JP2002300890A - 組換えヤドリギレクチン（ｒＭＬ） - Google Patents
組換えヤドリギレクチン（ｒＭＬ）Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明の根底にある課題は、ヤドリギレクチン
を純粋な形態で、そして大規模でのその利用が可能にな
る量で提供することにある。 【解決手段】ヤドリギレクチンの遺伝子配列を初めて提
供することによって、インビトロにて再会合し得、そし
てそれゆえタンパク質化学、酵素活性、および構造に関
して均質なｒＭＬホロタンパク質を生成する個々の高純
度組換え鎖（ｒＭＬＡ、ｒＭＬＢ）が、該配列から開始
することにより得られ得る。
を純粋な形態で、そして大規模でのその利用が可能にな
る量で提供することにある。 【解決手段】ヤドリギレクチンの遺伝子配列を初めて提
供することによって、インビトロにて再会合し得、そし
てそれゆえタンパク質化学、酵素活性、および構造に関
して均質なｒＭＬホロタンパク質を生成する個々の高純
度組換え鎖（ｒＭＬＡ、ｒＭＬＢ）が、該配列から開始
することにより得られ得る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、成熟後にヤドリギ
レクチンダイマーの生物学的活性を有するプレプロタン
パク質をコードする核酸分子、これらの核酸分子を含有
するベクター、該ベクターで形質転換された宿主、およ
びこれらの核酸分子によってコードされるポリペプチド
および／またはポリペプチドダイマーに関する。本発明
のポリペプチドおよび／またはポリペプチドダイマー
は、治療上広範に適用可能である。従って、本発明はさ
らに、本発明のポリペプチドおよび／またはポリペプチ
ドダイマーを含有するイムノトキシンならびに薬学組成
物に関する。さらに、本発明は、本発明の核酸分子、本
発明のポリペプチドおよび／またはポリペプチドダイマ
ー、および／または本発明の核酸分子と特異的にハイブ
リダイズするプライマーを含有する診断組成物に関す
る。最後に、本発明は、本発明のポリペプチドおよび／
または本発明のポリペプチドダイマーを含有する植物保
護剤に関する。
レクチンダイマーの生物学的活性を有するプレプロタン
パク質をコードする核酸分子、これらの核酸分子を含有
するベクター、該ベクターで形質転換された宿主、およ
びこれらの核酸分子によってコードされるポリペプチド
および／またはポリペプチドダイマーに関する。本発明
のポリペプチドおよび／またはポリペプチドダイマー
は、治療上広範に適用可能である。従って、本発明はさ
らに、本発明のポリペプチドおよび／またはポリペプチ
ドダイマーを含有するイムノトキシンならびに薬学組成
物に関する。さらに、本発明は、本発明の核酸分子、本
発明のポリペプチドおよび／またはポリペプチドダイマ
ー、および／または本発明の核酸分子と特異的にハイブ
リダイズするプライマーを含有する診断組成物に関す
る。最後に、本発明は、本発明のポリペプチドおよび／
または本発明のポリペプチドダイマーを含有する植物保
護剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヤドリギ抽出物は数世紀にわたって治療
に用いられている。今世紀始めから、ヤドリギ調製物は
ガンの治療に用いられ、様々な成功例がある（Ｂｏｃｃ
ｉ，１９９３； Ｇａｂｉｕｓ ら、１９９３； Ｇａ
ｂｉｕｓ および Ｇａｂｉｕｓ， １９９４； Ｇａ
ｎｇｕｌｙ および Ｄａｓ， １９９４）。Ｈａｊｔ
ｏ ら （１９８９， １９９０）は、治療効果が、特
にいわゆるヤドリギレクチン（ビスキュミン（ｖｉｓｃ
ｕｍｉｎ）、Ｖｉｓｃｕｍ ａｌｂｕｍアグルチニン、
ＶＡＡ）によって媒介されるということを示すことがで
きた。今日、細胞傷害効果の他に、従来技術では特に、
（非特異性）免疫刺激について論じられており、この正
の効果を腫瘍患者の随伴治療およびアフターケアに利用
される。生活の質の向上は、このような患者において内
因性エンドルフィンの分泌によりおそらく媒介される
（Ｈｅｉｎｙ および Ｂｅｕｔｈ， １９９４）。イ
ンビトロ（Ｈａｊｔｏ ら、１９９０； Ｍａｅｎｎｅ
ｌ ら、１９９１； Ｂｅｕｔｈ ら、１９９３）およ
びインビボ（Ｈａｊｔｏ， １９８６； Ｈａｊｔｏ
ら、１９８９； Ｂｅｕｔｈ ら、１９９１； Ｂｅｕ
ｔｈ ら、１９９２）での多数の研究ならびに臨床試験
（Ｂｅｕｔｈ ら、１９９２）において、炎症性サイト
カイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６）の増加した
放出ならびに免疫系の細胞成分（ＴH細胞、ＮＫ細胞）
の活性化が報告されている。
に用いられている。今世紀始めから、ヤドリギ調製物は
ガンの治療に用いられ、様々な成功例がある（Ｂｏｃｃ
ｉ，１９９３； Ｇａｂｉｕｓ ら、１９９３； Ｇａ
ｂｉｕｓ および Ｇａｂｉｕｓ， １９９４； Ｇａ
ｎｇｕｌｙ および Ｄａｓ， １９９４）。Ｈａｊｔ
ｏ ら （１９８９， １９９０）は、治療効果が、特
にいわゆるヤドリギレクチン（ビスキュミン（ｖｉｓｃ
ｕｍｉｎ）、Ｖｉｓｃｕｍ ａｌｂｕｍアグルチニン、
ＶＡＡ）によって媒介されるということを示すことがで
きた。今日、細胞傷害効果の他に、従来技術では特に、
（非特異性）免疫刺激について論じられており、この正
の効果を腫瘍患者の随伴治療およびアフターケアに利用
される。生活の質の向上は、このような患者において内
因性エンドルフィンの分泌によりおそらく媒介される
（Ｈｅｉｎｙ および Ｂｅｕｔｈ， １９９４）。イ
ンビトロ（Ｈａｊｔｏ ら、１９９０； Ｍａｅｎｎｅ
ｌ ら、１９９１； Ｂｅｕｔｈ ら、１９９３）およ
びインビボ（Ｈａｊｔｏ， １９８６； Ｈａｊｔｏ
ら、１９８９； Ｂｅｕｔｈ ら、１９９１； Ｂｅｕ
ｔｈ ら、１９９２）での多数の研究ならびに臨床試験
（Ｂｅｕｔｈ ら、１９９２）において、炎症性サイト
カイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６）の増加した
放出ならびに免疫系の細胞成分（ＴH細胞、ＮＫ細胞）
の活性化が報告されている。
【０００３】今日、６０ｋＤａのヤドリギレクチンタン
パク質は、抽出物から生化学的に得られるヤドリギ抽出
物の活性成分であると考えられている（Ｆｒａｎｚ
ら、１９７７； Ｇａｂｉｕｓ ら、１９９２）。ＭＬ
タンパク質は、２個の共有Ｓ−Ｓ結合したサブユニット
からなり、そのＡ鎖はリボソームの酵素的不活性化を担
い（Ｅｎｄｏ ら、１９８８）、そして、そのＢ鎖は炭
水化物結合を担う。今日、生物学的活性は、主にＢ鎖の
レクチン活性による（Ｈａｊｔｏ ら、１９９０）。
パク質は、抽出物から生化学的に得られるヤドリギ抽出
物の活性成分であると考えられている（Ｆｒａｎｚ
ら、１９７７； Ｇａｂｉｕｓ ら、１９９２）。ＭＬ
タンパク質は、２個の共有Ｓ−Ｓ結合したサブユニット
からなり、そのＡ鎖はリボソームの酵素的不活性化を担
い（Ｅｎｄｏ ら、１９８８）、そして、そのＢ鎖は炭
水化物結合を担う。今日、生物学的活性は、主にＢ鎖の
レクチン活性による（Ｈａｊｔｏ ら、１９９０）。
【０００４】しかしながら、ヤドリギレクチン（ＭＬ）
の構造／機能関係についてはほとんど知られていない。
観察される作用様式および／または治療効果に対してど
ちらの単鎖ならびにその異なる生化学的活性および酵素
活性が寄与するかは未だに明らかでない。構造／機能関
係の分析は、調製物に他のヤドリギ植物成分が混入する
ため、困難になっている（Ｓｔｅｉｎ および Ｂｅｒ
ｇ， １９９４）。抽出調製物の活性は調製物の異なる
組成に依存し得、次にはこの組成は宿主樹木（リンゴ、
マツ、ポプラなど）の種類に依存し得ることが論じられ
る（Ｈｕｅｌｓｅｎ ら、１９８６）。ビスコトキシン
（ｖｉｓｃｏｔｏｘｉｎ）（Ｇａｒｃｉａ−Ｏｌｍｅｄ
ｏ ら、１９８３； Ｍｅｎｄｅｚ ら、１９９０）お
よびその他のビスキュミン（ｖｉｓｃｕｍｉｎ）（例え
ば、ＭＬ−２、ＭＬ−３など）は、同様の効果を有する
と言われる（Ｅｉｆｌｅｒ ら、１９９４）。生化学的
に（アフィニティークロマトグラフィーにより）高度に
精製されたＭＬ調製物ですらも実質的には不均一である
（図８参照）。この不均一さは、生化学的に評価可能な
鎖の活性、インビトロおよびインビボにおいて引き起こ
される効果およびタンパク質構造それ自体に関する。構
造変異体は、ＭＬのＡおよびＢ鎖のグリコシル化ならび
に配列変異について論じられる。Ｇａｂｉｕｓ ら
（１９９２）および Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ら （１９９
２）は、ＭＬ−１のＡ１鎖およびＡ２鎖の配列変異性を
示す。
の構造／機能関係についてはほとんど知られていない。
観察される作用様式および／または治療効果に対してど
ちらの単鎖ならびにその異なる生化学的活性および酵素
活性が寄与するかは未だに明らかでない。構造／機能関
係の分析は、調製物に他のヤドリギ植物成分が混入する
ため、困難になっている（Ｓｔｅｉｎ および Ｂｅｒ
ｇ， １９９４）。抽出調製物の活性は調製物の異なる
組成に依存し得、次にはこの組成は宿主樹木（リンゴ、
マツ、ポプラなど）の種類に依存し得ることが論じられ
る（Ｈｕｅｌｓｅｎ ら、１９８６）。ビスコトキシン
（ｖｉｓｃｏｔｏｘｉｎ）（Ｇａｒｃｉａ−Ｏｌｍｅｄ
ｏ ら、１９８３； Ｍｅｎｄｅｚ ら、１９９０）お
よびその他のビスキュミン（ｖｉｓｃｕｍｉｎ）（例え
ば、ＭＬ−２、ＭＬ−３など）は、同様の効果を有する
と言われる（Ｅｉｆｌｅｒ ら、１９９４）。生化学的
に（アフィニティークロマトグラフィーにより）高度に
精製されたＭＬ調製物ですらも実質的には不均一である
（図８参照）。この不均一さは、生化学的に評価可能な
鎖の活性、インビトロおよびインビボにおいて引き起こ
される効果およびタンパク質構造それ自体に関する。構
造変異体は、ＭＬのＡおよびＢ鎖のグリコシル化ならび
に配列変異について論じられる。Ｇａｂｉｕｓ ら
（１９９２）および Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ら （１９９
２）は、ＭＬ−１のＡ１鎖およびＡ２鎖の配列変異性を
示す。
【０００５】ヤドリギレクチンの治療効果についてより
詳細な分析を行うには、ヤドリギレクチンが純粋な形態
の構造的に均一な物質として利用可能であることが望ま
しい。さらに、科学者らにとっては、ヤドリギレクチン
／その成分を薬学組成物の活性成分として大規模に用い
得るように、これを純粋な形態で大量に調製できること
が重要である。これらの目的は、当該分野で公知のプロ
セスでは達成し得なかった。当該分野の現在の状況に従
う植物原料からの単離では、常に不均一な物質の混合物
しか得られない。
詳細な分析を行うには、ヤドリギレクチンが純粋な形態
の構造的に均一な物質として利用可能であることが望ま
しい。さらに、科学者らにとっては、ヤドリギレクチン
／その成分を薬学組成物の活性成分として大規模に用い
得るように、これを純粋な形態で大量に調製できること
が重要である。これらの目的は、当該分野で公知のプロ
セスでは達成し得なかった。当該分野の現在の状況に従
う植物原料からの単離では、常に不均一な物質の混合物
しか得られない。
【０００６】植物ヤドリギレクチン調製物の不均一さは
特に、イソ型であるＭＬ−２およびＭＬ−３へのＭＬ−
１の翻訳後プロセシングの結果である。そのため、ヤド
リギレクチン調製物は、単離方法または発酵期間に依存
して異なる含有量のＭＬ−１、ＭＬ−２およびＭＬ−３
を有する（Ｊａｅｇｇｙ ら、１９９５）。さらに、上
述した任意のイソ型はさらに、等電点電気泳動によって
ＭＬ−１について図８に例示されるようにたいてい微小
不均一（ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）であ
