkazu exprese se prohlédly stejné objemy rozpustné frakce (stopa 2, 4, 6, 8) a také nerozpustné frakce inklusních částic (stopa 1,3, 5, 7) rozbitých buněk Escherichia coli na obsah rMLB. K představení průběhu exprese se při tom použili vzorky (stopa 1 + 2), 2 hodiny (stopa 3 + 4), 4 hodiny (stopa 5 + 6) a 6 hodin (stopa 7-8) po zavedení genu exprese. Westernová blotová analýza ukázala již 1 hodinu po indukci objevení se imunoreaktivního 31 kDa proteinového pásu odpovídajícího rMLB, přičemž se maximum exprese dosáhlo 4 hodiny po indukci. 4 hodiny po indukci se rozdělí množství rMLB vždy asi 50 % na rozpustné a případně nerozpustné frakce rozbitých buněk. Delší doba inkubace vedla k rostoucí akumulaci exprimované rMLB ve formě nerozpustných inklusních částic.

(IV) Izolace rMLB z nerozpustných inklusních částic

Sediment rozbitých buněk Escherichia coli se promyl dvakrát po 20 ml STET-ústoje (50 mM Tris-HCl, 8 % (hmotnost/ objem) sacharózy, 50 mM EDTA, 1 % (objem/ objem) Triton X-100, pH7,4) podle Babbit a J. (1990), aby se odstranily nerozpustné proteiny. Zbylý sediment se Zachovalými inklusními částicemi se rozpustil v 20 ml denaturačního ústoje (6 M gvanidiumchlorid, 100 mM DTT, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) 16 hodinovou inkubací za třepání při pokojové teplotě.

K renaturaci rMLA se roztok proteinu v denaturačním ústoji pomalu přikapal do 90-násobného objemu skládacího ústoje (20 mM fosfátový ústoj, 50 mM KC1,1 mM EDTA, 100 mM glukózy, 10 % (objem/objem) glycerin, 10 mM β-laktózy, pH 5,5) a 16 hodin se za míchání inkuboval při pokojové teplotě. Znovu složený protein se oddělil 30 minutovým odstřeďováním při 6000 otáčkách za minutu při 4 °C v rotoru GS-3 (Sorvall).

(VI) Izolace rMLB afinitní chromatografií na N-acetyl-D- galaktosamin-agaróze

K izolaci aktivní rMLB vázající uhlovodíky se ekvilibrovala afinitní matrice N-acetyl-D-galaktosamin-agarózy (PIERCE, USA) s 10 objemy sloupce chromatografického ústoje (50 mM fosfátový ústoj, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 % (objem/objem) glycerin, 0,05 % (objem/objem) Tween-20(R), pH 7,0). Nastavení testu se uskutečnilo šaržovou inkubací afinitní matrice

- 17CZ 292689 B6 v roztoku vzorku obsahujícím rMLB po aspoň 2 hodiny při 4 °C. Po promytí afinitní matrice chromatografíckým ůstojem k odstranění nespecificky vázaných proteinů se eluovala vázaná rMLB kompetitivním vytěsněním s 0,3 M N-acetylD-galaktosaminem v chromatografickém ústoji, pH 4,0.

(VH) Reasociace in vitro řetězce lektinu z jmelí k expresi holoproteinu

Exprese rekombinantního holoproteinu lektinu z jmelí (ML) může vyjít z izolovaného složeného a také z denaturovaného, během společného skládání renaturovaného A-řetězce lektinu z jmelí a B-řetězce lektinu z jmelí. K reasociaci izolovaného složeného jednotlivého řetězce se inkuboval izolovaný B-řetězec lektinu z jmelí (nMLB nebo rMLB) s molámím přebytkem rMLA v 20 mM fosfátový ústoj, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,2 při 4 °C 16 až 48 hodin. Aby se vytvořily interchenámí disulfidové můstky, následovala inkubace v přítomnosti redox systému z6mM glutathionu (poměr redukovaný k oxidovanému 5:1) nebo lOmM glutathionu (poměr redukovaný k oxidovanému 2:1)+1 μΜ protein-disulfidové izomerázy (Boehringer Mannheim).

