CN1078401A - 抗与表面抗原相关的cd33的免疫毒素 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新颖的免疫毒素和治疗肿瘤疾病的 方法。这些免疫毒素包含对CD33蛋白质显示结合 特异性的抗原结合区与细胞生长调节剂的结合物。 本发明的免疫毒素特异地选择性杀死以CD33抗原 表达为特征的肿瘤细胞。因而，该新颖免疫毒素对治 疗急性和慢性人类白血病，及其它脊髓发育不良综合 症是有用的。

Description

本发明大体而论涉及肿瘤疾病治疗的领域。具体地，本发明涉及新颖免疫结合剂及它们在肿瘤疾病治疗中的运用。更具体地，本发明涉及对以CD33抗原表达为特征的白血病细胞具有细胞毒性的新颖免疫结合剂。
在西方世界，肿瘤疾病是死亡及发病的首要原因之一。所有的肿瘤疾病或“癌症”至少具有一个特征，即，在细胞生长调节过程中含有缺陷。
位于癌细胞表面上的抗原已被用于从非淋巴细胞性白血病中区分出淋巴细胞性白血病，将急性骨髓性粒细胞性白血病分成亚型，预测治疗结果，和在体内治疗或在体外通过骨髓净化治疗。特定于急性非淋巴细胞性细胞的抗原也可识别处于它们发育早期的正常造血细胞。
CD33抗原是一种67千道尔顿糖蛋白，它可在正常的粒细胞一单核细胞集落形成单位，（CFU-GM），在部分爆式红细胞集落形成单位（BFU-E），及在粒细胞，红细胞，单核细胞，巨核细胞集落形成单位（CFU-GEMM）被发现，在正常多能干细胞中缺乏。
抗体是由动物的免疫系统对抗原决定簇作出应答时正常生成的蛋白质。抗体与它们所对应的抗原结合。特异性单克隆抗体的发展为研究者提供了过度表达肿瘤相关抗原的细胞选择性靶向化学治疗剂可能的手段。
免疫毒素是含有共价结合至毒素上的单克隆抗体的杂合分子。免疫毒素可能具有几个优于传统抗肿瘤剂之处，包括对肿瘤细胞的选择性和极强烈的毒素的潜在释放。
CD33抗原在急性非淋巴细胞性白血病细胞和急性骨髓性粒细胞性白血病细胞上的存在为研究选择性免疫毒素提供了机会。目前，尚无这种有效的免疫毒素存在。因此，在本技术领域中仍十分需要寻求选择性杀死白血病细胞的化合物和方法。
本发明提供了一种新颖的组合物，包括将能结合对CD33蛋白质显示有结合特异性的区域的抗原与细胞生长调节剂相结合。这种组合物可作为免疫毒素以专一地杀死以表达CD33蛋白质为特征的肿瘤细胞。
因此，在本发明的一个实施例中提供了一种新颖的组合物，包括将能结合对CD33蛋白质显示有结合特异性的区域的抗原与细胞生长调节剂相结合。细胞生长调节剂可以是毒素，杀细胞药物，抑制细胞生长的药物，或生物应答修饰因子。优选地，细胞生长调节剂是gelonin。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种治疗肿瘤疾病的方法，包括对需要这种治疗的个体施用杀细胞有效剂量的本发明免疫毒素。
在本发明的再一个实施例中，提供了一种杀死骨髓中肿瘤细胞的方法，包括从患有肿瘤疾病的个体中取出骨髓，用本发明组合物处理骨髓，并将处理后的骨髓回输进该个体内。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种防止肿瘤疾病复发的方法，其中该疾病是以CD33蛋白质表达为特征的。复发的防止是通过施用本发明免疫毒素的杀细胞有效剂量进行治疗。
在本发明的还有一个实施例中，提供了一种新颖的组合物，包括将CD33抗原结合区与细胞生长调节剂融合而形成的一种融合蛋白。较好的细胞生长调节剂是gelonin。
在本发明的进一步实施例中，提供了通过对此哺乳动物施用本发明的免疫毒素延长患肿瘤的哺乳动物生存时间的方法。在进一步实施例中，提供了通过施用本发明的免疫毒素延缓肿瘤生长速率的方法。更进一步，提供了一种含有本发明免疫毒素的药物组合物。
图1描绘了gelonin和M195免疫毒素对HL60细胞蛋白质合成的抑制作用。
图2说明了gelonin和M195  gelonin对SKLY16和HL60细胞系蛋白质合成的抑制作用。
图3说明了M195免疫毒素与HL60三天培养对蛋白质合成的抑制作用。
图4描绘了M195-IT五天培养对HL60细胞蛋白质合成的抑制作用。
图5说明了HuGl和HuGl-IT与HL60，U937，MOLT4细胞的结合。