る。
特に、イソ型であるＭＬ−２およびＭＬ−３へのＭＬ−
１の翻訳後プロセシングの結果である。そのため、ヤド
リギレクチン調製物は、単離方法または発酵期間に依存
して異なる含有量のＭＬ−１、ＭＬ−２およびＭＬ−３
を有する（Ｊａｅｇｇｙ ら、１９９５）。さらに、上
述した任意のイソ型はさらに、等電点電気泳動によって
ＭＬ−１について図８に例示されるようにたいてい微小
不均一（ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）であ
る。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
根底にある課題は、ヤドリギレクチンを純粋な形態で、
そして大規模でのその利用が可能になる量で提供するこ
とにある。この課題は、請求の範囲において特徴付けら
れる実施態様によって解決される。
根底にある課題は、ヤドリギレクチンを純粋な形態で、
そして大規模でのその利用が可能になる量で提供するこ
とにある。この課題は、請求の範囲において特徴付けら
れる実施態様によって解決される。
【０００８】したがって、本発明は、（ａ）成熟後にヤ
ドリギレクチンダイマーの生物学的機能を有し、そして
図４ｃに示されるヌクレオチド配列を有するプレプロタ
ンパク質をコードする核酸分子；（ｂ）（ａ）のプレプ
ロタンパク質のフラグメントであってヤドリギレクチン
ダイマーの生物学的に活性な成分をコードする核酸分
子；（ｃ）遺伝暗号の縮重により（ａ）または（ｂ）の
核酸分子と異なる核酸分子；あるいは（ｄ）ストリンジ
ェントな条件下で（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の核酸
分子とハイブリダイズし、そして（ａ）または（ｂ）に
示される生物学的機能および／または活性を有するポリ
ペプチドをコードする核酸分子に関する。
ドリギレクチンダイマーの生物学的機能を有し、そして
図４ｃに示されるヌクレオチド配列を有するプレプロタ
ンパク質をコードする核酸分子；（ｂ）（ａ）のプレプ
ロタンパク質のフラグメントであってヤドリギレクチン
ダイマーの生物学的に活性な成分をコードする核酸分
子；（ｃ）遺伝暗号の縮重により（ａ）または（ｂ）の
核酸分子と異なる核酸分子；あるいは（ｄ）ストリンジ
ェントな条件下で（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の核酸
分子とハイブリダイズし、そして（ａ）または（ｂ）に
示される生物学的機能および／または活性を有するポリ
ペプチドをコードする核酸分子に関する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】１．本発明は、核酸分子
であって、 (a) 成熟後にヤドリギレクチンダイマーの生物学的機
能を示し、かつ図４Ｃに示される核酸配列を有するプレ
プロタンパク質をコードする； (b) (a)に記載のプレプロタンパク質のフラグメントで
あって、ヤドリギレクチンダイマーの生物学的に活性な
部分であるフラグメントをコードする； (c) (a)または(b)に記載の核酸分子とは遺伝子コード
の縮重に起因して異なる；または (d) ストリンジェントな条件下で(a)、(b)、または(c)
に記載の核酸分子とハイブリダイズし、かつ(a)または
(b)に示される生物学的機能または活性を有するポリペ
プチドをコードする、核酸分子、に関する。
であって、 (a) 成熟後にヤドリギレクチンダイマーの生物学的機
能を示し、かつ図４Ｃに示される核酸配列を有するプレ
プロタンパク質をコードする； (b) (a)に記載のプレプロタンパク質のフラグメントで
あって、ヤドリギレクチンダイマーの生物学的に活性な
部分であるフラグメントをコードする； (c) (a)または(b)に記載の核酸分子とは遺伝子コード
の縮重に起因して異なる；または (d) ストリンジェントな条件下で(a)、(b)、または(c)
に記載の核酸分子とハイブリダイズし、かつ(a)または
(b)に示される生物学的機能または活性を有するポリペ
プチドをコードする、核酸分子、に関する。
【００１０】２．本発明の好ましい実施形態では、上記
フラグメントが、図４ａに示されるヌクレオチド配列に
よってコードされるヤドリギレクチンのＡ鎖である、１
に記載の核酸分子が提供される。
フラグメントが、図４ａに示されるヌクレオチド配列に
よってコードされるヤドリギレクチンのＡ鎖である、１
に記載の核酸分子が提供される。
【００１１】３．本発明の好ましい実施形態では、上記
フラグメントが、図４ｂに示されるヌクレオチド配列に
よってコードされるヤドリギレクチンのＢ鎖である、１
に記載の核酸分子が提供される。
フラグメントが、図４ｂに示されるヌクレオチド配列に
よってコードされるヤドリギレクチンのＢ鎖である、１
に記載の核酸分子が提供される。
【００１２】４．本発明の好ましい実施形態では、ＤＮ
Ａ分子である、１〜３のいずれかに記載の核酸分子が提
供される。
Ａ分子である、１〜３のいずれかに記載の核酸分子が提
供される。
【００１３】５．本発明の好ましい実施形態では、ＲＮ
Ａ分子である、１〜３のいずれかに記載の核酸分子が提
供される。
Ａ分子である、１〜３のいずれかに記載の核酸分子が提
供される。
【００１４】６．本発明の好ましい実施形態では、１〜
５のいずれかに記載の核酸分子に対してアンチセンス鎖
である、核酸分子が提供される。
５のいずれかに記載の核酸分子に対してアンチセンス鎖
である、核酸分子が提供される。
【００１５】７．本発明の好ましい実施形態では、１〜
６のいずれかに記載の核酸分子を少なくとも１つ含有す
る、ベクターが提供される。
６のいずれかに記載の核酸分子を少なくとも１つ含有す
る、ベクターが提供される。
【００１６】８．本発明の好ましい実施形態では、２ま
たは４に記載の核酸分子および３または４に記載の核酸
分子の両方を含有する、７に記載のベクターが提供され
る。
たは４に記載の核酸分子および３または４に記載の核酸
分子の両方を含有する、７に記載のベクターが提供され
る。
【００１７】９．本発明の好ましい実施形態では、上記
ベクターが発現ベクターである、７または８に記載のベ
クターが提供される。
ベクターが発現ベクターである、７または８に記載のベ
クターが提供される。
【００１８】１０．本発明の好ましい実施形態では、７
〜９のいずれかに記載のベクターの少なくとも１つで形
質転換されている、宿主が提供される。
〜９のいずれかに記載のベクターの少なくとも１つで形
質転換されている、宿主が提供される。
【００１９】１１．本発明の好ましい実施形態では、哺
乳動物細胞、植物細胞、細菌、カビ細胞、酵母細胞、昆
虫細胞またはトランスジェニック植物である、１０に記
載の宿主が提供される。
乳動物細胞、植物細胞、細菌、カビ細胞、酵母細胞、昆
虫細胞またはトランスジェニック植物である、１０に記
載の宿主が提供される。
【００２０】１２．本発明の好ましい実施形態では、上
記細菌がＥ．ｃｏｌｉであり、上記カビ細胞がＡｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ細胞であり、上記昆虫細胞がＳｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａ細胞であり、好ましくはＳｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞である、１１に記載の宿
主が提供される。
記細菌がＥ．ｃｏｌｉであり、上記カビ細胞がＡｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ細胞であり、上記昆虫細胞がＳｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａ細胞であり、好ましくはＳｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞である、１１に記載の宿
主が提供される。
【００２１】１３．本発明の好ましい実施形態では、１
〜５のいずれかに記載の核酸分子または７〜９のいずれ
か１つに記載のベクターによってコードされ、および／
または１０〜１２のいずれかに記載の宿主によって産生
される、ポリペプチドが提供される。
〜５のいずれかに記載の核酸分子または７〜９のいずれ
か１つに記載のベクターによってコードされ、および／
または１０〜１２のいずれかに記載の宿主によって産生
される、ポリペプチドが提供される。
【００２２】１４．本発明の好ましい実施形態では、少
なくとも１つの化学的または酵素的な修飾を示す、１３
に記載のポリペプチドが提供される。
なくとも１つの化学的または酵素的な修飾を示す、１３
に記載のポリペプチドが提供される。
【００２３】１５．本発明の好ましい実施形態では、上
記ポリペプチドが、融合タンパク質である、１３または
１４に記載のポリペプチドが提供される。
記ポリペプチドが、融合タンパク質である、１３または
１４に記載のポリペプチドが提供される。
【００２４】１６．本発明の好ましい実施形態では、ヤ
ドリギレクチンの生物学的機能を有するポリペプチドダ
イマーであって、第１のモノマーが２、４、または５に
記載の核酸分子によってコードされ、そして第２のモノ
マーが３〜５のいずれかに記載の核酸分子によってコー
ドされる、ポリペプチドダイマーが提供される。
ドリギレクチンの生物学的機能を有するポリペプチドダ
イマーであって、第１のモノマーが２、４、または５に
記載の核酸分子によってコードされ、そして第２のモノ
マーが３〜５のいずれかに記載の核酸分子によってコー
ドされる、ポリペプチドダイマーが提供される。
【００２５】１７．本発明の好ましい実施形態では、上
記モノマーの少なくとも１つが、１４または１５に記載
のポリペプチドである、１６に記載のポリペプチドダイ
マーが提供される。
記モノマーの少なくとも１つが、１４または１５に記載
のポリペプチドである、１６に記載のポリペプチドダイ
マーが提供される。
【００２６】１８．本発明の好ましい実施形態では、１
３〜１５のいずれかに記載のポリペプチドおよび／また
は１６または１７に記載のポリペプチドダイマーに特異
的に結合する抗体またはそのフラグメントもしくは誘導
体が提供される。
３〜１５のいずれかに記載のポリペプチドおよび／また
は１６または１７に記載のポリペプチドダイマーに特異
的に結合する抗体またはそのフラグメントもしくは誘導
体が提供される。
【００２７】１９．本発明の好ましい実施形態では、１
０〜１２のいずれかに記載の宿主を適当な条件下で培養
し、そのようにして得られるポリペプチドまたはポリペ
プチドダイマーが単離される、１３〜１５のいずれかに
記載のポリペプチドまたは１６もしくは１７に記載のポ
リペプチドダイマーを生成するための方法が提供され
る。
０〜１２のいずれかに記載の宿主を適当な条件下で培養
し、そのようにして得られるポリペプチドまたはポリペ
プチドダイマーが単離される、１３〜１５のいずれかに
記載のポリペプチドまたは１６もしくは１７に記載のポ
リペプチドダイマーを生成するための方法が提供され
る。
【００２８】２０．本発明の好ましい実施形態では、１
３〜１５のいずれかに記載のポリペプチドまたは１６も
しくは１７に記載のポリペプチドダイマーを少なくとも
１つ含む、イムノトキシンが提供される。
３〜１５のいずれかに記載のポリペプチドまたは１６も
しくは１７に記載のポリペプチドダイマーを少なくとも
１つ含む、イムノトキシンが提供される。
【００２９】２１．本発明の好ましい実施形態では、１
３〜１５のいずれかに記載のポリペプチドおよび／また
は１６もしくは１７に記載のポリペプチドダイマーおよ
び／または２０に記載のイムノトキシンを、必要に応じ
て、薬学的に受容可能な担体との混合物中に含む、医薬