K reasociaci denaturovaného jednotlivého řetězce během skládání se rozpustil rMLA-řetězec v6M gvanidiumchloridu, 100 mM DTT, 50 mM TrisHCl, pH 8,0 na koncentraci 2mg/ml, rMLB-řetězec se rozpustil k úplné redukci cysteinových zbytků v 6 M gvanidiumchloridu, 100 mM DTT, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 a po inkubaci 20 minut při pokojové teplotě se přenesl do ústoje 6 M gvanidiumchloridu, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 pomocí gelové permeace na PDIO (Pharmacia. Švédsko) a nastavil se na koncentraci 0,200 mg/ml. K reasociaci došlo v rámci společného skládání rMLB s molámím přebytkem rMLA pomalým ředěním 1:30 gvanidium roztoků v spojovacím ústoji (50 mM sodnofosfátový ústoj, 50 mM KC1, 1 mM EDTA, 10 % (objem/objem) glycerin, 100 mM glukózy, 20 mM laktózy, pH 8,0) a inkubaci 16 hodin při 4 °C. Aby se vytvořily interchenámí disulfidové můstky, následovala inkubace v přítomnosti redox systému z 2mM glutathionu (poměr redukovaný k oxidovanému 1:1).

Spojovací násady se dialýsovaly v skladovacím ústoji (50 mM sodnofosfátový ústoj, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 % (objem/objem) glycerin, 0,05 % (objem/objem) Tween-20(R), pH 8,0). Důkaz a identifikace vzniklých heterodimerů se provedly SPS-PAGE za neredukujících podmínek a následující Westem-blotovou analýzou s použitím specifické monoklonální protilátky proti A-řetězci lektinu z jmelí (TA5), případně B-řetězci (TB33). Izolace volné rMLA, případně rMLA agregátů se provedla afinitní chromatografií na Nacetyl-D-galaktosaminagaróze, jak se popisuje pod (VI).

Příklad 8

Izoelektrická homogenita rMLA a rMLB

1-2 μΐ rMLA, přírodní rMLA, rMLB, přírodní rMLB nebo ML- holoprotein se fokusovalo spolu s IEF-proteinovými standardy (BiORad, USA) na Servalyt Prenets IEF-gelech (pH 3-10, 125 x 125 mm, 150 pm. Serva Heildelberg). K důkazu se proteiny mobilizovaly polosuchým elektrickým skvmováním na nitrocelulózových membránách (0,2 pm, Schleicher a Schull. Dassel). Imunologické barvení se provedlo s pomocí MLA- specifické monoklonální protilátky (TA5, Tonevitsky aj., 1995) pro rMLA anMLA, případně s pomocí MLB-specifické monoklonální protilátky (TB33, Tonevitsky aj., 1995) pro rMLB, nMLB a ML-holoprotein. Imunokomplexy se barvily za použití antimyší IgG-IgG (Sigma, Deisenhofen) konjugovanou s alkalickou fosfátázou s výměnou substrátů NBT a BCIP (obr. 8).

Zatím co se vysoce čistý přírodní A-řetězec lektinu z jmelí a také vysoce čistý přírodní B-řetězec lektinu z jmelí ukazuje jako izoelektricky nehomogenní protein s izoelektrickými body nMLA

-18CZ 292689 B6

5,2, 5,4, 5,5 a 6,2, rekombinantní rMLAřetězec se ukazuje jako izoelektricky homogenní protein s izoelektrickými bodem 6,8 a také rekombinantní rMLB-řetězec se ukazuje jako izoelektricky homogenní protein s izoelektrickými bodem 5,1 (obr. 8).

Tím se ukazuje u přírodního ML-holoproteinu heterogenní řada variací molekul (obr. 8 níže), zatím co jednotná mobilita rekombinantních proteinů lektinu z jmelí dokumentuje homogenitu rML na rozdíl k mikroheterogenitě přírodních lektinů z jmelí.

Příklad 9

Důkaz enzymatické ribosomy dezaktivující aktivity rMLA

Proteinová koncentrace rMLA (znovu složený) a rMLA (rozpustný) a také přírodního MLAřetězce (nMLA) vyčištěných imunoafinitní chromatografií se stanovila podle Bradforda (1976) za použití BSA-standardů.