图6说明了由HuGl-IT导致的对HL60细胞DNA合成的抑制作用。
图7描绘了在HuGl-IT和HuGl或FD79间的竞争。
图8说明了单独的M195，反应混合物，单独的gelonin，或经纯化的M195  gelonin的电泳模式。
正如在此所用的，术语“嵌合性（chimeric）抗体”或“嵌合性多肽”指那些抗体或抗体多肽，其中多肽的一部分具有一个氨基酸序列，该序列得自于或同源于，得自第一基因源的抗体或多肽中的相应序列，而链（一条或多条）中其余部分同源于另一基因源的相应序列。例如，嵌合性重链抗体多肽可含有一个鼠的可变区和一个人的稳定区。这二种基因源典型地是分属二个分隔的种，但偶然地会属于一个种。
典型地，嵌合性抗体或多肽的制备是通过重组分子和/或细胞技术。在许多情况中，嵌合性抗体具有模拟得自一哺乳动物种的抗体可变区的轻和重链的可变区，同时稳定区和/或框架部分则同源于得自第二个不同哺乳动物种的抗体序列。
正如在此所用的，然而对嵌合性抗体的定义并不限于此例。嵌合性抗体是任一种抗体：重链或轻链或两条链均由模拟不同来源抗体中的序列的序列结合形成的，这些来源可以是来自不同的纲。具有不同的抗原反应，或者具有不同的起源种类，融合点不管如何均是在可变区/稳定区的界线上。例如，嵌合性抗体可以包括框架和互补决定区（CORs）得自不同来源的抗体。例如，将非人类CDRs整合入连接于人类稳定区的框架区以制成“人类化抗体”。参见，例如，PCT申请公告No.WO 87/02671;美国专利No.4，816，567;欧州专利申请0173494;Jones，et al.，Nature，321：522-525（1986）;and Verhoeyen，et al.，Science，239：1534-1536（1988），所有这些在此引入作为参考。
正如在此所用的，术语“人样的框架区”是每一条抗体链的框架区，它通常含有至少约70或更多氨基酸残基。典型地含有75-85或更多残基。人样的框架区的氨基酸残基至少约80%，更优选的是约80-85%，而最优选的是超过85%与人类免疫球蛋白的氨基酸残基同源。这与其它endergenous抗体共有的特征，在生成靶标部分是有用的，它只引发很小免疫反应时，例如，减小对“自身”标志反应的机制。
正如在此所用的，术语“人类化”或“人样免疫球蛋白”指一种免疫球蛋白，含有人样框架区和基本与人类免疫球蛋白稳定区实质上同源的稳定区，即，含有至少约80%或更多，优选的是约85-90%或更多，最优选有约95%或更多同源。因此，人样免疫球蛋白在大部分，可能除了CDRs，基本上与一个或更多天然的人免疫球蛋白序列的相应部分实质上是同源。
正如在此所用的，术语“杂合抗体”指一种抗体，其中每条链分别与哺乳动物抗体链同源，但其结合代表了一种新颖的集合，以使该抗体识别两种不同的抗原。在杂合抗体中，重链和轻链对是与抗抗原识别特征即表面决定簇的抗体的重链和轻链对同源，而其它对重链和轻链对则与抗另一表面决定簇的抗体中所发现的一对同源。这导致了多功能价的性质。即能同时结合至少两个不同的表面决定簇。这些杂合子当然可以用嵌合链生成。
正如在此所用的，术语“单克隆抗体”指识别分隔的抗原决定簇。考虑抗体的来源或其制备方法并不应作为对它的限定。
对于本发明，如果抗体或多肽结合或能够结合CD33（用标准抗体-抗原或配体-受体试验，例如竞争试验，饱和试验，或标准免疫试验如ELISA或RIA测量或测定的蛋白质），该抗体或多肽对CD33具特异性。这种特异性的定义也用于单条重和/或轻链，CDRs，融合蛋白或重和/或轻链的片断，如果它们单独结合CD33它们对CD33也有特异性，或如果，当它们恰如其份与互补的可变区和稳定区被适当地结合入免疫球蛋白结构中，则它能够特异性地与CD33结合。
在竞争试验中一种抗体或多肽片断结合抗原能力，可以通过检测该多肽与已知能结合该抗原的化合物竞争结合能力来确定。已知数种竞争分析方法并在此讨论。可供选择地，无需抑制剂而测定受试化合物结合的分析方法也可被采用。例如，一个分子或其它化合物对CerbB-2蛋白质的结合能力可以通过直接标记感兴趣的分子来检测，或可不加标记而用各种夹层分析形式进行间接检测。数种结合分析方法如竞争结合分析是已知的（见美国专利3，376，110，4，016，043，及Harlow  and  Lane，Antibodies：A  Laboratory  Manual，Cold  Spring  Harbor  Publications，N.Y.（1988）这些文献结合于此参考）。
