NO314686B1 - Immuntoksiner rettet mot CD33-beslektede overflateantigener, farmasöytisk preparat og anvendelse derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår generelt behandling av neoplastisk sykdom. Mer spesifikt angår foreliggende oppfinnelse sammensetninger omfattende nye immunkonjugater og farmasøytiske preparater inneholdende disse for behandling av neoplastisk sykdom kjennetegnet ved ekspresjon av CD33-antigenet.

Neoplastisk sykdom er en av de ledende årsaker til sykelighet og dødelighet i den vestlige verden. Alle neoplastiske sykdommer eller "cancere" har minst et felles karaktertrekk, dvs. involvering av defekter i prosessen som regulerer cellevekst.

Antigener lokalisert på overflaten av cancerceller har vært nyttig ved atskillelse av lymfoide fra ikke-lymfoide leukemier, subtyping av akutt myelogen leukemi, forutsi terapeutisk resultat og ved terapi in vivo eller via en benmargsrensing ex vivo. Antigener som definerer akutte ikke-lymfocyttiske celler identifiserer også normale hematopoetiske celler under tidlig trinn av deres utvikling.

CD33 antigen er et 67 kilodalton glykoprotein som man finner i normale kolonidannende enheter for granulocytt og monocytt (CFU-GM), på en andel av "burst-forming unit erytroid" (BFU-E) og CFU-granulocytt, -erytroid, -monocytt, -megakaryocytt) CFU-GEMM, og fraværende i normale pluripotente stamceller.

Antistoffer er proteiner som normalt blir produsert av immunsystemet i et dyr som respons på antigene determinanter. Antistoffer bindes til det spesifikke antigenet som det er rettet mot. Utvikling av spesifikke monoklonale antistoffer har skaffet tilveie for forskerne en mulig måte å selektivt målrette kjemoterapeutiske midler til celler som overuttrykker tumorassosierte antigener.

Immuntoksiner er hybridmolekyler som består av et monoklonalt antistoff som er kovalent bundet til et toksin. Immuntoksiner har flere mulige fordeler i forhold til konvensjonelle anti-neoplastiske midler inkludert selektivitet for tumorceller og potensiell avlevering av ekstremt potente toksiner.

Tidligere kjent teknikk som for eksempel A.N. Houghton et al., Seminars in Oncology, vol. 13 nr. 2, 1986, s 165-179 M. Tanimoto et al., Leukemia, vol.3, nr. 5, 1989, s 339-348 og NO 303122 beskriver enkeltkomponentene som utgjør bestanddeler av immuntoksiner. Imidlertid antydes ikke noe om at kombinasjoner av disse kan frembringe funksjonelle immuntoksiner.

Tilstedeværelse av CD33 antigenet på akutt ikke-lymfoide leukemiceller og akutte myelogenene leukemiceller gir en mulighet for utvikling av selektive immuntoksiner. For tiden eksisterer ingen slike effektive immuntoksiner. Det er derfor et fortsatt behov og ønske innenfor fagområdet for forbindelser og fremgangsmåter for selektivt å drepe leukemiceller.

Foreliggende oppfinnelse skaffer tilveie en ny sammensetning som omfatter et konjugat av en antigenbindende region som utviser bindingsspesifisitet for CD33-protein og en cellevekstmodulator. En slik sammensetning virker som et immuntoksin for spesifikt å drepe tumorceller som er kjennetegnet ved ekspresjon av CD33-protein.

Foreliggende oppfinnelse angår således en sammensetning kjennetegnet ved at den omfatter et konjugat av et protein som utviser bindingsspesifisitet for en antigendomene for CD33- protein og en cellevekstmodulator. Cellevekstmodulatoren kan være et toksin, et cytocidisk medikament, et cytostatisk medikament, eller en biologisk responsmodifiserer. Cellevekstmodulatoren er fortrinnsvis gelonin.

I en utførelsesform av oppfinnelsen blir det skaffet tilveie en ny sammensetning av stoff som omfatter et fusjonsprotein dannet ved fusjon av CD33-antigenbindende region og en cellevekstmodulator. Cellevekstmodulatoren er fortrinnsvis gelonin.

Foreliggende oppfinnelse angår videre et farmasøytisk preparat kjennetegnet ved at den innbefatter en sammensetning ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse angår videre anvendelse av en sammensetning omfattende et konjugat av et protein som utviser bindingsspesifisitet for et antigen domene for CD33-protein og en cellevekstmodulator, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for å behandle en neoplastisk celle der den neoplastiske celle uttrykker CD33-antigenprotein.

Foreliggende oppfinnelse angår videre anvendelse av en cytocidisk effektiv dose av en sammensetning ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et preparat for dreping av tumorceller i benmarg, der nevnte tumorceller er kjennetegnet ved ekspresjon av CD33-antigenprotein, og der benmarg fra et individ blir brakt i kontakt med preparatet ex-vivo.

Figur 1 viser hemming av proteinsyntese av gelonin og Ml95 immuntoksin på

HL60 celler.

Figur 2 demonstrerer hemming av proteinsyntese av gelonin og Ml95 gelonin på

SKLY16 og HL60 cellelinjer.

Figur 3 illustrerer hemming av proteinsyntese ved en tre dagers inkubering av M195

immuntoksin med HL60.

Figur 4 viser hemming av proteinsyntese ved en fem dagers inkubering av M195-IT

på HL60 celler.

Figur 5 viser binding av HuG 1 og HuGl -IT til HL60, U937, MOLT4 celler.

Figur 6 illustrerer hemming av DNA-syntese som resulterer fra HuG 1-IT på HL60-celler.

Figur 7 viser konkurrering mellom HuGl-IT og HuGl eller FD79.

Figur 8 illustrerer elektroforetiske mønstre av Ml95 alene, en reaksjonsblanding,

gelonin alene eller renset Ml95 gelonin.

