EA012507B1 - Высокоаффинные мелан-а т-клеточные рецепторы - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к Т-клеточным рецепторам (TCR), обладающим аффинностью (K), меньшей или равной 3 μМ, и/или скоростью диссоциации (k) 1×10Sили ниже в отношении AAGIGILTV-HLA-A*0201 комплекса. Такие TCR могут оказаться полезными как сами по себе, так и в сочетании с терапевтическим агентом для нацеливания в раковые клетки, содержащие этот комплекс.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к Т-клеточным рецепторам (ТСН), обладающим свойством связываться с ЛЛОЮ1ЬТУ-НЬА-А*0201 и включающим по меньшей мере один вариабельный домен ТСН β-цепи, характеризующимся тем, что указанный ТСН имеет К_с в отношении указанного комплекса АА6Ю1ЬТУ-НЬА-А*0201 менее или равный 3 цМ и/или скорость диссоциации (к_о££), равную 1х 10^-3 8^-1 или ниже.

Уровень техники

ААОЮ1ЬТУ пептид получен из Ме1ап-А (Маг!-1) белка, который экспрессируется большинством свежеотобранных проб меланомы и примерно 60% клеточных линий меланомы, а также нормальными меланоцитами ((Соийе е! а1., (1994) 1. Ехр. Меб. 180: (1)1-4) и Ка^акаш! е! а1., (1994) РЫА8 И8А 91:3515). Класс I НЬА веществ этих раковых клеток включает пептиды из этого белка, в том числе ААОЮГЬТУ (8ЕО ΙΟ N0:43) (Ме1ап-А_27-35). АА6Ю1ЬТУ-НЕА-А*0201 комплекс является, по-видимому, иммунодоминантной мишенью для меланома-специфичных Т-клеток (Каетакаш1 е! а1., (1994) РNА8 И8А 91:3515) и (Ηίνο1ΐίηί е! а1., (1995) 1. 1ттипо1. 154:2257). Следовательно, этот пептид-НЬА комплекс является маркером рака и может служить мишенью для ТСН, например, с целью доставки цитотоксических или иммуностимулирующих средств к раковым клеткам. Однако с этой целью было бы предпочтительным, если бы ТСН имел более высокую аффинность и/или более низкую скорость диссоциации в отношении пептид-НЬА комплекса, чем нативные ТСН, специфичные для этого комплекса.

Сущность изобретения

Благодаря данному изобретению впервые становятся доступными ТСН-ы, имеющие высокую аффинность связывания (К_с) менее или равную 3 цМ и/или скорость диссоциации (к_о££), равную 1х10^-3 8^-1 или ниже в отношении ААОЮ1ЬТУ-НЬА-А*0201 комплекса. Такие ТСН-ы могут применяться как сами по себе, так и в сочетании с терапевтическим агентом для нацеливания на клетки рака, содержащие этот комплекс.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к Т-клеточному рецептору (ТСН), обладающему свойством связываться с ААОЮ1ЬТУ-НЬА-А*0201, включающему по меньшей мере один вариабельный домен ТСН α-цепи и/или по меньшей мере один вариабельный домен ТСН β-цепи и характеризующемуся тем, что указанный ТСН имеет К в отношении указанного комплекса ААОЮ1ЬТУ-НЬА-А*0201 менее или равный 3 цМ и/или скорость диссоциации (к_о££), равную 1 х 10^-3 8^-1 или ниже.

В другом варианте настоящего изобретения указанные ТСН-ы имеют К_с в отношении комплекса АА6Ю1ЬТУ-НЬА-А*0201 менее или равный 1 цМ.

Определение К может быть осуществлено любым из известных методов. Предпочтительным является метод 8ш£асе Р1актоп Некопапсе (В1асоге) по примеру 4.

Для сравнения взаимодействие дисульфидно-связанного растворимого варианта нативного МЕЬ ТСН (см. 8Е0 ΙΟ N0:9 для ТСН α-цепи и 8Е0 ΙΟ N0:10 для ТСН β-цепи) и комплекса ААОЮ1ЬТУНЬА-А*0201 имеет К_с примерно 4 цМ при определении В1асоге-методом по примеру 4.

Для нативного МЕЬ ТСН, специфичного к комплексу АА0Ю1ЬТУ-НЬА-А*0201, нужно использовать следующие гены V α-цепи и V β-цепи (используя терминологию для Т-клеточного рецептора по ЕасЬЬоок. (2001) ЬеЕтапе апб ЬеЕтапе, Асабет1с Ргекк, Ι8ΒΝ 0-12-441352-8, см. ниже):

α-цепь - ТНАV 12-2, β-цепь - ΊΈΒν 30.

Нативный МЕЬ ТСН может использоваться как матрица, на которой могут осуществляться различные мутации, которые и придают высокую аффинность и/или низкую скорость диссоциации при взаимодействии между заявленными ТСН-ами и комплексом ААСIСI^ТV-Н^А-А*020Ε Таким образом, изобретение относится к ТСН-ам, мутированным относительно вариабельного региона α-цепи нативного МЕЬ ТСН (см. фиг. 1а и 8Е0 ГО N0:1) и/или вариабельного региона β-цепи (см. фиг. 1Ь и 8Е0 ГО N0:2) по меньшей мере в одной области, определяющей комплементарность (СОН), и/или каркасной области вариабельных регионов. Это также дает возможность предполагать, что другие гипервариабельные области в вариабельных регионах заявленных ТСН-ов, как, например, гипервариабельные 4 (4ν4) области, могут быть мутированными так, что получается мутант с высокой аффинностью.

Нативные ТСН-ы существуют в гетеродимерных αβ или γδ формах. Однако уже было показано, что рекомбинантные ТСН-ы, состоящие из единственной ТСН α- или ТСН β-цепи, связывают пептидные МНС молекулы.

В одном варианте ТСН настоящего изобретения включает и вариабельный домен α-цепи, и вариабельный домен ТСН β-цепи.

Специалисту в данной области должно быть очевидно, что мутация(и) в последовательности ТСН α-цепи и/или последовательности ТСН β-цепи могут быть вызваны замещением(ями), делецией(ми) или инсерцией(ями). Эти мутации могут быть получены с помощью соответствующего метода, включающего (но не только) полимеразную цепную реакцию (РСН), клонирование на основе энзимов рестрикции или

- 1 012507 процедуры лигационного независимого клонирования (МС). Эти методы подробно описаны во многих пособиях по молекулярной биологии. Для более детального ознакомления в отношении мутагенеза полимеразной цепной реакции (РСК) и клонирования с использованием энзимов рестрикции (см. 8атЬгоок & Ки88е11, (2001) Мо1еси1аг С1ошп§ - А РаЬогакиу Мапиа1 (3^гб Еб.) С8НЬ Ргезз). Дополнительная информация по Ь1С процедурам может быть найдена в КазЫсЫап, (1995) Сигг. Θρΐη. Вю1есЬпо1. 6 (1):30-6. Фаговый дисплей является единственным средством, с помощью которого могут быть получены библиотеки ТСК вариантов. Методы, пригодные для фагового дисплея и последующего скринирования библиотек ТСК вариантов, каждый из которых содержит ненативную дисульфидную междуцепочечную связь, детально описаны в е! а1., (2005) \аШге Вю!есЕ. 23(3): 349-354 и АО 2004/04404.

Следует отметить, что любой αβ ТСК включает применение сходных V а- и V β-генов и, следовательно, аминокислотную последовательность с тем, чтобы МЕЬ ТСК мог образовать удобный матричный ТСК. Это сделает возможным внесение в ДНК, кодирующую один или оба вариабельных региона матричного αβ ТСК, изменений, необходимых для получения заявляемых мутированных ТСК-ов с высокой аффинностью. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, необходимые мутации могут быть внесены с помощью целого ряда методов, например метода сайт-направленного мутагенеза.

Если только не утверждается обратное, аминокислотные последовательности ТСК в настоящем описании получаются с использованием Ν-терминального остатка метионина (Ме! или М). Как должно быть известно специалистам в данной области, этот остаток может быть удален в процессе получения рекомбинантных белков. Как должно быть также очевидно специалистам в данной области, возможно усечение последовательностей на С-конце и/или Ν-конце на 1, 2, 3, 4, 5 остатков или более без оказания существенного воздействия на рМНС связывающие свойства ТСК, все такие обычные варианты включаются в объем данного изобретения.

Следует иметь в виду, что в используемом здесь смысле термин «вариабельный регион» охватывает все аминокислоты данного ТСК, которые не включены в константный домен, кодируемый ТКАС геном для ТСК α-цепей и/или ТКВС1, или ТКВС2 для ТСК β-цепей (Т се11 гесер!ог Еас!зЬоок, (2001) ЕеЕгапс апб ЕеЕгапс Асабетю Ргезз, 18В\ 0-12-441352-8).

Также должно быть понятно, что в используемом здесь смысле термин «вариабельный домен» охватывает все аминокислоты данного ТСК, которые входят в состав аминокислотной последовательности, кодируемой ТКАV геном для ТСК α-цепей и ТКВV геном для ТСК β-цепей (Т се11 гесер!ог Еас!зЬоок, (2001) ЕеЕгапс апб ЕеЕгапс Асабетю Ргезз, 18В\ 0-12-441352-8).

Варианты изобретения включают мутированные ТСК-ы, которые имеют мутацию одной или более аминокислот вариабельного региона α-цепей, соответственно: 28Ώ, 29К, 300, 318, 49М, 511, 538, 54Ν, 72Υ, 94ν, 95А, 960, 97К, 988 и 99Т, например, мутации, соответствующие:

28ϋ—>Р, 28ϋ—>Υ, 28ϋ^8, 28ϋ-^Ν,

29Κ—><2, 29К-ГО, 29Κ—»1, 29Κ—Ρ,

306-+Η,

318-μ-Α,

49Μ—>1,

511—>Τ,

538—>Κ,

54Ν—»Ε,

72Υ-+Η,

94ν-^Ό, 94У—+Ρ, 94У—>8, 94У^Ь, 94ν^Ν, 95Α-+Ο,

95Α—*8, 95Α—>Ε,

96(3—>Ν, 96(3—>Ρ, 96С—>У, 96<3^Μ, 96Ο^Ε, 96Ο^Κ,

97Κ—>Κ, 97Κ—>Υ, 97Κ—>У, 97К-ГО, 97Κ-+Η, 97Κ^Ο, 97Κ-4, 97Κ-+Ρ,

988-+Ε 988-^Μ, 988—>Κ,

99Τ—>Ь или 99Τ—>Κ.

Нумерация, используемая выше, та же, что и приведенная на фиг. 1 и 8ЕО 10 N0:1.

Варианты изобретения включают мутированные ТСК-ы, которые имеют мутацию одной или более аминокислот вариабельного региона β-цепей, соответственно: 45Е, 518, 52ν, 530, 541, 761, 1000, 101Т, 1020, 103Е, 104Е и 105Е, используя нумерацию, показанную в 8ЕО ГО N0:2, которая имеет мутацию(и), например, мутации, соответствующие:

- 2 012507

45Ь->Р.

518—>Υ, 518—*Р, 518—

52У—>0,

530—*Р,

541—>Р, 54—>Υ,

761—>У,

ЮОО-*Ν,

ΙΟΙΤ^Μ, 101Т-Щ 101Т-+У,

1020—>8, 1020—>Ν, Ю2О-+Т,

103Е-Ю,

104Ь^А¥,

105Ρ->8,105Γ-+Α, 105Ρ^Ο, 105Ρ^ϋ или 105Ρ-+Ε

Нумерация, используемая выше, та же, что и приведенная на фиг. 1Ь и 8Ε^ ГО N0:2.

Другие предпочтительные варианты изобретения относятся к ТСК-ам, включающим одну из мутированных аминокислотных последовательностей вариабельного региона α-цепей, показанных на фиг. 6 (8Ε^ ГО N0:11-24) или фиг. 20 (8Ε^ ГО N0:47-53). Фенотипически молчащие варианты таких ТСК-ов также являются частью изобретения.

Другие предпочтительные варианты изобретения относятся к ТСК-ам, включающим одну из мутированных аминокислотных последовательностей вариабельного региона β-цепей, показанных на фиг. 21 (8Ε^ ГО N0:54-67). Фенотипически молчащие варианты таких ТСК-ов также являются частью изобретения.

Нативные ТСК-ы существуют в гетеродимерных αβ или γδ формах. Однако было показано, что и рекомбинантные ТСК-ы, состоящие из αα или ββ гомодимеров, связывают пептидные МНС молекулы. Следовательно, один из вариантов изобретения относится ТСК αα или ТСК ββ гомодимерам.