测量受试化合物与单一组分结合的分析方法而非竞争分析也是可采用的。例如，免疫球蛋白可用于识别CD33的存在。单克隆抗体分析的标准步骤，如ELISA，可加以使用（见Harlow和Lane，Supra）。为回顾可使用的各种不同信号产生系统，见美国专利4，391，904，在此引入作为参考。
进而，结合部分对CD33的特异性可通过它们的亲和性来确定。如果该部分的解离常数（KD＝1/K，其中K是亲和常数）＜1μm，优选＜100nM，最优选＜1nM，则这种特异性存在。抗体分子的KD典型地在很低的范围内。KD＝〔R-L〕/〔R〕〔L〕，其中〔R〕，〔L〕，和〔R-L〕分别是受体或CD33（R），配体，抗体或多肽（L）和受体一配体复合物（R-L）的平衡浓度。典型地，配体或多肽与受体或抗原间的结合相互作用包括可逆的非共价结合如静电吸引，范德华力，及氢键。
其它分析方法可以包括检测是否由相互作用产生各种生理学或化学变化，例如磷酸化作用的下调，内在化，或增加，如美国专利申请07/644，361（于1/18/91申请）中所述，在此引入作为参考。也可见，Gelonin是从Gelonium  multiforum的种子中提纯的一种糖蛋白（M.W.约29-30，000Kd）。Gelonin属于一类强的灭活核糖核蛋白体的植物毒素。这一类灭活核糖核蛋白体的植物毒素的其它成员是相思豆毒素链，蓖麻毒蛋白链和modeccin。Gelonin，与相思豆毒素和蓖麻毒蛋白相似，通过破坏哺乳动物核糖核蛋白体的60S亚基来抑制蛋白质的合成。Geolonin表现出对化学和物理处理的稳定性。而且，gelonin本身与细胞不结合，因此是无毒的（除了在很高的浓度下）并且在实验室中操作是安全的。对核蛋白体的灭活作用是不可逆的，看来不涉及辅助因子，并且发生的效率高，提示gelonin起酶促作用。
按蛋白质重量计，gelonin和蓖麻毒蛋白是属抑制蛋白质合成的最具活性的毒素。在抑制蛋白质合成方面，gelonin是蓖麻毒蛋白A链活性的10-1000倍。类如蓖麻毒蛋白和相思豆毒素多肽由二条链组成，A链是毒性单元位而B链的作用是与细胞结合。与蓖麻毒蛋白和相思豆毒素不同，gelonin由单链组成，因为它缺少一条与细胞结合的B链，它本身对完整的细胞无毒性作用。
哺乳动物细胞显然缺少结合和/或使天然gelonin分子内在化的能力。将gelonin与单克隆抗体，如与抗存在于某些肿瘤细胞上肿瘤相关抗原的M195相结合，提供了一种特异的方法，使gelonin与细胞结合和使gelonin一抗体复合物内在化。
免疫毒素的细胞毒性部分可以是细胞毒性药物或来源于细菌和植物的具酶促活性的毒素，或这一种毒素具酶促活性的片断（“A链”）。具酶促活性的毒素及其片断是优选的，例如gelonin，白喉毒素A链，白喉毒素的非结合活性片断，外毒素A链（得自绿脓杆菌），蓖麻毒蛋白A链，相思豆毒素A链，modeccin  A链，α-帚曲菌素，油桐属蛋白，dianthin蛋白，Phytoiacca  americana蛋白（PAPⅠ，PAPⅡ，及PAP-S），momordia  charantia抑制剂，泻果素，巴豆毒素，肥皂草抑制剂，有丝分裂素，restrictocin，phenomycin，及enomycin。最优选的是与gelonin结合。
活性片断及衍生物包括任何具有与gelonin全长结构相同的核心结构但缺少完整的初级序列的化合物。这些片断或衍生物具有与gelonin相同或改进了的生物学上或细胞毒活性。Gelonin片断或衍生物的细胞毒性由普通技术人员使用家兔网状细胞溶解物试验按常规方法确定。
可与M195抗体结合并用于本发明的生物反应修饰因子包括，但并不限于，淋巴因子和细胞因子如白细胞介素1，白细胞介素2，干扰素（α，β，或γ），肿瘤坏死因子，淋巴毒素，肿瘤生长因子β，及白细胞介素6。这些生物反应修饰因子对肿瘤细胞具有各种效应。其中，通过直接作用增强杀死肿瘤细胞作用，同样通过增加宿主防御介导过程来增强杀死肿瘤细胞作用。抗体M195与这些生物反应修饰因子的结合使其在肿瘤内选择性定位，因此增强了抗增殖效应同时降低了导致对非靶细胞毒性的非特异作用。
