JPH06501620A - 可溶性マンノース受容体ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 可溶性マンノース受容体ペプチド 発明の背景 本発明は、診断用化合物を包含する抗微生物および抗ウィルス化合物の一般的分 野、ならびに該化合物を製造および使用するための方法および試薬に関する。

抗微生物剤として、感染性細胞の代謝過程を妨げる化合物を使用することが知ら れている。例えば、スルホンアミド類の抗菌剤は、ｐ−アミノ安息香酸の構造的 アナログとして、感受性微生物におけるプリンヌクレオチド合成を妨げ、一方、 ペニシリンは、細胞壁の生合成の最終段階の完了を妨げる。

例えばＡＺＴやスラミンのような多数の抗ウィルス剤は、レトロウィルス特有の 酵素である逆転写酵素を標的とすることによりそれらの効畢を発現する。ＡＺＴ は、ヒト免疫不全ウィルス１型（ＨＩＶ−１）により起こる後天性免疫不全症候 群（ＡＩＤＳ）の患者の治療のために既に認可されている。もう一つの抗ウィル ス剤のポリアニオン性化合物であるデキストラン硫酸は、ピリオンが標的細胞に 結合するのを妨害する。可溶性マンノース結合タンパク質は、レトロウィルスの エンベロープ糖タンパク質上で発現される高マンノースグリカンに結合すること により、ＨＩＶ−１によるＨ９リンパ芽球の感染を妨げる［エゼコウィッッ１つ の態様においては、本発明は、マンノース受容体タンパク質（ＭＲＰ）の細胞外 部分に由来する少なくとも１個（好ましくは２個、３個またはそれ以上）の炭水 化物認識ドメインよりなる可溶性組換えペプチドで特徴づけられる。該ペプチド は、それらの炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）により、マンノース、Ｎ−アセチ ルグルコサミンまたはフコースを発現する細胞を特異的に標的とする能力を有す る。例えば、ＭＲＰ由来炭水化物認識ドメインは、細胞壁上またはエンベロープ 糖タンパク質上の特異的糖部分の露出した立体配置を有する真核性または原核性 病原細胞（例、細菌、真菌またはウィルス）に特異的に結合する。さらに、ＭＲ Ｐ由来ＣＲＤを含有するペプチドは、アベラント（ａｂｂｅｒａｎｔ）グリコジ ル化の結果いずれかの露出したマンノース残基を有する癌細胞を特異的に標的と することができる。本発明のペプチドは、かかる細胞のプローブ、または特異的 分子（例、毒素、または例えばＴ細胞抗原、ＣＤ４のような細胞特異的分子）を それらの細胞へ送達させる手段、または免疫系に対するそれらの細胞のインビボ マーカーを提供する。該ドメインは、図３に示すように、一般に、マンノース受 容体タンパク質の１以上の炭水化物認識ドメインの配列と相同な少なくとも１５ ０個、または好ましくは３００個の隣接するアミノ酸を含有する点で、ＭＲＰ由 来であると言われている。該可溶性ペプチドは、ＭＲＰのトランスメンブランお よび細胞質領域を欠く。ペプチドは、本発明で有用な約１０個以上のアミノ酸の 鎖（より大きなポリペプチドおよびタンパク質を包含する）を意味する。該ペプ チドは、０−またはＮ−結合を介してグリコジル化されていてもよい。組換えペ プチドは、以下で定義する改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）核酸から発現されるペ プチドを意味する。

もう１つの態様においては、本発明は、かかる可溶性ペプチドをエンコードする 改変核酸（好ましくはｃＤＮＡ）で特徴づけられる。改変核酸は、精製または　 。

組換えＤＮＡ法によりその自然環境から（すなわち、自然に隣接する核酸から） 取り出された核酸を意味し、かかる語は合成核酸またはｃＤＮＡをも包含する。

この核酸はＤＮＡまたはＲＮＡのフラグメントであってもよく、ベクター系（例 、プラスミド、コスミドまたはファージ）に存在してもよく、あるいは生物のゲ ノム内にあってもよい。ある場合には、かかる核酸は精製されており、所望の核 酸の均一調製物を包含する。

好ましい具体例においては、それをエンコードするペプチドおよび核酸は、さら に、マンノース受容体タンパク質の１以上の炭水化物認識ドメインの少なくとも １５０個、好ましくは３００個の隣接するアミノ酸の配列に対する、アミノ酸レ ベルでの少なくとも７５％の同一性により特徴づけられる。最も好ましくは、該 ペプチドはマンノース受容体タンパク質の細胞外全領域を含む。他の好ましい具 体例においては、該核酸は、マンノース受容体タンパク質の可溶性細胞外フラグ メントをエンコードする核酸の、実質的に少な（とも４５０個の隣接する塩基に 対応し、これはＡＴＣＣ第６８４３０号としてＡＴＣＣに寄託されており、本明 細書中で配列表１のヌクレオチド１−４２１２として記載する。また、該核酸は 、毒素分子（例、ＡＺＴ、リジンまたはコレラ毒素）の毒性部分をエンコードす る核酸、または補体を固定する能力を有するペプチドをエンコードする核酸に連 結される。かかる連結された核酸によりエンコードされるハイブリッドペプチド は、エフェクター分子の標的を非所望の細胞または他の生物、例えばウィルスに する場合に特に有用である。