Другие предпочтительные варианты относятся к ТСК-ам данного изобретения, включающим комбинации аминокислотной последовательности вариабельного региона α-цепи и аминокислотной последовательности вариабельного региона β-цепи, перечисленные ниже, фенотипически молчащие варианты таких ТСК-ов также являются частью этого изобретения.__________________________

Последовательность вариабельной области альфа цепи, 8Е() Ю N0:
И
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
47
48
49
50
51
52
53

Последовательность вариабельной области бета цепи, 8Е(} ГО N0:
2
2
2
2 ‘
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2

- 3 012507

11
и
11
11
11
и
11
11
11
11
11
11
11
11

54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67

Предпочтительные варианты относятся к заявляемым ТСК-ам, включающим вариабельный регион α-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:11, и вариабельный регион β-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:2;

вариабельный регион α-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:47, и вариабельный регион β-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:2;

вариабельный регион α-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:48, и вариабельный регион β-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:2;

вариабельный регион α-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:53, и вариабельный регион β-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:2;

вариабельный регион α-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:11, и вариабельный регион β-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:54;

вариабельный регион α-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:11, и вариабельный регион β-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:55;

вариабельный регион α-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:11, и вариабельный регион β-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:56;

вариабельный регион α-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:11, и вариабельный регион β-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:57;

вариабельный регион α-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:11, и вариабельный регион β-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:58;

вариабельный регион α-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:11, и вариабельный регион β-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:62;

вариабельный регион α-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:11, и вариабельный регион β-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:65;

вариабельный регион α-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:11, и вариабельный регион β-цепи, показанный в виде 8Ε^ ГО N0:66, или фенотипически молчащие варианты любого из вышеприведенных ТСК-ов,

В другом предпочтительном варианте ТСК-ы изобретения, включающие сочетания (комбинации) вариабельных регионов, раскрытые выше, включают также аминокислотную последовательность константной области α-цепи, показанную на фиг. 7а (8Ε^ ГО N0:25), и одну из аминокислотных последовательностей константных областей β-цепей, показанных на фиг. 7Ь и 7с (8Ε^ ГО N0:26 и 27), или их фенотипически молчащие варианты.

В используемом здесь смысле под термином «фенотипически молчащие варианты» подразумеваются те ТСК-ы, которые имеют К_о для указанного комплекса ΑΑΘΙΘΙΕΤν-ΗΕΑ-Α*0201 менее или равный 3 рМ. Например, специалистам в данной области известно, что можно создать ТСК-ы, у которых имеются минорные изменения в константных и/или вариабельных областях по сравнению с теми, что детально описаны выше, но без изменения аффинности и/или скорости диссоциации при взаимодействии с ΑΑΘЮI^ΤV-Η^Α-Α*0201. Такие варианты тоже включены в объем настоящего изобретения. Такие ТСК-ы, в которых осуществлены один или несколько консервативных замен, также составляют часть данного изобретения.

В широком аспекте ТСК-ы данного изобретения находятся либо в форме одноцепочечных ТСК-ов (зсТСК), либо в форме димерных ТСК-ов (бТСКз), как описано в Ж.) 04/033685 и Ж.) 03/020763.

Подходящая зеТСК форма включает первый сегмент, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей вариабельному региону α-цепи ТСК, второй сегмент, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей вариабельному региону β-цепи ТСК, слитой с N концом аминокислотной последовательности, соответствующей экстрацеллюлярной последовательности

- 4 012507 константного домена β-цепи ТСК, и линкерную последовательность, соединяющую С-конец первого сегмента с Ν-концом второго сегмента.

Или же первый сегмент может состоять из аминокислотной последовательности, соответствующей вариабельному региону β-цепи ТСК; второй сегмент может состоять из аминокислотной последовательности, соответствующей последовательности вариабельного региона α-цепи ТСК, слитой с Ν-концом аминокислотной последовательности, соответствующей экстрацеллюлярной последовательности константного домена α-цепи ТСК.

Вышеупомянутые §сТСК-ы могут также включать дисульфидную связь между первой и второй цепями, причем эта дисульфидная связь является связью, которая не имеет эквивалента в нативных αβ'Γклеточных рецепторах, и где длина линкерной последовательности и положение дисульфидной связи таковы, что последовательности вариабельных доменов первого и второго сегментов взаимно ориентированы практически так же, как в нативных αβΨ-клеточных рецепторах.

Более конкретно первый сегмент может состоять из аминокислотной последовательности, соответствующей последовательности вариабельного региона α-цепи ТСК, слитой с Ν-концом аминокислотной последовательности, соответствующей экстрацеллюлярной последовательности константного домена αцепи ТСК, второй сегмент может состоять из аминокислотной последовательности, соответствующей вариабельному региону β-цепи ТСК, слитой с Ν-концом аминокислотной последовательности, соответствующей экстрацеллюлярной последовательности константного домена β-цепи ТСК, а между первой и второй цепями может быть предусмотрена дисульфидная связь, причем не имеющая эквивалента в нативных αβΨ-клеточных рецепторах.

В вышеуказанных §сТСК формах линкерная последовательность может связывать С-конец первого сегмента с Ν-концом второго сегмента и может характеризоваться формулой - РООО-(8ОООО)_п-Р, где η равно 5 или 6, а Р является пролином, О является глицином, а 8 является серином.

- РООО-8ОООО8ООС68ООСО8ОООО8ОООО-Р (8Е(? Ш N0:41)

- РООО-8ОООО8ОООО8ОООО8ООСС8ОО(ЗО8ОООС-Р (8Е0 Ш N0:42)

Подходящая С.1ТСК форма ТСК-ов настоящего изобретения включает первый полипептид, в котором последовательность, соответствующая последовательности вариабельного региона α-цепи ТСК, слита с Ν-концом последовательности, соответствующей экстрацеллюлярной последовательности константного домена α-цепи ТСК, и второй полипептид, в котором последовательность, соответствующая последовательности вариабельного региона β-цепи ТСК, слита с Ν-концом последовательности, соответствующей экстрацеллюлярной последовательности константного домена β-цепи ТСК, причем первый и второй полипептид соединены дисульфидной связью, которая не имеет эквивалента в нативных αβ Т-клеточных рецепторах.

Первый полипептид может включать последовательность вариабельного региона α-цепи ТСК, слитую с Ν-концом последовательности, соответствующей экстрацеллюлярной последовательности константного домена α-цепи ТСК, и второй полипептид, в котором последовательность, соответствующая последовательности вариабельного региона β-цепи ТСК, слита с Ν-концом последовательности, соответствующей экстрацеллюлярной последовательности константного домена β-цепи ТСК, причем первый и второй полипептиды связаны дисульфидной связью между цистеиновыми остатками, которыми замещены ТЬг 48 экзона 1 ТКАС*01 и серии 57 экзона 1 ТКВС1*01 или ТКВС2*01 или их эквивалента нечеловеческого происхождения. («ТКАС» и др. номенклатурные обозначения приведены соответственно принятым для Т-клеточных рецепторов по Рас1§Ьоок, (2001) БеРгапс апб БеРгапс, Асабеш1с Рг姧, Ι8ΒΝ 0-12441352-8).

сГГСК или §сТСК форма заявляемых ТСК-ов могут иметь аминокислотные последовательности, соответствующие последовательностям экстрацеллюлярных константных и вариабельных регионов αβТСК человека, а дисульфидная связь может соединять аминокислотные остатки указанных константнодоменовых последовательностей, причем дисульфидная связь не имеет эквивалента в нативных ТСК-ах. Дисульфидная связь имеет место между цистеиновыми остатками, соответствующими аминокислотным остаткам, β-углеродные атомы которых в нативных ТСК-ах находятся на расстоянии менее чем 0,6 нм, например, между цистеиновыми остатками, которыми замещены ТЬг 48 экзона 1 ТКАС*01 и 8ег 57 экзона 1 ТКВС1*01 или ТКВС2*01 или их эквивалента нечеловеческого происхождения. Другие сайты, куда могут быть введены цистеины для создания дисульфидной связи, следующие остатки в экзоне 1 ТКАС*01 для ТСК α-цепи и ТКВС1*01 или ТКВС2*01 для ТСК β-цепи.

- 5 012507

ТСК. а цепь	ТСК β цепь	Удаленность нативных β-углеродных атомов (нм)
ТЬг 45	8ег77	0,533
ТЬг 10	Зег 17	0,359
ТЬг 45	Азр 59	0,560
8ег 15	Ст1и 15	0,59

Конкретные варианты изобретения относятся к заявляемым ТСК и, в частности, 4ТСК, включающим первый полипептид, в котором последовательность, соответствующая последовательности вариабельного региона α-цепи ТСК, слита с Ν-концом последовательности, соответствующей экстрацеллюлярной последовательности константного домена α-цепи ТСК, и второй полипептид, в котором последовательность, соответствующая последовательности вариабельного региона β-цепи ТСК, слита с Ν-концом последовательности, соответствующей экстрацеллюлярной последовательности константного домена β-цепи ТСК, первый и второй полипептиды соединены дисульфидной связью, которая не имеет эквивалента в нативных αβ Т клетках, между цистеиновыми остатками, которыми замещены ТЬг 48 экзона 1 ТКАС*01 и 8ег 57 экзона 1 ТКВС1*01 или ТКВС2*01 или их эквивалента нечеловеческого происхождения.

Помимо ненативной дисульфидной связи, упомянутой выше, 4ТСК или зсТСК форма заявленных ТСК-ов может включать дисульфидную связь между остатками, соответствующими остаткам, связанным дисульфидной связью в нативных ТСК-ах.

4ТСК или зсТСК форма ТСК-ов изобретения предпочтительно не включает последовательности, соответствующей трансмембранным или цитоплазматическим последовательностям нативных ТСК-ов.

В настоящее время предпочтительные варианты изобретения обеспечиваются растворимыми ТСКами, включающими аминокислотную последовательность α-цепи 8Ер ΙΌ N0:29 и аминокислотную последовательность β-цепи М-П ΙΌ N0:10, аминокислотную последовательность α-цепи 8Ер ΙΌ N0:68 и аминокислотную последовательность β-цепи δθ) ΙΌ N0:10, аминокислотную последовательность α-цепи 8Ер ΙΌ N0:69 и аминокислотную последовательность β-цепи М-П ΙΌ N0:10, аминокислотную последовательность α-цепи 8Ер ΙΌ N0:70 и аминокислотную последовательность β-цепи δθ) ΙΌ N0:10, аминокислотную последовательность α-цепи 8Ер ΙΌ N0:29 и аминокислотную последовательность β-цепи δθ) ΙΌ N0:71, аминокислотную последовательность α-цепи 8Ер ΙΌ N0:29 и аминокислотную последовательность β-цепи М-П ΙΌ N0:72, аминокислотную последовательность α-цепи 8Ер ΙΌ N0:29 и аминокислотную последовательность β-цепи δθ) ΙΌ N0:73, аминокислотную последовательность α-цепи 8Ер ΙΌ N0:29 и аминокислотную последовательность β-цепи δθ) ΙΌ N0:74, аминокислотную последовательность α-цепи 8Ер ΙΌ N0:29 и аминокислотную последовательность β-цепи М-П ΙΌ N0:75, аминокислотную последовательность α-цепи 8Ер ΙΌ N0:29 и аминокислотную последовательность β-цепи δθ) ΙΌ N0:76, аминокислотную последовательность α-цепи 8Ер ΙΌ N0:29 и аминокислотную последовательность β-цепи δθ) ΙΌ N0:77, аминокислотную последовательность α-цепи 8Ер ΙΌ N0:29 и аминокислотную последовательность β-цепи М-П ΙΌ N0:78.

Изобретение предлагает также нуклеиновую кислоту или нуклеиновые кислоты, кодирующие ТСК-ы изобретения. Такие нуклеиновая кислота или нуклеиновые кислоты могут предусматриваться в форме, которая адаптирована для экспрессии в прокариотической или эукариатической клетке-хозяине. Подходящие клетки-хозяева включают, но без ограничения, клетки бактерий, дрожжей, млекопитающих или насекомых. Например, хозяйская клетка может быть Т-клеткой человека или гемопоэтической стволовой клеткой человека.

Такие адаптированные нуклеиновая кислота или нуклеиновые кислоты мутирована/мутированы для того, чтобы отражать предпочтение (выбор) в отношении кодонов клетки-хозяина, в которую она/они включена/ы. Введенные мутации являются молчащими мутациями, которые не оказывают влияние на аминокислотную последовательность кодируемых полипептида или полипептидов. ОепеАг! (КедепзЬигд,

- 6 012507

Сегтапу) предлагает подходящий сервис по оптимизации нуклеиновых кислот (Сспс0р1пш/сг^|Л1). Заявка А0 2004/059556, принадлежащая СепеЛй. предлагает дополнительные детали по оптимизационной технике процесса.