組成物が提供される。
３〜１５のいずれかに記載のポリペプチドおよび／また
は１６もしくは１７に記載のポリペプチドダイマーおよ
び／または２０に記載のイムノトキシンを、必要に応じ
て、薬学的に受容可能な担体との混合物中に含む、医薬
組成物が提供される。
【００３０】２２．本発明の好ましい実施形態では、１
〜５のいずれか１つに記載の核酸分子またはその相補的
鎖に特異的にハイブリダイズするプライマーまたはプラ
イマー対が提供される。
〜５のいずれか１つに記載の核酸分子またはその相補的
鎖に特異的にハイブリダイズするプライマーまたはプラ
イマー対が提供される。
【００３１】２３．本発明の好ましい実施形態では、診
断組成物であって、少なくとも （ａ） １〜５のいずれかに記載の核酸分子； （ｂ） ２２に記載のプライマーおよび／またはプライ
マー対；および／または （ｃ） １３〜１５のいずれかに記載のポリペプチドお
よび／または１６または１７に記載のポリペプチドダイ
マーを含有する、診断組成物が提供される。
断組成物であって、少なくとも （ａ） １〜５のいずれかに記載の核酸分子； （ｂ） ２２に記載のプライマーおよび／またはプライ
マー対；および／または （ｃ） １３〜１５のいずれかに記載のポリペプチドお
よび／または１６または１７に記載のポリペプチドダイ
マーを含有する、診断組成物が提供される。
【００３２】２４．本発明の好ましい実施形態では、１
３〜１５のいずれかに記載のポリペプチドおよび／また
は１６または１７に記載のポリペプチドダイマーを含有
する、植物保護因子が提供される。
３〜１５のいずれかに記載のポリペプチドおよび／また
は１６または１７に記載のポリペプチドダイマーを含有
する、植物保護因子が提供される。
【００３３】
【発明の実施の形態】ヤドリギレクチンの遺伝子配列を
初めて提供することによって、インビトロにて再会合し
得、そしてそれゆえタンパク質化学、酵素活性、および
構造に関して均質なｒＭＬホロタンパク質を生成する個
々の高純度組換え鎖（ｒＭＬＡ、ｒＭＬＢ）が、該配列
から開始することにより得られ得る。再会合した組換え
タンパク質は、特にその一次構造および翻訳後修飾（グ
リコシル化、リン酸化）においては変異しないだけでな
く微小不均一でもないため、ホロタンパク質としても、
部分鎖としてもサブフラグメントの形状でも治療上特に
有用である。
初めて提供することによって、インビトロにて再会合し
得、そしてそれゆえタンパク質化学、酵素活性、および
構造に関して均質なｒＭＬホロタンパク質を生成する個
々の高純度組換え鎖（ｒＭＬＡ、ｒＭＬＢ）が、該配列
から開始することにより得られ得る。再会合した組換え
タンパク質は、特にその一次構造および翻訳後修飾（グ
リコシル化、リン酸化）においては変異しないだけでな
く微小不均一でもないため、ホロタンパク質としても、
部分鎖としてもサブフラグメントの形状でも治療上特に
有用である。
【００３４】本発明によれば、ヤドリギレクチンプレプ
ロタンパク質の「フラグメント」は、天然に存在するフ
ラグメントのみならず、ヤドリギレクチンダイマーの生
物学的に活性な成分であるいかなるフラグメントでもあ
ることが理解される。当業者らは、ヤドリギレクチンダ
イマーのこのような生物学的に活性な成分はまた、明瞭
であるという理由で、言うまでもなくダイマーの単鎖の
成分でもあると理解することが示される。したがって、
図４ｃに示される配列の一部を形成する単鎖またはその
フラグメントも本発明に包含される。
ロタンパク質の「フラグメント」は、天然に存在するフ
ラグメントのみならず、ヤドリギレクチンダイマーの生
物学的に活性な成分であるいかなるフラグメントでもあ
ることが理解される。当業者らは、ヤドリギレクチンダ
イマーのこのような生物学的に活性な成分はまた、明瞭
であるという理由で、言うまでもなくダイマーの単鎖の
成分でもあると理解することが示される。したがって、
図４ｃに示される配列の一部を形成する単鎖またはその
フラグメントも本発明に包含される。
【００３５】本発明において、「ヤドリギレクチンの成
分」に関して用いられる「天然に」という用語は、この
ように特徴付けされたフラグメントが、ヤドリギレクチ
ンダイマー鎖または該鎖において天然に存在する鎖のサ
ブフラグメントのいずれかであることを指すものと理解
される。これらのフラグメントは、好ましくは生物学的
に活性である。
分」に関して用いられる「天然に」という用語は、この
ように特徴付けされたフラグメントが、ヤドリギレクチ
ンダイマー鎖または該鎖において天然に存在する鎖のサ
ブフラグメントのいずれかであることを指すものと理解
される。これらのフラグメントは、好ましくは生物学的
に活性である。
【００３６】本発明において、「生物学的に活性」とい
う用語は、これらのフラグメントが、本願において記載
されるような鎖またはダイマーの生物学的機能、あるい
は単鎖またはダイマーの任意のその他の生物学的機能を
少なくとも１つ有することを指すものと理解される。さ
らに、「生物学的に活性」という用語は、薬理学的な活
性および／または免疫学的活性にも関連していることを
意味する。
う用語は、これらのフラグメントが、本願において記載
されるような鎖またはダイマーの生物学的機能、あるい
は単鎖またはダイマーの任意のその他の生物学的機能を
少なくとも１つ有することを指すものと理解される。さ
らに、「生物学的に活性」という用語は、薬理学的な活
性および／または免疫学的活性にも関連していることを
意味する。
【００３７】さらに組換えＭＬタンパク質を初めて使用
することで、実験によって個々のドメインおよびサブド
メインの貢献度を調査し得る。組換えＭＬタンパク質お
よび組換えサブユニット／部分鎖は、抽出調製物および
標準抽出物の代わりに使用し得るように対応して規定さ
れた単一物質調製物の主成分である。
することで、実験によって個々のドメインおよびサブド
メインの貢献度を調査し得る。組換えＭＬタンパク質お
よび組換えサブユニット／部分鎖は、抽出調製物および
標準抽出物の代わりに使用し得るように対応して規定さ
れた単一物質調製物の主成分である。
【００３８】従来のクローニング方法が失敗した後に、
驚くべきことに新たなクローニング方法に基づいてヤド
リギレクチンをコードする遺伝子のクローニングがもた
らされ得た。
驚くべきことに新たなクローニング方法に基づいてヤド
リギレクチンをコードする遺伝子のクローニングがもた
らされ得た。
【００３９】ヤドリギレクチンＭＬ−１については多数
のタンパク質化学データが知られている。その分子量お
よびサブユニット構造、特に短いＮ−末端ペプチドが知
られている。これらのアミノ酸配列は、Ｄｉｅｔｒｉｃ
ｈ ら （１９９２）およびＧａｂｉｕｓ ら （１９
９２） （ＤＥ４２２１８３６号も参照のこと）によっ
て個々に記載されている。アミノ酸組成およびこれらの
ペプチドから開始するＡおよび／またはＢ鎖のＮ−末端
ペプチドの高縮重度のために、ゲノム遺伝子ライブラリ
ーをスクリーニングする場合にＭＬ遺伝子フラグメント
を同定し得るほど十分に縮重度が低い合成オリゴヌクレ
オチドを調製することは事実上不可能である。Ｖｉｓｃ
ｕｍ ａｌｂｕｍポリ−（Ａ＋）ＲＮＡに基づいて調製
されたｃＤＮＡ遺伝子ライブラリーについても同様のこ
とが言える。
のタンパク質化学データが知られている。その分子量お
よびサブユニット構造、特に短いＮ−末端ペプチドが知
られている。これらのアミノ酸配列は、Ｄｉｅｔｒｉｃ
ｈ ら （１９９２）およびＧａｂｉｕｓ ら （１９
９２） （ＤＥ４２２１８３６号も参照のこと）によっ
て個々に記載されている。アミノ酸組成およびこれらの
ペプチドから開始するＡおよび／またはＢ鎖のＮ−末端
ペプチドの高縮重度のために、ゲノム遺伝子ライブラリ
ーをスクリーニングする場合にＭＬ遺伝子フラグメント
を同定し得るほど十分に縮重度が低い合成オリゴヌクレ
オチドを調製することは事実上不可能である。Ｖｉｓｃ
ｕｍ ａｌｂｕｍポリ−（Ａ＋）ＲＮＡに基づいて調製
されたｃＤＮＡ遺伝子ライブラリーについても同様のこ
とが言える。
【００４０】ポリメラーゼ連鎖反応によって、既知のス
トレッチの間に位置しているＤＮＡストレッチを増幅す
ることができる（Ｅｒｌｉｃｈ ら、１９８８）。ＭＬ
ＡのＮ−末端から開始する「センス」オリゴヌクレオチ
ドおよびＭＬＢのＮ−末端から開始する「アンチセン
ス」オリゴヌクレオチドを使用すると、ＭＬ遺伝子にイ
ントロンが含まれていなければ、介在遺伝領域が増幅さ
れると考えられる（図１ａ）。しかしながら、実際には
Ｂ鎖のＮ−末端配列を分析してみると、オリゴヌクレオ
チドの考えられる組み合わせの縮重度はこの方法を実現
させるには高すぎるということが分かる。その原因は特
に、オリゴヌクレオチド構成にとっては好ましくなく、
そして公知のアミノ酸配列領域から開始されるＭＬ遺伝
子配列の増幅を実行不可能にするＢ鎖のＮ−末端の配列
にあり得る（図１ｂ）。
トレッチの間に位置しているＤＮＡストレッチを増幅す
ることができる（Ｅｒｌｉｃｈ ら、１９８８）。ＭＬ
ＡのＮ−末端から開始する「センス」オリゴヌクレオチ
ドおよびＭＬＢのＮ−末端から開始する「アンチセン
ス」オリゴヌクレオチドを使用すると、ＭＬ遺伝子にイ
ントロンが含まれていなければ、介在遺伝領域が増幅さ
れると考えられる（図１ａ）。しかしながら、実際には
Ｂ鎖のＮ−末端配列を分析してみると、オリゴヌクレオ
チドの考えられる組み合わせの縮重度はこの方法を実現
させるには高すぎるということが分かる。その原因は特
に、オリゴヌクレオチド構成にとっては好ましくなく、
そして公知のアミノ酸配列領域から開始されるＭＬ遺伝
子配列の増幅を実行不可能にするＢ鎖のＮ−末端の配列
にあり得る（図１ｂ）。
【００４１】改変されたＰＣＲストラテジーを使用して
ＭＬ遺伝子をクローニングしようとする場合、科学者ら
は、特にヤドリギレクチンとＩ型およびＩＩ型のリボソ
ーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）との類似点に基づく
タンパク質データをさらに追加し、増幅オリゴヌクレオ
チドを構成するよう試みた（Ｓｔｉｒｐｅ ら、１９９
２）。（ａ）Ｉ型ＲＩＰタンパク質およびリシンのＡ鎖
ならびに（ｂ）アブリンおよびリシンのＢ鎖の複数アラ
インメントに基づいて保存領域を全部で８つの配列スト
レッチにおいて同定した。これらの配列領域から開始し
て、関連種のコドン選択表についても考慮し、全部で２
１個のオリゴヌクレオチドを構築して２００回を超える
増幅試験において様々な組み合わせで使用した。しかし
ながら、アニーリング温度、Ｍｇ2+含有量ならびにサイ
クルパラメータに関してＰＣＲ条件を広範に変化させた
にもかかわらず、いずれの場合においても特異的な増幅
産物を得ることはできなかった。
ＭＬ遺伝子をクローニングしようとする場合、科学者ら
は、特にヤドリギレクチンとＩ型およびＩＩ型のリボソ
ーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）との類似点に基づく
タンパク質データをさらに追加し、増幅オリゴヌクレオ
チドを構成するよう試みた（Ｓｔｉｒｐｅ ら、１９９
２）。（ａ）Ｉ型ＲＩＰタンパク質およびリシンのＡ鎖
ならびに（ｂ）アブリンおよびリシンのＢ鎖の複数アラ
インメントに基づいて保存領域を全部で８つの配列スト
レッチにおいて同定した。これらの配列領域から開始し
て、関連種のコドン選択表についても考慮し、全部で２
１個のオリゴヌクレオチドを構築して２００回を超える
増幅試験において様々な組み合わせで使用した。しかし
ながら、アニーリング温度、Ｍｇ2+含有量ならびにサイ
クルパラメータに関してＰＣＲ条件を広範に変化させた
にもかかわらず、いずれの場合においても特異的な増幅
産物を得ることはできなかった。
【００４２】上述したように熟考したところ、ゲノムラ
イブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グしてもＰＣＲ技術を使用しても、特異的なＭＬのＤＮ
Ａ配列に達することはできなかった。
イブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グしてもＰＣＲ技術を使用しても、特異的なＭＬのＤＮ
Ａ配列に達することはできなかった。
【００４３】したがって、増幅オリゴヌクレオチドの構
築においてリシンおよびアブリンの構造の構造的特性を
さらに含むための新たな方法を見いだすための試みが行
われている。
築においてリシンおよびアブリンの構造の構造的特性を
さらに含むための新たな方法を見いだすための試みが行
われている。
【００４４】リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）
（ここでは特にＩＩ型のＲＩＰリシン）の酵素メカニズ
ムはＭＬの酵素メカニズムと類似している（Ｅｎｄｏ
ら、１９８８ａ ＋ １９８８ｂ）ため、これらのタン
パク質もまた機能的一次構造および三次構造のレベルで
構造的に類似しているということを除外することはでき
なかった。リシンの結晶構造（Ｋａｔｚｉｎ ら、１９
９１； Ｒｕｔｅｎｂｅｒ および Ｒｏｂｅｒｔｕ
ｓ， １９９１； Ｗｅｓｔｏｎ ら、１９９４）から
開始して、リシンＡ鎖の鎖の可変性を分析したところ、
保存配列領域内に位置しているＡｒｇ１８０の移動度の
低さが指摘された。さらに、基質の相互作用を十分に検
討しながら、鎖の「バックボーン」の立体配置が原因で
起こり得る活性中心のこの領域での可能性のあるアミノ
酸置換についても分析した。このように熟考の結果は、
リシンＡ鎖およびさらにＩ型ＲＩＰの広範囲の配列アラ
インメントについての評価と相関していた。
（ここでは特にＩＩ型のＲＩＰリシン）の酵素メカニズ
ムはＭＬの酵素メカニズムと類似している（Ｅｎｄｏ
ら、１９８８ａ ＋ １９８８ｂ）ため、これらのタン
パク質もまた機能的一次構造および三次構造のレベルで
構造的に類似しているということを除外することはでき
なかった。リシンの結晶構造（Ｋａｔｚｉｎ ら、１９
９１； Ｒｕｔｅｎｂｅｒ および Ｒｏｂｅｒｔｕ
ｓ， １９９１； Ｗｅｓｔｏｎ ら、１９９４）から
開始して、リシンＡ鎖の鎖の可変性を分析したところ、
保存配列領域内に位置しているＡｒｇ１８０の移動度の
低さが指摘された。さらに、基質の相互作用を十分に検
討しながら、鎖の「バックボーン」の立体配置が原因で
起こり得る活性中心のこの領域での可能性のあるアミノ
酸置換についても分析した。このように熟考の結果は、
リシンＡ鎖およびさらにＩ型ＲＩＰの広範囲の配列アラ
インメントについての評価と相関していた。
【００４５】このように、構造データを含むことによる
配列比較の結果を補足したところ、特定の位置における
特定のアミノ酸残基の発生率についての確率データが得
られた。これらのデータを使用して、この領域には多数
の理論ＭＬアミノ酸配列が存在するのではないかと仮定
し、後者に基づいて、驚くほど縮重度の低い（図１ｃ）
対応のオリゴヌクレオチド（ＲＭＬＡ２）を構築するこ
とができた。
配列比較の結果を補足したところ、特定の位置における
特定のアミノ酸残基の発生率についての確率データが得
られた。これらのデータを使用して、この領域には多数
の理論ＭＬアミノ酸配列が存在するのではないかと仮定
し、後者に基づいて、驚くほど縮重度の低い（図１ｃ）
対応のオリゴヌクレオチド（ＲＭＬＡ２）を構築するこ
とができた。
【００４６】ＲＭＬＡ１（ＭＬＡ鎖のＮ−末端アミノ酸
配列由来の縮重オリゴヌクレオチド；例えば図１ｂ）
と、上述した熟考内容に基づいて構築された「活性部
位」オリゴヌクレオチドＲＭＬＡ２とを組み合わせるこ
とにより、上述した他のアプローチが全て失敗に終わっ
た後に、複合ゲノムＭＬ−ＤＮＡから開始される所定の
ＰＣＲパラメータでフラグメントを得ることができた。
配列由来の縮重オリゴヌクレオチド；例えば図１ｂ）
と、上述した熟考内容に基づいて構築された「活性部
位」オリゴヌクレオチドＲＭＬＡ２とを組み合わせるこ
とにより、上述した他のアプローチが全て失敗に終わっ
た後に、複合ゲノムＭＬ−ＤＮＡから開始される所定の
ＰＣＲパラメータでフラグメントを得ることができた。
【００４７】次に、フラグメントａ（図３）をクローニ
ングして配列決定することによって得られるＭＬＡの部
分遺伝子配列由来の特異的な非縮重オリゴヌクレオチド
プライマーと、ＲＩＰ Ｉおよびリシン／アブリン配列
アラインメント由来の縮重オリゴヌクレオチドとによっ
て、さらにＰＣＲ増幅を行って遺伝子の配列情報を完成
させた。縮重Ｂ鎖オリゴヌクレオチドを構築するため
に、高度に保存された領域が認められるリシンおよびア
ブリンのＢ鎖の配列アラインメントを使用した。
ングして配列決定することによって得られるＭＬＡの部
分遺伝子配列由来の特異的な非縮重オリゴヌクレオチド
プライマーと、ＲＩＰ Ｉおよびリシン／アブリン配列
アラインメント由来の縮重オリゴヌクレオチドとによっ
て、さらにＰＣＲ増幅を行って遺伝子の配列情報を完成
させた。縮重Ｂ鎖オリゴヌクレオチドを構築するため
に、高度に保存された領域が認められるリシンおよびア
ブリンのＢ鎖の配列アラインメントを使用した。
【００４８】ホロタンパク質の５’末端および３’末端
と、Ｂ鎖の部分フラグメントと、５’非翻訳領域および
３’非翻訳領域とを決定するために、単離したヤドリギ
ＲＮＡから開始される逆転写によってアナログｃＤＮＡ
を合成し、ＲＡＣＥ技術（Ｆｒｏｈｍａｎ ら、１９８
８）を使用してそれぞれの遺伝子セクションを得た。多
数のオーバーラップ遺伝子フラグメントを利用できるよ
うになると（図３）、それぞれ複合ゲノムヤドリギＤＮ
Ａから開始される完全なＡ鎖およびＢ鎖遺伝子セクショ
ンを、特異的ＰＣＲによって得た。ｒＭＬＡおよびｒＭ
ＬＢの遺伝子配列はいずれも末端修飾されていた。これ
を図４ａおよび図４ｂに示す。５’非翻訳領域および
３’非翻訳領域ならびにエンドペプチドおよびシグナル
ペプチドをコードする遺伝子セクションを有する完全な
ＭＬ遺伝子配列を図４ｃに示す。
と、Ｂ鎖の部分フラグメントと、５’非翻訳領域および
３’非翻訳領域とを決定するために、単離したヤドリギ
ＲＮＡから開始される逆転写によってアナログｃＤＮＡ
を合成し、ＲＡＣＥ技術（Ｆｒｏｈｍａｎ ら、１９８
８）を使用してそれぞれの遺伝子セクションを得た。多
数のオーバーラップ遺伝子フラグメントを利用できるよ
うになると（図３）、それぞれ複合ゲノムヤドリギＤＮ
Ａから開始される完全なＡ鎖およびＢ鎖遺伝子セクショ
ンを、特異的ＰＣＲによって得た。ｒＭＬＡおよびｒＭ
ＬＢの遺伝子配列はいずれも末端修飾されていた。これ
を図４ａおよび図４ｂに示す。５’非翻訳領域および
３’非翻訳領域ならびにエンドペプチドおよびシグナル
ペプチドをコードする遺伝子セクションを有する完全な
ＭＬ遺伝子配列を図４ｃに示す。
【００４９】本発明の核酸分子の好ましい実施態様にお
いて、フラグメントは、図４ａに示されるヌクレオチド
配列によってコードされるヤドリギレクチンのＡ鎖（Ｍ
ＬＡ）である。
いて、フラグメントは、図４ａに示されるヌクレオチド
配列によってコードされるヤドリギレクチンのＡ鎖（Ｍ
ＬＡ）である。
【００５０】本発明の核酸分子のさらに好ましい実施態
様において、フラグメントは、図４ｂに示されるヌクレ
オチド配列によってコードされるヤドリギレクチンのＢ
鎖（ＭＬＢ）である。
様において、フラグメントは、図４ｂに示されるヌクレ
オチド配列によってコードされるヤドリギレクチンのＢ
鎖（ＭＬＢ）である。
【００５１】本発明のさらに好ましい実施態様は、ＤＮ
Ａ分子である核酸分子に関する。
Ａ分子である核酸分子に関する。
【００５２】本発明において、「ＤＮＡ分子」という用
語は、ゲノム分子およびｃＤＮＡ分子の両方または
（半）合成ＤＮＡ分子と関係しているものと解される。
本発明の教示内容のついての知識において、これらの様
々なＤＮＡ分子を調製するためのプロセスは当業者に周
知である。
語は、ゲノム分子およびｃＤＮＡ分子の両方または
（半）合成ＤＮＡ分子と関係しているものと解される。
本発明の教示内容のついての知識において、これらの様
々なＤＮＡ分子を調製するためのプロセスは当業者に周
知である。
【００５３】本発明のさらに好ましい実施態様におい
て、核酸分子はＲＮＡ分子である。
て、核酸分子はＲＮＡ分子である。
【００５４】本発明はさらに、本発明の上述した核酸分
子のいずれかに対するアンチセンス鎖である核酸分子に
関する。このようなアンチセンス鎖は、転写阻害に実験
的に使用され得、したがって植物における発現および調
節の研究に実験的に使用され得る。
子のいずれかに対するアンチセンス鎖である核酸分子に
関する。このようなアンチセンス鎖は、転写阻害に実験
的に使用され得、したがって植物における発現および調
節の研究に実験的に使用され得る。
【００５５】本発明はまた、本発明による少なくとも１
つの核酸分子を含有するベクターに関する。
つの核酸分子を含有するベクターに関する。
【００５６】本発明のベクターは、例えば、ヤドリギレ
クチンプレプロタンパク質全体をコードする本発明の１
つの核酸分子を含有し得る。上記ベクターが発現ベクタ
ーであると仮定すると、プレプロタンパク質は適切な形
質転換宿主においてプロセスされ得、そしてインビボま
たはインビトロにてモノマー単位を結合し、ヤドリギレ
クチンダイマーを得ることができる。他の実施態様にお
いて、本発明のベクターは、本発明の核酸の増殖にのみ
使用されるベクターである。
クチンプレプロタンパク質全体をコードする本発明の１
つの核酸分子を含有し得る。上記ベクターが発現ベクタ
ーであると仮定すると、プレプロタンパク質は適切な形
質転換宿主においてプロセスされ得、そしてインビボま
たはインビトロにてモノマー単位を結合し、ヤドリギレ
クチンダイマーを得ることができる。他の実施態様にお
いて、本発明のベクターは、本発明の核酸の増殖にのみ
使用されるベクターである。
【００５７】好ましい実施態様において、本発明のベク
ターは、ヤドリギレクチンのＡ鎖またはそのフラグメン
トをコードする核酸分子およびＢ鎖またはそのフラグメ
ントをコードする核酸分子の両方を含有する。好ましく
は、これらのモノマーのフラグメントは生物学的に活性
である。
ターは、ヤドリギレクチンのＡ鎖またはそのフラグメン
トをコードする核酸分子およびＢ鎖またはそのフラグメ
ントをコードする核酸分子の両方を含有する。好ましく
は、これらのモノマーのフラグメントは生物学的に活性
である。
【００５８】さらに好ましい実施態様において、本発明
のベクターは発現ベクターである。様々な宿主生物に適
した発現ベクターをどのようにして得るかについては、
当業者には明らかである。
のベクターは発現ベクターである。様々な宿主生物に適
した発現ベクターをどのようにして得るかについては、
当業者には明らかである。
【００５９】本発明によれば、ヤドリギレクチンＡ鎖を
コードする配列を、複合ゲノムヤドリギＤＮＡから開始
される特異的ＰＣＲによって、異種発現用に生成した。
使用するプライマーオリゴヌクレオチドの非相補的領域
を介して翻訳制御エレメントならびに制限エンドヌクレ
アーゼの認識配列を加え、それによって、ゲノム形態で
存在するプレプロヤドリギレクチン遺伝子に基づいてヤ
ドリギレクチンＡ鎖をクローニングして別々に発現させ
ることができた。
コードする配列を、複合ゲノムヤドリギＤＮＡから開始
される特異的ＰＣＲによって、異種発現用に生成した。
使用するプライマーオリゴヌクレオチドの非相補的領域
を介して翻訳制御エレメントならびに制限エンドヌクレ
アーゼの認識配列を加え、それによって、ゲノム形態で
存在するプレプロヤドリギレクチン遺伝子に基づいてヤ
ドリギレクチンＡ鎖をクローニングして別々に発現させ