K důkazu a kvantifikování enzymatické rRNA-N-glykosidázové aktivity MLA se upravil za použití TNT spojeného systému retikulocytů (Promega. USA) neradioaktivní testovací systém. Na násadu se předem inkubovaly stejná množství (20 μΐ) TNT systému při 30 °C po 15 minut. Ke kvantifikování inhibice translace se přisadily kontrolní násady 2 μΐ odpovídajících ústojů, případně testované násady 2 μΐ stoupajících MLA-ředění (rozsah koncentrací 350-0 pM). Z každé násady se odebraly v odstupech 8 minut 2 vzorky a k zastavení reakce se zmrazily v kapalném dusíku. Jako míra translační aktivity se stanovilo relativní množství luciferázy (sqrt-cpm) v bioluminiscenčním testu pomocí scintilačního přístroje. Pro každou násadu se při tom určila diference měřeného sqrt-cpm u obou časových vzorků jako míra relativní translační aktivity, přičemž aktivita kontrolní násady bez RIP se určila na 0 %.

Vynesením relativní lychlosti inaktivace translace proti použitým koncentracím rMLA se určily pomocí nelineární regrese ty koncentrace proteinů, které vedly k 50 % inhibici translační aktivity ve srovnání s kontrolní násadou. Tato hodnota IC_5o představuje veličinu závislou na systému, která umožňuje důkaz a kvantifikování enzymatické aktivity rMLA (znovu složený) a rMLA (rozpustný) ve srovnání s nMLA (obr. 9).

Obr. 9 ukazuje důkaz enzymatické ribosomy dezaktivující aktivity rekombinantního MLAřetězce, přičemž se zachovává enzymaticky aktivní produkt jak při izolaci rozpustného podílu produktu exprese rMLA (rozpustný), tak u proteinu izolovaného znovusložením z nerozpustných inklusních částic (rMLA znovu složený). rMLA (rozpustný) a rMLA (znovu složený) vykazují hodnoty IC50 10,7 +/- 1,7 pM, případně 15,6 +/- 6,6 pM překrývajících se aktivit. Tím vykazují nižší toxickou aktivitu než přírodní MLA-řetězec (IC50 1,1 +/- 0,7 pM).

Příklad 10

Aktivita vázání uhlovodíků B-řetězcem lektinu z jmelí

Důkaz aktivity vázání uhlovodíků B-řetězcem lektinu z jmelí a také srovnání aktivit vázání uhlovodíků B-řetězcemi rekombinantního a rostlinného lektinu z jmelí a jejich specifit se provede testem spojení enzymu s lektinem (ELLA) v přítomnosti kopetitivních uhlovodíků. K vazbě nMLB- a rMLB-řetězců došlo za použití imobilizované matrice asialofetuinu převážně na zbytcích galaktózy a Nacetylgalaktosaminu a také za použití imobilizované matrice fetuinu převážně na zbytcích kyseliny sialinové.