上記ペプチドおよびそれらのペプチドに対する抗体を、治療剤または診断剤に使 用してもよい。好ましくは、該ペプチドを精製する、すなわち、該ペプチドを不 純ペプチドから実質的に分離する。最も好ましくは、それは治療的使用に適切な 担体物賃中に混合した均一調製物として提供される。治療剤は、病気または障害 の治療に有用な物質を意味する。診断剤は、病気または障害の発見に関する物質 を意味する。

さらに他の態様においては、本発明は、細菌、真菌またはウィルスに感染した動 物、例えばヒトを治療する方法で特徴づけられる（細菌、真菌またはウィルスは 、感染を引き起こす能力を有するあらゆる型の非所望の細胞または他の生物を包 含する意である）。かかる方法の１つは、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミ ンまたはフコースを発現する細胞を特異的に標的とするマンノース受容体タンパ ク質の可溶性細胞外部分を含む治療的に有効量の治療剤またはペプチドを与えお よび投与することを包含す灸。該治療剤またはペプチドは、感染性生物の増殖の 直接阻害を引き起こし、宿主防御細胞、例えばマクロファージを病原性生物に誘 引させ、それによりこれは不活性化される。かかる不活性化は、該ペプチドによ り固定される補体の存在により助力されるかもしれない。治療的に有効量は、患 者に有意な生理学的効果を与える量であり、動物の大きさおよび重量ならびに他 のよ（知られた要素に依存すると当業者に認識されている。

好ましい具体例においては、該ペプチドは、マンノース受容体タンパク質の可溶 性細胞外部分の治療的に有効なフラグメントである。該ペプチドは、細菌、真菌 またはウィルスの増殖またはこれらによる感染を阻害（例、減少または妨害）す ることができ、上記のとおりのペプチドである。最も好ましくは、該動物はヒト である。該感染は結果として田面症または局所細菌感染、寄生性感染、または菌 コロニー化となるようなものである。投与経路は、静脈内、筋肉、経口的または 局所的のいずれかであり、散剤またはローション剤の形態で、好ましくは５〜１ ００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２５μｇ／ｍ＋で投与する。また、ウィルスは ＨＩＶまたは関連ウィルスである。該ペプチドは、真核細胞がウィルスに感染す る率を低下させる。該タンパク質またはペプチドは、ヒト血清または組織中の最 終濃度が１〜５００μｇ／ｍＩ　（好ましくは１００〜１５０μｇ／ｍｌ）とな るように与える。あるいは、毒素または抗生物質を含有する脂質小胞またはリポ ソームを該ペプチドで被覆し、患者に直接投与する。該ペプチドにより、かかる リポソームは感染部位を標的とし、リポソーム中の内容物が放出され、それによ り標的部位中の標的細胞または生物の増殖を特異的に遅延または妨害する。

関連態様においては、本発明は、患者に流体を長期投与するのに有用な被覆カテ ーテルにより特徴づけられる。例えばカテーテル物質を該ペプチドに含浸させる ことにより、カテーテルを上記ペプチドの１つで被覆する。該ペプチドはカテー テルを介して患者が細菌、真菌またはウィルスに感染する率を低下させる。

もう１つの態様においては、本発明は、細菌、真菌またはウィルスによる感染を 診断する方法により特徴づけられる。該方法は、血清のサンプルに本発明のペプ チドが結合する量を測定することにより、ＭＲＰにより認識される標的糖タンパ ク質の１つを発現させる病原体の血清値を検出することを包含する。検出される 病原体値は、患者の感染を表す。好ましくは、該方法は、免疫的または蛍光的手 法により該ペプチドを測定することを特徴とする。

関連態様においては、本発明は、本発明のペプチドを特異的に認識する精製抗体 により特徴づけられる。該抗体は、好ましくは、モノクローナルまたはポリクロ ーナル抗体の均一調製物として提供される。該抗体は、本発明によるマンノース 受容体タンパク質またはそのペプチドの細胞外部分の精製および上に開示のとお りの感染の診断に有用である。

最後の態様においては、本発明は、マンノース受容体タンパク質の細胞外部分よ りなる精製可溶性ペプチドにより特徴づけられる。該ペプチドは、マンノース受 容体タンパク質トランスメンブランおよび細胞質領域を欠（。

本発明の他の特徴および利点は、その好ましい具体例の以下の記載および請求の 範囲から明らかである。

図面の簡単な記載 図１ａは、マンノース受容体タンパク質の細胞外部分のヌクレオチド塩基配列お よび対応するアミノ酸配列を示す。本明細書中では配列表１のヌクレオチド１− ４２１２として記載する。

図１ｂは、マンノース受容体タンパク質のトランスメンブランおよび細胞質部分 のヌクレオチド塩基配列および対応するアミノ酸配列を示す。本明細書中では配 列表２のヌクレオチド１−４２１２として記載する。

図２は、マンノース受容体タンパク質の細胞外部分の機能領域を含む概略図であ る。

図３は、−字のアミノ酸コードを使用する、マンノース受容体の種々の炭水化物 認識ドメインのアミノ酸配列の対応を示す。

好ましい具体例の記載 １以上の炭水化物認識ドメイン（ＣＨＤ）を含有するマンノース受容体の細胞外 部分由来の可溶性組換えペプチドは、天然の膜結合マンノース受容体に匹敵する 特異性で、炭水化物を認識することができる。かかる可溶性マンノース受容体ペ プチドは、有効な炭水化物認識能を失うことな（、もう１つの分子の部分に固定 化または結合させることができる。