ることができた。
【００６０】２つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイ
ゼーションおよびクローニングすることにより、および
翻訳開始コドンを加えることにより、アミノ酸配列残基
チロシン1−チロシン17に対応するｒＭＬＡをコードす
る配列の５’領域（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ら、１９９２；
Ｇａｂｉｕｓ ら、１９９２）を合成遺伝子フラグメ
ントとして調製した。このように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉにおいて強く発現する遺伝子について説
明されている（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ら、１９８４）よう
にコドンの選択に関して遺伝子配列を最適化した。合成
ｒＭＬＡ遺伝子フラグメントの３’末端ならびにＰＣＲ
によって得られるｒＭＬＡ遺伝子フラグメントの５’末
端において、ＴＡＣからＴＡＴへのチロシン17コドンの
特異的な交換によってＳｓｐ Ｉ制限部位を導入した。
この制限部位によって、ベクターｐＭＬ１４−１７（図
５）を得ながら２つのｒＭＬＡ遺伝子フラグメントを融
合させることができた。ＤＮＡ配列決定（図４ａ）によ
ってｒＭＬＡをコードする配列を確認した。Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいてｒＭＬＡを発現させる
ために、ベクターｐＭＬ１４−１７から遺伝子配列を単
離し、これを発現ベクターｐＴ７−７に挿入することに
よってＴ７−ＲＮＡポリメラーゼプロモーターーおよび
転写ターミネーターーの制御下においた（Ｓｔｕｄｉｅ
ｒ およびＭｏｆｆａｒｔ， １９８６）。得られた発
現ベクターｐＴ７−ＭＬＡ（図５）を使用して、Ｅ．
ｃｏｌｉ発現菌株ＢＬ２１を形質転換した。遺伝子発現
の誘導は、相対分子量が２５ｋＤａを有する非グリコシ
ル化組換えヤドリギレクチンＡ鎖に対応するタンパク質
バンドの発生によって特徴付けられる。この組換え発現
産物についてのアッセイおよび同定を、特異的抗ＭＬＡ
抗体を使用してウェスタンブロット分析によって実施し
た（図７）。
ゼーションおよびクローニングすることにより、および
翻訳開始コドンを加えることにより、アミノ酸配列残基
チロシン1−チロシン17に対応するｒＭＬＡをコードす
る配列の５’領域（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ら、１９９２；
Ｇａｂｉｕｓ ら、１９９２）を合成遺伝子フラグメ
ントとして調製した。このように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉにおいて強く発現する遺伝子について説
明されている（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ら、１９８４）よう
にコドンの選択に関して遺伝子配列を最適化した。合成
ｒＭＬＡ遺伝子フラグメントの３’末端ならびにＰＣＲ
によって得られるｒＭＬＡ遺伝子フラグメントの５’末
端において、ＴＡＣからＴＡＴへのチロシン17コドンの
特異的な交換によってＳｓｐ Ｉ制限部位を導入した。
この制限部位によって、ベクターｐＭＬ１４−１７（図
５）を得ながら２つのｒＭＬＡ遺伝子フラグメントを融
合させることができた。ＤＮＡ配列決定（図４ａ）によ
ってｒＭＬＡをコードする配列を確認した。Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいてｒＭＬＡを発現させる
ために、ベクターｐＭＬ１４−１７から遺伝子配列を単
離し、これを発現ベクターｐＴ７−７に挿入することに
よってＴ７−ＲＮＡポリメラーゼプロモーターーおよび
転写ターミネーターーの制御下においた（Ｓｔｕｄｉｅ
ｒ およびＭｏｆｆａｒｔ， １９８６）。得られた発
現ベクターｐＴ７−ＭＬＡ（図５）を使用して、Ｅ．
ｃｏｌｉ発現菌株ＢＬ２１を形質転換した。遺伝子発現
の誘導は、相対分子量が２５ｋＤａを有する非グリコシ
ル化組換えヤドリギレクチンＡ鎖に対応するタンパク質
バンドの発生によって特徴付けられる。この組換え発現
産物についてのアッセイおよび同定を、特異的抗ＭＬＡ
抗体を使用してウェスタンブロット分析によって実施し
た（図７）。
【００６１】ヤドリギＢ鎖の異種発現用に、複合ゲノム
Ｖｉｓｃｕｍ ａｌｂｕｍ ＤＮＡから特異的ＰＣＲに
よって完全なＭＬＢコード配列を増幅した。使用するプ
ライマーオリゴヌクレオチドの非相補的領域を介して、
制限エンドヌクレアーゼの翻訳制御エレメントおよび認
識配列を導入した（図６）。得られた０．８ｋｂｐのＰ
ＣＲ産物を、発現ベクターｐＴ７−７に挿入することに
よってＴＡクローニングベクターｐＣＲＩＩでクローニ
ングした後、翻訳制御エレメントの制御下におき、そし
て得られた発現ベクターｐＴ７−ＭＬＢで発現菌株Ｅ．
ｃｏｌｉ ＢＬ２１を形質転換した。
Ｖｉｓｃｕｍ ａｌｂｕｍ ＤＮＡから特異的ＰＣＲに
よって完全なＭＬＢコード配列を増幅した。使用するプ
ライマーオリゴヌクレオチドの非相補的領域を介して、
制限エンドヌクレアーゼの翻訳制御エレメントおよび認
識配列を導入した（図６）。得られた０．８ｋｂｐのＰ
ＣＲ産物を、発現ベクターｐＴ７−７に挿入することに
よってＴＡクローニングベクターｐＣＲＩＩでクローニ
ングした後、翻訳制御エレメントの制御下におき、そし
て得られた発現ベクターｐＴ７−ＭＬＢで発現菌株Ｅ．
ｃｏｌｉ ＢＬ２１を形質転換した。
【００６２】ＤＮＡ配列決定（図４ｂ）によってｒＭＬ
Ｂコード配列の完全性を確認した。特異的抗ＭＬＢ抗体
（ＴＢ３３、Ｔｏｎｅｖｉｔｓｋｙ ら、１９９５）を
使用して、ウェスタンブロットアッセイにて発現を検出
した。ここで、遺伝子発現を誘導した２時間後に非グリ
コシル化組換えヤドリギレクチンＢ鎖に対応する相対分
子量３１ｋＤＡの免疫反応性タンパク質が生じた（図７
ｂ）。Ｅ． ｃｏｌｉ細胞を完全に細胞破砕した後の細
胞画分の分析では、合成ｒＭＬＢ鎖が上清における可溶
性画分とＥ． ｃｏｌｉ細胞破砕時の沈降物における不
溶性封入体画分とに分かれることを示した。誘導の４時
間後に、可溶性および不溶性画分はそれぞれ全収量の５
０％を占めていた（図７ｂ）。
Ｂコード配列の完全性を確認した。特異的抗ＭＬＢ抗体
（ＴＢ３３、Ｔｏｎｅｖｉｔｓｋｙ ら、１９９５）を
使用して、ウェスタンブロットアッセイにて発現を検出
した。ここで、遺伝子発現を誘導した２時間後に非グリ
コシル化組換えヤドリギレクチンＢ鎖に対応する相対分
子量３１ｋＤＡの免疫反応性タンパク質が生じた（図７
ｂ）。Ｅ． ｃｏｌｉ細胞を完全に細胞破砕した後の細
胞画分の分析では、合成ｒＭＬＢ鎖が上清における可溶
性画分とＥ． ｃｏｌｉ細胞破砕時の沈降物における不
溶性封入体画分とに分かれることを示した。誘導の４時
間後に、可溶性および不溶性画分はそれぞれ全収量の５
０％を占めていた（図７ｂ）。
【００６３】本発明はさらに、本発明の少なくとも１つ
のベクターで形質転換された宿主に関する。
のベクターで形質転換された宿主に関する。
【００６４】当業者が追求する目的に応じて、本発明の
宿主は、一つのモノマーのみまたは両方のモノマーの組
み合わせのいずれかを、好ましくは会合ダイマーとして
調製するためにのみ使用することができる。本発明の宿
主は、真核生物細胞または原核生物細胞、トランスジェ
ニック植物またはトランスジェニック動物であり得る。
宿主は、一つのモノマーのみまたは両方のモノマーの組
み合わせのいずれかを、好ましくは会合ダイマーとして
調製するためにのみ使用することができる。本発明の宿
主は、真核生物細胞または原核生物細胞、トランスジェ
ニック植物またはトランスジェニック動物であり得る。
【００６５】好ましくは、本発明の宿主は、哺乳類細
胞、植物細胞、細菌、カビ細胞、酵母細胞、昆虫細胞ま
たはトランスジェニック植物である。
胞、植物細胞、細菌、カビ細胞、酵母細胞、昆虫細胞ま
たはトランスジェニック植物である。
【００６６】特に好ましい実施態様において、本発明の
宿主は、細菌Ｅ． ｃｏｌｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
細胞またはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ細胞であり、好ましく
はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａであ
る。
宿主は、細菌Ｅ． ｃｏｌｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
細胞またはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ細胞であり、好ましく
はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａであ
る。
【００６７】本発明はさらに、本発明の核酸分子または
本発明のベクターによってコードされるポリペプチドお
よび／または本発明の宿主によって産生されるポリペプ
チドに関する。
本発明のベクターによってコードされるポリペプチドお
よび／または本発明の宿主によって産生されるポリペプ
チドに関する。
【００６８】本発明のポリペプチドは、好ましくはヤド
リギレクチンのＡ鎖またはＢ鎖の生物学的活性を有す
る。しかし、他の実施態様においては、本発明のポリペ
プチドは、生物学的活性の一部のみ呈し得るかあるいは
全く生物学的活性を呈することができない。本発明にお
いて、「生物学的活性の一部」は、低減された活性およ
び／または生物学的活性の範囲からの多数の活性のいず
れかに関するものと解される。本発明のポリペプチド
は、上述した特性を呈するＡ鎖またはＢ鎖のフラグメン
トであり得る。
リギレクチンのＡ鎖またはＢ鎖の生物学的活性を有す
る。しかし、他の実施態様においては、本発明のポリペ
プチドは、生物学的活性の一部のみ呈し得るかあるいは
全く生物学的活性を呈することができない。本発明にお
いて、「生物学的活性の一部」は、低減された活性およ
び／または生物学的活性の範囲からの多数の活性のいず
れかに関するものと解される。本発明のポリペプチド
は、上述した特性を呈するＡ鎖またはＢ鎖のフラグメン
トであり得る。
【００６９】（ｒＭＬＡ、ｒＭＬＢおよびｒＭＬホロタ
ンパク質の特性についての試験） （（Ｉ） 相対分子量および構造）還元条件下でのＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動と、これに続く銀ま
たはクーマシーブリリアントブルーでのタンパク質染色
とによって、あるいはウェスタンブロット分析における
免疫染色によって、相対分子量を測定した。
ンパク質の特性についての試験） （（Ｉ） 相対分子量および構造）還元条件下でのＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動と、これに続く銀ま
たはクーマシーブリリアントブルーでのタンパク質染色
とによって、あるいはウェスタンブロット分析における
免疫染色によって、相対分子量を測定した。
【００７０】驚くべきことに、組換え非グリコシル化ヤ
ドリギレクチンＡ鎖は２５ｋＤａの相対分子量を有して
おり、従って天然に存在するヤドリギレクチンＡ鎖のＡ
１の３１ｋＤＡおよびＡ２の２９ｋＤＡとは有意に異な
っているということが分かった。従来技術においてはＡ
鎖はグリコシル化されないと仮定されていたため、相対
分子量にこのような差異が見られたのは極めて驚くべき
ことである。組換えヤドリギＢ鎖は３１ｋＤａの相対分
子量を有しており、従って３６ｋＤａのグリコシル化さ