Другие предпочтительные в настоящее время варианты изобретения относятся к нуклеиновым кислотам. состоящим из одной из полноразмерных ДНК-последовательностей α-цепи ТСВ 8ЕЦ ΙΌ N0:33. 35 или 37 (фиг. 12а, 13а или 14а соответственно) и ДНК-последовательности β-цепи ТСВ 8ЕЦ ΙΌ N0:39 (показано на фиг. 15а).

Нуклеиновая кислота. комплементарная любой из вышеперечисленных. или соответствующая РНКпоследовательность также составляет часть данного изобретения. Кроме того. специалисту в данной области должно быть очевидно. что нуклеиновая кислота или нуклеиновые кислоты. кодирующие ТСВ-ы данного изобретения. могут также включать некодирующие последовательности (интроны).

Полноразмерные дикого типа и высокоаффинные ДНК цепей МЕЬ ТСВ. имеющие 8ЕЦ ΙΌ N0:31. 33. 35. 37 и 39. кодируют аминокислотные последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:32. 34. 36. 38 и 40 соответственно (фиг. 11Ъ. 12Ъ. 13Ъ. 14Ъ и 15Ъ соответственно).

Аминокислотные последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:33. 35 и 37 включают высокоаффинные вариабельные регионы α-цепи МЕЬ ТСВ 8ЕЦ ΙΌ N0:11. 15 и 23 соответственно.

Как должно быть очевидно специалистам в данной области. такие полноразмерные ДНКпоследовательности цепей ТСВ кодируют следующие последовательности: лидерную последовательность и экстрацеллюлярную. трансмембранную и цитоплазматическую последовательности ТСВ.

Указанные здесь полноразмерные последовательности ДНК включают также последовательности. узнающие рестрикционные энзимы для облегчения лигирования в выбранном векторе.

ПЭГилированные ТСВ мономеры

В частном варианте ТСВ связывают по меньшей мере с одной цепочкой (цепочками) полиалкиленгликоля. Такая ассоциация может быть осуществлена с помощью различных методов. известных специалистам в данной области. Предпочтительно полиалкиленовая цепочка (звенья. цепочки) ковалентно присоединяется/присоединяются к ТСВ. В другом варианте полиэтиленгликолевые цепи данного аспекта изобретения включают по меньшей мере два повторяющихся полиэтиленовых звена.

Мультивалентные ТСВ комплексы

Один способ данного изобретения касается мультивалентного ТСВ комплекса. включающего по меньшей мере два ТСВ изобретения. В одном варианте по меньшей мере две молекулы ТСВ связаны через линкерные остатки и образуют мультивалентные комплексы. Предпочтительно эти комплексы водорастворимые. так что линкерную часть следует соответственно подбирать. Кроме того. желательно. чтобы линкерный фрагмент был бы способен присоединяться в определенных положениях молекул ТСВ. так чтобы структурное различие между образованными комплексами было минимальным. Один из таких вариантов изобретения обеспечивается ТСВ комплексом изобретения. где полимерная цепь или последовательность пептидного линкера простирается между аминокислотными остатками каждого ТСВ. которые не находятся в вариабельном регионе последовательности ТСВ.

Так как комплексы данного изобретения могут предназначаться для использования в медицине. линкерные остатки должны подбираться с учетом их фармацевтической пригодности. например. их иммуногенности.

Примеры линкерных фрагментов. которые отвечают вышеупомянутым желательным критериям. хорошо известны в данной области. например. в практике связывания фрагментов антител.

Существуют два класса линкеров. которые предпочтительны для использования при получении мультивалентных ТСВ молекул настоящего изобретения. ТСВ комплекс по изобретению. в котором ТСВ-ы связаны полиалкиленгликолевой цепью. обеспечивает один из вариантов данного аспекта.

Прежде всего в качестве гидрофильных полимеров следует рассмотреть полиалкиленгликоли. Наиболее часто используемым из этого класса является полиэтиленгликоль. или РЕС. структура которого показана ниже

Н0СН2СН20(СН2СН20)_П-СН2СН20Н.

где п больше чем 2.

Однако в основе других линкеров могут быть иные подходящие необязательно замещенные полиалкиленгликоли. включающие полипропиленгликоль и сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля.

Такие полимеры могут использоваться для обработки терапевтических средств или конъюгации с ними. особенно с лекарственными средствами. представляющими собой полипептиды или белки. для достижения благоприятных изменений в отношении РК профиля терапевтического средства. например сниженного ренального клиренса. улучшенного значения показателя «полужизни» плазмы. сниженной иммуногенности и улучшенной растворимости. Считается. что такие улучшения РК профиля РЕСтерапевтических конъюгатов являются следствием того. что РЕС молекула (или молекулы) образуют «оболочку» вокруг терапевтического средства. которые создают стерические затруднения для взаимодействия с иммунной системой и уменьшают протеолитическое разрушение (Саксу с! а1.. (2000) Титог Тагдейшд 4. 235-244). Размер используемого гидрофильного полимера может быть. в частности. подоб

- 7 012507 ран на основе предназначенного терапевтического использования ТСН комплекса. Таким образом, если предполагается, что продукт покидает кровоток и просачивается в ткань, например, при использовании для лечения опухолей, удобно использовать полимеры с низким молекулярным весом порядка 5 кДа. Существует множество обзоров и литературных источников, которые детально раскрывают применение РЕС и подобных веществ в фармацевтических композициях. См., например, Нагл8 (1992) Ро1ус111у1спс С1усо1 Сйетщйу - Вю1есйшса1 апй Вютей1са1 АррНсайопк, Р1епит, Νο\ν Уогк, ΝΥ, или Наглк 2айр§ку (1997) СйетщЦу апй Вю1ощеа1 Аррйсайопз о£ Ро1ус111у1спс С1усо1 АС8 Воокз, \Уа51шщ1оп. Э.С.

Используемый полимер может быть линейным или разветвленным. Разветвленные РЕС-молекулы, а также их производные, могут быть созданы использованием разветвляющихся остатков, в том числе глицерин и олигомеры глицерина, пентаэритритол, сорбитол и лизин.

Как правило, этот полимер должен иметь в своей структуре химически реакционноспособную группу или группы, например, на одном или обоих концах и/или на разветвлениях боковых цепей, обеспечивающие возможность полимера связываться с предназначенными сайтами в ТСН. Эта химически реакционноспособная группа или группы могут быть непосредственно присоединены к гидрофильному полимеру или же должен быть специальный спейсер в виде химической группы или фрагмента между гидрофильным полимером и активным химическим соединением, как показано ниже:

активное соединение - гидрофильный полимер - активное соединение;

активное соединение - спейсер - гидрофильный полимер - спейсер - активное соединение.

Спейсер, используемый для образования конструкций типа показанной выше, может быть любым органическим остатком, который не реакционноспособен, химически стабилен, представляет собой цепочку. Такие спейсеры включают, например, следующие:

(СН2)п, где п=2-5, (СН2)з1МНСО(СН2)2.

ТСН комплекс изобретения, в котором двухвалентный алкиленовый спейсерный радикал располагается между полиалкиленгликолевой цепью и точкой его присоединения к ТСН комплексу, представляет собой еще один вариант этого аспекта изобретения.

Другой вариант этого аспекта представляет собой ТСН комплекс изобретения, в котором цепь полиалкиленгликоля включает по меньшей мере две повторяющиеся единицы полиэтиленгликоля.

На рынок поставляется множество гидрофильных полимеров, связывающихся непосредственно или через спейсер, для активации химических веществ, которые могут использоваться в настоящем изобретении. К поставщикам таких веществ относятся №к!аг Тйегареийск (СА, И8А), ΝΟΕ Согрогайоп (1арап), 8ипЫо (8ои1й Когеа) и Епхоп Рйагтасеийсак (ΝΥ, И8А).

Коммерчески доступные гидрофильные полимеры для активации химических средств, связанные непосредственно или через спейсер, которые могут использоваться в настоящем изобретении, включают (но не только) следующие:

- 8 012507

Характеристика РЕО линкера	Источник	Номер в каталоге
присоединение ТСК мономера
5К линейный (малеимид)	Ыек1аг	2ϋ2ΜΟΗΟ1
20К линейный (малеимид)	ХекХаг	2И2МОНО1
20К линейный (малеимид)	ΝΟΓ Согрогайоп	δϋΝΒΚΙΟΗΤ МЕ-200МА ,
20К разветвленный (малеимид)	ΝΟΕ Согрогайоп	δϋΝΒΚΙΟΗΤ СЬ2- 200МА
ЗОК линейный (малеимид)	ΝΟΕ Согрогайоп	δϋΝΒΚΙΟΗΤ МЕ- 300МА
40К разветвленный РЕО (малеимид)	ХекТаг	2ОЗХОТО1
5Κ-ΝΡ линейный (для присоединения Ьуз)	ΝΟΡ Согрогайоп	δϋΝΒΚΙΟΗΤ МЕХР-50Н
10Κ-ΝΡ линейный (для присоединения	ΝΟΕ Согрогайоп	δϋΝΒΚΙΟΗΤ
Ьуз)		ΜΕΝΡ-10Η
20Κ-ΝΡ линейный (для присоединения	ΝΟΡ СогрогаВоп	δϋΝΒΚΙΟΗΤ
Ьуз) ТСК димерные линкеры		ΜΕΝΡ-20Η
3.4К линейный (малеимид)	Хек!аг	2ϋ2ϋΟΕΟ2
5К разветвленный (малеимид)	Хек1аг	2ϋ2ϋΟΗΟΕ
ЮК линейный (с ортопиридил <3злинкерами в место малеимида)	8ипЬю
20К разветвленный (малеимид)	Хек1аг	2ϋ2ϋΟΡΟΕ
20К линейный (малеимид)	ΝΟΡ Согрогайоп
40К разветвленный (малеимид) ТСК мультимеры более высокого порядка	ХекГаг	2Ώ3ΧΟΤΟΕ
15К, 3 звена, Ма1з (для тримера)	ХекТаг	ΟΙΟΟΝΟ3
20К, 4 звена, МаЦ (для тетрамера)	Хек1аг	ОЮОРО4
40К, 8 звеньев, МаК (для октамера)	Хек1аг	0Ю0Т08

Огромное множество связывающих химических веществ могут использоваться, чтобы связывать молекулы полимеров с лекарственными средствами, которые представляют собой белки или пептиды. Выбор самого подходящего химического связывающего реагента в большой степени зависит от желаемого сайта связывания. Например, следующие связывающие реагенты использовали для присоединения к одному или более концам РЕО молекул (Информация: Иек1аг Мо1еси1аг Епдшееппд Са1а1о§ие 2003):

N - малеимид, винилсульфон, карбонат бензотриазола, пропионат сукцинимидила, бутаноат сукцинимидила, тиоэфир, ацетальдегиды, акрилаты, биотин, первичные амины.

Как упоминалось выше, полимеры, в основе которых не РЕО, также могут быть подходящими для мультимеризации ТСК-ов настоящего изобретения. Например, могут быть использованы остатки, содержащие малеимидные концы, связанные алифатическими цепями, такие как ВМН и ВМОЕ (Р1егсе, продукты № 22330 и 22323).

Пептидные линкеры представляют собой другой класс ТСК линкеров. Эти линкеры включают аминокислотную цепочку и обладают свойством образовывать простые линкеры или домены мультимеризации, на которые могут присоединяться ТСК молекулы. Система биотин/стрептавидин ранее уже использовалась для получения ТСК тетрамеров (см. Ш0/99/60119) в ιη уйго исследованиях связывания. Однако

- 9 012507 стрептавидин - это полипептид микробного происхождения и поэтому не идеально подходит для использования в терапии.

ТСВ комплекс изобретения, в котором ТСВ-ы связаны пептидным линкером, полученным из мультимеризационного домена человека, является одним из вариантов настоящего изобретения.

Есть целый ряд белков человека, которые содержат мультимеризационный домен, который можно было использовать при получении мультивалентных ТСВ комплексов. Например, тетрамеризационный домен р53, который уже использовался для получения тетрамеров 5сРу фрагментов антитела, которые показали повышенную сывороточную персистентность и значительно пониженную скорость диссоциации по сравнению с мономерным 5сРу фрагментом АШибе с1 а1. (2001) 1. ΒίοΙ. Сйеш. 276 (17): 1438514392. Гемоглобин также представляет собой тетрамеризационный домен, который потенциально мог бы быть использован для такого рода применения.

Мультивалентный ТСВ комплекс данного изобретения, включающий по меньшей мере два ТСВ-α, обеспечивает заключительный вариант, в котором по меньшей мере один из указанных ТСВ-ов ассоциирован с терапевтическим средством.