-19CZ 292689 B6

K imobilizaci uhlovodíkové matrice se dalo 100 μΐ roztoku 1,1 mg asialofetuinu (Sigma, Deisenhofen) v 11 ml PBS do jamek MaxiSorp C96 mikrotitračních desek (Nunc, Wiesbaden) a inkubovalo se 16 hodin při pokojové teplotě. Po promytí mikrotitračních desek třikrát s 150 μΐ/jainku PBS-T (10 mM sodno fosfátový ústoj, 130 mM NaCl, 0,1 % (objem/ objem) Tween-20(R), pH 7,2) se mikrotitrační desky inkubovaly se 1 hodinu při 36 °C, aby se blokovaly nespecifická vazná místa v 200 μΐ/jamku PBS-T-1 % BSA (10 mM sodno fosfátový ústoj, 130 mM NaCl, 0,1 % (objem/ objem) Tween-20(R), 1 % (hmotnost/objem) BSA pH 7,2) a pak se opět promyly, jak popsáno. K testu se použili 100 μΐ preparáty obsahující B-řetězce v koncentraci 100-500 ng/ml, výhodně 400 ng/ml, přičemž se testované koncentrace upravily ředěním vzorků v PBS- 0,05 % BSA (10 mM sodno fosfátový ústoj, 130 mM NaCl, 0,05 % (hmotnost/objem) BSA pH 7,2). Na testované koncentrace se daly 2-3 opakování. Stanovení prázdné hodnoty se provede s PBS-0,05 % BSA nebo s daným preparačním ústojem. K stanovení vazebných specifit se provedla inkubace vzorků v přítomnosti kopetitivních cukrů. K vytěsnění rMLB, nMLB nebo ML-holoproteinu z vazby na asialofetuinovou nebo fetuinovou matrici se přidala galaktóza výhodně v koncentračním rozmezí 0-280 mM, N-acetylgalaktosamin v koncentračním rozmezí 0-140 mM, v koncentračním rozmezí 0-280 mM, laktóza nebo kyselina sialinová v koncentračním rozmezí 0-140 mM. Desky se po naložení inkubovaly se 2 hodiny při 36 °C a potom se promyly, jak popsáno. Do naplněných jamek se přidalo 100 μΐ/jamku séra z koz proti lektinů z jmelí (1:19800 zředění sérových poolů vPBS-T-0,1 % BSA-Tx (10 mM sodno fosfátový ústoj, 130 mM NaCl, 0,1 % (objem/objem) Tween-20(R), 0,1 % (hmotnosťobjem) BSA, 1 % (objem/objem) Triton X-100, pH 7,2), inkubovalo se 2 hodiny při 36 °C a pak se opět promyly, jak popsáno. K důkazu imunokomplexů se na naloženou dutinu dalo ΙΟΟμΙ/dutinu séra protikozího IgG-IgG (Sigma, Deisenhofen) konjugovaného s křenovou peroxidázou v 1:3500 zředění vPBS-1 % BSA (10 mM sodno fosfátový ústoj, 130 mM NaCl, 1 % (objem/objem) BSA, pH 7,2) a inkubovalo se 1 hodinu při 36 °C. Dutiny se pak šestkrát promyly 150 μΐ/dutinu PBS-T. K vyvolání se přidalo 100 μΐ/jamku roztoku substrátu (1 tableta o-fenylendiaminu (Sigma, Deisenhofen) v 25 ml 65 mM kyseliny citrónové, pH 5,0 + 10 μΐ peroxidu vodíku) a inkubovalo se 20 minut při pokojové teplotě v temnu. K zastavení reakce došlo přidáním 100 μΐ/dutinu 1 M kyseliny sírové. Vyhodnocovalo se měřením absorbce při 450 nm s referenční vlnovou délkou 690 nm a výpočtem hodnot IC50 popsáním naměřených dat 4-parametrickou korelací. Obr. 10 ukazuje vynášení pozorovaných vytěsnění v ELLA-soustavě rMLB a nMLB z imobilizovaných ligandů asialofetuinu rostoucími množstvími D-galaktózy (obr. 10a), β-laktózy (obr. 10b) N-acetyl-galaktosaminu (obr. 10c) a také vytěsnění z imobilizovaných ligandů asialofetuinu rostoucími množstvími kyseliny sialinové (obr. lOd). Vazebné charakteristiky rMLB a nMLB byly popsané hodnotou IC50 odpovídající polovičnímu maximálnímu vytěsnění.

Zatímco vazba uhlovodíků rostlinného nMLB-řetězce může soutěžit s galaktózou (IC50 = 4,5 mM) ηβ-ΙβΗόζου (IC50 = 4,9 mM), ukazuje rekombinantní rMLB-řetězec překvapivě zřetelně změněnou uhlovodíkovou specifitu. Na rozdíl od nMLB nesoutěží uhlovodíková vazebná aktivita s galaktózou (IC50 nebyla stanovitelná) a jen v malé míře s β-laktózou (IC50 > 70 mM). Vedle drasticky snížené afinitě ke galaktóze, ukazuje rekombinantní rMLB-řetězec přece zřetelnou afinitu k N-acetyl-galaktosaminu. Další aktivita popsaná pro NMLB, vazba na ligandy kyseliny sialinové však mohla být pro rekombinantní rMLB-řetězec dokázaná (obr. lOd). Při tom se ukazují souhlasné hodnoty pro rostlinný nMLBřetězec (IC50 = 49,8 mM) a pro rekombinantní rMLB-řetězec (IC50 = 47,1 mM).