在本发明中使用的细胞毒性药物（及其衍生物）包括，但不局限于，亚德里亚霉素，顺铂复合物，博莱霉素和氨甲咪呤。这些细胞毒性药物对临床控制肿瘤复发是有用的，但它们的使用也由于严重的副作用和对非靶细胞的损伤而复杂化。M195抗体可用作这些药物的有用载体，为将其传递到肿瘤和增强其进入肿瘤细胞提供了有效的手段。另外，特异的抗体将细胞毒性药物传递到肿瘤，保护了敏感部位如不表达CD33的肝脏和骨髓干细胞免受化学治疗剂的有害作用。结合于M195抗体药物用作为传递系统，使药物本身剂量更低，因为所有的药物部分都结合至能在肿瘤或白血病细胞中浓集的抗体上。
单克隆抗体的结合可以通过使用各种双功能蛋白偶合剂而制备。这些试剂可以是SPDP，亚氨基硫羟烷（IT），亚氨基酯类的双官能团衍生物例如己二酰亚氨酸二甲酯，HCl，活性酯类如二琥珀酰亚胺辛二酸酯，醛类如戊二醛，双叠氮基化合物类如双（对叠氮基苯甲酰基）-己二胺，双重氮化衍生物类如双（对重氮苯甲酰基）-亚乙基二胺，双异氰酸酯类如2，6-二异氰酸亚苄酯，以及双活性氟化物类如1，5-二氟-2，4-二硝基苯。
对已被诊断患有以表达CD33蛋白为特征的白血病个体施用本发明免疫毒素，会使细胞毒性剂靶标并浓集于需杀死肿瘤细胞之处。通过对细胞毒性剂进行靶标，对其它器官，组织和细胞的非特异性素性将会消除或减小。
当用于体内治疗时，对人或动物患者施用治疗有效量的免疫毒素，即消除或减轻肿瘤负担的量或在早期化疗和放疗治疗后消除残余疾病的量。它们通常是胃肠道外给药，优选静脉内给药。给药剂量和剂量分配依据白血病的性质及其分群，特异免疫毒素的性质，也即其治疗指数，病人，及病史。典型地，所施用的免疫毒素的量典型的在约0.01-约1.0mg/kg病人体重的范围内。
为胃肠道外施用，将免疫毒素与药学可接受的胃肠道外载体配制成单位剂量可注射形式（溶液，混悬液，乳液）。这些载体本身无毒且无治疗作用。这些载体可以是水，盐水，林格氏溶液，葡萄糖溶液，及5%人血清白蛋白。也可以使用非水载体例如固相油和油酸乙酯。可使用脂质体作为载体。载体中可含有少量添加剂以提高等渗性和化学稳定性的物质，例如，缓冲液和防腐剂。典型地，在这些载体中免疫毒素被配制成浓度约0.1mg/ml-10mg/ml。
本发明的免疫毒素可被用于杀死骨髓中肿瘤细胞的方法中。此方法中，首先从患有肿瘤疾病如白血病的个体取出骨髓。接着，用杀细胞有效剂量的本发明免疫毒素处理骨髓。
下列实施例提供了本发明免疫毒素的制备，特征描绘及使用的具体说明。这些实施例均不依任何方式限制本发明。
实施例1
Gelonin的纯化
将Gelonium  multiflorum的种子脱壳并在均化器中用8倍体积的含5mM磷酸钠（pH7.4）的0.14M  NaCl制匀浆。将匀浆于4℃下搅拌过夜，用冰冷却并在0℃以35，000×g离心20分钟。取出上清液，用5mM磷酸钠（pH6.5）透析并用pm10滤器浓缩。将样品层放在用5mM磷酸钠（pH6.4）平衡的CM-52离子交换柱（20×1.5cm）上。结合于离子交换树脂上的物质在4℃下用400ml  0-0.3M线性NaCl梯度以25ml/小时的速率洗脱。以5毫升等份收集。将各流份在分光光度计在280mm处进行检测。gelonin洗脱于55-70流份，且是最后的主要大洗脱峰。合并55-70流份，用双蒸水透析并经冷冻干燥浓缩。用高压液相色谱（使用TSK3000凝胶渗透柱，用50mM磷酸钠缓冲液。pH7.4）和15%十二烷基硫酸酯-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-page）检测各分离部分的纯度和分子量。gelonin泳动成一单带，分子量约为29-30，000道尔顿。
实施例2
Gelonin活性测定
在无细胞蛋白质合成抑制实验中检测gelonin的活性。无细胞蛋白质合成抑制实验的进行是依次将下列成分加入50μl家兔网状细胞溶解产物，每次加毕混合，所加的成分是：0.5ml  0.2M  Tris-HCl（pH-7.8），8.9ml乙二醇，及0.25ml  1M  HCl。