マンノースおよびＮ−アセチルグルコサミンのような露出した糖は、多数の病原 体の細胞壁の特徴であり、一方、ヒトおよび動物を含む高等生物は、マンノース 受容体により認識されないマスクされた内部マンノース残基を有する傾向がある 。したがって、本発明による可溶性マンノース受容体ペプチドは、細菌、真菌、 酵母、寄生体またはある種のウィルスのエンベロープ糖タンパク質を包含するマ ンースに富む病原体を特異的に縛り付ける点で治療剤に有用である。かかるペプ チドはまた、アベラント（ａｂｂｅｒａｎｔ）グリコジル化の結果露出したマン ノース残基を有する癌細胞を特異的に標的とすることができる。かかる可溶性ペ プチドを、例えばマクロファージまたは補体を固定するペプチド部分のような他 の物（＝結合させた場合、または例えば毒素または細胞特異的剤のような特異的 分子をマンノースに富む病原体に送達させるための手段として使用した場合、該 ペプチドはかかる病原体の患者からの除去を方向づけることができる。また、本 発明による可溶性ペプチドは、診断におけるプローブとしても有用である。

マンノース受容体のアミノ酸配列（本発明のペプチドはこれに由来する）は、ｃ ＤＮＡ配列（図１ａおよびｌｂ）から推定され、以下のとおり分析される。

図２を参照すると、第１のドメインはＮＨ２末端の１３４個のアミノ酸よりなる 。いずれの説にも拘束されることなく、このシスティンに富む領域は本発明のマ ンノース標的化に必須ではないようである。したがって、本発明の精神から逸脱 することなくこれは削除してもよい。しかし、本発明の好ましい可溶性ペプチド はこのドメインを含む。

第２のドメインは残基１３５〜１８８に及ぶ。いずれの説にも拘束されることな く、このドメインはフィブロネクチンＩＩ型に関連しているようであり、細胞外 マトリックスとの相互作用において役割を演じたり、全長受容体を発現する組織 マクロファージの広がりおよび吸着に寄与しているかもしれない。第１のドメイ ンと同様、第２のドメインは本発明の実施に必須でないが、好ましいペプチドは それを含む。

炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）は、該受容体の細胞外部分の残部よりなる。

さらに詳しくは、ドリソカ？　（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ）ら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｍ、２旦旦９５５７−９５６０　（１９８８））が報告しているように、 動物レクチンのＣ型炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）に関連する８個のセグメン トがある。これらのＣＲＤは、以下でさらに詳細に説明する。それらは本発明の 中心である。

トランスメンブラン領域およびＣ０ＯＨ末端細胞質ドメインは、本発明のペプチ ドにおいて受容体から先端切断され、可溶性を増大させ該ペプチドの治療的適用 を容易にしている。驚くべきことに、受容体のトランスメンブランおよび細胞内 部分の先端切断後、該分子は、本出願の他所で議論している種々の目的に有効な 炭水化物結合能を保持している。

本発明の好ましいペプチドは、図２に示す８個の炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ ）の少なくとも１個以上、好ましくは４個以上を含む。図１ａ、配列表１のヌク レオチド１−４２１２に示すマンノース受容体の全可溶性細胞外部分のアミノ酸 配列と合った各ＣＲＤの出発アミノ酸の番号と共に、個々のＣＲＤの配列を図３ に示す。

本発明の概念および精神から逸脱することな（、使用する可溶性炭水化物標的化 ペプチドの特異的配列を変化させることが可能であることを、当業者は認識する であろう。トランスメンブラン部分および全長受容体の細胞質尾部を先端切断し たマンノース受容体の全細胞外部分が好ましいペプチドである。しかし、先端切 断受容体のＣＲＤ含有フラグメントもまた、本発明の範囲内である。

本発明は、先端切断された受容体のＣＲＤ含有フラグメントだけでなく、先端切 断された受容体およびそのフラグメントの保存的変異にも及ぶ。好ましくは、本 発明のペプチドは、マンノース受容体タンパク質の多数の（２以上、好ましくは ４以上）ＣＲＤである。さらに、個々のＣＲＤを反復させて、本発明のペプチド の炭水化物結合能をさらに増大させることができる。限定的でなく単に例示的に 言えば、該ペプチドは、図３に示すマンノース受容体の１以上の特異的ＣＲＤの 多数のコピーを含むことができる。

マンノース受容体タンパク質ＣＲＤをエンコードする単離された核酸は、該タン パク質の組換えペプチドフラグメントの生産に有用である。さらに、同一のまた は修飾されたペプチドを発現させるために、該核酸を標準的技術により修飾する ことができる。例えば、保存的塩基置換により核酸を修飾でき、該核酸は依然と して同一のアミノ酸配列をエンコードすることができる。あるいは核酸を修飾し て保存的アミノ酸置換をコードさせることができ、これは三次構造および該ペプ チドにおける荷電アミノ酸の分布を保存する。

本発明者らは、マンノース受容体タンパク質（ＭＲＰ）の細胞外部分（エフトド メイン）の特異的ｃＤＮＡクローンを記載する。該クローンは本発明の特定の例 としてだけでなく、本発明の他のペプチドを得るための出発物質として記載され る。下記するような、候補ペプチドの生産方法およびかかる候補のマンノース親 和性についてのスクリーニング方法を用いる。