Proti rostlinnému nMLB-řetězi v prvé řadě specifickému pro galaktózu a β-laktózu, má rekombinantně exprimovaný rMLB- řetězec zřetelně rozdílnou, na stranu N-acetyl-galaktosaminu a kyseliny sialinové posunutou uhlovodíkovou specifitu.

-20CZ 292689 B6

Příklad 11

Stanovení cytotoxické aktivity rML-holoproteinu reasociovaného in vitro na lidské leukemické buňky

Integrita holoproteinu lektinu z jmelí se dokázala kvantitativním stanovením cytotoxicity proti lidské linii leukemických mononukleámích (lymfatických) buněk MOLT4 (Evropská sbírka zvířecích buněčných kultur číslo 85011413).

Buňky MOLT4 se kultivovaly v médiu bez séra MDC-1 (PAN SYSTEMS, Aidenach) a pro test se nasadily při násadové hustotě 1,6x10⁵ buněk MOLT4/ml při viabilitě > 98 %. K stanovení cytotoxicity se naočkovaly dutiny mikrotitrační desky s96 jamkami 90 μΐ suspenze buněk MOLT s 18 000 buněk/jamku a smíchaly se s 10 μΐ zkušebního roztoku. K testu se nasadily preparáty holoproteinu lektinu z jmelí (šarže číslo 220793 (Madaus) aBRAIN 12/94, které se izolovaly z listů jmelí nebo čaje z jmelí standardním postupem na laktosylsefaróze (Franz aj., 1977), tak také rMLB holoprotein reasociovaný in vitro v koncentračním rozmezí 0-100 pg/ml odpovídajícímu (1,6 fM-1,66 pM), přičemž se řady ředění upravily kultivovačním médiem pro buňky MDC-1. Na koncentrace vzorků a kontrol se dalo 6 opakování.

Buňky se inkubovaly se 72 hodin při 37 °C v 5 % CO₂ v zaplynovaném inkubátoru. Kvantifikace cytotoxického účinku se provedla měřením viability buněk pomocí rozpustných formazanových barviv způsobem WST-1 (Scudiero aj., 1988) za použití odpovídajícího reagentu proliferace buněk WST-1 (Boehringer Mannheim).

Rekombinantní holoprotein a také chimémí holoprotein rMLA/nMLB ukazují vzhledem MOLT4-cytotoxicitě biologickou aktivitu shodnou s přírodním proteinem s hodnotami IC50 okolo 10 až30 pg/ml. Naproti tomu rMLB neukazuje v testované oblasti (rMLB až do 1 ng/ml) žádnou cytotoxickou aktivitu.

Příklad 12

Indukce apoptosy rekombinantním lektinem z jmelí (rML) na příkladu lidské monocytové buněčné linie U937

Indukce apoptosních pochodů rekombinantním lektinem z jmelí (rMLA/rMLB) se dokázala barvením buněčných jader fluorescentním barvivém DAPI (Hotz aj., 1992). Typické apoptosní změny morfologie jader se tím mohly zviditelnit mikroskopem a kvantifikovat se spočítáním 500 až 1000 buněk na vzorek. Použití média bez séra má význam pro citlivost testů, protože přítomnost proteinů séra v daném množství lektinu se drasticky snižuje (asi o faktor 40 při 10 % FCS, Ribereau-Gayon aj., 1995). Doba indukce 24 hodin dovoluje jen podmíněně přímou korelaci s MOLT-testem, neboť cytotoxický účinek v testu viability se plně projeví teprve po 72 hodinách, apoptosa je však dřívější účinek. Při delší době inkubace apoptosa překiyta nekrotickými účinky.