20微升的盐-氨基酸-能源混合物（SAEM）包括：0.375M  KCl，10mM Mg（CH3CO2）2，15mM葡萄糖，0.25-10mM氨基酸（亮氨酸除外），5mM ATP，1mM GTP，50mM Tris-HCl（pH7.6），10μl磷酸肌酐-肌酐磷酸激酶，8μl14C亮氨酸（Amersham，348mCi/mmol），并加入合同不浓度gelonin混合物的1.5ul溶液。该混合物在30℃下培育60分钟。通过在玻璃纤维滤器上沉淀合成的蛋白质，用10%TCA和丙酮洗涤，并在Beta一计数器中用Aquasol闪烁液检测放射性来检测一份混合物中的14C亮氨酸。将特异活性不低于4×109U/mg的gelonin用于与抗体结合。gelonin的活性单位是在无细胞分析实验中引起〔14C〕亮氨酸掺入蛋白质时抑制50%的gelonin蛋白的量。
实施例3
用亚氨基硫羟烷对gelonin的修饰
2-IT修饰的gelonin的制备
将磷酸盐缓冲的盐水中的gelonin在Centriprep 10浓缩器中浓缩至约10mg/ml。将盐酸三乙醇胺（TEA/HCl，PH8.0）和EDTA加入使终浓度为60mM TEA/HCl和1mM EDTA，（pH8.0）。加入2-亚氨基硫羟烷母液（500mM于含1mM EDT的60mM TEA/HCl缓冲液，pH8.0），使终浓度为1mM，将样品在氮气流下在4℃下搅拌，培育90分钟。在Sephadex G-25（1×24cm）柱上进行凝胶过滤除去过量的亚氨基硫羟烷，该柱用含有0.01M Na2HPO4，0.0018M KH2PO4，0.0034M KCl，0.001M EDTA和0.17M NaCl的。磷酸酯-EDTA缓冲液预平衡（pH7.5），用Bio-Rad实验在微量滴定板上分析各流分的蛋白质含量。gelonin在空柱体积洗脱（约21-23流份）。合并这些部分并在4℃贮藏。
与4-琥珀酰亚氨基氧羰基-α-甲基-α（2-吡啶基二硫代）甲苯（SMPT）相连结的M195是通过将2-IT-修饰的gelonin与SMPT-修饰的MAB  M195偶合而制备的。简言之，为用SMPT修饰M195，将于1.0ml  PBS中的10mg抗体用2×硼酸盐缓冲液（0.05M硼酸钠1.7%氯化钠，pH9.0）稀释1∶1，并向抗体溶液中缓慢加入52μl的4mM SMPT无水DMF溶液。在室温氮气下将该反应搅拌培育2小时。通过将反应混合物过含有磷酸酯-EDTA缓冲液（pH7.5）的Sephadex G-25柱除去过量的SMPT，含抗体的部分用Bio-Rad分析评估。合并各部分并在4℃N2下贮存。与2-IT的交联在27℃N2下搅拌进行96小时。最终产物的纯化如前为SPDP所述。
实施例4
鼠单克隆抗体M195的制备
鼠单克隆抗体M195由杂交瘤（hybridomas）制得，该杂交瘤是由NS-1小鼠骨髓瘤细胞和被患有急性非淋巴细胞性白血病（FAB-M2）病人的白血病细胞免疫过的五周龄BALB/C小鼠的脾细胞融合而成。将从克隆的杂交瘤培养物得到的上清液使用金黄色葡萄球菌A蛋白（PA）细细胞玫瑰花结的方法，对于白血病细胞系和原ANLL白血病细胞进行分组筛分。将重复亚克隆（subcolone）的M195杂交瘤在接触双降植烷抗原的（C57 BL/6×BALB/C）F1小鼠中扩增。
在PA-Sepharose上通过亲和色谱层析法用序列分步稀释，纯化M195。在用考马斯亮蓝染色的十二烷基钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶上测定其纯度。人类化的单克隆抗体的制备按Co等所述“Chimeric  and  Humanized  Antibodies  with  Specificity  for  the  CD33  Antigen”，J.Immunol.，148：1149-1154（1992）及从杂交瘤制备并如上纯化。
简言之，将鼠M195和L链的高变区（V区）用链式PCR方法克隆。首先，将M195杂交瘤细胞溶解并用热酚法提取其中RNA。通过用病毒逆转录酶培育从RNA合成cDNA通过用病毒逆转录酶培育从RNA合成cDAN。然后标计PCR引物，在上游和下游引物中包括ECO  RI和HindⅢ内切位点以继续亚克隆。PCR反应在一个程序化加热器中进行，使用加热循环30次（92℃1分钟，50℃2分钟，72℃3分钟）。PCR产物通过在低熔点琼脂糖胶上的电泳进行分离。将电泳带到下，并用限制内切酶消化和克隆入PUC18载体以确定其序列。然后用不同的载体将鼠H和L可变区缝接入含有互补的人类H和L链的质粒中。接着将编码嵌合性鼠/人类人和H链的载体通过电导转染入SP2/0细胞。将存活的克隆接种平板并测试生成人类化αCD33抗体的能力。