実施例１　全長ＭＲＰのクローニングおよび本発明のペプチドをエンコードし発 現させるＭＲＰｃＤＮＡのプロセッンング精製受容体から配列情報を得ることに より、プローブについての配列を決定した。受容体は、レナーツ（Ｌｅｎｎａｒ ｔＺ）ら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６２　：　９９４２゜１９８７）の 記載のとおり、肺胞マクロファージまたはヒト胎盤から精製した。

ドユポン（Ｄｕｐｏｎｔ）オリゴヌクレオチド・ノンセサイザー上で縮重オリゴ ヌクレオチドプローブを合成し、ゲル濾過により精製し、３２ｐ−ＡＴＰおよび ポリヌクレオチドキナーゼでラベルした。放射能標識したプローブを使用して、 コロニーハイブリッド形成によりｐＣＤＭ８胎ｆｆ１ｃＤＮＡライブラリー［ビ ー・シード（Ｂ、　５ｅｅｄ）博士、バーバード・メディカル・スクールから贈 呈コをスクリーンし・た。２５個の陽性クローンを２ラウンドの増幅により単離 し、分析した。分析により、最長のクローン（３，３ｋｂ）が、胎盤マンノース 受容体由来の多数のペプチドをエンコードする配列を含有することが判明した［ ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６５　：１２１ ５６．　１９９０コ。この３．３ｋｂの胎盤由来クローンを放射能標識し、７日 マクロファージｃＤＮＡライブラリーからマクロファージマンノース受容体ｃＤ ＮＡを単離するためのプローブとして使用した［エゼコウィソツ（Ｅｚｅｋｏｗ ｉｔｚ）ら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ　印刷中、１９９０年１２月コ。

胎盤マンノース受容体ｃＤＮＡの５゛エクステント（ｅｘｔｅｎｔ）由来の７５ ０ｂｐのｃＤＮＡを用いて、マクロファージ・ライブラリーから５゛クローンを 単離した。ついで、全長ｃＤＮＡをＣＤＭ８発現ベクター中に合体させた。

マクロファージマンノース受容体の配列は、ヌクレオチド２２８４におけるＣか らＴへの多形性以外は該胎盤型と同一である。サンガー鎖終結法［サンガー（Ｓ ａｎｇｅｔ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　 ７４　：　５４６３．　１９７７］に基づき、修飾Ｔ７ポリメラーゼ、シークエ ナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）　（登録商標）［ニー・ニス・バイオケミカル（ Ｕ、Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）　、クレベランド（Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ） 　、オハイオ（Ｏｈｉｏ）　］を使用する二本鎖配列決定により、初期の胎盤ク ローンを配列決定した。特異的オリゴヌクレオチドを合成し、配列決定用プライ マーとして使用した。ファージクローンについては、２μＩの精製ストックを各 アームからのλＧＴＩＩプライマーにアニーリングし、サーマルサイクラ−［ド ルフマン（Ｄｏｒｆ＋ａａｎ）ら、Ｂｉｏ、　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、７　：　 ５６８．　１９８９］上、２５サイクル（９４℃、３０ｓ変性、５５℃３０ｓア ニーリングおよび７２℃３分伸張）後にｔａｑポリメラーゼ増幅生成物を得、該 生成物をアガロースゲル電気泳動により精製した。該精製生成物をＥｃｏＲｌで 消化し、ｐＵＣ−１９ベクター中にサブクローンし、ヌクレオチド配列を上記の とおり決定した。

該ヌクレオチド配列から推定されるコード化タンパク質の配列を図１ａおよびｌ ｂ（配列表１）に示す。オーブンリーディングフレームから、Ｎ結合糖の除去後 に受容体ポリペプチド（１５０ｋｄ）の推定分子量と一致する１４３８個のアミ ノ酸部分が予想される［レナーツ（Ｌｅｎｎａｒｔｚ）ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｗ、２６４　：２３８５．１９８９；ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら、Ｊ、 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２旦５：１２１５６゜１９９０　：エゼコウィソツ（ Ｅｚｅｋｏｖｉｔｚ）ら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、印刷中、１９９０年１２ 月り。

膜結合マンノース受容体タンパク質の特徴を、概略図（図２）に示す。これは、 （ｉ）典型的疎水性ノグナルベブチド；　（ｉｉ）システィンに冨むＮＨ２末端 領域；　（ｉｉｉ）フィブロネクチンＩＩ型ドメイン：　（ｉｖ）　８個の炭水 化物認識ドメイン：（Ｖ）疎水性トランスメンブラン領域；および（ｖｉ）細胞 質尾部を含む。該ＮＨ！末端アミノ酸は、Ｎ−末端ペプチドによりＬｅｕとして 定義され、これはシグナルペプチダーゼの典型的な認識配列であるＡｌａ−Ｖａ ｌ−Ｌｅｕの後に続（［フォノ・ハイユネ（Ｙｏｎ　Ｅｅｉｊｎｅ）　、　Ｅｕ ｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　１３３　：１７．　１９８３１゜本発明のペプチ ドをエンコードおよび発現させるために、まず全長マンノース受容体タンパク質 （ＭＲＰ）をエンコードするｃＤＮＡを上記ＣＤＭ８プラスミド発現ベクターか ら得た。ついで可溶性マンノース受容体ペプチドをエンコードするｃＤＮＡの構 築物を、以下の多段階法によりＣＤ　Ｍ　８プラスミド中で調製した。