Obr. 12 ukazuje zřetelné zvýšení rychlosti apoptosních pochodů buněk U937 po ošetření rekombinantním ML-holoproteinem. Při 70 pg/ml je počet apoptosních buněk po 2 hodinách v dvou rozdílných kulturách v médiích bez séra zvýšena o faktor 3. Rekombinantní lektin z jmelí má také jako přírodní protein schopnost indukovat apoptosní smrt buněk (Janssem aj., 1993).

-21 CZ 292689 B6

Příklad 13

Imunitu stimulující účinek rekombinantního lektinu zjmelí v PBMC-modelu

U cytokinů TNF-α (monocyty, makrofágy) a IFN-γ (T-pomocné buňky) se jedná o centrální mediátory uvnitř složité sítě lidského imunitního systému. Lidské mononukleámí buňky (PBMC, obsahují monocyty alymfocyty) ze zdravých dárců krve se izolovaly FICOLL-PAQUE(R) odstřeďováním s hustotním gradientem podle údajů výrobce (Pharmacia. Švédsko).

Pro indukci uvolnění TNF-a se inkubovaly buňky (4x10⁶ mononukleárních buněk/ml) v médiu RPMI 1640 s 10 % (objem/objem) fetálního telecího séra, 100 E/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu nejprve 18 hodin se samotnými rekombinantními proteiny lektinu zjmelí a pak dalších 24 hodin s 1 pg/ml lipopolysacharidů ze Salmonella abortus equi jako kostimulačního faktoru při 37 °C v 5 % CO₂ a 95 % relativní vlhkosti vzduchu v U-tvarovaných mikrotitračních deskách pro buněčné kultury v zaplynovaném inkubátoru. Pak se ihned kvantifikovala koncentrace TNF-α ve zbytcích bez buněk pomocí ELISA (Genzyme Diagnostics. Russelheim).

Pro indukci uvolnění IFN-γ se inkubovaly buňky ve shora uvedeném médiu nejprve 1 hodinu se samotnými rekombinantními proteiny lektinu zjmelí a pak dalších 65 hodin s0,5 pg/ml fytohemagglutininu-L jako kostimulačního faktoru, jak popsáno. Pak se ihned kvantifikovala koncentrace IFN-γ ve zbytcích bez buněk pomocí ELISA (ENDOGENINC., Cambridge. USA).

Příklad 14

Imunitu stimulující účinek rekombinantního lektinu zjmelí v modelu kůže²-ZK1200

Jako biotest zavedený model kůže²-ZK1200 sestává z třídimensionální kůže obsahující fíbróblasty a ze strukturované pokožky z nezrohovatělých keratinocytů v jejich vlastní přirozeně oddělené matrici (Joller aj., 1996). Kousky kůže (11x11 mm, připravené z lidských primárních buněk (Advanced Tissue Sciences. Inc. (ATS), La Jolla. USA) se nastavily vždy na mřížce z nylonové tkaniny a ihned po dodání se převedly do speciálního média A (ATS, La Jolla. USA). Jak BL-la tak IL-6 jsou relevantní stimulující cytokiny lidského imunitního systému.

Pro indukci uvolnění IL-la, případně IL-6, se kousky tkáně kůže² se vždy inkubovaly se zkoušenou látkou v 2 ml speciálního média B (ATS, La Jolla. USA) 24 hodin při 37 °C, 5 % CO² ve vzduchu a přes 95 % relativní vlhkosti vzduchu v 12 jamkových deskách pro buněčné kultury (Coming Glass Works. Coming. USA). Pak se kvantifikovala koncentrace DL-Ια ve zbytcích bez buněk pomocí ELISA (Quantikine human IL-la Assay, RandD Systems, Minneapolis, USA), případně IL-6 (h-interleukin 6 ELISA, Boehringer Mannheim).

V modelu kůže² se ukázalo na dávce závislé uvolnění, 0,25-8 ng rML/ml indukované uvolnění, IL-la a také na dávce závislé uvolnění, 0, 5-8 ng rML/ml indukované uvolnění, IL-6 (obr. 14). Samotným rekombinantním rMLB-řetězcem se nemohlo překvapivě indukovat žádné shora uvedené uvolňování cytokinů, což je v rozporu s dosavadním stavu znalostí, podle kterého je aktivita stimulující imunitu odvozena hlavně od lektinové aktivity B-řetězce (Hajto aj., 1990).