实施例5
SPDP-修饰的单克隆抗体M195与亚氨基硫
羟烷-修饰的gelonin的结合
将1mg如实施例1所述制备的纯gelonin（2mg/ml于PBS中）按实施例3所述用亚氨基硫羟烷进行修饰。将如实施例4所述修饰的单克隆抗体M195与等重量经修饰的gelonin混合。与抗体相比，这个比例相当于过量5倍摩尔量的gelonin。加入0.05M TEA/HCl缓冲液（pH8.0），使混合物pH调节至7.0，在4℃ N2下将混合物培育20小时。加入碘乙酰胺（0.1M）使终浓度为2mM，以封闭任何残余巯基基团，并在约25℃继续再培育1小时。在4℃贮存反应混合物直至用凝胶过滤纯化。
实施例6
gelonin-单克隆抗体M195复合物的纯化
通过在经PBS预平衡的Sephadex  S-300柱（1.6×31cm）上作凝胶过滤，将非结合gelonin和低分子量产物从实施例5的反应混合物中除去。
在上Sephadex柱前，用Centricon  30微型浓缩器将实施例5的反应混合物浓缩至约1ml。用PBS洗柱。每1ml等份收集，用Bradford试验方法分析50μl部分中的蛋白质。
为除去未结合的M195，将得自S-300柱的高分子量峰（28-40流份）用于用含0.1M  NaCl的10mM磷酸盐缓冲液（pH7.2）预平衡过的Blue  Sepharose  CL-6B亲合层析柱（1×24cm）。样品装于柱上后，用30ml缓冲液彻底地洗脱非结合抗体。该柱用含盐线性梯度0.1-2M  NaCl的10mM磷酸盐缓冲液（pH7.2）洗脱。洗脱部分的蛋白质含量由Bradford分析确定。
通过在由含0.1M  NaCl的10mM磷酸盐缓冲液（pH7.2）预平衡的Blue  Sephazose  CL-6B柱（1×24cm）上作亲合层析，将非结合抗体从gelonin结合的抗体中除去。装完S-300待洗样品后，该柱用30ml相同缓冲液洗脱以彻底洗脱非结合抗体。
gelonin结合的抗体结合到柱上，用0.2-2M NaCl的10mM磷酸盐缓冲液（pH7.2）的盐线性梯度进行洗脱。在约0.7M NaCl洗脱出抗体-gelonin复合物。用Bradford分析测定洗出部分的蛋白质含量。混合含蛋白质的各部分，在5-20%梯度非还原聚丙烯酰胺凝胶上电泳确证洗脱结果。图8描述了单独M195，M195未提纯的反应混合物，gelonin和M195-gelonin，单独gelonin，或提纯后的M195-gelonin的电泳型。洗出峰（流份14-20）仅含有游离抗体，用高浓度盐洗脱的流份50-80，含无未结合gelonin或抗体的M195-gelonin结合物。终产物中含有偶合了1，2或3分子gelonin的M195抗体。每抗体分子平均含1.5分子gelonin。使用家兔网状细胞在体外转译系统估价基本纯净的gelonin M195抗体复合物的gelonin活性。在此分析中活性单位的定义是：与未处理的对照组相比，抑制50%蛋白质合成所需蛋白质的量。使用该分析，测定天然gelonin和M195-gelonin结合物的特异活性，分别是2×108U/mg和8.2×105U/mg。基本纯净的gelonin M195抗体在网状细胞溶解产物分析中是有活性的。原样1∶1000稀释后引起蛋白质合成约50%抑制，即减少50%14C-亮氨酸掺入蛋白质。因此，原制备物的活性是1000U/ml。
实施例7
本发明的组合物可以包括M195单克隆抗体和细胞毒部分的融合构成物。本发明的免疫毒素的这种融合构成物可按Co等人的方法进行制备，在此引入作为参考。