Slik det blir brukt her refererer begrepet "kimeriske antistoffer" eller "kimeriske peptider" til de antistoffer eller antistoffpeptider der en del av peptidet har en aminosyresekvens som er avledet fra, eller er homolog med en korresponderende sekvens i et antistoff eller peptid avledet fra en første genkilde, mens det gjenværende segmentet i kjeden(e) er homolog med korresponderende sekvenser fra en annen genkjede. Et kimerisk tungkjedet antistoffpeptid kan f.eks. omfatte en variabel region fra en gnager og en human konstant region. De to genkildene vil typisk være fra to separate arter, men vil av og til involvere en art.

Kimeriske antistoffer eller peptider blir typisk produsert ved å anvende rekombinante molekylære og/eller cellulære teknikker. I mange tilfeller har kimeriske antistoffer variable regioner av både lette og tunge kjeder som etterligner de variable regionene i antistoffene avledet fra en pattedyrkilde, mens de konstante og/eller rarnmeverkregion er homologe med sekvensene i antistoffer avledet fra en annen, ulik pattedyrart.

Slik den blir brukt her er definisjonen av kimerisk antistoff imidlertid ikke begrenset til dette eksemplet. Et kimerisk antistoffer et hvilket som helst antistoff der den ene eller begge av de tunge eller lette kjedene består av kombinasjoner av sekvenser som etterligner sekvensene i antistoffer av forskjellige kilder, enten disse kildene er fra forskjellige klasser, forskjellige antigenresponser eller forskjellige opprinnelsesarter, eller hvorvidt eller ikke fusjonspunktet er på den variable/konstante grensen. Kimeriske antistoffer kan f.eks. innbefatte antistoffer der rammeverk og komplementær-bestemmende regioner (CDR) er fra forskjellige kilder. For eksempel er ikke-human CDR integrert inn i humane rammeverkregioner bundet til en human konstant region for å lage "humaniserte antistoffer". Se f.eks. PCT-søknad publikasjon nr. WO 87/02671; US-patent nr. 4.816.567; EP-patentsøknad 0173494; Jones, et al., Nature, 321:522-525

(1986); og Verhoeyen, et al., Science, 239:1534-1536 (1988), alle disse er innbefattet med referanse.

Slik det blir brukt her er begrepet "human-lignende rammeverkregion" en rammeverksregion for hver antistoffkjede, og er vanligvis omfattet av minst ca. 70 eller flere aminosyrerester, typisk 75 til 85 eller flere rester. Aminosyrerestene i den human-lignende rammeverkregionen er minst ca. 80%, fortrinnsvis ca. 80-85%, og mest å foretrekke mer enn 85% homolog med de i et humant immunoglobulin. Dette felles-trekket med andre endogene antistoffer er nyttig i generering av en målrettet del som bare induserer en mindre immunreaksjon, f.eks. en mekanisme som minimaliserer respons til "selv" markører.

Slik det blir brukt her refererer begrepet "humanisert" eller "human-lignende immunglobulin" til et immunglobulin som omfatter en human-lignende rammeverkregion og en konstant region som hovedsakelig er homolog med en humant immunglobulin konstant region, som f.eks. har minst ca. 80% eller mer, fortrinnsvis ca. 85-90% eller mer og mest å foretrekke ca. 95% eller mer homologi. De fleste deler av et human-lignende immunglobulin med mulig unntagelse for CDR, er i det vesentlige homologe med tilsvarende deler av en eller flere native immunglobulinsekvenser.

Slik det blir brukt her refererer begrepet "hybrid antistoff til et antistoff der hver kjede separat er homolog med referanse til en pattedyrantistoffkjede, men kombinasjonen representerer en ny sammenkobling slik at to forskjellige antigener blir gjenkjent av antistoffet. I hybridantistoffer er et tungt og lettkjedet par homolog med det som man finner i et antistoff mot et antigengjenkjennende trekk, f.eks. epitope, mens det andre tunge og lettkjedede paret er homolog med et par som man finner i et antistoff mot en annen epitope. Dette resulterer i egenskapen multi-funksjonell valens, dvs. evne til å binde minst to forskjellige epitoper samtidig. Slike hybrider kan naturligvis også bli

dannet ved å anvende kimeriske kjeder.

Slik det blir brukt her menes begrepet "monoklonalt antistoff<1> en antistoffsammensetning som gjenkjenner en særskilt antigendeterminant. Det har ikke til hensikt å være begrensende når det gjelder kilden for antistoff eller måten som det er laget.

Ifølge oppfinnelsen er et antistoff eller annet peptid spesifikk for en CD33 når antistoffet eller peptidet bindes eller har evnen til å binde CD33, f.eks. protein målt eller bestemt ved standard antistoff-antigenanalyser eller ligand-reseptoranalyser, f.eks. konkurrerende analyser, metningsanalyser eller standard immunanalyser slik som ELISA eller RIA. Denne definisjonen for spesifisitet anvendes på enkle tunge og/eller lette kjeder, CDR, fusjonsproteiner eller fragmenter av tunge og/eller lette kjeder, som også er spesifikk for CD33 hvis de binder CD33 alene, eller hvis når de er riktig inkorporert i immunglobulin konformasjonen med komplementære variable regioner og konstante regioner som passer, har de således evne til å binde CD33 med spesifisitet.

I konkurrerende analyser kan evnen et antistoff eller peptidfragment har til å binde et antigen bli bestemt ved påvisning av evnen peptidet har til å konkurrere med binding av en forbindelse som er kjent å binde antigenet. Mange typer av konkurrerende analyser er kjent og blir her diskutert. Analyser som måler binding av en testforbindelse i fravær av en hemmer kan alternativt også bli anvendt. Evnen et molekyl eller annen forbindelse har til å binde c-erbB-2 proteinet kan f.eks. bli påvist ved merking av det aktuelle molekylet direkte eller det kan være umerket eller påvist indirekte ved å anvende forskjellige sandwichanalyseformater. En lang rekke bindingsanalyser slik som konkurrerende bindingsanalyser er kjent (se f.eks. US-patent nr. 3.376.110,4.016.043, og Harlow og Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publi-cations, N.Y. (1988)) som her er innbefattet med referanse). Analyser for å måle binding av en testforbindelse til en komponent alene istedenfor anvendelse av en konkurrerende analyse er også tilgjengelig. For eksempel kan immunglobulin bli anvendt til å identifisere tilstedeværelse av CD33. Standardprosedyrer for monoklonale antistoffanalyser, slik som ELISA, kan bli anvendt (se Harlow og Lane, over). For en gjennomgang av forskjellige signalproduserende systemer som kan bli anvendt, se US-patent nr. 4.391.904, som med dette er innbefattet med referanse.