図１ａおよび１ｂを参考にして、第１段階で、３″末端塩基対４１６９から５′ １部位塩基対３５１０を包含させた。該プライマーを全長マンノース受容体ｃＤ ＮＡにアニールし、ポリメラーゼ連鎖反応技術（ＰＣＲ）を用いて７２６塩基対 ンの最後の３個のアミノ酸、全トランスメンブラン領域、全細胞質ドメインおよ びあるベクター１列を除去した（図１８および２参暉）。このフラグメントを７ ２６ｂｐＰＣＲフラグメントで置換し、これによりクローン（ＳＭＲ）を創製し 、配列分析により確認した。これは、マンノース受容体のシグナルペプチドおよ び全エフトドメインをエンコードするｃＤＮＡを含有していた（最後の３個のア ミノ酸を除く）。このクローンは可溶性マンノース受容体ペプチドを生成する能 力を有する。この構築物は、哺乳動物弁環系に安定にまたは一時的にトランスフ ェクトすることができ、発現された可溶性受容体ペプチドは培地中に分泌される 。

ＡＴＣＣ＋＝ＡＴＣＣ第６８４３０号として寄託されているこのプラスミドがら 、ポリメラーゼ連鎖反応または簡便な制限酵素部位のいずれかを使用して分泌さ れうる分子を創製することにより、標準的な分子生物学的技術により、種々の数 の炭水化物認識ドメインを含有する可溶性マンノース受容体ペプチドの一連の先 端切断形を構築することができる。あるいは、標準的な分子生物学的技術を用い て、上記と同様の手法により、マンノース受容体タンパク賃の細胞外部分をエン コードする他の核酸（特にｃＤＮＡ）クローンを単離してもよい。

また、ペプチド発現に適切な発現ベクターは、標準的な細菌、酵母およびウィル ス発現ベクターならびに真核ベクターを包含する。当業者は、かかるベクターが 一般に本発明のペプチドの発現に適切であることを認識するであるもこれらのベ クターおよび生物による可溶性ヒトマンノース受容体ペプチドの発現は、セファ ロース−マンノースのようなマンナンアフィニティーカラムを用いて追跡するこ とができる。まずカラムに発現物質を接触させる。マンノースを認識し結合しう るペプチドを、マンノース−セファロースマトリックスに結合させ、５０ｍＭ） リス／ＩＯＭ　ＥＤＴＡで溶出し、８％ポリアクリルアミドゲルを使用して同定 される［ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）緩衝液を使用、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ ）２２７：６００，１’９７０］。かかるカラムに結合しうるペプチドを生成す るクローンは、本発明における有用なものの１つである。

ペプチドの用途 上記のとおり発現される可溶性マンノース受容体ペプチドは、例えばマンノース 、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはフコースのような炭水化物を表面で発現する 細胞を特異的に標的とさせる（または特異的に認識させる）のに有用である。

このように、これらのペプチドは、多様な病原性生物［例、レイシュマニア・プ ロアマステイゴテス（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｐｒｏａｍａｓｔｉｇｏｔｅｓ） 　、二ニーモジステイス・カリニイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉ ｉ）　、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｅａｎｓ）、ミク ロバクテリア・ラベルクロシス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａ　ｔｕｂｅｒｃｕ ｌｏｓｉｓ）　（および他の非定型マイコバクテリア）、ヒト免疫不全ウィルス １型（ＨＩＶ−１）またはインフルエンザウィルス］の感染の診断剤または治療 剤に有用である。また、かかる薬剤は、日和見感染、例えば癌患者、化学療法ま たは骨髄移植を行っている患者、または先天性または後天性免疫不全疾患（例、 ＡＩＤＳ）の患者に起こる日和見感染の治療に有用である。さらに、かかる薬剤 は、アベラント（ａｂｂｅｒａｎｔ）グリコ／ル化の結果露出したマンノース残 基を有する癌細胞を特異的に標的とする。

非ウィルス性病原体の場合、宿主の防御機構による除去は、マンノース結合タン パク質のような受容体の細胞付着部位と共に、可溶性マンノース受容体ペプチド が食細胞表面に付着するよう指向させ、それにより、食細胞に病原体を認識させ て循環からの病原体のクリアランスを増すことにより連成される。マンノースに 富む糖タンパク質を発現するウィルスの場合、ウィルスおよびウィルス感染細胞 の直接不活性化は、リジン、コレラ、ジフテリアまたは百日咳のような毒素、ま たはＡＺＴのような抗代謝剤を治療的可溶性マンノース受容体ペプチドに結合さ せることにより達成される。このように形成したハイブリッドペプチドは、ＨＩ Ｖのような標的細胞を殺傷または増殖を阻害することに役立つ。

かかるハイブリッドペプチドを形成するために、かかる毒素をエンコードする核 酸を、本発明の可溶性マンノース受容体ペプチドをエンコードする核酸に、よく 知られた技術により連結することができ、融合核酸は単一体として発現されハイ ブリッドペプチドを形成し得る［例えば、マルフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）　（出典 明示により本明細書の一部とする米国特許第４．６７５．３８３号）により記載 されているとおりである］。（連結は、酵素的または化学的に結合させて核酸の 単一体を形成させる、ことを意味する。）あるいは、２個のペプチドを別々に合 成して化学的に結合させることができる［例えば、ロス（Ｒｏｓｓ）　（出典明 示により本明細書の一部とする米国特許第４．２７５．０００号）により記載さ れているとおりである］。