В одном из вариантов ТСВ данного изобретения (или его мультивалентный комплекс) мог альтернативно или дополнительно включать реакционноспособный цистеин на С-конце или Ν-конце его α- или β-цепей.

Диагностическое или терапевтическое применение

В одном аспекте ТСВ изобретения может быть связан с терапевтическим средством или детектируемым остатком. Например, этот терапевтический агент или детектируемый остаток может быть ковалентно связан с ТСВ.

В одном варианте изобретения указанный терапевтический агент или детектируемый остаток ковалентно связан с С-концом одной или обеих ТСВ-цепей.

В одном аспекте ксТСВ или одна, или обе цепи бТСВ-цепи ТСВ-ов настоящего изобретения могут быть мечены детектируемым остатком, например, меткой, которая пригодна для целей диагностики.

Такие меченые ТСВ-ы могут применяться в способе детектирования ААС1С1ЬТУ-НЬА-А*0201 комплекса, причем способ включает контактирование ТСВ лиганда с ТСВ (или мультимерным высокоаффинным ТСВ комплексом), который специфичен по отношению к ТСВ лиганду, и детектирование связывания с ТСВ лигандом.

В тетрамерных ТСВ комплексах, образованных, например, с использованием биотинилированных гетеродимеров, в качестве детектируемой метки может быть использован флуоресцентный стрептавидин. Такой флуоресцентномеченный ТСВ тетрамер пригоден для использования в РАС8 анализе, например, для того, чтобы определить антигенпрезентирующие клетки, несущие ААС1СЬТУ-НЬА-А*0201 комплекс, к которому эти высокоаффинные ТСВ-ы специфичны.

Другой способ, с помощью которого могут быть определены растворимые ТСВ-ы настоящего изобретения, основан на применении ТСВ-специфичных антител, в частности моноклональных антител. Существует множество коммерчески доступных анти-ТСВ антител, таких как αΡΙ и βΡΙ, которые распознают константные домены α- и β-цепей соответственно.

Согласно другому аспекту изобретения ТСВ (или его мультивалентный комплекс) может быть альтернативно или дополнительно ассоциирован с терапевтическим средством (например, ковалентно или какой-либо другой связью), которое может представлять собой токсичный остаток для применения с целью уничтожения (КШшд) клеток или оказывающее иммуноактивное действие вещество, такое как интерлейкин или цитокин. Мультивалентный комплекс ТСВ данного изобретения может обладать повышенной способностью к связыванию с ТСВ лигандом, по сравнению с немультимерным данного типа или гетеродимером Т-клеточного рецептора данного изобретения. Так что мультивалентные ТСВ комплексы согласно изобретению особенно пригодны для слежения или нацеливания на клетки, презентирующие конкретные антигены ίη νίίτο или ίη νίνο, и которые также пригодны как промежуточные для производства уже других ТСВ комплексов, имеющих такое же применение. Эти ТСВ-ы или мультивалентные ТСВ комплексы могут, следовательно, быть представлены в составе фармацевтически приемлемого средства для применения ίη νίνο.

Изобретением также предлагается способ доставки терапевтического средства в клетку-мишень, причем этот способ включает контактирование потенциальных клеток/мишеней с ТСВ или мультивалентным ТСВ комплексом в соответствии с изобретением в условиях, позволяющих присоединение ТСВ или мультивалентного ТСВ комплекса к клетке-мишени, причем указанный ТСВ или мультивалентный ТСВ комплекс специфичен в отношении ААС1С1ЬТУ-НЬА-А*0201 комплекса и несет присоединенное к нему терапевтическое средство.

В частности, растворимый ТСВ или мультивалентный ТСВ комплекс настоящего изобретения может быть использован для доставки терапевтических средств в место локализации клеток, презентирующих конкретный антиген. Это может быть полезно во многих ситуациях и, в частности, против опухолей.

Терапевтическое средство, которое доставляется, должно быть таким, которое проявляет свое действие локально, но не только в отношении к клетке, с которой связывается. Таким образом, одна кон

- 10 012507 кретная стратегия намечает противоопухолевые вещества, связанные с ТСН-ами или с мультивалентными ТСН комплексами в соответствии с изобретением, специфичными к опухолевым антигенам.

Многие терапевтические агенты могут применяться для этой цели, к примеру, радиоактивные соединения, энзимы (перфорин, например) или химиотерапевтические агенты (цисплатин, например). Чтобы обеспечить проявление токсических эффектов в нужном месте, токсин может быть заключен внутрь липосомы, связанной со стрептавидином, так чтобы соединение выделялось медленно. Это должно предотвращать повреждающие эффекты в процессе продвижения в организме и обеспечивать максимальный эффект токсина после связывания ТСН с соответствующими антигенпрезентирующими клетками.

Другие подходящие терапевтические средства включают низкомолекулярные цитотоксические агенты, т.е. соединения, обладающие способностью убивать клетки млекопитающего, имеющие молекулярную массу менее чем 700 дальтон (Да). Такие соединения могут также содержать токсичные металлы, способные оказывать цитотоксическое действие. Кроме того, понятно, что эти низкомолекулярные цитотоксические агенты также включают пролекарства, т.е. соединения, которые разрушаются или подвергаются конверсии при физиологических условиях с высвобождением цитотоксических агентов. Примеры таких агентов включают цисплатин, производные мейтензина, рахельмицин, калихеамицин, доцетаксель, этопозид, гемцитабин, ифосфамид, иринотекан, мелфалан, митоксантрон, сорфимер натрийфотофрин II, темозолмид, топотекан, триметриат глюкуронат, ауристатин Е винкристин и доксорубицин;

пептидные цитокины, т.е. белки и их фрагменты, способные убивать клетки млекопитающих. В том числе, но не только, рицин, дифтерийный токсин, псевдомонадный бактериальный экзотоксин А, ДНКаза и РНК-аза;

радионуклиды, т.е. нестабильные изотопы элементов, которые разрушаются при одновременной эмиссии одного или нескольких факторов: α- или β-частиц или γ-лучей, включая, но не только йод 131, рений 186, индий 111, иттрий 90, висмут 210 и 213, актиний 225 и астатин 213, хелатирующие агенты могут быть использованы для того, чтобы облегчить ассоциацию этих радионуклидов с высокоаффинными ТСН-ами или их мультимерами;

пролекарства, включающие (но не только) антителонаправленные энзимные пролекарства;

иммуностимуляторы, т.е. вещества, которые стимулируют иммунный ответ. Включают (но не только) цитокины, такие как 1Ь-2 и ΙΕΝ, суперантигены и их мутанты, рНЬА комплексы и хемокины, такие как 1Ь-8, тромбоцитный фактор 4, протеин, стимулирующий рост меланомы и т.д., антитела или их фрагменты, активаторы комплемента, ксеногенные белковые домены, домены аллогенных белков, домены вирусных бактериальных белков, виральные или бактериальные пептиды, антитела к Т-клеточным детерминантам (например, анти-СЭЗ или анти-СП28).

Функциональные фрагменты антител и варианты

Фрагменты антител и варианты/аналоги, которые пригодны для использования в композициях и способах, описанных здесь, включают (но без ограничения) следующие.

Фрагменты антител.

Как известно специалистам в данной области, можно получать фрагменты данного антитела, которые сохраняют практически те же характеристики связывания, как и исходное родительское антитело. Далее охарактеризованы детали таких фрагментов.

Минитела - эти конструкции состоят из антител с усеченной Ес частью. Как таковые, они сохраняют цельные связывающие домены антитела, из которого они получены.

ЕаЬ фрагменты - они включают одиночную легкую цепь иммуноглобулина, ковалентно связанную с частью тяжелой цепи иммуноглобулина. Как таковые, ЕаЬ фрагменты содержат один антигенсвязывающий сайт. Отличительной особенностью ЕаЬ фрагментов является часть 1дО, которая высвобождается при обработке папаином. Такие фрагменты обычно получают методами рекомбинантных ДНК (Нссуск е! а1., (2000) Ьсс1игс ΝοΚκ оп 1ттипо1оду (4 111 Εάίΐίοη) РиЬНкйеб Ьу В1аск\\'е11 8с1епсе).

Е(аЬ')₂ фрагменты - они включают оба антитенсвязывающих сайта и шарнирный регион единого (отдельно взятого) антитела. Отличительной особенностью Е(аЬ')₂ фрагментов является часть 1дО, которая высвобождается при обработке пепсином. Такие фрагменты обычно получают методами рекомбинантных ДНК (Кееуек е! а1., (2000) Ьес1иге ΝοΚδ оп 1ттипо1оду (4 11 Εάίΐίοη) РиЬйкйеб Ьу В1аск\уе11 8с1епсе).

Εν фрагменты - они включают иммуноглобулиновый вариабельный тяжелый домен, связанный с иммуноглобулиновым вариабельным легким доменом. Ряд Εν конструкций уже создан. Они включают άδΕν, в которых ассоциация между двумя доменами усилена введенной дисульфидной связью. Альтернативно хсЕу могут быть получены с помощью пептидного линкера для связывания два домена вместе в единый полипептид. Εν конструкции, содержащие вариабельный домен тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина, ассоциированный с вариабельным и константным доменом соответствующей тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина, также уже получены. Εν были также мультимеризованы с получением диател и триател (МаупаМ е! а1., (2000) Аппи. Неу. Вюп^. Епд. 2, 339-376).

Нанотела™ - эти конструкции, поставляемые на рынок АЬ1упх (Ве1дшт), включают синтетический

- 11 012507 вариабельный тяжелый домен отдельного полипептида, полученный из антитела отряда верблюжьих (например, верблюда или ламы).

Доменные антитела - эти конструкции, поставляемые на рынок Эотап115 (Ве1дшт), включают вариабельный тяжелый домен аффинно-зрелого отдельного полипептида или вариабельный легкий иммуноглобулиновый домен.

Варианты и аналоги антител.

Определяющая функциональная характеристика антител в контексте настоящего изобретения - это их способность специфически связываться с намеченным лигандом. Как это известно специалистам в данной области, можно создать целый ряд белков с такими же связывающими характеристиками. Примеры вариантов и аналогов антител, пригодные для использования в композициях и способах настоящего изобретения, включают следующие (но без ограничения указанными ниже).

Созданные на основе каркаса белка связывающие полипептиды. Семейство этих связывающих конструкций включает мутированные аналоги белков, которые содержат нативные связывающие «петли». Примеры включают А££1Ьоб1е8, поставляемые А££1Ьобу (Бетебеп), в основе которых лежит мотив из трех завитков, получаемый из одного из ΙβΟ связывающих доменов белка А 8!арЬу1ососси§ аигеик. Другой пример - продукт, поставляемый под маркой Е\эЬоб1е5. производимый Е\^гоСешх (АийгаПа), в основе которого лежат экстрацеллюлярные домены СТЬА, в которые «пересажены» домены, подобные петлям антитела, где происходит связывание. Еще один пример, Су!окше Тгарк, поставляемый Недепегоп Рйаттасеибсак (И8), получаемый пересадкой рецепторных доменов цитокина на каркас антитела (Ждгеп е! а1., (2000) Сштеп! 0ршюп ш 8!гис!ига1 Ью1оду 7: 463-469), дает обзор использования каркасов для создания новейших конструкций связывающих сайтов в белках. В этом обзоре указаны следующие белки как источники каркасов: СР1 цинковый палец, Тепбатк!а!, Ζ домен (аналог белка А), РСТ1, СоПеб сойк («свернутые в спираль кольца»), ЕАС'Ч-01 и цитохром Ь₅₆₂. В других исследованиях каркасов белков сообщалось об использовании ИЬтопесйп, зеленого флуоресцентного белка (СЕР) и анкириновых повторов.

Как известно специалистам в данной области, можно получить антитела или их фрагменты, варианты, аналоги, которые связываются с различными частями данного белкового лиганда. Например, могут быть созданы анти-СЭ3 антитела к любой из полипептидных цепей, из которых этот комплекс сформирован (т.е. γ, δ, ε, ζ и η СЭ3-цепей). Антитела, которые связываются с ε-цепью СЭ3, являются предпочтительными анти-СЭ3 антителами для использования в композициях и способах настоящего изобретения.

Растворимые ТСН-ы или мультивалентные ТСН комплексы изобретения могут быть связаны с энзимом, способным превращать пролекарство в лекарство. Это обуславливает превращение пролекарства в лекарство только в том сайте, который требуется (т.е. намеченном кТСН).

Полагают, что высокоаффинные ААСЮГЫА (БЕС ΙΌ N0:43)-Н^А-А*0201 специфичные ТСН-ы, охарактеризованные здесь, могут использоваться в способах диагностики и лечения рака.