Příklad 15

Aktivace imunokompetentních buněk rekombinantním rMLB- řetězcem lektinu zjmelí

-22CZ 292689 B6

Aktivace imunokompetentních buněk se studovala na indukci proteinu CD69 na povrchu buněk. CD69 se objevuje jako jeden z prvých antigenů na povrchu buněk po aktivaci T-buněk, B-buněk a zejména přirozených zabijáckých buněk (NK-buňky), které na základě své schopnosti rozeznávat a rozpouštět neoplastické buňky mají centrální význam při přirozené obraně proti tumorům. CD69 představuje markér aktivace shora uvedených imunokompetentních populací buněk, protože protein na povrchu buněk se neexprimuje na klidových lymfocytech. Mimo to se dokázala pro indukovatelný protein na povrchu buněk CD69 podpůrná funkce pro cytotoxickou aktivitu NK-buněk a TcRy/δ T-buněk (Moretta aj., 1991). K důkazu markrů na povrchu buněk na lidských mononukleámích buňkách průtokovou cytometrií (FACS) se PBMC podobně jako v příkladě 13 izolovaly hustotním gradientem na Hypaque (Sigma). Po převedení buněk do média RPMI160 s 5 % FCS a násadou asi 25 000 buněk/jamku mikrotitrační desky následovala 4-hodinová inkubace s 1, 10, 30 a 100 ng testované látky. Po 20 minutové inkubaci s fluorescenčně značeným antiCD69-MAK v ledové lázni následovalo promývání vHankově roztoku s 5 % FCS. Sedimentované značené buňky se převedly do 200 μΐ obalové kapaliny a měřily se v FACScan (Becton Dickinson). Vynesena je střední fluorescence odpovídající počtu CD69 markru na povrchu buněk na buňku, tak podílu CD69 positivních buněk v celé populaci buněk.

V koncentračním rozmezí 1-100 ng/ml se mohla zjistit aktivace mononukleámích buněk jak s ohledem na objevení se CD69 na povrchu buněk, tak s ohledem na podíl CD69 positivních buněk. Při tom se ukázala zvonovitá křivka závislosti na dávce. Cytotoxický účinek na zde studované PBMC se také nemohl dokázat při nejvyšší koncentraci 100 ng/ml rMLB.

Claims (28)

1. Molekula nukleové kyseliny, která (a) kóduje preprotein, který po dozrání vykazuje biologickou aktivitu dimeru lektinu z jmelí a který vykazuje na obrázku 4c ukázaný řetězec nukleotidů, (b) kóduje fragment preproteinu podle (a), přičemž je fragment biologicky aktivní částí dimeru lektinu z jmelí, (c) se liší od molekuly nukleové kyseliny podle (a) nebo (b), degenerací genetického kódu nebo (d) za stringentních podmínek se hybridizuje s molekulou nukleové kyseliny podle (a), (b) nebo (c) a kóduje polypeptid s v (a) nebo (b) udanou biologickou funkcí nebo aktivitou.

2. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, kde fragmentem je A-řetězec lektinu z jmelí, který je kódován sekvencí nukleotidů znázorněnou na obrázku 4a.

3. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, kde fragmentem je B-řetězec lektinu z jmelí, který je kódován sekvencí nukleotidů znázorněnou na obrázku 4b.

4. Molekula nukleové kyseliny podle jednoho z nároků 1 až 3, kde jí je DNA molekula.

5. Molekula nukleové kyseliny podle jednoho z nároků 1 až 3, kde jí je RNA molekula.

6. Molekula nukleové kyseliny, kterou je protismyslný řetězec k molekule nukleové kyseliny podle jednoho z nároků 1 až 5.

-23CZ 292689 B6

7. Vektor, který obsahuje alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny podle jednoho z nároků 1 až 6.

8. Vektor podle nároku 7, který obsahuje jak molekulu nukleové kyseliny podle nároku 2 nebo 4, tak molekulu nukleové kyseliny podle nároku 3 nebo 4.