あるいは、補体固定領域（例、免疫グロブリン重鎮のまたはマンノース結合タン パク質の補体固定領域）をエンコードする核酸を標準的技術により改変して、可 溶性マンノース受容体タンパク質をエンコードする核酸とハイブリッド分子を形 成させることができる。かかる核酸の発現生成物を使用して、露出した表面炭水 化物部分を有する細胞を標的化し、ついで補体成分と相互作用させ、補体を活性 化させることができる。ついで活性化補体は、マクロファージの標的病原性細胞 への結合およびそれに続くマクロファージによるそれらの摂取を刺激する。

実施例２．融合タンパク質の調製 可溶性マンノース受容体ペプチド−免疫グロブリン融合タンパク質は、可溶性マ ンノース受容体ペプチドをエンコードするｃＤＮＡを消化し、オリゴヌクレオチ ドリンカー（例、ＢａｍＨ１リンカ−）を挿入することにより調製することがで きる。得られたプラスミドはＢａｍＨｌで消化することができ、全細胞外ドメイ ンをエンコードする部分は、免疫グロブリン（例、ヒトＩｇＧ１）発現プラスミ ドの合成スプライスドナー配列に連結することができる［アルフォ（＾ｒｕｆｆ ｏ）ら、Ｃｅ１ｌ旦１：１３０３−１３１３，１９９０コ。かかる発現ベクター はそれらの３′領域に、補体を固定する能力を有する免疫グロブリン重鎖定常部 ２および３を含有する。かかる融合ｃＤＮＡ配列から発現される融合タンパク質 は、可溶性マンノース受容体ペプチドの３゛末端に補体固定領域を含有する。

もう１つの構築物においては、マンノース結合タンパク質のＮＨ２末端領域、細 胞付着ドメインおよび補体固定領域Ｃエゼコウィッッ（Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚ）　 、国際特許出願第ＷＯ３９１０１５１９号、１９８９年２月２３日コに融合され る免疫グロブリンシグナルペプチドをエンコードするｃＤＮＡを改変して、可溶 性マンノース受容体ペプチドのシスティンに富む、またフィブロネクチン結合ド メインを置換することができる。かかるｃＤＮＡ配列から発現される融合タンパ ク賃は、該分子のアミノ末端部分に補体固定領域（炭水化物認識ドメインがこれ に続（）を含有する。

本発明の可溶性マンノース受容体ペプチドは、医薬上許容しうる担体物質、すな わち薬剤または医薬の調剤のような医薬用途に適切な不活性物質中、常法により 投与してもよい。例えば、ニューモジステイス・カリニイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓ ｔｉｓｃａｒｉｎｉｉ）を治療するためにエアゾール形態で投与してもよい。あ るいは、経口的または非経口的に投与してもよい。例えば、動物、特にヒトの血 流中に、１〜５００μｇ／ｍｌ血清（最も好ましくは１００〜１５０μｇ／ｍｌ ）最終濃度の値にまで直接注射することができ、この用量を反復してこの値を維 持することができる。該ペプチドは、予防的にまたは感染後に投与することがで きる。

特定の予防的使用においては、可溶性マンノース受容体ペプチドを使用して静脈 内または尿道カテーテル（例、カテーテル物質を該ペプチドで化学的含浸させる ことによる）を被覆し、免疫無防備状態の患者（例、長期静脈内化学療法を受け ている癌患者）における感染を予防してもよい。かかるカテーテルは感染生物に 拘束し、それらが患者内へ侵入するのを予防する。

特定の治療的使用においては、可溶性マンノース受容体ペプチドを、散剤または ロー７ョン剤の形態で局所的に適用（５６〜１００μｇ／ｍｌの濃度で）して、 例えば、細菌感染、酵母感染または白癖菌感染（これはみずむしを起こす）のよ うな局所感染を治療してもよい。

また、可溶性マンノース受容体ペプチドを診断的手段として、例えば真菌疾患の 診断に使用することもできる。動物に感染する真菌は、マンノースに富む多糖を 血清中に放出する。患者からのサンプル（例、１００μｍ）を、蛍光標識された 可溶性マンノース受容体ペプチドで分析し、真菌の多糖被膜への結合を観察する ことができ、結合の程度を一連の治療後に残存する真菌感染の程度と関連づける ことができる。別の診断的方法においては、可溶性マンノース受容体ペプチドの 結合の程度を、該ペプチドを特異的に認識する標識抗体を使用して検出すること ができる。それに応じてその後の適切な治療を計画することができる。

他の具体例 上記のとおり、本発明は一般には、ＭＲＰ由来炭水化物認識ドメインを含むペプ チドにより特徴づけられる。可溶性マンノース受容体ペプチドをエンコードする 遺伝物質（上記のとおり、ＡＴＣＣ第６８４３０号として寄託されている）を使 用して、全長核酸をフラグメント化し候補フラグメントを発現させることにより 、非常に多くの組換えペプチドを生成させることができる。あるいは、上記のと おり、標準的な分子生物学的技術を使用して可溶性マンノース受容体ペプチドを エンコードする他の核酸（特にｃＤＮＡ）クローンを単離してもよい。また、こ れらのクローンを使用して候補フラグメントペプチドを発現させてもよい。上記 のとおり、好ましいフラグメントは、多数のＣＤＲ５を含有するものである。