Spesifisiteten av bindingsdelene til CD33 kan bli bestemt ved deres affinitet. Slik spesifisitet eksisterer hvis dissosiasjonskonstanten (Krj) = l/K, der K er affinitets-konstanten) er < luM, fortrinnsvis < 100 nM, og mest å foretrekke < 1 nM. Antistoffmolekyler vil typisk ha en Kp i de nedre områder. Krj = [R-L]/[R][L] der [R], [L] og [R-L] er konsentrasjonene ved likevekt av henholdsvis reseptoren eller CD33 (R), ligand, antistoff eller peptid (L) og reseptor-ligandkompleks (R-L). Bindingsinteraksjoner mellom ligand eller peptid og reseptor eller antigen innbefatter reversible ikke-kovalente assosiasjoner slik som elektrostatisk tiltrekning, Van der Waals krefter og hydrogenbindinger.

Andre analyseformater kan innbefatte påvisning av tilstedeværelse eller fravær av forskjellige fysiologiske eller kjemiske endringer som resultat av interaksjon, slik som nedmodulering, internalisering eller en økning i fosforylering som beskrevet i US-patentsøknad nr. 07/644.361 inngitt 18.1.1991, og her innbefattet med referanse. Se også Receptor-Effector Coupling - A Practical Approach, ed. Hulme, IRL Press, Oxford

(1990).

Gelonin er et glykoprotein (M.W. tilnærmet 29-30.000 Kd) renset fra frø av Gelonium multiforum. Gelonin tilhører en klasse av potente ribosom-inaktiverende plantetoksiner. Andre medlemmer av denne klassen av ribosom-inaktiverende plantetoksiner er kjeder av abrin, ricin og modeccin. Gelonin, som abrin og ricin, hemmer proteinsyntese ved åskade 60S sub-enheten av pattedyrirbosomer. Gelonin synes åvære stabil overfor kjemisk og fysikalsk behandling. Gelonin selv binder ikke til celler, og er derfor ikke-toksisk, (unntatt i høye konsentrasjoner) og er trygg å håndtere i laboratorier. Inaktivering av ribosomer er irreversibel, synes ikke å involvere ko-faktorer og forekommer med en effektivitet som antyder at gelonin virker enzymatisk.

Gelonin og ricin er blant de mest aktive toksiner som hemmer proteinsyntese på proteinvektbasis. Gelonin er 10 til 1000 ganger mer aktiv i hemming av proteinsyntese enn ricin A-kjeden. Peptider som ricin og abrin består av to kjeder, en A-kjede som er den toksiske enheten og en B-kjede som virker ved å binde til cellene. I motsetning til ricin og abrin, består gelonin av en enkel kjede, og fordi den mangler en B-kjede for binding til celler, er den i seg selv relativt ikke-toksisk overfor intakte celler.

Pattedyrceller mangler tilsynelatende evnen til å binde og/eller internalisere det native geloninmolekylet. Konjugater av gelonin og monoklonalt antistoff, slik som Ml95 rettet mot et tumor assosiert antigen som er tilstede på visse tumorceller, skaffer tilveie både en spesifikk metode for å hemme gelonin til cellen og en vei for internalisering av gelonin-antistoffkomplekset.

Den cytotoksiske delen av immuntoksinet kan være et cytotoksisk medikament eller et enzymatisk aktivt toksin av bakteriell opprinnelse eller planteoppirnnelse, eller et enzymatisk aktivt fragment ("A-kjede") av et slikt toksin. Enzymatisk aktive toksiner og fragmenter derav er foretrukket og kan eksemplifiseres ved gelonin, difteri A-kjeden, ikke-bindende aktive fragmenter av difteri toksin, eksotoksin A-kjede (fra Pseudomonas aeruginosa), ricin A-kjede, abrin A-kjede, modeccin A-kjede, alfa-sarcin, Aleurites fordii proteiner, diantinproteiner, Phytoiacca americana proteiner (PAPI, PAPII og PAP-S), momordica charantia hemmer, kurcin, krotin, saponaria offlcinalis hemmer, mitogellin, restrictocin, fenomycin og enomycin. Mest foretrukket er konjugatet med gelonin.

Aktive fragmenter og derivater innbefatter enhver forbindelse som har samme kjemestruktur som fullengdestrukturen av gelonin, men som mangler hele den primære sekvensen. Disse fragmenter eller derivater vil ha samme eller forbedret biologisk eller cytotoksisk aktivitet som gelonin. Cytotoksisiteten av geloninfragmenter eller derivater kan rutinemessig bli bestemt av personer med kunnskap innenfor fagområdet ved å anvende kaninreticulocyttlysatanalysen.

Biologisk responsmodifiserere som kan bli koplet til Ml95 antistoffet og anvendt i foreliggende oppfinnelse innbefatter, men er ikke begrenset til lymfokiner og cytokiner slik som IL-1, IL-2, interferoner (a, 13 eller y) TNF, LT, TGF-6 og IL-6. Disse biologiske responsmodifiserere har en lang rekke effekter på tumorceller. Blant disse effektene er økt tumorcelledreping ved direktevirkning så vel som økt tumorcelledreping ved økning i vertcellemedierte prosesser. Konjugering av antistoff Ml95 til disse biologiske responsmodiftsererne tillater selektiv lokalisering i tumorer, og således forbedrete anti-proliferative effekter mens man undertrykker ikke-spesifikke effekter som fører til toksisitet av ikke-målrettede celler.