9. Vektor podle nároku 7 nebo 8, který je expresním vektorem.

10. Hostitel, který je vybrán ze skupiny sestávající ze savčí buňky, rostlinné buňky, bakteriální buňky, buňky houby, kvasinkové buňky anebo hmyzí buňky, přičemž je transformován alespoň jedním vektorem podle kteréhokoliv z nároků 7 až 9.

11. Hostitel podle nároku 10, kterým je bakterie Escherichia coli, buňka houby Aspergillus nebo buňka Spodoptera, s výhodou buňka Spodoptera jrugiperda.

12. Polypeptid, který je kódován molekulou nukleové kyseliny podle jednoho z nároků 1 až 5.

13. Polypeptid, který je kódován vektorem podle jednoho z nároků 7 až 9.

14. Polypeptid, který je produkován hostitelem podle jednoho z nároků 10 až 11.

15. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 12 až 14, který obsahuje aspoň jednu chemickou nebo enzymatickou modifikaci, které zahrnují glykozylaci/deglykozylaci, acetylaci/deacetylaci, fosforylaci/defosforylaci, amidaci/deamidaci, karboxymethylaci/dekarboxymethylaci, zavedení aktivních sulfhydrilových skupin, zavedení reaktivních skupin na nukleofilní/elektrofilní párování s látkami, peptidy nebo proteiny, γ-karboxylaci/dekarboxylaci, hydroxylaci/dehydroxylaci, hydrolýzu, halogenizaci, jako například jodizaci, methylaci/demethylaci, biotynilaci, použití neproteinových aminokyselin, zavedení neproteinových přívěsků, kovalentní párování s proteinovými apeptidovými přívěsky, blokování uhlovodíkových vazebních míst, například kovalentním párováním s glykoproteiny/glykopeptidy, zejména asialoglykopeptidy, přičemž enzymatická modifikace se liší od glykozylace vyskytující se ve Viscum album.

16. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 12 až 15, kterým je fuzní protein.

17. Dimer polypeptidu s biologickou aktivitou lektinu z jmelí, přičemž jeden monomer je kódován molekulou nukleové kyseliny podle jednoho z nároků 2, 4 nebo 5 a druhý monomer je kódován molekulou nukleové kyseliny podle jednoho z nároků 3 až 5.

18. Dimer polypeptidu podle nároku 17, kde alespoň jeden z monomerů je polypeptid podle některého z nároků 12 až 16.

19. Protilátka nebo její fragment či derivát, které specificky vážou polypeptid podle jednoho z nároků 12 až 16 a nebo dimer polypeptidu podle nároků 17 nebo 18.

20. Způsob přípravy polypeptidu podle jednoho z nároků 12 až 16, nebo dimeru polypeptidu podle nároku 17 nebo 18, vyznačující se tím, že se při něm pěstuje hostitel podle jednoho z nároků 10 nebo 11 za vhodných podmínek atak získaný polypeptid nebo dimer polypeptidu se izoluje.

21. Imunotoxin obsahující alespoň jeden polypeptid podle jednoho z nároků 12 až 16 a/nebo dimer polypeptidu podle nároku 17 nebo 18.

-24CZ 292689 B6

22. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle jednoho z nároků 12 až 16, případně spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.

23. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje dimer polypeptidů podle nároku 17 nebo 18, případně spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.

24. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje imunotoxin podle nároku 21, případně spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.

25. Primér nebo pár primérů, který specificky hybridizuje s molekulou nukleové kyseliny podle jednoho z nároků 1 až 5, případně hybridizuje s komplementárním řetězcem, jak jsou ukázané na obrázcích 1, 5 a 6.

26. Diagnostická souprava na skríning genomů organizmů z hlediska obsahu lektinového genu, která obsahuje:

(a) molekulu nukleové kyseliny podle jednoho z nároků 1 až 5, a/nebo (b) primér nebo pár primérů podle nároku 25.

27. Souprava na generování lektinových protilátek nebo antiséra, která obsahuje polypeptid podle jednoho z nároků 12 až 16 a/nebo dimer polypeptidů podle nároku 17 nebo 18.

28. Prostředek na ochranu rostlin, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle jednoho z nároků 12 až 16 a/nebo dimer polypeptidů podle nároku 17 nebo 18.