種々のアッセイを使用して個々の候補ペプチドが炭水化物認識能を有するか否か を決定してもよい。

上記のアフィニティーカラムクロマトグラフィーによるアッセイに加え、もう１ つのアッセイにおいて（ｌ！！−標識マンノース−ＢＳＡの結合および取り込み が生じる。特に、エゼコウィッツ（Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚ）ら（Ｊ、　Ｅｘｐ、　 Ｍｅｄ、１５４　：　６０゜１９８１）の記載のとおりマンノース−ＢＳＡ［イ ー・ワイ・ラブダ（ＥＹ　Ｌａｂｓ）、ＣＡ］を放射能標識し、放射能標識リガ ンドの結合および取り込みを、候補ペプチドをエンコードするクローン化ｃＤＮ Ａでトランスフェクトされたｃｏｓ−ｒ細胞上で行う。ＣＤ６４でトランスフェ クトされたＣＯ３−１細胞は対照として使用し、チオグリコラート誘導マウス腹 腔マクロファージは陽性対照として使用する。

もう１つのアッセイでは、可溶性マンノース受容体ペプチドを特異的に認識する 抗体を利用する。該抗体は蛍光標識を結合させ、抗体−ペプチド結合をフロー・ サイトフォトメトリーで確認してもよい。あるいは、該抗体を固定化してアッセ イに使用したり、酵素結合イムノソルベントアッセイまたはＥＬＩＺＡ試験で使 用してもよい。

！教 イー・コリ（Ｅ−ｃｏｌｉ）株ＭＣ１０６１／Ｐ３中のＣＤＭ８におけるプラス ミドＳＭＲは、１９９０年１０月２日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ レクション［Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ ｏｎ　（Ａ　Ｔ　ＣＣ）コにＡＴＣＣ第６８４３０号として寄託された。

出願人の譲受人であるチルドレンズ・メディカル・センター・コーポレイシ３ン （Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’　ｓ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ ｉｏｎ）は、ＡＴＣＣは該寄託を永存させ、特許が得られたら公衆がそれを容易 に利用できる受託者であると表明する。

このように寄託された該物質を公衆が利用する上でのすべての制限は、特許の付 与の際に除かれる（これは廃棄できない）。コミ・ノショナーカ＜３７ＣＦＲ１ ，１４および３５ＵＳＣ１２２に基づき許可した者は、該物質を該特許出願の係 属中でも入手することができる。寄託された物質は、寄託微生物のサンプルの供 給の最終要求後少なくとも５年間、いずれの場合も、寄託日後少なくとも３０年 間または特許の実施可能期間のいずれか長い期間、成長でき汚染されな（１状態 を保つのに必要なすべての注意を払って保持される。出願人の譲受人１よ、寄託 の状態のため要求時にサンプルを供給できない寄託を代える義務を認めてＬＸる 。

配列表 配列番号＝１ （１）配列の特徴 （Ａ）長さ　５１４５塩基対 （Ｂ）型−核酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｉｉ）配列の記載： 丁ＴＧＣＣＩＣＴＩＡＧｎＣＣＧＣＣＣＴＣＣｆ＋ｉτＣＣＡ＋ＣＡＧＣ，ＡＧ ＾ａｃｃ＾＾ａｃｃａｒんＡ＾ｃｃｃＴｃｃｃｃｃｂｓＣＡＣＣＡＡＣＯＧＡＧ Ｇ＾＾＾ａｃｅ＋ｃｃｃＡＡＣＡＡＣＡＧＡＡＣＧＣＴＧＡＧＣＴＣ（１０ａｃ ｅａ３１＋＋ｉｓ　Ｃ１ｎ＾ｌａ　Ａｒｍ　ＬｙＳ　ｔａｒ　Ｃｙｓ　Ｃ１ｎ　 Ｃ１ｎ　Ｃ１ｎ＾ｉ＾＾Ｉｓ　Ｇｌｕ　ＬＲＩ　Ｌｅｖ　１ｅｒ２２５　２３０ 　８ｓ ＡｌｅＡＣＡＣＡＧＡＴＡＣＡｉＧＡＧＣＡＡＡＣＡＩＡＣＣＩＧＡｃａＧＣＡ Ｔτ＾ＡｃｅＪＪＴ仁ｃａｙｗＩＩｓ　Ｔｌ＋ｒ　Ｇｌｕ　Ｉ　ｒｅ　Ｈｉｍ　 Ｃ１ｕ　Ｇｌｎ　Ｔｈｅ　Ｉｙｒ　Ｌｓｖ　Ｔｈｒ　Ｃ１ｙ　Ｌｏｗ　Ｔｈｅ　 ｉｅｒ　５■■ １＆ｏ　２ｔＳ　２ｓ６ ＧＧｆＴＣ４ｅＡＧＩＧＧＡｔ；ＴＧＡｅＣＣＣ＾ＣＴｅｃＴ＋ＴＣＣＧＡＴＡ Ｔ丁丁ＧＡＡＣｆＫｒｒＡ９７５１ｉｌｙｒｒｐＧｌｒ＋ＴｒｐｔａｒＡｓｐム ｐｇＳａｔＰｒ＠＊ｈｅ＾ｒ＠ｆｙｒＬｅｉｉＡ＆１ｌｆｒｐＬＫＩ２７′Ｓ２ 閲　２１１５ ＣＣＡＣ＆Ａ（ｉｆＣｍムＴｌ：ＡＧＣＴｅ＾ａＣｅＴＣ１ｊ入ＡＡＡ！ＴＧｆ ＱＴＧ丁仁ＡＣＴＡＭｆ１０２３Ｐｒｅ　Ｇ（Ｙｉ＊ｒ　Ｐｒ０ｓａｐ　Ａｌａ 　Ｃ１ｕ　Ｐｒｏ　ａｔｙ　ｔｙｓ　細ｒ　Ｃｙｍ　Ｖｍｌ　ｉｅｒ　ｔ〜ａｔ ｎ２９０２９５　ｓｏ。