Что касается лечения рака, близлежащее расположение опухолей и метастаз должно усиливать действие токсинов или иммуностимуляторов. Что касается доставки вакцин, вакцинный антиген может локализоваться вблизи антигенпрезентирующих клеток, усиливая таким образом действенность антигена. Этот метод может быть также применен с целью получения изображений.

Один вариант изобретения обеспечивается выделенной клеткой, презентирующей ТСН изобретения. Например, указанная клетка может быть человеческой Т-клеткой или гемопоэтической стволовой клеткой человека. Другие варианты изобретения обеспечиваются фармацевтической композицией, включающей ТСН или мультивалентный ТСН комплекс изобретения (необязательно связанный с терапевтическим агентом) или совокупность клеток, презентирующих, по меньшей мере, ТСН изобретения, или нуклеиновую кислоту или нуклеиновые кислоты, кодирующие ТСН изобретения, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

Изобретением также предусматривается способ лечения рака, включающий введение субъекту, страдающему от ракового заболевания, эффективного количества ТСН или мультивалентного ТСН комплекса изобретения (необязательно связанного с терапевтическим агентом), или совокупности клеток, презентирующих по меньшей мере один ТСН изобретения, или нуклеиновой кислоты или нуклеиновых кислот, кодирующих ТСН изобретения. Изобретение также предусматривает (как еще один вариант) применение ТСН или мультивалентного ТСН комплекса изобретения (необязательно связанного с терапевтическим агентом) или совокупности клеток, презентирующих по меньшей мере один ТСН изобретения, или нуклеиновой кислоты или нуклеиновых кислот, кодирующих ТСН изобретения, для получения композиции для лечения рака.

Специалисту в данной области будет очевидно, что рак, который будет поддаваться лечению композициями, включающими ТСН-ы данного изобретения, это Ме1ап-А⁺ виды рака.

ТСН-ы данного изобретения терапевтического характера, а также ТСН-ы, позволяющие получать изображения, следует обычно применять как часть стерильной фармацевтической композиции, которая обычно включает фармацевтически приемлемый носитель. Эта фармацевтическая композиция может быть в любой подходящей форме (в зависимости от требуемого пациенту способа введения). Она может быть в виде единичных доз, должна обычно быть упакованной в запечатанный контейнер и может пред

- 12 012507 ставлять собой часть набора. Такой набор может, как правило, (хотя не обязательно) включать инструкции по использованию. Он может включать несколько указанных однократных дозировочных форм.

Фармацевтическая композиция может быть приспособлена для введения любым соответствующим способом, например, парентерально, трансдермально или путем ингаляции, предпочтительно парентеральным (включая подкожным, внутримышечным или наиболее предпочтительно внутривенным) путем. Такие композиции могут быть получены любым известным в фармацевтике методом, например смешиванием активного ингредиента с носителем (носителями) или разбавителем (разбавителями) в условиях стерильности.

Дозировки веществ настоящего изобретения могут варьировать в широком диапазоне, в зависимости от заболевания или состояния, требующих лечения, возраста и состояния индивидуума, которого лечат, и т.д., и врачом будут назначаться дозы, соответствующие конкретному случаю.

Дополнительные аспекты.

зсТСК или 6ТСК настоящего изобретения (которые предпочтительно составлены константными и вариабельными последовательностями, соответствующими человеческим последовательностям) могут быть представлены в практически чистом виде или как очищенный или выделенный препарат. Например, он может быть представлен в форме, которая практически не содержит других белков.

Изобретением также обеспечивается способ идентификации высокоаффинного ТСК, обладающего свойством связываться с ΑΑСIСI^ΤV-Η^Α-Α*0201. характеризующийся тем, что ТСК (ί) включает по меньшей мере один вариабельный домен α-цепи ТСК и/или по меньшей мере один вариабельный домен β-цепи ТСК и (ίί) имеет К_с в отношении указанного комплекса ΑΑСIСI^ΤV-Η^Α-Α*0201 менее 3 рМ, и способ включает:

(a) получение (составление) обширной библиотеки ТСК-ов, включающих вариабельные домены αи β-цепей МЕЬ ТСК, причем один или оба вариабельных домена α- и β-цепей включают мутацию(и);

(b) контактирование вышеупомянутой обширной библиотеки ТСК-ов с ΑΑСIСI^ΤV-Η^Α-Α*0201 в условиях, способных обеспечить связывание ТСК-ов с ΑΑСIСI^ΤV-Η^Α-Α*0201. и (c) измерение К_с взаимодействия.

Существуют предпочтительные особенности каждого аспекта изобретения, так что для каждого из этих аспектов можно предусмотреть соответствующие изменения. Указанные здесь источники из уровня техники включены для полноты изложения, не противоречащей закону.

Примеры

Далее изобретение охарактеризовано следующими примерами, которые никак не ограничивают объем изобретения.

В нижеследующих примерах даны отсылки на приложенные графические материалы.

На фиг. 1а и 1Ь приведены аминокислотные последовательности вариабельного региона β-цепи и вариабельного региона α-цепи нативного МЕЬ ТСК соответственно.

На фиг. 2а и 2Ь приведены соответственно ДНК-последовательности α- и β-цепей растворимых версий нативного МЕЬ ТСК.

На фиг. 3 а и 3Ь приведены экстрацеллюлярные аминокислотные последовательности соответственно α- и β-цепей МЕЬ ТСК, полученные на основе ДНК-последовательностей, приведенных на фиг. 2а и 2Ь.

На фиг. 4а и 4Ь приведены ДНК-последовательности α- и β-цепей растворимых версий МЕЬ ТСК, мутированные включением дополнительных остатков цистеина с образованием ненативной дисульфидной связи. Мутированный кодон в каждой цепи показан штриховкой, а введенные сайты распознавания энзимами рестрикции подчеркнуты.

На фиг. 5а и 5Ь показаны экстрацеллюлярные аминокислотные последовательности соответственно α- и β-цепей МЕЬ ТСК, соответствующие ДНК-последовательностям фиг. 4а и 4Ь. Введенный цистеин в каждой цепи показан штриховкой.

На фиг. 6 показаны аминокислотные последовательности вариабельного региона α-цепей высокоаффинных вариантов МЕЬ ТСК. Мутированные остатки подчеркнуты.

На фиг. 7а показана аминокислотная последовательность усеченной формы ТЕХС.

На фиг. 7Ь показана аминокислотная последовательность усеченной формы ТКВС1.

На фиг. 7с показана аминокислотная последовательность усеченной формы ТКВС2.

На фиг. 8а приведена плазмидная карта плазмиды рЕХ202.

На фиг. 8Ь приведена ДНК-последовательность плазмиды рЕХ202.

На фиг. 9а детально показаны аминокислотные последовательности α-цепей предпочтительного растворимого высокоаффинного варианта МЕЬ ТСК.

На фиг. 9Ь детально охарактеризованы аминокислотные последовательности β-цепей растворимого МЕЬ ТСК дикого типа вместе с кодируемым ТКВС2 константным регионом, слитым с помощью пептидного линкера с человеческим 1Ь-2 дикого типа. Последовательности линкера и 1Ь-2 даны курсивом.

На фиг. 10 приведена кривая В1асоге отклика, полученного в результате взаимодействия растворимого дисульфидсвязанного МЕЬ ТСК дикого типа и ΑΑСIСI^ΤV-Η^Α-Α*0201.

- 13 012507

На фиг. 11а и 11Ь приведены ДНК-последовательность α-цепи полноразмерного МЕЬ ТСН дикого типа, мутированная для повышения экспрессии в человеческих клетках, и соответственно кодируемая ею аминокислотная последовательность.

На фиг. 12а и 12Ь приведены ДНК-последовательность α-цепи полноразмерного высокоаффинного с1 МЕЬ ТСН, мутированная для повышения экспрессии в человеческих клетках, и соответственно кодируемая ею аминокислотная последовательность.

На фиг. 13а и 13Ь приведены ДНК-последовательность α-цепи полноразмерного высокоаффинного с16 МЕЬ ТСН, мутированная для повышения экспрессии в человеческих клетках, и соответственно кодируемая его аминокислотная последовательность.

На фиг. 14а и 14Ь приведены ДНК-последовательность α-цепи полноразмерного высокоаффинного с9 МЕЬ ТСН, мутированная для повышения экспрессии в человеческих клетках, и соответственно кодируемая его аминокислотная последовательность.

На фиг. 15а и 15Ь приведены ДНК-последовательность α-цепи полноразмерного с9 МЕЬ ТСН, мутированная для повышения экспрессии в человеческих клетках, и соответственно кодируемая его аминокислотная последовательность.

На фиг. 16 показаны данные ЕЫ8РОТ анализа, показывающие способность растворимого дисульфидсвязанного варианта высокоаффинного с1 ХУТ Ме1 ТСН ингибировать активацию Ме1-специфичного СТЬ клона.

На фиг. 17а и 17Ь приведены ДНК-последовательности, кодирующие соответственно ОКЕ α-цепи полноразмерного МЕЬ ТСН дикого типа и ОНЕ β-цепи МЕЬ ТСН дикого типа.

На фиг. 18 приведена ДНК-последовательность, кодирующая ОНЕ α-цепи полноразмерного с1 МЕЬ ТСН, включая ДНК-кодоны дикого типа за исключением тех, которые кодируют мутированные аминокислоты.

На фиг. 19а приведены ЕАС8 данные по уровню экспрессии ТСН, достигаемому при трансфекции 1игка1 клеток не оптимизированной по кодонам ДНК, кодирующей а с1 α/ХУТ β МЕЬ ТСН.

На фиг. 19Ь приведены ЕЛС8 данные по уровню экспрессии ТСН, достигаемому при трансфекции 1шка1 клеток оптимизированной по кодонам ДНК, кодирующей а с1 α/ХУТ β МЕЬ ТСН.

На фиг. 20 показаны аминокислотные последовательности вариабельных регионов дополненных αцепей высокоаффинного МЕЬ ТСН. Мутированные остатки подчеркнуты.

На фиг. 21 показаны аминокислотные последовательности вариабельных регионов дополненных αцепей высокоаффинного МЕЬ ТСН. Мутированные остатки подчеркнуты.

На фиг. 22 показаны аминокислотные последовательности α-цепей растворимого высокоаффинного МЕЬ ТСН, включающие ненативный цистеиновый остаток. Этот ненативный цистеиновый остаток высвечен, а мутированные остатки подчеркнуты.

На фиг. 23 показаны аминокислотные последовательности β-цепей растворимого высокоаффинного МЕЬ ТСН, включающие ненативный цистеиновый остаток. Этот ненативный цистеиновый остаток высвечен, а мутированные остатки подчеркнуты.

Пример 1. Получение растворимого дисульфидно-связанного ТСН, включающего вариабельные домены нативного МЕЬ.

На фиг. 4а и 4Ь показаны ДНК-последовательности растворимых дисульфидсвязанных α- и β-цепей МЕЬ ТСН дикого типа, который специфичен в отношении ЛЛ6Ю1ЕТУ-НЕЛ-Л*0201 комплекса. Эти ДНК-последовательности могут синтезироваться бе-ηονο множеством контрактных исследовательских компаний, например бепеЛй (НедепкЬигд, Сегтапу). Распознаваемые рестриктазами сайты также добавлялись к этим ДНК-последовательностям для того, чтобы облегчить лигирование этих ДНКпоследовательностей в экспрессионные плазмиды на основе рСМТ7, которые содержат промотор Т7 для высокоуровневой экспрессии в штамме Е.сой ВЬ21-ЭЕ3 (рЬукЗ), (Рап е! а1., Вю1ес1ис.|ие5 (2000), 29(6): 1234-8).

ДНК последовательности, кодирующие каждую ТСН цепь, усеченные Ыбе I и Ηίηά III, лигируются в различных рЕХ202 рСМТ7 - основанных векторах, которые также были вырезаны с помощью Ыбе I и Ηίηά III (см. на фиг. 8а плазмидную карту рЕХ202 и на фиг. 8Ь - ДНК-последовательность этого вектора (8ЕС ГО ЫО:28)).

Сайты, распознаваемые энзимами рестрикции, используемые для включения в ДНК, кодирующие цепи водорастворимого МЕЬ ТСН дикого типа:

Ыбе I - САТАТС

Ηίηά III - ААССТТ.

Лигирование.

Лигируемые плазмиды переносят в компетентные клетки штамма Е.со11 ХЬ1-голубой и помещают в плашки с ЬВ-агаром, содержащим ампициллин в количестве 100 мг/мл. После этого их инкубируют в течение ночи при 37°С, отдельные колонии отбирают и выращивают в 10 мл ЬВ, содержащего 100 мг/мл ампициллина, в течение ночи при 37°С при встряхивании. Клонированные плазмиды очищают с помощью М1шргер набора (^аден) и инсертные вставки анализируют секвенированием на автоматическом

- 14 012507

ДНК-секвенаторе (Ьагк Тес1ию1од1е5).