Cytotoksiske medikamenter (og derivater av disse) som er nyttig ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter, men er ikke begrenset til, adriamycin, cis-platinakompleks, bleomycin og metotreksat. Disse cytotoksiske medikamentene er nyttig for klinisk behandling av tilbakevendende tumorer, men deres anvendelse er komplisert ved

alvorlige bivirkninger og skader påført celler som ikke er målsøkte. Ml 95 antistoff kan tjene som en nyttig bærer og slike medikamenter som skaffer tilveie en effektiv måte for både avlevering til tumor og forbedret inngang i tumorcellene selv. I tillegg vil spesifikk antistoffavlevering av cytotoksiske medikamenter til tumorer skaffe tilveie beskyttelse

av sensitive steder slik som lever som ikke uttrykker CD33 og benmargstamceller fra den alvorlige virkning av kjemoterapeutiske midler. Anvendelse av medikamenter konjugert til Ml 95 antistoff som et avleveringssystem tillater lavere dosering av medikamentet selv, siden alle medikamentdelene er konjugert i antistoffer som konsentreres i tumoren eller leukemien.

Konjugat er av monoklonalt antistoff kan bli laget ved å anvende en lang rekke bifunksjonelle proteinkoplingsmidler. Eksempler på slike reagenser er SPDP, iminotiolan (IT), bifunksjonelle derivater av imidoestere slik som dimetyladipimidat, HC1, aktive estere slik som disuksinimidylsuberat, aldehyder slik som glutaraldehyd, bis-azidoforbindelser slik som bis(p-azidobenzoyl)heksandiamin, bis-diazoniumderivater slik som bis-(p-diazoniumbenzoyl)-etylendiamin, diisocyanater slik som tolylen 2,6-diisocyanat og bis-aktive fluorforbindelser slik som 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen.

Administrering av immunotksinene ifølge foreliggende oppfinnelse til et individ som har blitt diagnostisert å ha leukemi som er kjennetegnet ved ekspresjon av CD33 protein vil muliggjøre målretting og konsentrering av det cytotoksiske midlet på stedet der det er nødvendig å drepe tumorceller. Ved slike målrettede cytotoksiske midler, vil ikke-spesifikk toksisitet til andre organer, vev og celler bli eliminert eller redusert.

Når de blir anvendt in vivo for terapi, blir immuntoksinene administrert til menneske eller dyrepasienten i terapeutisk effektive mengder, dvs. mengder som eliminerer eller reduserer tumorbesværet eller i mengder som eliminerer resterende sykdom etter en tidligere behandling med kjemoterapi eller stråleterapi. De vil normalt bli administrert parenteralt, fortrinnsvis intravenøst. Dose og doseringssystem vil avhengig av type leukemi og dens populasjon, karakteristiske trekk ved det spesielle immuntoksin, f.eks. dens terapeutiske indeks, pasient og pasientens historie. Mengde av immuntoksin som blir administrert vil typisk være i området fra ca. 0,01 til ca. 1,0 mg/kg pasientvekt.

For parenteral administrering vil immuntoksinene bli formulert i en injiserbar enhetsdoseform (oppløsning, suspensjon, emulsjon) sammen med en farmasøytisk akseptabel parenteral bærer. Slike bærere er i seg selv ikke-toksiske og ikke-terapeutiske. Eksempler på slike bærere er vann, saltvann, Ringer's oppløsning, dekstroseoppløsning og 5% human serumalbumin. Ikke-vandige bærere slik som fikserte oljer og etyloleat kan også bli anvendt. Liposomer kan bli anvendt som bærere. Bæreren kan inneholde mindre mengder additiver slik som substanser som øker isotonisitet og kjemisk stabilitet, f.eks. buffere og konserveringsmidler. Immuntoksinet vil typisk bli formulert i slike bærere ved konsentrasjoner på ca. 0,1 mg/ml til 10 mg/ml. Immuntoksinene i foreliggende oppfinnelse kan også bli anvendt i en fremgangsmåte for å drepe tumorceller i benmarg. I denne fremgangsmåten blir benmarg først fjernet fra et individ som har en neoplastisk sykdom slik som leukemi. Deretter blir benmargen behandlet med en cytocidisk effektiv dose av et immuntoksin ifølge foreliggende oppfinnelse.

Følgende eksempler skaffer tilveie en detaljert beskrivelse av fremstilling, karakterisering og anvendelse av immuntoksiner i foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

Rensing av gelonin

Skallet på frø fra gelonium multiflorum ble fjernet skall og nøttene knust i en homogenisator med åtte volumer 0,14 M NaCl inneholdende en 5 mM natriumfosfat (pH 7,4). Homogenatet fikk stå over natten ved 4°C med kontinuerlig omrøring, avkjølt på is og sentrifugert ved 35.000 ganger g i 20 minutter ved 0°C. Supematanten ble fjernet, dialysert mot 5 mM natriumfosfat (pH 6,5) og konsentrert ved å anvende et pm 10 filter. Prøven ble lagt på en CM-52 ionebyttekolonne (20 x 1,5 cm) ekvilibrert med 5 mM natriumfosfat (pH 6,5). Materialet som bandt seg til ionebytterharpiksen ble eluert med 400 ml av en 0 til 0,3 M lineær NaCl gradient ved en hastighet på 25 ml pr. time ved 4°C. Fem ml fraksjoner ble samlet. Fraksjonene ble registrert ved 280 nm i et spektrofotometer. Geloninen ble eluert rundt fraksjonene 55-70 og var den siste hoved-elueringstoppen. Fraksjonene 55-70 ble samlet, dialysert mot dobbeltdestillert vann og konsentrert ved lyofilisering. Renhet og molekylvekt av hver fremstilling ble undersøkt i høytrykkvæskekromatografi ved å anvende en TSK 3000 gelgjennomtrengingskolonne med 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,4 og 15% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDSpage). Gelonin beveget seg som et enkelt bånd med en tilnærmet molekylvekt på 29-30.000 dalton.