れた天然に存在するヤドリギレクチンＢ鎖よりも実質的
に軽い（図７）。
ドリギレクチンＡ鎖は２５ｋＤａの相対分子量を有して
おり、従って天然に存在するヤドリギレクチンＡ鎖のＡ
１の３１ｋＤＡおよびＡ２の２９ｋＤＡとは有意に異な
っているということが分かった。従来技術においてはＡ
鎖はグリコシル化されないと仮定されていたため、相対
分子量にこのような差異が見られたのは極めて驚くべき
ことである。組換えヤドリギＢ鎖は３１ｋＤａの相対分
子量を有しており、従って３６ｋＤａのグリコシル化さ
れた天然に存在するヤドリギレクチンＢ鎖よりも実質的
に軽い（図７）。
【００７１】グリコシル化および／または配列変異によ
る天然に存在するＭＬタンパク質の不同質性は、ＳＤＳ
ゲルにおいて広いバンドとして明らかになり、試験を行
ったいかなる例の組換え種においても生じない。
る天然に存在するＭＬタンパク質の不同質性は、ＳＤＳ
ゲルにおいて広いバンドとして明らかになり、試験を行
ったいかなる例の組換え種においても生じない。
【００７２】再会合したｒＭＬＡ／ｒＭＬＢホロタンパ
ク質（ｒＭＬ）の相対分子量は、これよりも重い６５〜
６７ｋＤａのｎＭＬと比較すれば、合計で５６ｋＤａに
なる。
ク質（ｒＭＬ）の相対分子量は、これよりも重い６５〜
６７ｋＤａのｎＭＬと比較すれば、合計で５６ｋＤａに
なる。
【００７３】（（ＩＩ） 等電同質性）ｒＭＬＡは、等
電点５．２；５．４；５．７および６．２を有する４種
に分類される高度に精製された天然に存在するヤドリギ
レクチンＡ鎖と比較すると、等電点６．８を有する等電
的に均一なタンパク質であることが分かる（図８）。
電点５．２；５．４；５．７および６．２を有する４種
に分類される高度に精製された天然に存在するヤドリギ
レクチンＡ鎖と比較すると、等電点６．８を有する等電
的に均一なタンパク質であることが分かる（図８）。
【００７４】ｒＭＬＢは、等電点７．１および７．３を
有する２種に分類される天然に存在するヤドリギレクチ
ンＢ鎖と比較すると、等電点５．１を有する等電的に均
一なタンパク質であることが分かる（図８）。
有する２種に分類される天然に存在するヤドリギレクチ
ンＢ鎖と比較すると、等電点５．１を有する等電的に均
一なタンパク質であることが分かる（図８）。
【００７５】このため、天然に存在するＭＬホロタンパ
ク質については可能性のある分子変異体および組み合わ
せ（図８下）が多数存在するが、組換えヤドリギレクチ
ンタンパク質についてはＩＥＦクロマトフォーカシング
における移動度が均一である。このことは、天然に存在
するタンパク質種の微小不均一に対するｒＭＬの同質性
を示す。
ク質については可能性のある分子変異体および組み合わ
せ（図８下）が多数存在するが、組換えヤドリギレクチ
ンタンパク質についてはＩＥＦクロマトフォーカシング
における移動度が均一である。このことは、天然に存在
するタンパク質種の微小不均一に対するｒＭＬの同質性
を示す。
【００７６】（（ＩＩＩ） ｒＭＬＡの酵素活性）組み
合わせた転写／翻訳アッセイにイムノアフィニティー精
製ｒＭＬＡ調製物を使用すると、ｒＭＬＡ（可溶性発現
産生画分から単離）およびｒＭＬＡ（不溶性「封入体」
画分から単離）についての翻訳阻害活性を検出すること
ができた。
合わせた転写／翻訳アッセイにイムノアフィニティー精
製ｒＭＬＡ調製物を使用すると、ｒＭＬＡ（可溶性発現
産生画分から単離）およびｒＭＬＡ（不溶性「封入体」
画分から単離）についての翻訳阻害活性を検出すること
ができた。
【００７７】ｒＭＬＡは、翻訳阻害の用量依存性および
使用した網状赤血球溶解物における非阻害可能な残基翻
訳活性に関して、天然に存在するヤドリギレクチンＡ鎖
に対して異なる阻害特性を示した（図９を参照のこ
と）。ＭＬホロタンパク質の毒性作用の基礎を形成する
酵素特性は、組換え種において有意に減少する。
使用した網状赤血球溶解物における非阻害可能な残基翻
訳活性に関して、天然に存在するヤドリギレクチンＡ鎖
に対して異なる阻害特性を示した（図９を参照のこ
と）。ＭＬホロタンパク質の毒性作用の基礎を形成する
酵素特性は、組換え種において有意に減少する。
【００７８】（（ＩＶ） ｒＭＬＢの炭水化物結合活
性）一次発現産物からの再生および再酸化によって生成
されたｒＭＬＢ鎖は、インビトロで再会合したｒＭＬＡ
／ｒＭＬＢ、ｒＭＬＡ／ＭＬＢおよびＭＬＡ／ｒＭＬＢ
ホロタンパク質と同様に、炭水化物マトリクスのアシア
ロフェチュインまたはフェチュインに結合することによ
る酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）によって検出
され得る炭水化物結合活性を有する。ＥＬＬＡ系におい
て、ガラクトース、β−ラクトース、Ｎ−アセチルガラ
クトサミン（ＧａｌＮＡｃ）およびシアル酸（ｓｉａｌ
ｉｃ ａｃｉｄ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎ−ａ
ｃｅｔｙｌ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ， ＮＡ
ＮＡ）の競合条件下で、組換えｒＭＬＢ鎖の炭水化物特
異性が測定および定量され得る。驚くべきことに、競合
ＥＬＬＡテストはｎＭＬＢおよびｒＭＬＢに対して異な
る炭水化物特異性を示す。結合親和性は、ガラクトース
（ＩＣ５０ ｎＭＬＢ； ４．５ｍＭ； ＩＣ５０ ｒ
ＭＬＢ：相互作用が低すぎるため測定できない）、β−
ラクトース（ＩＣ５０ ｎＭＬＢ： ４．９ ｍＭ；
ＩＣ５０ ｒＭＬＢ： ＞ ７０ｍＭ）、Ｎ−アセチル
ガラクトサミン（ＩＣ５０ ｎＭＬＢ： ２０．７ｍ
Ｍ； ＩＣ５０ ｒＭＬＢ： １０９ｍＭ）による固定
化アシアロフェチュインリガンド、またはシアル酸（Ｉ
Ｃ５０ ｎＭＬＢ： ４９．８ ｍＭ； ＩＣ５０ ｒ
ＭＬＢ： ４７．１ ｍＭ）による固定化フェチュイン
リガンドのタンパク質の半値幅置換の系特異的ＩＣ５０
値によって特徴付けられる。
性）一次発現産物からの再生および再酸化によって生成
されたｒＭＬＢ鎖は、インビトロで再会合したｒＭＬＡ
／ｒＭＬＢ、ｒＭＬＡ／ＭＬＢおよびＭＬＡ／ｒＭＬＢ
ホロタンパク質と同様に、炭水化物マトリクスのアシア
ロフェチュインまたはフェチュインに結合することによ
る酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）によって検出
され得る炭水化物結合活性を有する。ＥＬＬＡ系におい
て、ガラクトース、β−ラクトース、Ｎ−アセチルガラ
クトサミン（ＧａｌＮＡｃ）およびシアル酸（ｓｉａｌ
ｉｃ ａｃｉｄ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎ−ａ
ｃｅｔｙｌ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ， ＮＡ
ＮＡ）の競合条件下で、組換えｒＭＬＢ鎖の炭水化物特
異性が測定および定量され得る。驚くべきことに、競合
ＥＬＬＡテストはｎＭＬＢおよびｒＭＬＢに対して異な
る炭水化物特異性を示す。結合親和性は、ガラクトース
（ＩＣ５０ ｎＭＬＢ； ４．５ｍＭ； ＩＣ５０ ｒ
ＭＬＢ：相互作用が低すぎるため測定できない）、β−
ラクトース（ＩＣ５０ ｎＭＬＢ： ４．９ ｍＭ；
ＩＣ５０ ｒＭＬＢ： ＞ ７０ｍＭ）、Ｎ−アセチル
ガラクトサミン（ＩＣ５０ ｎＭＬＢ： ２０．７ｍ
Ｍ； ＩＣ５０ ｒＭＬＢ： １０９ｍＭ）による固定
化アシアロフェチュインリガンド、またはシアル酸（Ｉ
Ｃ５０ ｎＭＬＢ： ４９．８ ｍＭ； ＩＣ５０ ｒ
ＭＬＢ： ４７．１ ｍＭ）による固定化フェチュイン
リガンドのタンパク質の半値幅置換の系特異的ＩＣ５０
値によって特徴付けられる。
【００７９】ガラクトース特異的レクチンとして説明さ
れているｎＭＬＢ鎖は予想通りガラクトースおよびβ−
ラクトースによって置換され得るが、Ｅ． ｃｏｌｉに
おいて組換えにより得られるｒＭＬＢ鎖はガラクトース
と検出可能な相互作用を少しも示さず、β−ラクトース
とわずかな相互作用を示すのみである。組換えｒＭＬＢ
は、順にＮ−アセチルガラクトサミンおよびシアル酸に
対して明らかな親和性を有しており、驚くべきことに、
植物ｎＭＬＢに関してＮ−アセチルガラクトサミン／シ
アル酸特異的レクチンに対する炭水化物特異性の実質的
なシフトを示す。ｒＭＬＢおよびホロタンパク質を含有
しているｒＭＬＢの生物学的活性に関して、これによっ
てリガンド、レセプターまたは標的細胞が、ある範囲で
存在する可能性が生じる。この範囲は、植物ヤドリギレ
クチンタンパク質での範囲を超えるかまたはこれとは異
なっている。
れているｎＭＬＢ鎖は予想通りガラクトースおよびβ−
ラクトースによって置換され得るが、Ｅ． ｃｏｌｉに
おいて組換えにより得られるｒＭＬＢ鎖はガラクトース
と検出可能な相互作用を少しも示さず、β−ラクトース
とわずかな相互作用を示すのみである。組換えｒＭＬＢ
は、順にＮ−アセチルガラクトサミンおよびシアル酸に
対して明らかな親和性を有しており、驚くべきことに、
植物ｎＭＬＢに関してＮ−アセチルガラクトサミン／シ
アル酸特異的レクチンに対する炭水化物特異性の実質的
なシフトを示す。ｒＭＬＢおよびホロタンパク質を含有
しているｒＭＬＢの生物学的活性に関して、これによっ
てリガンド、レセプターまたは標的細胞が、ある範囲で
存在する可能性が生じる。この範囲は、植物ヤドリギレ
クチンタンパク質での範囲を超えるかまたはこれとは異
なっている。
【００８０】好ましい実施態様において、本発明のポリ
ペプチドは少なくとも１つの化学的または酵素的な修飾
を有する。
ペプチドは少なくとも１つの化学的または酵素的な修飾
を有する。
【００８１】この修飾は、ポリペプチドの生物学的活性
を、もしあるのであれば、変化、低下または上昇させ得
る。このような修飾は、例えばポリペプチドの翻訳およ
び単離後に行うことができる。このような修飾はまた、
本発明のポリペプチドの化学的または半合成的な調製中
に導入することができる。これらの修飾は、当業者がそ
れ自体公知の方法によって導入し、ヤドリギレクチンの
薬理学的活性を変化させ、好ましくはこれを改善するこ
とができる。
を、もしあるのであれば、変化、低下または上昇させ得
る。このような修飾は、例えばポリペプチドの翻訳およ
び単離後に行うことができる。このような修飾はまた、
本発明のポリペプチドの化学的または半合成的な調製中
に導入することができる。これらの修飾は、当業者がそ
れ自体公知の方法によって導入し、ヤドリギレクチンの
薬理学的活性を変化させ、好ましくはこれを改善するこ
とができる。
【００８２】他の好ましい実施態様において、本発明の
ポリペプチドは融合タンパク質である。この融合タンパ
ク質は、好ましくは先に定義した生物学的活性を有す
る。
ポリペプチドは融合タンパク質である。この融合タンパ
ク質は、好ましくは先に定義した生物学的活性を有す
る。
【００８３】本発明のポリペプチドのこの実施態様はま
た、好ましくは、ヤドリギレクチンポリペプチドの薬理
学的特性を細胞レベルでの標的用に変化させ、好ましく
はこれを改善するよう設計される。
た、好ましくは、ヤドリギレクチンポリペプチドの薬理
学的特性を細胞レベルでの標的用に変化させ、好ましく
はこれを改善するよう設計される。
【００８４】本発明はさらに、２つのモノマーが本発明
の核酸分子によってコードされている、ヤドリギレクチ
ンの生物学的活性を有するポリペプチドダイマーに関す
る。
の核酸分子によってコードされている、ヤドリギレクチ
ンの生物学的活性を有するポリペプチドダイマーに関す
る。
【００８５】「ヤドリギレクチンの生物学的活性」とい
う用語は、ヤドリギレクチンの全体の生物学的活性スペ
クトル（ｓｐｅｃｔｅｒ）のあらゆる生物学的活性を含
むものと解される。このような機能は、例えば、ヤドリ
ギレクチンの薬理学的作用である。