На фиг. 5а и 5Ь приведены экстрацеллюлярные аминокислотные последовательности α- и β-цепей соответственно растворимого дисульфидно-связанного МЕЬ ТСК дикого типа, полученные исходя из ДНК-последовательностей, приведенных на фиг. 4а и 4Ь. Сайты, распознаваемые рестриктазами, в этих ДНК-последовательностях подчеркнуты.

Пример 2. Получение высокоаффинных вариантов растворимого с дисульфидными связями МЕЬ ТСК.

Растворимый дисульфидно-связанный нативный МЕЬ ТСК, полученный согласно примеру 1, может использоваться как матрица, с помощью которой можно получать ТСК-ы данного изобретения, которые обладают повышенной аффинностью в отношении ЛЛ6Ю1ЬТУ (8ЕО ГО N0:43) НЬЛ-Л*0201 комплекса.

Фаговый дисплей является одним из средств, с помощью которого могут быть созданы библиотеки Ηΐν Сад ТСК вариантов для того, чтобы определять высокоаффинные мутанты. Например, фаговый дисплей ТСК и способы скринирования, описанные в Ь1 с1 а1., (2005) №1иге Вю1ес11. 23(3): 349-354, могут быть приспособлены и использованы применительно к Ηΐν Сад ТСК-ов.

Аминокислотные последовательности мутированных вариабельных регионов α-цепей мутированного ТСК, которые при сочетании с вариабельным регионом β-цепи МЕЬ дикого типа, проявляют высокую аффинность в отношении ААС1С1ЬШ-НЬА-А*0201 комплекса, приведены на фиг. 6 (8Е0 ГО N0:11-24). Как известно специалистам в данной области, необходимые изменения кодонов, которые требуются для получения этих мутированных цепей, могут быть включены в ДНК, кодирующие эти-цепи, сайт-направленным мутагенезом (Ошск Сйаиде™ 8йе-0йес1ей Ми1адеие818 Кй от 81га1адеие).

В основном, это достигается использованием праймеров, которые включают желаемое изменение (изменения) кодонов, и рЕХ202 плазмид, содержащих релевантную ДНК цепи МЕЬ ТСК в качестве матрицы для мутагенеза.

Мутагенез осуществляют в следующих условиях: 50 нг плазмидной матрицы, 1 цл 10 мМ й№ГР, 5 цл 10 X РГи ДНК-полимеразного буфера, полученного от производителя, 25 пмоль Γ\νά праймера, 25 пмоль геу праймера, 1 цл рГи ДНК-полимеразы в общем объеме 50 цл. После первоначальной денатурационной стадии в течение 2 мин при 95°С реакцию проводили в 25 циклов денатурации (95°С, 10 с), отжига (55°С, 10 с) и удлинения (72°С, 8 мин). Полученный продукт подвергали действию рестрикционного энзима Όρηΐ, чтобы удалить матрицу-плазмиду и трансформировать его в Е.сой штамм ХЬ1 - голубой. Мутагенез был проконтролирован секвенированием.

Пример 3. Экспрессия, рефолдинг и очистка растворимого ТСК.

Экспрессионные рЕХ202 плазмиды, содержащие МЕЬ ТСК α-цепи и МЕЬ ТСК β-цепи, полученные как описано в примерах 1 или 2, вводят раздельно в Е.сой штамм ВЬ21 рЬуз 8, и одинарные колонии с устойчивостью к ампициллину выращивают при 37°С в ТУР (ампициллин 100 цг/мл) среде до 0Ό₆₀₀, равной 0,4, до индуцирования экспрессии белка, с 0,5 мМ 1РТС. Клетки собирают спустя 3 ч после начала индукции, центрифугируя в течение 30 мин при 4000 об/мин на Весктаи 1-6В. Клеточную массу ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ Трис-НС1, 25% (вес./об.) сахарозы, 1 мМ №1-ЭДТА. 0,1% (вес./об.) 10 мМ ЭТТ, рН 8,0. После процедуры замораживания-оттаивания, выполняемой в течение ночи, клетки озвучивали в целом около 10 мин в МПзошсз ХБ2020 устройстве для озвучивания, используя стандартную 12-миллиметровую по диаметру пробу. Осадок телец включения отделяли центрифугированием в течение 30 мин при 13000 об/мин на Весктаи 12-21 центрифуге. Три раза промыли детергентом, чтобы удалить клеточный дебрис и мембранные компоненты. Каждый раз осадок телец включения гомогенизировали в Тгйои буфере (50 мМ Трис-НС1, 0,5% Тгйои-Х100, 200 мМ №С1, 10 мМ №-ЭДТА, 0,1 % (вес./об.) ХаА/Не, 2 мМ ЭТТ, рН 8,0) перед осаждением центрифугированием в течение 15 мин при 15000 об/мин на Весктаи 12-21. Детергент и соли потом удаляли простым промыванием следующим буфером: 50 мМ Трис-НС1, 1 мМ №-ЭДТА, 0,1% (вес./об.) 2 мМ ЭТТ, рН 8,0. Наконец, тельца включения разделили на аликвоты на 30 мг и заморозили при -70°С. Выход белка телец включения определяется количественно растворением 6М гуанидин - НС1 и определением по связыванию с красителем ВгайГогй (РегВю).

Примерно 30 мг ТСК β-цепных и 60 мг ТСК α-цепных солюбилизированных телец включения дают оттаять из замороженных блоков, затем полученные образцы были смешаны и смесь разбавили, вылив ее в 15 мл раствора гуанидина (6М гуанидин-хлорид, 10 мМ ацетата натрия, 10 мМ ЭДТА) для обеспечения полной денатурации цепей. Раствор гуанидина, содержащий полностью разрушенные и денатурированные цепи ТСК, затем инжектируют в 1 л буфера для рефолдинга, который имеет следующий состав: 100 мМ Трис рН 8,5, 400 мМ Ь-аргинина, 2 мМ ЭДТА, 5 мМ восстановленного глутатиона, 0,5 мМ окисленного глутатиона, 5 М мочевины, 0,2 мМ РМ8Е. Реагенты восстановительного сочетания 2меркаптоэтиламин и цистамин (до конечных концентраций 6,6 мМ и 3,7 мМ соответственно) добавляют приблизительно за 5 мин до добавления денатурированных ТСК-цепей. Раствор оставляют на 5 ч±15 мин. Рефолдированный ТСК диализуют с помощью 8рес1гарог 1 мембраны (8рес1гит; Ргойис! №. 132670) против 10 л 10 мМ Трис рН 8,1 при 5±3°С в течение 18-20 ч. После этого диализный буфер заме

- 15 012507 няют на свежий 10 мМ Трис рН 8,1 (10 л) и диализ продолжают при 5±3°С еще 20-22 ч.

§ТСВ продукт отделяют от разрушенных продуктов и примесей, нанеся диализованный рефолд на анионообменную колонку РОВОС 50НО и элюируя связанный белок градиентом 0-500 мМ ЫаС1 в пределах 50 колоночных объемов, используя Ак1а ршгГег (Рйогшас1а). Фракции, соответствующие пикам, хранили при 4°С и анализировали с использованием кумасси-окрашенного 8Ό8-ΡΑΟΕ перед тем, как их собрать и концентрировать. Наконец, §ТСВ очищают и характеризуют, используя гель-фильтрационную колонну 8ирегбех 200 НВ, предварительно уравновешенную НВ8-ЕР буфером (10 мМ ΗΕΡΕ8 рН 7,4, 150 мМ №1С1. 3,5 мМ ЭДТА, 0,05% пошбе! р40). Собирают фракцию, элюируемую при соответствии молекулярной массе приблизительно 50 кВа, концентрируют ее прежде, чем подвергнуть анализу с помощью В1асоге метода поверхностного плазмонного резонанса.

Пример 4. Характеристика §ТСВ, связывающегося со специфическим рМНС, полученная В1А-соге методом поверхностного плазменного резонанса.

Биосенсор поверхностного плазменного резонанса (В1асоге 3000™) использовали для анализа связывания растворимых МЕЬ ТСВ-ов с родственным пептид-МНС лигандом. Это обеспечивалось тем, что получали отдельные рМНС комплексы (описанные ниже), которые затем иммобилизовали на стрептавидинсодержащий связывающей поверхности полуориентированным образом, позволяющим проводить эффективную проверку связывания растворимого Т-клеточного рецептора с четырьмя различными МНС (иммобилизованными на отдельно движущихся в потоке клетках) одновременно. Впрыскивание НЬА комплекса, производимое вручную, обеспечивает точный уровень содержания иммобилизованных молекул класса I с тем, чтобы ими было легко манипулировать.

Биотинилированные молекулы класса I НЬА-А*0201 были подвергнуты рефолдингу ίη уйго, исходя из экспрессируемых бактериями телец включения, содержащих составляющие субъединичные белки и синтетический пептид, с последующей очисткой и ίη νίΙΐΌ энзиматическим биотинилированием (О' Са11адйап е! а1. (1999) Апа1. Вюсйеш. 266: 9-15). НЬА-А*0201 - тяжелая цепь экспрессировалась с Сконцевой биотинилированной метки, что заменяет трансмембранные и цитоплазмические домены белка на соответствующий конструкт. Были получены уровни экспрессии телец включения ~75 мг/л бактериальной культуры. МНС легкая цепь или в2-микроглобулин также экспрессировался в тельцах включения в Е.сой с соответствующего конструкта, в количестве ~500 мг/л бактериальной культуры.

Клетки Е.сой лизировали и выделяли тельца включения с чистотой примерно 80%. Белок из телец включения денатурировали в 6М гуанидин-НС1, 50 мМ Трис рН 8,1, 100 мМ ЫаС1, 10 мМ ОТТ, 10 мМ ЭДТА, и подвергали рефолдингу при концентрации 30 мг/л тяжелой цепи, 30 мг/л β2ιη в 0,4 М Ьаргинин-НС1, 100 мМ Трис рН 8,1, 3,7 мМ цистамина, 6,6 мМ β-цистеамина, 4 мг/мл АЛбЮГЬТУ пептида, необходимых для присоединения молекулы НЬА-А*0201 путем одномоментного добавления денатурированного белка в рефолд-буфер при температуре ниже 5°С. Рефолдинг достигал полного завершения в течение по крайней мере 1 ч при 4°С.

Затем меняли буфер диализом в 10 объемах 10 мМ Трис рН 8,1. Две замены буфера необходимы для существенного уменьшения ионной силы раствора. Затем раствор белка фильтровали через 1,5 цм ацетатцеллюлозный фильтр и наносили на анионообменную колонку РОВО8 50 НО (объем слоя 8 мл). Белок элюировали линейным градиентом 0-500 мМ №1С1. НЬА-А*0201 - пептидный комплекс элюировали при примерно 250 мМ №1СТ фракции пиков собирали, добавляли смесь ингибиторов протеаз (Са1Ьюсйеш) и эти фракции охлаждали на льду.

Для меченных биотинилированием рМНС молекул заменяли буфер на 10 мМ Трис рН 8,1, 5 мМ №СТ используя Рйагшаста колонку быстрого обессоливания, уравновешенную тем же буфером. Сразу же после элюции белоксодержащие фракции охлаждали на льду и добавляли смесь ингибиторов протеаз (Са1Ьюсйеш). Были добавлены следующие реагенты биотинилирования 1 мМ биотин, 5 мМ АТР (забуференного до рН 8), 7,5 мМ МдС1₂ и 5 цг/мл В1гА энзим (очищенный согласно О' Са11адйап е! а1. (1999) Апа1. Вюсйеш. 266: 9-15). Затем смесь оставляли инкубироваться на ночь при комнатной температуре.

Биотинилированные рНЬА-А*0201 молекулы очищали гель-фильтрационной хроматографией. Колонка Рйатшаста 8ирегбех 75 НВ 10/30 была предварительно уравновешена отфильтрованным РВ8 и затем 1 мл реакционной смеси биотинилирования наслаивали на колонку и затем пропускали РВС со скоростью 0,5 мл/мин. Биотинилированные рНЬА-А*0201 молекулы элюировались одиночным пиком объемом примерно 15 мл. Фракции, содержащие белок, собирали, охлаждали на льду и добавили смесь ингибиторов протеаз. Концентрацию белка определяли, используя Соошакые-связывающий метод анализа (РегВю), аликвоты биотинилированных рНЬА-А*0201 молекул были заморожены при -20°С. Был иммобилизирован стрептавидин стандартными аминосвязывающими методами. Такие иммобилизованные комплексы способны связывать как рецепторы Т-клеток, так и корецептор СО8аа, причем и те, и другие могут вводиться в растворимой фазе. Специфическое связывание ТСВ происходит даже при низких концентрациях (по меньшей мере 40 цг/мл), при этом подразумевается, что ТСВ относительно стабилен. Установлено, что связывающие рМНС свойства §ТСВ качественно и количественно аналогичны, независимо от того, используется §ТСВ в растворимом или иммобилизованном виде. Это является важным средством контроля частной активности растворимых образцов и также наводит на мысль, что биотини

- 16 012507 лированные рМНС комплексы так же биологически активны, как и небиотинилированные комплексы.