Eksempel 2

Analyse av geloninaktivitet

Geloninaktivitet ble registrert i en cellefri proteinsyntesehemmingsanalyse. Cellefri proteinsyntesehemmingsanalyse ble gjennomført ved i rekkefølge å tilsette til 50 ul kaninretikulocyttlysat, blanding etter hver tilsetning, følgende komponenter: 0,5 ml 0,2

M Tris-HCl (pH 7,8), 8,9 ml etylenglykol og 0,25 ml 1 M HC1).

Tyve mikroliter av en salt-aminosyreenergiblanding (SAEM) bestående av: 0,375 M KC1,10 mM Mg(CH3CC>2)2> 15 mM glukose, 0,25-10 mM aminosyrer (unntatt leucin), 5 mM ATP, 1 mM GTP, 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 ul kreatininfosfat-kreati-ninfosfokinase, 8 ul leucin (Amersham, 348 mCi mmol), og tilsetning av 1,5 ul av oppløsningene inneholdende forskjellige konsentrasjoner av geloninblandingen. Blandingen ble inkubert i 60 minutter ved 30°C. ^C-leucininkorporering ble registrert i en prøve av blandingen ved utfelling av syntetisert protein på glassfiberfilter, vasking i 10% TC A og aceton, og registrering av reaktivitet i beta-teller ved å anvende Aquasol-scintillasjonsfluid. Gelonin med en spesifikk aktivitet som ikke var lavere enn 4 x 10<9 >U/mg ble anvendt for konjugering med antistoffene. En enhet av gelonin er mengden av geloninprotein som sørget for 50% hemming av inkorporering av [^ C] leucin i protein i dens cellefrie analysen.

Eksempel 3

Modifikasjon av gelonin med iminotiolanfremstilling av 2- IT modifisert gelonin

Gelonin i fosfatbufret saltvann ble konsentrert til tilnærmet 10 mg/ml i en Centriprep 10 konsentrater. Trietanolaminhydroklorid (TEA/HCl), pH 8,0 og EDTA ble tilsatt en endelig konsentrasjon av 60 mM TEA/HCl og 1 mM EDTA, pH 8,0. En 2-iminotiolanstamoppløsning (500 mM i 60 mM TEA/HCl buffer inneholdende 1 mM EDTA, pH 8,0) ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 1 mM og prøven ble inkubert i 90 min. ved 4°C under en strøm av nitrogengass under omrøring. Overskudd iminotiolan ble fjernet ved gelfiltrering på en kolonne av sefadex G-25 (1 x 24 cm) for-ekvilibrert med fosfat-EDTA buffer, pH 7,5 inneholdende 0,01 M Na2HP04, 0,0018 M KH2PO4,0,0034 M KC1,0,001 M EDTA og 0,17 M NaCl. Fraksjoner ble analysert for proteininnhold i mikrotiterplater ved å anvende Bio-Rad analyse. Gelonin eluerte ved

hulromsvolumet (ca. fraksjoner 21-23). Disse fraksjonene ble samlet og lagret ved 4°C.

Ml95 bundet med 4-suksinimidyloksykarbonyl-_-metyl-_(2-pyirdyltio)toluen (SMPT) ble fremstilt ved å kople 2-IT-modifiserte gelonin med SMPT-modifisert MAB M195. For åmodifisere M195 med SMPT, blir 10 mg antistoff i 1,0 ml PBS fortynnet 1:1 med 2X boratbuffer (0,05 M natriumborat 1,7% natriumklorid, pH 9,0) og 52 ul 4 mM SMPT i tørr DMF langsomt tilsatt antistoffoppløsningen. Reaksjonen blir inkubert ved romtemperatur i 2 timer under omrøring under N2. Overskudd SMPT blir fjernet ved å føre reaksjonsblandingene gjennom en Sephadex G-25 kolonne inneholdende fosfat-EDTA-buffer, pH 7,5 og antistoff positive fraksjoner blir evaluert ved Bio-Rad analyse. Fraksjonene blir oppsamlet og lagret ved 4°C under N2. Kryssbinding med 2-IT ble gjennomført ved 27°C under N2 under omrøring i 96 timer. Sluttproduktet blir renset som tidligere beskrevet for SPDP.

Eksempel 4

Fremstilling av det murine monoklonale antistoff Ml 95

Murint monoklonalt antistoff M195 ble fremstilt fra hybridomaer som resultat av fusjon av NS-1 mus myelomaceller og miltceller fra en fem ukers gammel BALB/c mus immunisert med leukemiceller fra en pasient med akutt ikke-lymfocyttisk leukemi (FAB-M2). Supematant fra klonede hybridomakulturer ble screenet mot panelet av leukemicellelinjer og opprinnelig ANLL leukemiceller ved å anvende Staphylococcus aureaus protein A (PA) erytrocyttrosetting. Gjentagende subklonet Ml95 hybridoma ble ekspandert i dobbel pristan-primet (C57 BL/6 ganger BALB/c) Fl mus.

Ml95 ble renset på en PA-Sepharose ved affinitetskromatografi ved å anvende sekvensielle pH-trinnfotrynninger. Renhet ble bestemt på en natriumdodecyl(SDS)-polyakrylamidgel farget med en brilliant blå. Humanisert monoklonalt antistoff M195 ble fremstilt som beskrevet av Co et al., "Chimeric and Humanized Antibodies with Specificity for the CD33 Antigen", J. rmmunol., 148:1149-1154 (1992) og ble fremstilt fra hybridoma og renset som over.