う用語は、ヤドリギレクチンの全体の生物学的活性スペ
クトル（ｓｐｅｃｔｅｒ）のあらゆる生物学的活性を含
むものと解される。このような機能は、例えば、ヤドリ
ギレクチンの薬理学的作用である。
【００８６】植物ヤドリギ１は、アポトーシスメカニズ
ムによってヒトおよびマウス起源の多数の腫瘍細胞株に
おいて細胞溶解を誘導した（Ｊａｎｓｓｅｎ． １９９
３）。ヤドリギレクチン１またはＢ鎖単独は、健常ヒト
血液ドナーの末梢単核細胞からのサイトカインの放出を
誘導した（Ｈａｊｔｏ， １９９０）。ヤドリギレクチ
ン１は、ガン患者の好中球顆粒球からのスーパーオキシ
ドアニオンの分泌を誘導した（Ｔｉｍｏｓｈｅｎｋｏ，
１９９３）。ヤドリギレクチン１は、健常ヒト血液ド
ナーの末梢リンパ球におけるインターロイキン２レセプ
ター（ＣＤ２５）のＡ鎖および／またはＨＬＡ ＤＱ抗
原の発現を誘導した（Ｂｅｕｔｈ， １９９２）。ヤド
リギレクチン１をマウスに適用した後、胸腺細胞数、胸
腺における細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｌｙｔ−２＋）およ
びヘルパーＴ細胞（Ｌ３Ｔ４＋）数、および末梢マクロ
ファージ数、特に活性化マーカーＭＡＣ−３を有する末
梢マクロファージ数の増加が観察され得た（Ｂｅｕｔ
ｈ， １９９４）。実験動物の胸腺におけるＬ３Ｔ４＋
／Ｌｙｔ２＋の関連が増加した。マウスの末梢血におい
て、ヤドリギレクチン１での処理後に、白血球、リンパ
球、一般におよび特に細胞表面にてインターロイキン２
受容体を活性化マーカーとして発現するリンパ球の単
球、および活性化マーカーＭＡＣ３を発現する単球の密
度が増加した（Ｂｅｕｔｈ， １９９４）。ガン患者の
血液では、ヤドリギレクチン１によって、Ｔリンパ球
（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋）、ナチュラルキラー細胞および
Ｂリンパ球の密度が増加した（Ｂｅｕｔｈ， １９９
２）。
ムによってヒトおよびマウス起源の多数の腫瘍細胞株に
おいて細胞溶解を誘導した（Ｊａｎｓｓｅｎ． １９９
３）。ヤドリギレクチン１またはＢ鎖単独は、健常ヒト
血液ドナーの末梢単核細胞からのサイトカインの放出を
誘導した（Ｈａｊｔｏ， １９９０）。ヤドリギレクチ
ン１は、ガン患者の好中球顆粒球からのスーパーオキシ
ドアニオンの分泌を誘導した（Ｔｉｍｏｓｈｅｎｋｏ，
１９９３）。ヤドリギレクチン１は、健常ヒト血液ド
ナーの末梢リンパ球におけるインターロイキン２レセプ
ター（ＣＤ２５）のＡ鎖および／またはＨＬＡ ＤＱ抗
原の発現を誘導した（Ｂｅｕｔｈ， １９９２）。ヤド
リギレクチン１をマウスに適用した後、胸腺細胞数、胸
腺における細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｌｙｔ−２＋）およ
びヘルパーＴ細胞（Ｌ３Ｔ４＋）数、および末梢マクロ
ファージ数、特に活性化マーカーＭＡＣ−３を有する末
梢マクロファージ数の増加が観察され得た（Ｂｅｕｔ
ｈ， １９９４）。実験動物の胸腺におけるＬ３Ｔ４＋
／Ｌｙｔ２＋の関連が増加した。マウスの末梢血におい
て、ヤドリギレクチン１での処理後に、白血球、リンパ
球、一般におよび特に細胞表面にてインターロイキン２
受容体を活性化マーカーとして発現するリンパ球の単
球、および活性化マーカーＭＡＣ３を発現する単球の密
度が増加した（Ｂｅｕｔｈ， １９９４）。ガン患者の
血液では、ヤドリギレクチン１によって、Ｔリンパ球
（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋）、ナチュラルキラー細胞および
Ｂリンパ球の密度が増加した（Ｂｅｕｔｈ， １９９
２）。
【００８７】さらに、ヤドリギレクチン１の適用後、乳
癌患者の血液血漿中にて内因性オピエートメディエータ
であるβ−エンドルフィンの増加が検出され得た（Ｈｅ
ｉｎｙ， １９９４）。さらに、ヤドリギレクチン１
は、Ｋ−５６２腫瘍細胞に対する末梢のナチュラルキラ
ー細胞の細胞傷害性効果を増強し、ならびに末梢血にお
ける大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）の密度を高めることが確
認された（Ｈａｊｔｏ，１９８９）。マウスの肉腫細胞
におけるヤドリギレクチン１の抗転移活性も検出され得
た（Ｂｅｕｔｈ， １９９１）。
癌患者の血液血漿中にて内因性オピエートメディエータ
であるβ−エンドルフィンの増加が検出され得た（Ｈｅ
ｉｎｙ， １９９４）。さらに、ヤドリギレクチン１
は、Ｋ−５６２腫瘍細胞に対する末梢のナチュラルキラ
ー細胞の細胞傷害性効果を増強し、ならびに末梢血にお
ける大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）の密度を高めることが確
認された（Ｈａｊｔｏ，１９８９）。マウスの肉腫細胞
におけるヤドリギレクチン１の抗転移活性も検出され得
た（Ｂｅｕｔｈ， １９９１）。
【００８８】他の実施態様において、本発明のポリペプ
チドダイマーは天然に存在するヤドリギレクチンダイマ
ーと同じ範囲の生物学的活性を有する。
チドダイマーは天然に存在するヤドリギレクチンダイマ
ーと同じ範囲の生物学的活性を有する。
【００８９】（（Ｖ） 組換えヤドリギレクチンの生物
学的活性）同時折り畳み（ｃｏ−ｆｏｌｄｉｎｇ）工程
での可溶性折り畳み鎖または変性ｒＭＬＡおよびｒＭＬ
Ｂ鎖から開始して、インビトロにて別々の工程で組換え
により合成した単鎖を使用して、ｒＭＬホロタンパク質
を生成した。ここで、ｒＭＬＢは、好ましくは、グルタ
チオン酸化還元系の存在下、特にタンパク質ジスルフィ
ドイソメラーゼの存在下でモル過剰のｒＭＬＡと再会合
された。Ｎ−アセチルガラクトサミンアガロースまたは
ラクトシルアガロースを用いたアフィニティクロマトグ
ラフィーによる再会合反応から、ヘテロダイマーに対応
するｒＭＬホロタンパク質を単離および精製し、これに
よりこのタンパク質を遊離ｒＭＬＡおよびｒＭＬＡダイ
マーから分離した。類似の方法で、ｒＭＬＡ／ｒＭＬＢ
（ｒＭＬ）およびｒＭＬＡ／ｎＭＬＢヘテロダイマーホ
ロタンパク質を調製した。
学的活性）同時折り畳み（ｃｏ−ｆｏｌｄｉｎｇ）工程
での可溶性折り畳み鎖または変性ｒＭＬＡおよびｒＭＬ
Ｂ鎖から開始して、インビトロにて別々の工程で組換え
により合成した単鎖を使用して、ｒＭＬホロタンパク質
を生成した。ここで、ｒＭＬＢは、好ましくは、グルタ
チオン酸化還元系の存在下、特にタンパク質ジスルフィ
ドイソメラーゼの存在下でモル過剰のｒＭＬＡと再会合
された。Ｎ−アセチルガラクトサミンアガロースまたは
ラクトシルアガロースを用いたアフィニティクロマトグ
ラフィーによる再会合反応から、ヘテロダイマーに対応
するｒＭＬホロタンパク質を単離および精製し、これに
よりこのタンパク質を遊離ｒＭＬＡおよびｒＭＬＡダイ
マーから分離した。類似の方法で、ｒＭＬＡ／ｒＭＬＢ
（ｒＭＬ）およびｒＭＬＡ／ｎＭＬＢヘテロダイマーホ
ロタンパク質を調製した。
【００９０】（細胞傷害性活性）再会合したホロタンパ
ク質の生物学的活性の一例としての細胞傷害性作用をヒ
ト単球白血病細胞株（ＭＯＬＴ４）で試験した。Ｂ鎖
（表面結合）およびＡ鎖（酵素リボソーム不活性化）の
両方とも観察された細胞傷害性作用に寄与している。イ
ンビトロで再会合したｒＭＬＡ／ｒＭＬＢホロタンパク
質ならびにインビトロで再会合したｒＭＬＡ／ｎＭＬＢ
ホロタンパク質を、天然に存在するｎＭＬホロタンパク
質の２つのバッチと比較した。組換えｒＭＬＡ／ｒＭＬ
ＢおよびｒＭＬＡ／ｎＭＬＢホロタンパク質は、ＩＣ値
が約１０〜３０ｐｇ／ｍｌの比較的高い細胞傷害特性を
示す（図１１）。これは、組換え鎖を使用してインビト
ロで再会合されたｒＭＬホロタンパク質の機能的完全性
および生物学的活性を示す。驚くべきことに単離された
ｒＭＬＢ鎖のみでは細胞傷害活性を有さないため、細胞
傷害活性を作用させるためにはＢ鎖が酵素的に活性なＡ
鎖と作動可能に連結される必要がある。したがって、上
述の植物ヤドリギレクチンＢ鎖調製物の細胞傷害活性
は、おそらくｎＭＬホロタンパク質の残留含量に起因し
得る。このように、単鎖の組換え生成によって、ヤドリ
ギレクチンの炭水化物結合および酵素活性について別々
に説明してこれを利用することが初めて可能になる。
ク質の生物学的活性の一例としての細胞傷害性作用をヒ
ト単球白血病細胞株（ＭＯＬＴ４）で試験した。Ｂ鎖
（表面結合）およびＡ鎖（酵素リボソーム不活性化）の
両方とも観察された細胞傷害性作用に寄与している。イ
ンビトロで再会合したｒＭＬＡ／ｒＭＬＢホロタンパク
質ならびにインビトロで再会合したｒＭＬＡ／ｎＭＬＢ
ホロタンパク質を、天然に存在するｎＭＬホロタンパク
質の２つのバッチと比較した。組換えｒＭＬＡ／ｒＭＬ
ＢおよびｒＭＬＡ／ｎＭＬＢホロタンパク質は、ＩＣ値
が約１０〜３０ｐｇ／ｍｌの比較的高い細胞傷害特性を
示す（図１１）。これは、組換え鎖を使用してインビト
ロで再会合されたｒＭＬホロタンパク質の機能的完全性
および生物学的活性を示す。驚くべきことに単離された
ｒＭＬＢ鎖のみでは細胞傷害活性を有さないため、細胞
傷害活性を作用させるためにはＢ鎖が酵素的に活性なＡ
鎖と作動可能に連結される必要がある。したがって、上
述の植物ヤドリギレクチンＢ鎖調製物の細胞傷害活性
は、おそらくｎＭＬホロタンパク質の残留含量に起因し
得る。このように、単鎖の組換え生成によって、ヤドリ
ギレクチンの炭水化物結合および酵素活性について別々
に説明してこれを利用することが初めて可能になる。
【００９１】（アポトーシスの誘導）ヤドリギレクチン
の生物学的活性の一例としてのアポトーシス誘導能を、
単球細胞株Ｕ９３７を使用して、組換えｒＭＬホロタン
パク質について示した。７０ｐｇ／ｍｌで細胞を処理し
た２４時間後、ｒＭＬホロタンパク質によるアポトーシ
スの誘導を検出することができた（図１２）。ＭＯＬＴ
−４細胞および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）についての
ヤドリギレクチンでの試験は、低用量範囲でのアポトー
シスプロセスの誘導がヤドリギレクチンの細胞傷害活性
の基礎であることを示した。サイトカイン誘導は低細胞
傷害性の濃度範囲内で起こる（図１３、図１４）ため、
アポトーシス誘導活性との相関がありそうではあるが、
高用量範囲においてならびにインキュベーション時間を
長くすると、アポトーシスは壊死作用により重畳され
る。アポトーシスの結果として生じる細胞傷害性は、感
受性ＭＯＬＴ−４細胞を組換えＢ鎖で処理した場合には
検出できなかったため、低用量範囲におけるアポトーシ
ス誘導の生物学的活性は、ホロタンパク質の作用にのみ
起因し得る。
の生物学的活性の一例としてのアポトーシス誘導能を、
単球細胞株Ｕ９３７を使用して、組換えｒＭＬホロタン
パク質について示した。７０ｐｇ／ｍｌで細胞を処理し
た２４時間後、ｒＭＬホロタンパク質によるアポトーシ
スの誘導を検出することができた（図１２）。ＭＯＬＴ
−４細胞および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）についての
ヤドリギレクチンでの試験は、低用量範囲でのアポトー
シスプロセスの誘導がヤドリギレクチンの細胞傷害活性
の基礎であることを示した。サイトカイン誘導は低細胞
傷害性の濃度範囲内で起こる（図１３、図１４）ため、
アポトーシス誘導活性との相関がありそうではあるが、
高用量範囲においてならびにインキュベーション時間を
長くすると、アポトーシスは壊死作用により重畳され
る。アポトーシスの結果として生じる細胞傷害性は、感
受性ＭＯＬＴ−４細胞を組換えＢ鎖で処理した場合には
検出できなかったため、低用量範囲におけるアポトーシ
ス誘導の生物学的活性は、ホロタンパク質の作用にのみ
起因し得る。
【００９２】（免疫刺激活性）組換えヤドリギレクチン