Взаимодействия между растворимыми МЕЬ ТСК-ами, содержащими новую, неизвестную межцепочечную связь, и родственным рМНС или нерелевантной комбинацией рМНС, получение которой описано выше, анализировали с помощью В1асоге 3000™ биосенсора поверхностного плазмонного резонанса (8РК). 8РК измеряет изменения рефрактивного индекса, выражаемого в единицах отклика (КИ) вблизи поверхности сенсора внутри небольшой проточной ячейки, принцип которого может использоваться для определения взаимодействий между рецептором и лигандом и позволяет анализировать их аффинность и кинетические параметры. Проточные ячейки, содержащие пробы, готовили иммобилизацией конкретных отдельных НЬА-пептидных комплексов в отдельных проточных ячейках, осуществляя связывания между биотином поперечно-сшитым на 32т и стрептавидином, который был поперечно сшит с активированной поверхностью проточных ячеек. Это исследование выполнялось при пропускании зТСК над поверхностями различных, не схожих проточных ячеек при постоянной скорости протока и измерении отклика 8РК в текущий момент выполнения.

Измерение константы равновесного связывания.

Готовили серийные разбавления МЕЬ зТСК, мутированных или дикого типа, и впрыскивали их при постоянной скорости протока, равной 5 рл/мин, над двумя различными проточными ячейками; одна покрыта примерно 1000 Ки специфичного ААОЮ1ГТУ-НГА-А*0201 комплекса, вторая покрыта примерно 1000 КИ неспецифичного НЬА-А2-пептидного комплекса. Отклик был нормализован для каждой концентрации с помощью измерения фона в контрольной ячейке. Нормализованный уровень отклика наносили против величины концентрации образца ТСК и подгоняли гиперболу для того, чтобы вычислить константу равновесия связывания, К_о (Рпсе & 1)мек, Ргтс1р1ез апб РгоЫетз ΐη Рйу81са1 Сйет181гу Юг Вюсйет1818 (2^1к| Εάΐΐίοη) 1979, С1агепбоп Ргезз, ОхГогб).

Измерение кинетических параметров.

Для высокоаффинных ТСК-ов К_о определяли экспериментально, измеряя константу скорости диссоциации к_а, и константу скорости ассоциации к_а. Константу равновесия вычисляли как к_а/к_а.

ТСК впрыскивали в две разные ячейки, одна - с покрытием ~300 Ки специфичного НЬА-А2-ААОЮ1ЬТУ комплекса, другая - с покрытием ~300 Ки неспецифичного НГА-А2 - пептидного комплекса. Скорость протока составляла 50 рл/мин. Обычно впрыскивали 250 рл ТСК при ~3 рМ концентрации. Затем пропускали буфер, пока уровень отклика не возвращался к исходному. Кинетические параметры вычисляли, используя В1аеуа1иа1юп программное обеспечение. Фазу диссоциации также подгоняли к простому уравнению экспоненциального снижения, позволяющему вычислить срединный уровень «полужизни».

Результаты.

Взаимодействие между растворимым дисульфидно-связанным МЕЬ ТСК дикого типа (состоящим из α и β ТСК цепей, охарактеризованных на 8Ер ГО N0: 9 и 10 соответственно) и ААОЮГОТУ-НЬАА*0201 комплексом анализировали с помощью вышеуказанного способа, и оно показало К_о, равное 4 рМ (см. фиг. 12 для В1асоге кривой отклика).

ТСК-ы, характеризующиеся применением вариабельных регионов, указанных в нижеследующей таблице, имеют К_о менее или равный 3 рМ. Учитывая опыт с высокоаффинными ТСК-ами, отличными от имеющихся МЕЬ ТСК-ов (см., например, Ь1 е! а1., №1иге Вю1есй. 2005, 23 (3):349-354), ожидали, что некоторые или все из ТСК-ов, перечисленных в нижеследующей таблице, будут иметь К_о^, равный 1 х10^-3 8^-1 или ниже, и на самом деле было показано, что это имело место с образцами растворимых ТСК, включающих эти вариабельные домены (см. таблицу).

В1асоге данные взаимодействия высокоаффинных растворимых дисульфидно-связанных МЕЬ ТСК-ов, включающих определенные вариабельные регионы и родственного АА0101ЬТУ-НЬА-А*0201 - пептид - МНС

- 17 012507

2

21	2
22	2
23	2
24	2
47	2
48	2
49	2
50	2
51	2
52	2
53	2
11	54
11	55 .
И	56
11	57
И	58
11	59
11	60
11	61
11	62
11	63
11	64
и	65

66

11	67
Последовательность вариабельного региона альфа цепи, 8Е(2 ГО ΝΟ:	Последовательность вариабельного региона бета цепи, 8Ε(2Π)ΝΟ:	Аффинность (КО), нМ	Скорость диссоциации (Кой), 1/8
11	2	6.4	3.26 х 10'3
47	2	6.1	1.21 х 10’3
48	2	3.2	6.56 х 10·4
53	2	10.6	1.8 х 10’3
11	54 1	0.42	2.3 х 10·4
И	55	0.52	2.04 х 10'3
11	56	0.82	2.2 х 10·4
И	57	0.61	1.73 х 10·4
11	58	0.40	1.55 х ΙΟ4
11	62	0.57	2.06 х 10·4
И	65	1.0	1.14 х 10·4
11	66	1.9	1.62 х 10·4

Пример 5. Получение слитого белка на основе растворимого высокоаффинного МЕЬ ТСК и ШТ человеческого 1Ь-2.

Способы, конкретно описанные в примерах 1-3, могут использоваться для получения слитого белка на основе растворимого высокоаффинного МЕЬ ТСК и ШТ человеческого 1Ь-2. Кратко говоря, ДНК, кодирующую желаемый линкер, и ШТ человеческий 1Ь-2, добавляют к З'-концу ДНКпоследовательности растворимого дисульфидно-связанного β-цепи МЕЬ ТСК дикого типа непосредственно до ТАА («81ор») кодона. На фиг. 9Ь показана аминокислотная последовательность слитого белка, включающего β-цепь дисульфидно-связанного МЕЬ ТСК дикого типа, слитую с ШТ человеческого 1Ь-2 через линкерную последовательность (8Е^ ΙΌ N0:30). Линкер и 1Ь-2 часть, входящая в состав данного слитого белка, показаны курсивом. ДНК, кодирующая этот конструкт, затем была лигирована в рЕХ202. Слитый белок в виде «растворимого высокоаффинного МЕЕ ТСК-1Е-2» может затем экспрессироваться при сочетании этого слитого белка на основе β-цепи с α-цепью растворимого высокоаффинного дисульфидно-связанного МЕЕ ТСК, содержащей один из вариабельных регионов, показанных на фиг. 6 (8Е^ ΙΌ N0:11-24), с использованием способов, практически описанных в примере 3. Например, на фиг. 9а (8Е^ ΙΌ N0:29) показана аминокислотная последовательность α-цепи растворимого высокоаффинного

- 18 012507 дисульфидно-связанного МЕЬ ТСК, содержащая вариабельный регион, показанный на 8ЕО ГО N0:11.

Пример 6. ЕБ18Р0Т анализ для оценки ш уЕго ингибирования активации цитотоксических Т-клеток (СТЬ) с помощью растворимых высокоаффинных Ме1 С1 с АТ Ме1 ТСК-ов.

Нижеследующий способ обеспечивает средства для оценки способности Ме1 с1 с АТ - высокоаффинных Ме1 ТСК-ов ингибировать активацию АА0I0I^ТV-Н^А-А*0201 - реактивных Т-клеточных клонов.

Растворимый Ме1 с1 с АТ - высокоаффинный Ме1 ТСК, используемый в данном опыте, содержал вариабельный домен α-цепи Ме1 ТСК и вариабельные регионы (8Е0 ГО N0:11) и (8Е0 ГО N0:2) β-цепи АТ Ме1 ТСК соответственно. Полные аминокислотные последовательности ТСК α- и β-цепей этого растворимого дисульфидно-связанного ТСК показаны на фиг. 9а (8Е0 ГО N0:29) и на фиг. 5Ь (8Е0 ГО N0:10) соответственно.

Реагенты.

Среда исследования: 10% ЕС8 (инактивированный теплом, 01Ьсо, са! # 10108-165), 88% КРМ1 1640 (01Ьсо, са! # 42401-018), 1% глутамин (01Ьсо, са! # 25030-024) и 1% пенициллин стрептомицин (01Ьсо, са! # 15070-063).

Промывочный буфер: 0,01 М РВ8/0,05% Твин 20 (1 саше фосфатно-солевого буфера с Твином 20, рН 7,4 от 81дта, СаГ # Р-3563, растворенные в 1 л дистиллированной воды, дает конечную композицию 0,01 М РВ8, 0,138 М №С1, 0,0027 М КС1, 0,05% Твин 20).

РВ8 (01Ьсо, саГ # 10010-015)

Э|ас1опе Е118ро! набор (ГО8) Е118ро! набор содержит все остальные требующиеся реагенты, то есть антитела для иммобилизации и для определения, сухое обезжиренное молоко, В8А, стрептавидин - щелочная фосфатаза, ВСЧР^ВТ раствор (человеческий 1Е№у Р'УОЕ Ей - зро! 20x96 ячеечных планшетов (ТО8 са! # ОС-856, 051.020, 0С-856.000.000)).

Нижеследующее описание способа основано на инструкциях производителей, которыми снабжается каждый набор, но с некоторыми изменениями.

Способ.

100 цл иммобилизованного антитела растворили в 10 мл стерильного РВ8 в расчете на 1 ячейку. 100 цл растворенного иммобилизованного антитела аликвотно наносили в каждую ячейку и оставляли на ночь при 4°С или 2 ч при комнатной температуре. Затем ячейки промыли три раза 450 цл промывочного буфера, ИИгатазЕ промывателем 96-луночных планшетов (ТЕегто Ь1Ге 8с1епсез), чтобы удалить избыток иммобилизованных антител. 100 цл 2% обезжиренного молока было затем добавлено в каждую ячейку (один пузырек с сухим обезжиренным молоком из тех, которые поставляются с ЕЫ8Р0Т набором, растворили в 50 мл стерильного РВ8). Планшеты затем инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч, затем промывали трижды 450 цл промывочным буфером, ЦЦгатазЕ промывателем для 96-луночных планшетов (ТЕегто ЫГе 8с1епсез).

Клетки-мишени рака Ме1 624 и Ме1 526 выделяли из соответствующих прокультивированных тканевых культур, используя трипсин, промывали один раз, центрифугируя (280хд в течение 10 мин) в среде для анализа, и ресуспендировали при 1х10⁶/мл той же самой среды. 50 мл этой суспензии затем добавили на планшет для анализа с получением общего количества клеток-мишеней 50000 клеток/на ячейку.

Импульсированные Е^АΟIΟI^ТV клетки Т2 мишени также были использованы как контроль. Этот аналогичный пептид был использован, так как он имеет большую аффинность в отношении МЬАА*0201, чем АТ пептид. Эти импульсированные пептидами клетки были промыты при центрифугировании (280 хд в течение 10 мин) в среде для анализа и ресуспендированы при 1 х 10⁶ клеток/мл той же среды. 50 мкл этой суспензии затем добавили на планшет для анализа с получением общего количества клеток мишеней 50000 клеток/на ячейку.

Клон Т-клеток (КА/С5), подвергнутых аутологичной стимуляции Е^АΟIΟI^ТV пептидом, собирали центрифугированием (280хд в течение 10 мин) и ресуспендировали при 1х 10⁵ клеток/мл в среде для анализа с получением концентрации 500 клеток/на ячейку при добавлении на планшет для анализа. Растворимые высокоаффинные МЕЬ ТСК-ы МЕЬ с1 с АТ высокоаффинного Ме1 ТСК разбавили средой для анализа в 3Х концентрации с получением 1Х конечной при добавлении 50 мкл на планшет до конечного объема 150 мкл. Диапазон концентраций исследуемых высокоаффинных Ме1 ТСК-ов был 1 цМ-1 нМ.