I korthet ble hypervariabel domene (V-region) for H- og L-kjeder av murin M195 klonet ved en anker-PCR-metode. Først ble Ml95 hybridomaceller lysert og RNA ble ekstrahert ved åanvende den varme fenolmetoden. cDNA ble syntetisert fra RNA ved inkubering med viral revers transcriptase. PCR-primere ble deretter fonnet og både ECO RI og Hind III seter ble inkubert i oppstrøms og nedstrøms primere for hensiktsmessig subkloning. PCR-reaksjonene ble gjennomført i en programerbar oppvarmingsblokk ved å anvende 30 runder av temperatursyklus (92°C i 1 minutt, 50°C i 2 minutter og 72°C i 3 minutter). PCR-produktene ble separert ved elektroforese på lavsmeltepunktagarosegel. Båndene ble snittet ut, spaltet med restriksjonsenzymer og klonet inn i PUC 18 vektor for sekvensbestemmelse. Murin H og L variable regioner ble deretter spleiset inn i plasmider inneholdende komplementære human H- og L-kjeder ved å anvende forskjellige vektorer. Vektorene som koder for kimeriske mus/human L-og H-kjeder ble deretter transfektert inn i SP 2/0 celler ved elektroporering. Overlevende kolonier ble sådd ut og testet for evnen til å fremstille humanisert 01CD33

antistoff.

Eksempel 5

Konjugering av SPDP- modifisert monoklonalt antistoff Ml95 med iminotiolan-modifisert gelonin

Et miligram renset gelonin (2 mg/ml i PBS) fremstilt som beskrevet i eksempel 1 ble modifisert med iminotiolan som beskrevet i eksempel 3. Monoklonalt antistoff Ml 95 modifisert som beskrevet i eksempel 4 ble blandet med en lik mengde av den modifiserte gelonin. Denne andelen tilsvarer et 5-gangers molart overskudd av gelonin sammenlignet med antistoff. pH av blandingen ble justert til 7,0 ved tilsetning av 0,05 M TEA/HCl buffer pH 8,0 og blandingen ble inkubert i 20 timer ved 4°C under nitrogen. Jodacetamid (0,1 M) ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 2 mM for å blokkere eventuelt gjenværende frie sulfhydrylgrupper og inkuberingen ble fortsatt i ytterligere en time ved ca. 25°C. Reaksjonsblandingen ble lagret ved 4°C inntil rensing ved gelfiltrering.

Eksmepel 6

Rensing av gelonin- monoklonalt antistoff Ml 95 komplekser

Dcke-konjugert gelonin og lavmolekylvektsproduktet ble fjernet fra reaksjonsblandingene fra eksempel 6 ved gelfiltrering på en Sephadex S-300 kolonne (1,6 x 31 cm) for-ekvilibrert med PBS.

Reaksjonsblandingen fra eksempel 5 ble konsentrert til tilnærmet 1 ml med Centricon 30 mikrokonsentrator før anbringelse på en Sephadexkolonne. Kolonnen ble vasket med PBS. En ml fraksjon ble samlet og 50 ul prøver ble analysert for protein ved Bradford-analysen.

For å fjerne ukonjugert M195, ble høymolekylvektstoppen (fraksjon 28-40) fra S-300 kolonnen applisert på en affinitetskromatografikolonne av Blue Sepharose CL-6B (1 x 24 cm) for-ekvilibrert med 10 mM fosfatbuffer (pH 7,2) inneholdende 0,1 M NaCl. Etter at prøven var anbrakt på kolonnen ble den vasket med 30 ml buffer for fullstendig å eluere ikke-konjugert antistoff. Kolonnen blir eluert med en lineær saltgradient fra 0,1 til 2 M Nacl i 10 mM fosfatbuffer pH 7,2. Proteininnhold av de eluerte fraksjonene ble bestemt i Bradford-analysen.

Ikke-konjugerte antistoff ble fjernet fra gelonin konjugert antistoff ved affinitetskromatografi på en kolonne (1 x 24 cm) av Blue Sepharose CL-6B forekvilibrert med 10 mM fosfatbuffer, pH 7,2 inneholdende 0,1 M NaCl." Etter anbringelse av S-300 eluatprøven ble kolonnen vasket med 30 ml av samme buffer for fullstendig å eluere ikke-konjugert antistoff.

Gelonin-konjugert antistoff bundet til kolonnen ble eluert med lineær saltgradient fra 0,2 til 2 M NaCl i 10 mM fosfatbuffer, pH 7,2. Antistoff-geloninkompleks eluerte ved tilnærmet 0,7 M NaCl. Proteininnhold i eluerte fraksjoner ble bestemt ved Bradford-analysen. Proteininneholdende fraksjoner ble oppsamlet og elueringsmønstret ble bekreftet ved elektroforese på en 5 til 20% gradient ikke-reduserende polyakrylamidgel. Figur 8 illustrerer elektroforetiske mønstre av M19S alene, en urenset reaksjonsblanding av M195, gelonin og M195-gelonin, gelonin alene eller renset M195-gelonin. Gjennomstrømningstoppen (fraksjoner 14-20) inneholder bare fritt antistoff mens fraksjoner 50-80, eluert med høyt saltinnhold, inneholder Ml 95-geloninkonjugat fritt for ukonjugert gelonin eller antistoff. Sluttproduktet inneholdt M195 antistoff koplet til 1,2 eller 3 geloninmolekyler. Gjennomsnittlig gelonininnhold var 1,5 molekyler pr. antistoffmolekyl. Kaninretikulocytt in vitro translasjonssystemet ble utnyttet for å bestemme geloninaktivitet av hovedsakelig ren gelonin Ml95 antistoffkompleks. En aktivitetsenhet av denne analysen ble definert som mengden protein som er nødvendig for å skaffe tilveie 50% hemming av proteinsyntese sammenlignet med ubehandlede kontroller. Ved åutnytte analysen ble spesifikk aktivitet til både nativgelonin og M195-geloninkonjugat bestemt å være henholdsvis 2 x 10^ U/mg og 8,2 x 10^ U/mg. Den hovedsakelig rene gelonin Ml 95 antistoff er aktiv i retikulocyttlysatanalyse. En 1:1000 fortynning av opprinnelig prøve medførte tilnærmet en 50% hemming av proteinsyntese, dvs. en 50% reduksjon av inkorporering av l^Oleucin 1 protein. Aktiviteten av det opprinnelige preparatet var 1000 U/ml.