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Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．マンノース受容体タンパク製の細胞外部分由来の少なくとも１個の炭水化物 認識ドメインよりなり、マンノース受容体タンパク質トランスメンブランおよび 細胞質領域を欠き、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはフコースを発 現する細胞を特異的に標的とする能力を有する可溶性組換えペプチド。
2. ２．マンノース受容体タンパク質の少なくとも１５０個の隣接したアミノ酸のフ ラグメントに対して７５％より大きな相同性を有する配列よりなる請求項１記載 のペプチド。
3. ３．マンノース受容体タンパク質の少なくとも１５０個の隣接するアミノ酸より なる請求項１記載のペプチド。
4. ４．マンノース受容体タンパク質の少なくとも３００個の隣接したアミノ酸のフ ラグメントに対して７５％より大きな相同性を有する配列よりなる請求項１記載 のペプチド。
5. ５．マンノース受容体タンパク質の少なくとも３００個の隣接するアミノ酸より なる請求項１記載のペプチド。
6. ６．図３に示されるマンノース受容体タンパク質からの少なくとも１個の完全炭 水化物認識ドメインよりなる請求項１記載のペプチド。
7. ７．図３に示されるマンノース受容体タンパク質からの少なくとも２個の完全炭 水化物認識ドメインよりなる請求項１記載のペプチド。
8. ８．図３に示されるマンノース受容体タンパク質からの炭水化物認識ドメインの 少なくとも２個のコピーよりなる請求項１記載のペプチド。
9. ９．さらに補体を固定する能力を有するセグメントよりなる請求項１記載のペプ チド。
10. １０．該ペプチドが免疫グロブリン重鎖の補体固定領域よりなる請求項９記載の ペプチド。
11. １１．さらに細胞毒よりなる請求項１記載のペプチド。
12. １２．該細胞毒がＡＺＴ、リシン、百日咳またはコレラ毒素である請求項１１記 載のペプチド。
13. １３．請求項１記載のペプチドをエンコードする改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ） 核酸。
14. １４．該核酸がｃＤＮＡである請求項１３記載の改変核酸。
15. １５．ＡＴＣＣにＡＴＣＣ第６８４３０号で寄託されているマンノース受容体タ ンパク質（配列表１）の可溶性細胞外フラグメントをエンコードする核酸の少な くとも４５０個の隣接する塩基に実質的的対応する核酸フラグメントであって、 マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはフコースを発現する細胞を特異的 に標的とする能力を有する可溶性ペプチドをエンコードする核酸フラグメント。
16. １６．ＡＴＣＣにＡＴＣＣ第６８４３０号で寄託されているマンノース受容体タ ンパク質（配列表１）の可溶性細胞外フラグメントをエンコードする核酸に実質 的に対応する改変核酸。
17. １７．請求項１３記載の改変核酸よりなる発現ベクター。
18. １８．請求項１３記載の改変核酸よりなる組換え細胞。
19. １９．医薬上許容しうる担体物質中で投与される治療的有効量の請求項１記載の ペプチドよりなる治療剤。
20. ２０．該可溶性ペプチドで被覆されたリボソームよりなる請求項１９記載の治療 剤。
21. ２１．請求項１９記載の治療剤を提供する段階および動物に治療的有効量の該治 療剤を投与する段階よりなる細菌、真菌またはウイルスに感染した動物の治療方 法。
22. ２２．該動物がヒトである請求項２１記載の方法。
23. ２３．該ペプチドが、該ペプチドよりなる散剤またはローション剤を足に塗布す ることにより投与される請求項２２記載の方法。
24. ２４．該治療剤が、該細菌、真菌またはウイルスによる真核細胞の感染レベルを 低下させる請求項２１記載の方法。
25. ２５．請求項１記載のペプチドを特異的に認識する精製抗体。
26. ２６．動物からの血清のサンプルを提供する段階、該血清を有効量の請求項１記 載のペプチドと接触させる段階および該血清サンプルに対する該ペプチドの結合 量を測定する段階よりなる細菌、真菌またはウイルスによる感染の動物における 診断方法。
27. ２７．該動物がヒトであり、該感染が真菌によるものである請求項２６記載の方 法。
28. ２８．該測定段階が、該ペプチドを含有する血清サンプルに対する該ペプチドに 特異的な抗体の結合量を測定することよりなる請求項２６記載の方法。
29. ２９．該測定段階が蛍光検出よりなる請求項２６記載の方法。
30. ３０．マンノース受容体タンパク質の細胞外部分よりなり、マンノース受容体タ ンパク質トランスメンブランおよび細胞質領域を欠く精製可溶性ペプチド。