Затем готовили ячейки, в которых содержалось (конечный реакционный объем в каждой ячейке был 100 цл):

Анализируемые образцы (добавлялось в указанном порядке) мкл Ме1 624 или Ме1 526 клеток+мишеней мкл растворимого высокоаффинного Ме1 с1 с АТ ТСК-ов желаемой концентрации мкл эффекторных клеток клеточного клона КА/С5

Негативные контроли мкл клеток мишеней мкл растворимого высокоаффинного Ме1 с1 с АТ ТСК-ов самой высокой концентрации мкл среды для анализа и

- 19 012507 цл эффекторных клеток цл растворимого высокоаффинного Ме1 с1 с АТ ТСВ-ов самой высокой концентрации цл среды для анализа и цл эффекторных клеток цл клеток-мишеней цл растворимого нерелевантного (НЬЛ-Л*0201 - Тах - специфичного) высокоаффинного тТСВ с самой высокой концентрацией

Позитивный контроль цл Ме1 624. Ме1 526 или пептидно-пульсированных Т2 мишенных клеток цл эффекторных клеток цл среды для анализа

Планшеты затем инкубировали в течение ночи при 37°С/5% С0₂. Затем планшеты промывали 6 раз промывочным буфером и стряхнули его избыток. Затем добавляли 550 цл дистиллированной воды в каждый сосуд для определения антител. снабженный ЕЫ8Р0Т набором для приготовления разбавленного раствора. 100 цл разбавленного раствора определения антител далее разбавили в 10 мл РВ8/1% В8Л на планшет и 100 цл разбавленного раствора определения антител аликвотно разливали в каждую ячейку. Затем планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 90 мин.

После этого планшеты промывали три раза промывочным буфером (три раза по 450 цл промывочного буфера. ийга^акЕ промыватель 96-луночных планшетов (Тбегто Ы£е 8с1епсек) и стряхнули досуха. 10 цл стрептавидина - щелочной фосфатазы затем разбавили 10 мл РВ8/1% В8Л на планшет и 100 цл разбавленного стрептавидина добавили в каждую ячейку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем планшеты промывали 3 раза по 450 цл промывочного буфера и стряхнули досуха.

В каждую ячейку добавили 100 цл ВСГР/ЫВТ. планшеты накрывали фольгой и оставляли на

5-15 мин. В течение этого времени планшеты регулярно просматривают на предмет образования пятна (пятен) для того. чтобы решить. закончилась ли реакция.

Планшеты затем тщательно промыли водой и досуха стряхнули и оставили сушиться.

Ставшие сухими планшеты подвергли считыванию с помощью ЕЫ8Р0Т считывателя (ЛЩоиптип П1адиокбка. Сегтапу).

Количество появившихся в каждой ячейке пятен прямо пропорционально числу активированных Тклеток. Следовательно. любое снижение числа пятен в ячейках. содержащих высокоаффинный Ме1 ТСВ. показывает ингибирование активации клона КА/С5 СТЬ.

Результаты.

Как показано на фиг. 16. растворимые с1 с АТ высокоаффинные Ме1 ТСВ-ы были эффективны в плане ингибирования активирования КА/С5 СТЬ клона. Эти данные показывают. что 100% ингибирование СТЬ активирования достигалось при 1 цМ водорастворимых с1 с АТ высокоаффинных Ме1 ТСВ-ов.

Пример 7. Сравнение уровней экспрессии ТСВ в 1игка! клетках. трансфицированных кодоноптимизированой и кодон-неоптимизированной ДНК. кодирующей высокоаффинный (с1 а АТЩ МЕЬ ТСВ 4х10⁶ 1игка! клеток. выращенных в ВМИ. содержащей 10% инактивированных теплом фетальных клеток теленка. выращенных на среде с сывороткой. были промыты бессывороточной средой и трансфицированы следующим:

a) 5 цг безэндотоксинной плазмидой рС'Тпео. содержащей кодон-оптимизированную последовательность. кодирующую МЕЬа с 1 мутантную полноразмерную ТСВ цепь. плюс 5 цг безэндотоксинной плазмиды рСЕ содержащей некодон-оптимизированную последовательность. кодирующую МЕЬв \\1 полноразмерную ТСВ цепь (0КЕ-ы этих последовательностей показаны на фиг. 18 (8ЕЦ ΙΌ N0:46) и фиг. 17Ъ (8ЕЦ ΙΌ N0:45) соответственно). или

b) 5 цг безэндотоксинной плазмидой рС'Тпео. содержащей 0КЕ кодон-оптимизированную МЕЬа с1 мутантную полноразмерную ТСВ цепь. плюс 5 цг безэндотоксинной плазмиды рСЕ содержащей 0ВЕ кодон-оптимизированной МЕБ-β \\1 полноразмерную ТСВ цепь (0ВЕ-ы этих последовательностей показаны на фиг. 12а (8ЕЦ ΙΌ N0:33) и фиг. 17Ъ (8ЕЦ ΙΌ N0:39) соответственно).

Трансфекцию осуществляли электропорацией. используя 0.4 см кюветы при 0.27 кв и 975 цЕ в ВюВаб Сепери1кег аппарате.

Клетки помещали в 6 мл ВРМЕ содержащую 20% инактивированной теплом фетальной сыворотки теленка. при 37°С в течение 72 ч.

Клетки окрашивали в объеме 100 цл РВ8. используя 1 цл (0.54 цг) РЕ - меченного р/НЬЛ-Л2 тетрамера на основе стрептавидина (пептид был либо гетероциклический МЕЬ пептид ЕЬЛСЮГЕТУ или негативный контроль НУ-Е80 пептид 8ЬЬ МАГГЦС). Спустя 20 мин при комнатной температуре клетки промывали один раз 5 мл ВР!^ и ресуспендировали в 800 цл ВРМ[ и анализировали с помощью ЕС 500 Весктап СоиЙег установки.

Результаты.

ЕЛС8 данные по окрашиванию. показанные на фиг. 19а и 19Ъ. отражают степень окрашивания род

- 20 012507 ственного рМНС тетрамера, полученную с помощью Лигка! клеток, трансфицированных кодоннеоптимизированной и кодон-оптимизированной ДНК, кодирующей с1 α. ШТ β МЕБ ТСК. Эти данные показывают, что высокий уровень экспрессии поверхности ТСК был достигнут с помощью использования кодон-оптимизированной ДНК, по сравнению с уровнем, достигнутым при использовании соответствующей кодон-неоптимизированной ДНК.

Claims (19)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Т-Клеточный рецептор (ТСК), обладающий свойством связываться с ААОЮ1БТУ-НБА-А*0201 и включающий по меньшей мере один вариабельный регион ТСК α-цепи, имеющий последовательность 8ЕС) ΙΌ ΝΟ:1, у которой одна или несколько аминокислот 28Ό, 29К, 30О, 318, 49М, 51Ι, 538, 54Ν, 72Υ, 94У, 95А, 96О, 97К, 988 и 99Т мутирована/мутированы, и по меньшей мере один вариабельный регион ТСК β-цепи, имеющий последовательность 8ЕС) ΙΌ ΝΟ:2, у которой одна или несколько аминокислот 45Б, 518, 52У, 53О, 54Ι, 76Ι, 100О, 101Т, 102О, 103Е, 104Б и 105Р мутирована/мутированы, и характеризующийся тем, что имеет К_о в отношении указанного комплекса ААОЮББТУ-НБА-А*0201 менее или равный 3 цМ и/или скорость диссоциации (к_о^), равную 1 х 10^-3 8^-1 или ниже.
2. 2. Т-Клеточный рецептор по п.1, включающий одну или несколько мутаций вариабельного региона α-цепей, соответствующих

   28ϋ—Р, 28ϋ—>Υ, 280—8, 28ϋ—Ν, 29К—О, 29К—Б, 29К—I, 29К—Р, 300—Н,

   318—А, 49М—I, 511—>Т, 538—К, 54Ν—Е, 72Υ—Н, 94У—ϋ, 94У—Р, 94У-8, 94У—Б, 94Υ-4-Ν, 95А—О, 95А—8, 95А—Е, 960—Ν, 960—Р, 960—V, 960—М, 960—Б, 960—К, 97К—К, 97К—Υ, 97К—>У, 97К—Б, 97К—Н, 97К—О, 97К—I, 97К—Р, 988—Б, 988—М, 988—К, 99Т—Б или 99Т—К, используя нумерацию 8Εζ) ГО N0:1.
3. 3. Т-Клеточный рецептор по п.1 или 2, включающий одну или несколько мутаций вариабельного региона β-цепей, соответствующих

   45Б-Р, 518—Υ, 518—Р, 518—Ш, 52У—О, 530—Р, 541—Р, 54—Υ, 761—V,

   100С—Ν, 101Т—Μ, 101Т—Б, 101Т—V, 1020—8, 1020—Ν, 1020—Т, ЮЗЕ—О, 104Б—V/, 105Р—8, 105Р—А, 105Р—О, 105Р—ϋ или 105Р—Е, используя нумерацию 8Е0 ГО N0:2.
4. 4. Т-Клеточный рецептор по п.1 или 2, включающий одну из аминокислотных последовательностей вариабельного региона α-цепей в 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 11-24 или 47-53.
5. 5. Т-Клеточный рецептор по п.1 или 4, включающий одну из аминокислотных последовательностей вариабельного региона β-цепей в 8ЕС) ΙΌ ΝΟ:54-67.
6. 6. Т-Клеточный рецептор по п.3, включающий соединенные парами вариабельные регионы α- и βцепей, показанные в следующей таблице:

   - 21 012507

   Последовательность вариабельной области альфа-цепи, 8Е(2 ГО N0: 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 47 48 49 50 51 52 53 11 И 11 И 11 11 11 11 11 11 И И И 11

   Последовательность вариабельной области бета-цепи, 8Εζ) ГО N0: 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67
7. 7. Т-Клеточный рецептор по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий аминокислотную последовательность константной области α-цепи, показанную на 8Е^ П) N0:25, и/или одну из аминокислотных последовательностей константных областей β-цепей в 8Е^ П) N0:26 и 27.
8. 8. Растворимый Т-клеточный рецептор, включающий аминокислотную последовательность α-цепи 8Е^ П) N0:29 и аминокислотную последовательность β-цепи 8Е^ П) N0:10.
9. 9. Растворимый Т-клеточный рецептор, включающий аминокислотную последовательность α-цепи 8Е^ П) N0:68 и аминокислотную последовательность β-цепи 8Е^ П) N0:10.
10. 10. Растворимый Т-клеточный рецептор, включающий аминокислотную последовательность α-цепи 8Е^ П) N0:69 и аминокислотную последовательность β-цепи 8Е^ П) N0:10.
11. 11. Растворимый Т-клеточный рецептор, включающий аминокислотную последовательность α-цепи 8Е^ П) N0:70 и аминокислотную последовательность β-цепи 8Е^ П) N0:10.
12. 12. Растворимый Т-клеточный рецептор, включающий аминокислотную последовательность α-цепи 8Е^ П) N0:29 и аминокислотную последовательность β-цепи 8Е^ П) N0:71.
13. 13. Растворимый Т-клеточный рецептор, включающий аминокислотную последовательность α-цепи 8Е^ П) N0:29 и аминокислотную последовательность β-цепи 8Е^ П) N0:72.
14. 14. Растворимый Т-клеточный рецептор, включающий аминокислотную последовательность α-цепи 8Е^ П) N0:29 и аминокислотную последовательность β-цепи 8Е^ П) N0:73.
15. 15. Растворимый Т-клеточный рецептор, включающий аминокислотную последовательность α-цепи 8Е^ П) N0:29 и аминокислотную последовательность β-цепи 8Е^ П) N0:74.
16. 16. Растворимый Т-клеточный рецептор, включающий аминокислотную последовательность α-цепи 8Е^ П) N0:29 и аминокислотную последовательность β-цепи 8Е^ П) N0:75.
17. 17. Растворимый Т-клеточный рецептор, включающий аминокислотную последовательность α-цепи

    - 22 012507

    8Е^ ΙΌ N0:29 и аминокислотную последовательность β-цепи 8Е^ ΙΌ N0:76.
18. 18. Растворимый Т-клеточный рецептор, включающий аминокислотную последовательность α-цепи 8Е^ ΙΌ N0:29 и аминокислотную последовательность β-цепи 8Е^ ΙΌ N0:77.
19. 19. Растворимый Т-клеточный рецептор, включающий аминокислотную последовательность α-цепи 8Е^ ΙΌ N0:29 и аминокислотную последовательность β-цепи 8Е^ ΙΌ N0:78.