在用于这些研究前，在0.1μg/ml天然gelonin存在下Sp2/-OAg14细胞最初能生长。几个月后，则要逐渐提高gelonin的深度，直至细胞能维持在高达10mg/ml的浓度中。然后通过在10mg/ml  gelonin存在下的限制性稀释（limiting  dilution）将细胞克隆，生成的抗gelonin克隆将扩大。将gelonin从培养基中除去传代二次。将细胞用gelonin暴露刺激以确保发育稳定的抗性克隆。在确认人类化M195的生成和活性的实验后，能产生抗体的gelonin抗性SP2/0细胞得到培养，通过与限制性核酸内切酶共培育将M195抗体的cDNA从总DNA中除去。同时，将cDNA从最佳表达gelonin的JM105E。coli中取出，纯化，并在用HindⅢ和Eco  RI消化后释放出编码gelonin的DNA。将gelonin基因连接到重链片断上，此插入物进入抗geloninSP2/0细胞。然后通过限制性释释将细胞亚克隆，将克隆株筛分成人类化抗体产物和gelonin成分。最后，将阳性克隆株扩大，将重组融合蛋白提纯并在体外细胞毒性和体内组织分布药物动力学，治疗学和毒性实验中测试。对M195gelonin融合蛋白性质与前述的M195-gelonin构成物的特性进行比较，以确定每一种的优点和缺点。在这些研究的基础上，对患有晚期乳腺癌的病人进行嵌合性M195-gelonin融合蛋白的临床Ⅰ期研究。
实施例8
关于图1，与测试M195免疫毒素杀HL60细胞的能力，与游离gelonin作比较。对蛋白合成的抑制（使用氚标记混合氨基酸（0.5uCi/ml;New  England  Naclear  Coup.）掺入三氯乙酸（TCA）可沉淀蛋白的试验）被用作所用试剂活性的测定。M195-gelonin免疫毒素的终浓度范围为4μg/ml-5μg/ml。gelonin终浓度范围为44-0.6μg/ml。
M195-gelonin免疫毒素比单独的游离gelonin，毒性约强600
M195-gelonin免疫毒素比单独的游离gelonin，毒性约强600倍。M195-gelonin免疫毒素的ID50约为0.4nM。M195-gelonin对蛋白合成的抑制，继而导致细胞分裂的缺乏或细胞死亡。细胞死亡的确认是通过使用台盼蓝排斥实验以确定活细胞总数和活细胞百分比。参照图1，将终浓度为1×106细胞数/毫升的HL60细胞，在M195-gelonin免疫毒素或单独gelonin存在下于37℃下培养3天。
关于图2，将终浓度为5×105细胞数/毫升的HL60 SKLY16细胞在单独gelonin或M195-gelonin免疫毒素存在下于37℃下培养3天。M195-gelonin免疫毒素的终浓度范围为4μg/ml-15.2pg/ml。gelonin的终浓度范围为10-0.1μg/ml。蛋白质合成的水平由5小时内氚标氨基酸掺入三氯乙酸可沉淀蛋白质的量来确定。
正如图2中可以看到的，M195-gelonin免疫毒素的某些浓度抑制超过80%的HL60蛋白质合成;相应浓度的免疫毒素对SKLY16细胞没有作用。因而，M195-gelonin免疫毒素的选择性是明显的。
关于图3和4，将终浓度1×106的HL60细胞在M195-gelonin免疫毒素存在下在37℃培养三天（图3）或五天（图4）。免疫毒素的终浓度范围是4μg/ml-0.9μg/ml。蛋白质合成水平由5小时内氚标记氨基酸掺入三氯乙酸可沉淀蛋白质的量来确定。
正如比较图3和4所见，暴露于免疫毒素的时间长短影响其活性。实质上，在与HL60细胞共培养五天后，M195-gelonin免疫毒素的效力比三天培养后的增加约十倍。
关于图5，检测人类化M195（HuGl）-免疫毒素与HL60，U937和MOLT4细胞的结合。将HuGl和HuGl-免疫毒素加入HL60细胞（图5，A组）或U937和MOLT4细胞系（图5，B组），浓度范围为5μg/ml-5ngml。在将过量挤体洗去前将细胞在冰中培养1小时。接着，将山羊抗人FITC加入细胞中，并将细胞在冰上再培养1小时。洗去过量抗体后，将细胞用0.5%多聚甲醛固定，并在EPICS  Profile流动
图5说明了人类化的M195-gelonin免疫毒素特异地结合于靶细胞。使用间接流动血细胞计数器，与单独使用人类化M195抗体相比，人类化M195-gelonin免疫毒素在图5中显示了对CD33阳性细胞系（HL60）和U937更特异的结合。它并不结合于CD33阴性细胞系（MOLT4;图5，B组）。
关于图6，在终浓度范围为4μg/ml-0.2ng/ml的人类化M195-gelonin免疫毒素存在下，将终浓度为3×104和5×104的HL60细胞在37℃培养五天。gelonin终浓度范围为50-0.5μg/ml。由与氚标记胸苷共培养5小时来测定DNA的合成。如图6中所说明，人类化M195-gelonin免疫毒素对蛋白质合成的抑制约是单用gelonin所观察到的4500倍。