Eksempel 7

Sammensetningen i foreliggende oppfinnelse kan inkludere fusjonskonstruksjoner av Ml 95 monoklonalt antistoff og en cytotoksisk del. Slike fusjonskonstruksjoner av immuntoksin i foreliggende oppfinnelse kan bli fremstilt ved fremgangsmåten til Co et al., som her er innbefattet med referanse.

Før anvendelse i disse studiene, vil Sp2/0-Agl4 celler dyrkes til å begynne med i nærvær av 0,1 ug/ml nativ gelonin. Over flere måneder vil konsentrasjon av gelonin gradvis bli øket inntil cellene kan bli holdt opptil 10 mg/ml. Celler vil deretter bli klonet ved begrenset fortynning i nærvær av 10 mg/ml gelonin og resulterende kolonier resistent mot gelonin vil ekspandere. Gelonin vil bli fjernet fra kulturmediet i to omganger og cellene ble igjen utfordret med gelonineksponering for å bekrefte utvikling av stabil-resistente kloner. Etter tester for å bekrefte produksjon og aktivitet av humanisert Ml 95, vil gelonin-resistente SP2/0-celleproduserende antistoff bli dyrket og cDNA for Ml95 antistoff fjernet fra total DNA ved inkubering med restriksjonsendo-nuklease. I parallell vil cDNA fra JM105 E. coli som uttrykker optimalisert gelonin bli fjernet, renset og DNA som kode for gelonin frigjort etter spalting med Hindlll og Eco RI. Geloningenene vil bli ligert inn i tung-kjedet fragment og innsnittet satt inn i geloninresistente SP2/0-celler. Celler vil deretter bli sub-klonet ved begrenset fortynning og kloner screenet for både humanisert antistoffproduksjon og gelonininnhold. Til slutt vil positive kloner bli ekspandert og rekombinant fusjonsprotein vil bli renset og undersøkt både i in vitro cytotoksisitetsanalyser og i in vivo vevsdistirbusjon, farmakokinetikk, terapeutiske og toksisitetstudier. En sammenligning av Ml95 geloninfusjonsproteinegenskaper med karaktertrekkene av tidligere beskrevne M195-geloninkonstruksjoner vil bli gjennomført for å bestemme fordeler og ulemper ved hver av dem. Basert på disse studier kan en klinisk fase I studie av kimerisk M195-geIoninfusjonsprotein bli gjennomført hos pasienter med fremskreden brystcancer.

Eksempel 8

Med referanse til fig. 1 ble Ml95 immuntoksin undersøkt for dens evne til å drepe HL60 celler sammenlignet med fri gelonin. Hemming av proteinsyntese (ved å anvende testen av tritiert blandet aminosyre (0,5 uCi/ml; New England Nuclear Corp.) inkorporering i trikloreddiksyre (TCA) utfelt protein) ble anvendt for å måle aktivitet av midlet som ble anvendt. Endelige konsentrasjoner av Ml95-geloninimmunotoksin fra 4 ug pr. ml til 5 nanogram. Geloninsluttkonsentrasjoner var i området fra 44 ug pr. ml til 0,6 ug pr. ml.

M195-geloninimmuntoksin var tilnærmet 600 ganger mer potent enn fritt gelonin alene. ID50 for M195-geloninimmunotoksin var tilnærmet 0,4 nM. Hemming av proteinsyntese ved M195-geloninimmunotoksin fører deretter til enten mangel på celledeling eller til celledød. Celledød ble bekreftet ved eksperimenter som anvender ekskludering av trypan blått for å bestemme totalt antall levende celler og prosentdel av levende celler med referanse til figur 1, ble HL60 celler med en sluttkonsentrasjon på 1 x 10^ celler/cm^ inkubert i tre dager ved 37°C i nærvær av M195-geloninimmunotoksin eller gelonin alene.

Med referanse til figur 2, ble HL60 SKLY16 celler som hadde en sluttkonsentrasjon på 5 x 10^ celler/cm^ inkubert i tre dager ved 37°C i nærvær av enten gelonin alene eller

M195-geloninimmunotoksin. Sluttkonsentrasjoner av M195-geloninimmunotoksin var i området fra 4 ug pr. ml til 15,2 pg/ml. Geloninsluttkonsentrasjoner var i området fra 10 fig/ml til 0,1 jig/ml. Nivåer av proteinsyntese var bestemt ved en 5 timers inkorporering av tritierte aminosyrer i trikloreddiksyreutfelt protein.

Slik man kan se i figur 2 hemmet konsentrasjoner av Ml95-geloninimmunotoksin mer enn 80% av HL60 proteinsyntese; sammenlignbare konsentrasjoner av immuntoksin hadde ingen effekt på SKLY16 celler. Selektiviteten til M195-geloninimmuntoksin er således klar.

Med referanse til figur 3 og 4 ble HL60 celler ved en sluttkonsentrasjon på 1 x 10^ inkubert i tre dager (figur 3) eller fem dager (figur 4) ved 37°C i nærvær av Ml 95-geloninimmuntoksin. Sluttkonsentrasjonen av immuntoksinet var i området fra 4 ug/ml til 0,9 ng/ml. Nivåer av proteinsyntese ble bestemt ved en fem timers inkorporering av tritierte aminosyrer i trikloreddiksyreutfelt protein.

Slik man kan se ved sammenligning av figur 3 og 4, påvirker varigheten av eksponeirngstiden til immuntoksinet dens aktivitet. Faktisk kan man se en tilnærmet ti gangers økning i effektivitet av M195-geloninimmuntoksin etter en fem dagers inkubering med HL60 celler i motsetning til en tre dagers inkubering.