图7说明人类化M195-gelonin免疫毒素杀死HL60细胞的能力。如图7中所见，人类化M195-gelonin免疫毒素的ID50低于10pmol。免疫毒素的此ID50比单独gelonin的ID50低4000倍多。
关于图8，在人类化M195抗体或F79，一种同型匹配HuGl对照抗体存在下，将HL60细胞在冰上培养1小时。加入人类化M195-gelonin免疫毒素，浓度为0.15μg/ml。在37℃培养细胞90小时。由台盼蓝排斥技术测定活细胞数目。百分抑制率表示与单用免疫毒素所杀细胞相比，在竞争性抗体存在下被杀死细胞的减少。
正如图8中所见，人类化M195抗体能按剂量依赖性方式阻断人类化M195-gelonin免疫毒素的细胞毒性。相反，Fd79，非特异的人类化IgGl，在相同的浓度时没有此作用。
因而总之，可见本发明及揭示于此的实施例很好地适于实现本发明的目的和取得本文开始时所提出的目标。在方法和仪器上可进行某些改变而不背离本发明的实质和范围。已认识到这些屐是可能的，因而进一步要求在下列任何权利要求中所述的每一部分或步骤应被理解为以实质相同或相当方式完成实质相同的结果所用的所有相当部分或步骤。本发明旨在尽可能宽地覆盖其原理所应用的任何形式。因而本发明极适于实现其目的，获得所述的结果和优越性，以及其他固有的用途。

Claims (21)

1、一种组合物，其特征在于含有对CD33蛋白的抗原区显示结合特异性的蛋白质与细胞生长调节剂的结合物。
2、如权利要求1所述的组合物，其特征在于：其中所述的结合特异性是对细胞外的CD33抗原决定簇。
3、如权利要求1所述的组合物，其特征在于：其中所述抗原结合区来自一个单链抗体。
4、如权利要求1所述的组合物，其特征在于：其中所述抗原结合区选自鼠单克隆抗体和人类化单克隆抗体。
5、如权利要求1所述的组合物，其特征在于：其中所述的细胞生长调节剂选自毒素，杀细胞剂，抑制细胞生长药物，和生物应答修饰因子。
6、如权利要求5所述的组合物，其特征在于：其中所述的毒素是来源于植物的毒素。
7、如权利要求6所述的组合物，其特征在于：其中所述来源于植物的毒素选自gelonin，全长重组gelonin片断。
8、如权利要求5所述的组合物，其特征在于：其中所述的毒素选自天然毒素和重组毒素。
9、如权利要求1所述的组合物，其特征在于;其中所述的结合物是所述抗原结合区和所述细胞调节剂间的一种融合蛋白。
10、如权利要求1所述的药物组合物。
11、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：进一步含有一种药学上可接受的载体。
12、如权利要求11的一种单剂量组合物。
13、一种治疗肿瘤的方法，其特征在于：包括对所述细胞施用一定剂量的组合物，该组合物含有对CD33蛋白质抗原区表现出结合特异性的一种蛋白质与生长调节剂的结合物，其中所述的肿瘤细胞是以CD33抗原蛋白质的表达为特征的。
14、如权利要求13所述的方法，其特征在于：其中所述的细胞选自急性和慢性髓细胞样白血病，急性或慢性脊髓发育不良综合症，再生障碍性贫血。淋巴细胞性白血病和未分化的白血病。
15、如权利要求13所述的方法，其特征在于：其中所述的组合物延缓所述细胞的生长速率。
16、如权利要求13所述的治疗方法，其特征在于：其中所述的肿瘤细胞是人类或非人类动物细胞。
17、如权利要求13所述的治疗方法，其特征在于：其中所述组合物预防肿瘤病情的复发。
18、如权利要求13所述的治疗方法，其特征在于：其中所述组合物延长所述肿瘤细胞宿主的生存时间。
19、如权利要求13所述的治疗方法，其特征在于：其中所述的肿瘤细胞是体外细胞。
20、如权利要求13所述的方法，其特征在于：其中所述的肿瘤细胞在骨髓中发现。
21、一种在骨髓内杀死肿瘤细胞的方法，其中所述肿瘤细胞以CD33抗原蛋白的表达为特征，其特征在于包括下列步骤：
从患有肿瘤疾病的个体内移出骨髓;
将所述的骨髓与杀细胞活性剂量的权利要求1组合物相接触;以及
将接触后的骨髓细胞重新输注入个体内。
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