Med referanse til figur 5 ble binding av humanisert Ml95 (HuGl)-immuntoksin til HL60, U937 og MOLT4 celler undersøkt. HuGl og HuGl-immunotoksin ble tilsatt HL60 celler (figur 5, panel A) eller U937 og MOLT4 cellelinjer (figur 5, panel B) i konsentrasjoner i området fra 5 ug/ml til 5 ng/ml. Cellene ble inkubert på is i en time før overskuddantistoff ble vasket vekk. Deretter ble geit anti-human FITC tilsatt cellene og cellene ble igjen inkubert i en time på is. Etter at man hadde vasket vekk overskudd av antistoff, ble cellene fiksert ved 0,5% paraformaldehyd og avlest på et EPICS Profile flowcytometer.

Figur 5 illustrerer at humanisert M195-geloninimmuntoksin har evne til spesifikk binding til målceller. Ved å anvende indirekte flowcytometri, viste humanisert Ml95-geloninimmuntoksin mer spesifikk binding i figur 5 til CD33 positive cellelinjer (HL60) og U937 sammenlignbare med humanisert M195 antistoff alene. Det bandt ikke til CD33 negative cellelinjer (MOLT4; figur 5, panel B).

Med referanse til figur 6 ble HL60 celler ved en sluttkonsentrasjon på 3 x IO<4> og 5 x IO<4> inkubert i fem dager ved 37°C i nærvær av humanisert M195-geloninimmuntoksin ved en sluttkonsentrasjon i området 4 ug/ml til 0,2 ng/ml. Geloninsluttkonsentrasjonene var i området fra 50 ug/ml til 0,5 ug/ml. DNA-syntese ble bestemt ved fem timers inkubering med tritiert tymidin. Slik det er illustrert i figur 6, hemmet humanisert M195-gelonin immuntoksin proteinsyntese tilnærmet 4500 x i forhold til det som man ser med gelonin alene.

Figur 7 illustrerer evnen til humanisert MI95-gelonin immunotoksin å drepe HL60 celler. Slik man kan se i figur 7, var ID50 for humaniserte M195-geloninimmunotoksin mindre enn 10 picomol. Denne ID50 for immunotoksin er mer enn 4000 ganger lavere enn ID50 for gelonin alene.

Med referanse til figur 8 ble HL60 celler inkubert i en time på is i nærvær av humanisert Ml 95 antistoff eller F79, et isotype tilpasset HuGl kontrollantistoff. Humanisert M195-geloninimmuntoksin ble tilsatt ved en konsentrasjon på 0,15 ug/ml. Celler ble inkubert i 90 timer ved 37°C. Mengden av levende celler ble bestemt ved trypanblå ekskluderingsteknikken. Prosent hemming representerer reduksjon av drepte celler i nærvær av konkurrende antistoff sammenlignet med celler drept ved immuntoksin alene.

Slik man kan se i figur 8, hadde humanisert Ml 95 antistoff evne til å blokkere cytotoksisitet av humanisert Ml95 antistoff-gelonmimmunotoksin på en doseavhengig måte. I motsetning til dette hadde Fd79, et ikke-spesifikt humanisert IgGl, ingen effekt på samme nivåer.

Som konklusjon ser man derfor at foreliggende oppfinnelse og utførelsesformen som her er beskrevet er godt tilpasset til å gjennomføre målene og det som er angitt her.

Claims (20)

1. Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et konjugat av et protein som utviser bindingsspesifisitet for en antigendomene for CD33 protein og en cellevekstmodulator.

2. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte bindingsspesifisitet er for en ekstracellulær epitope av CD33.

3. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte antigenbindingsregion er fra et enkeltkjedet antigen.

4. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte antigenbindingsregion blir valgt fra gruppen som består av munne monoklonale antistoffer og humaniserte monoklonale antistoffer.

5. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte cellevekstmodulator blir valgt fra gruppen som består av et toksin, et cytocidisk medikament, et cytostatisk medikament og en biologisk responsmodifiserer.

6. Sammensetning ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte toksin er et planteavledet toksin.

7. Sammensetning ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte planteavledet toksin blir valgt fra gruppen som består av gelonin, fullengde rekombinant gelonin og geloninfragmenter.

8. Sammensetning ifølge krav 5,karakterisert ved at nevnte toksin blir valgt fra gruppen som består av nativt toksin og rekombinant toksin.

9. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte konjugat er et fusjonsprotein mellom nevnte antigenbindende region og nevnte cellevekstmodulator.

10. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at den innbefatter en sammensetning ifølge krav 1.

11. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at den videre omfatter en farmasøytisk aksepterbar bærer.

12. Enkeldose preparat, karakterisert ved at den innbefatter en sammensetning ifølge krav 11.

13. Anvendelse av en sammensetning omfattende et konjugat av et protein som utviser bindingsspesifisitet for et antigen domene for CD33 protein og en cellevekstmodulator, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for å behandle en neoplastisk celle der den neoplastiske celle uttrykker CD33-antigenprotein.

14. Anvendelse ifølge krav 13, hvor nevnte celle blir valgt fra gruppen som består av akutte og kroniske myeloidleukemier, akutte og kroniske myelodysplastiske syndromer, refraktoriske anemier, lymfoide leukemier og udifferensierte leukemier.

15. Anvendelse ifølge krav 13, hvor nevnte sammensetning retarderer veksten av nevnte celler sammenliknet med en neoplastisk celle som ikke er behandlet med sammensetningen.

16. Anvendelse ifølge krav 13, hvor nevnte neoplastiske celle er i et menneske eller ikke-humant dyr.

17. Anvendelse ifølge krav 13, hvor nevnte sammensetning inhiberer vekst av nevnte celler.

18. Anvendelse ifølge krav 13, hvor nevnte neoplastiske celle er in vitro.

19. Anvendelse ifølge krav 13, hvor nevnte neoplastiske celle finnes i benmargen.

20. Anvendelse av en cytocidisk effektiv dose av en sammensetning ifølge krav 1 for fremstilling av et preparat for dreping av tumorceller i benmarg, der nevnte tumorceller er kjennetegnet ved ekspresjon av CD33 antigenprotein, og der benmarg fra et individ blir brakt i kontakt med preparatet ex-vivo.