ホロタンパク質の生物学的活性の例としての免疫刺激作
用を、健康な血液ドナー（ＰＢＭＣモデル）のヒト単核
細胞からの腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびインタ
ーフェロンγ（ＩＦＮ−γ）放出の誘導と、ヒト一次角
化細胞および皮膚線維芽細胞（皮膚2 ＺＫ１２００モ
デル）の共同培養物におけるインターロイキン１α（Ｉ
Ｌ−１α）およびインターロイキン６（ＩＬ−６）放出
の誘導とについて実験的に試験した。ＰＢＭＣモデルに
おいて組換えｒＭＬホロタンパク質３〜４８ｎｇ／ｍｌ
でＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの用量依存放出が起こ
り、皮膚2モデルでは組換えｒＭＬホロタンパク質０．
２５〜８ｎｇ／ｍｌでＩＬ−１αおよびＩＬ−６の用量
依存放出が起こった。
ホロタンパク質の生物学的活性の例としての免疫刺激作
用を、健康な血液ドナー（ＰＢＭＣモデル）のヒト単核
細胞からの腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびインタ
ーフェロンγ（ＩＦＮ−γ）放出の誘導と、ヒト一次角
化細胞および皮膚線維芽細胞（皮膚2 ＺＫ１２００モ
デル）の共同培養物におけるインターロイキン１α（Ｉ
Ｌ−１α）およびインターロイキン６（ＩＬ−６）放出
の誘導とについて実験的に試験した。ＰＢＭＣモデルに
おいて組換えｒＭＬホロタンパク質３〜４８ｎｇ／ｍｌ
でＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの用量依存放出が起こ
り、皮膚2モデルでは組換えｒＭＬホロタンパク質０．
２５〜８ｎｇ／ｍｌでＩＬ−１αおよびＩＬ−６の用量
依存放出が起こった。
【００９３】上述したサイトカインはいずれも関係のあ
るヒト免疫系の刺激メディエータであり、特に細胞性免
疫応答の活性化の際に中心となる機能を有する。
るヒト免疫系の刺激メディエータであり、特に細胞性免
疫応答の活性化の際に中心となる機能を有する。
【００９４】免疫刺激活性は主にＢ鎖のレクチン活性が
原因で起こるとしている現在までの従来技術の状況（Ｈ
ａｊｔｏ ら、１９９０）とは対照的に、上述したサイ
トカイン放出はいずれも組換えｒＭＬＢ鎖のみを用いて
誘導することはできなかった。免疫刺激活性は、低用量
範囲にて作動可能に結合されたｒＭＬホロタンパク質に
よってのみ達成された。この驚くべき所見から、植物ｒ
ＭＬＢ鎖の免疫刺激調製物は依然としてｎＭＬホロタン
パク質の痕跡を含んでおり、そしてｎＭＬＢ鎖に起因す
る免疫刺激作用は、ｎＭＬの残留量に起因しているに違
いないと考えられる。したがって、今まで述べられてい
るｎＭＬＢを調製するための方法では、ホロタンパク質
を定量的に分離することはできず、個々のヤドリギレク
チン鎖の組換えを実現することで、均一なヤドリギレク
チンＢ鎖調製物を試験して提供することが初めて可能に
なる。これによって、Ａ鎖およびＢ鎖の生物学的活性を
別々に説明してこれを利用し、そして一本鎖の生物学的
活性と作動可能に結合したホロタンパク質の生物学的活
性とを区別することが初めて可能になる。
原因で起こるとしている現在までの従来技術の状況（Ｈ
ａｊｔｏ ら、１９９０）とは対照的に、上述したサイ
トカイン放出はいずれも組換えｒＭＬＢ鎖のみを用いて
誘導することはできなかった。免疫刺激活性は、低用量
範囲にて作動可能に結合されたｒＭＬホロタンパク質に
よってのみ達成された。この驚くべき所見から、植物ｒ
ＭＬＢ鎖の免疫刺激調製物は依然としてｎＭＬホロタン
パク質の痕跡を含んでおり、そしてｎＭＬＢ鎖に起因す
る免疫刺激作用は、ｎＭＬの残留量に起因しているに違
いないと考えられる。したがって、今まで述べられてい
るｎＭＬＢを調製するための方法では、ホロタンパク質
を定量的に分離することはできず、個々のヤドリギレク
チン鎖の組換えを実現することで、均一なヤドリギレク
チンＢ鎖調製物を試験して提供することが初めて可能に
なる。これによって、Ａ鎖およびＢ鎖の生物学的活性を
別々に説明してこれを利用し、そして一本鎖の生物学的
活性と作動可能に結合したホロタンパク質の生物学的活
性とを区別することが初めて可能になる。
【００９５】（（ＶＩ） 組換えヤドリギレクチンＢ鎖
（ｒＭＬＢ）の生物学的活性）免疫担当細胞の活性化マ
ーカーとして、細胞表面タンパク質ＣＤ６９の誘導を試
験した。ＣＤ６９は、Ｔ細胞、Ｂ細胞および特にナチュ
ラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の活性化後に最初の細胞表
面抗原の１つとして現れる。細胞表面タンパク質は休止
リンパ球では発現しないため、ＣＤ６９は上述した免疫
担当細胞集団の活性化マーカーの機能を有する。さら
に、誘導可能なＣＤ６９表面タンパク質は、ＮＫ細胞お
よびＴｃＲγ／δＴ細胞の細胞溶解活性に対して助ける
機能を持っていることが明らかにされている（Ｍｏｒｅ
ｔｔａ ら、１９９１）。
（ｒＭＬＢ）の生物学的活性）免疫担当細胞の活性化マ
ーカーとして、細胞表面タンパク質ＣＤ６９の誘導を試
験した。ＣＤ６９は、Ｔ細胞、Ｂ細胞および特にナチュ
ラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の活性化後に最初の細胞表
面抗原の１つとして現れる。細胞表面タンパク質は休止
リンパ球では発現しないため、ＣＤ６９は上述した免疫
担当細胞集団の活性化マーカーの機能を有する。さら
に、誘導可能なＣＤ６９表面タンパク質は、ＮＫ細胞お
よびＴｃＲγ／δＴ細胞の細胞溶解活性に対して助ける
機能を持っていることが明らかにされている（Ｍｏｒｅ
ｔｔａ ら、１９９１）。
【００９６】細胞表面でのＣＤ６９の発生およびＣＤ６
９陽性細胞のシェアの両方に関して、抗ＣＤ６９ ｍＡ
ｂを使用するフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を利用
して濃度範囲１〜１００ｎｇ／ｍｌで単核細胞の活性化
を検出した。用量依存性曲線は釣り鐘型で、ｒＭＬＢ鎖
の２つのリガンド結合部位を介して細胞レセプターが相
互に結合する必要性を示している。ｒＭＬＢが１００ｎ
ｇ／ｍｌの最高濃度においても本試験で検討されたＰＢ
ＭＣに対する細胞傷害作用を証明することはできなかっ
た。
９陽性細胞のシェアの両方に関して、抗ＣＤ６９ ｍＡ
ｂを使用するフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を利用
して濃度範囲１〜１００ｎｇ／ｍｌで単核細胞の活性化
を検出した。用量依存性曲線は釣り鐘型で、ｒＭＬＢ鎖
の２つのリガンド結合部位を介して細胞レセプターが相
互に結合する必要性を示している。ｒＭＬＢが１００ｎ
ｇ／ｍｌの最高濃度においても本試験で検討されたＰＢ
ＭＣに対する細胞傷害作用を証明することはできなかっ
た。
【００９７】好ましい実施例において、本発明によるポ
リペプチドダイマーは、モノマーのうちの少なくとも１
つとして化学的または酵素的に修飾された本発明による
ポリペプチドまたは本発明による融合タンパク質を呈す
る。
リペプチドダイマーは、モノマーのうちの少なくとも１
つとして化学的または酵素的に修飾された本発明による
ポリペプチドまたは本発明による融合タンパク質を呈す
る。
【００９８】修飾を利用して効力を最適化することがで
きるが、特定の品質（例えば、Ｂ鎖の炭水化物結合部位
またはＡ鎖のグリコシダーゼ活性）をなくして、考えら
れる副作用をなくすことによって、考えられる治療用途
を拡げることもできる。特性が変化したポリペプチドも
また作用メカニズムを明瞭にするためのツールとして役
に立つことができる。特定の治療には、ポリペプチドの
抗原性および免疫原性を弱めることおよび／またはその
薬物動態学的特性を最適化することが必要とされる。こ
れは、個々のアミノ酸を特異的に交換することによって
可能になる。
きるが、特定の品質（例えば、Ｂ鎖の炭水化物結合部位
またはＡ鎖のグリコシダーゼ活性）をなくして、考えら
れる副作用をなくすことによって、考えられる治療用途
を拡げることもできる。特性が変化したポリペプチドも
また作用メカニズムを明瞭にするためのツールとして役
に立つことができる。特定の治療には、ポリペプチドの
抗原性および免疫原性を弱めることおよび／またはその
薬物動態学的特性を最適化することが必要とされる。こ
れは、個々のアミノ酸を特異的に交換することによって
可能になる。
【００９９】本発明はさらに、本発明によるポリペプチ
ドおよび／またはポリペプチドダイマーと特異的に結合
する抗体またはそのフラグメントまたは誘導体に関す
る。したがって、これらの抗体またはそのフラグメント
または誘導体は、天然に存在するヤドリギレクチンまた
はその一本鎖を認識しない。好ましくは、本発明による
抗体は天然に存在するヤドリギレクチンのグリコシル化
によってマスクされるエピトープと結合する。この抗体
は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または
（半）合成抗体であり得る。フラグメントは、例えば、
Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）2またはＦｖフラグメントであり
得る。抗体の誘導体も従来技術において公知である。
ドおよび／またはポリペプチドダイマーと特異的に結合
する抗体またはそのフラグメントまたは誘導体に関す
る。したがって、これらの抗体またはそのフラグメント
または誘導体は、天然に存在するヤドリギレクチンまた
はその一本鎖を認識しない。好ましくは、本発明による
抗体は天然に存在するヤドリギレクチンのグリコシル化
によってマスクされるエピトープと結合する。この抗体
は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または
（半）合成抗体であり得る。フラグメントは、例えば、
Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）2またはＦｖフラグメントであり
得る。抗体の誘導体も従来技術において公知である。
【０１００】本発明はさらに、本発明によるポリペプチ
ドまたはポリペプチドダイマーを調製するための方法に
関する。この方法では、本発明による宿主を適切な条件
下で培養し、このようにして得られるポリペプチドまた
はポリペプチドダイマーを単離する。
ドまたはポリペプチドダイマーを調製するための方法に
関する。この方法では、本発明による宿主を適切な条件
下で培養し、このようにして得られるポリペプチドまた
はポリペプチドダイマーを単離する。
【０１０１】当業者であれば、宿主を培養して単離する
ための適切な条件を熟知している。例えば、本発明によ
るポリペプチドまたはポリペプチドダイマーを適切な発
現系を介して宿主から輸出することができ、そして培地
において収集することができる。一方、ポリペプチドま
たはポリペプチドダイマーを細胞中に残存させ、そこか
ら単離することもできる。以下、本発明による方法の別
の好ましい実施態様について説明する。
ための適切な条件を熟知している。例えば、本発明によ
るポリペプチドまたはポリペプチドダイマーを適切な発
現系を介して宿主から輸出することができ、そして培地
において収集することができる。一方、ポリペプチドま
たはポリペプチドダイマーを細胞中に残存させ、そこか
ら単離することもできる。以下、本発明による方法の別
の好ましい実施態様について説明する。
【０１０２】ｒＭＬＡを単離するために、適切な発現ベ
クターで形質転換させたＥ． ｃｏｌｉ細胞を破壊し、
そして遠心分離によって可溶性と不溶性細胞画分とを分
離した。細胞画分を分析したところ、発現条件および発
現期間に応じて、組換えヤドリギレクチンＡ鎖は５〜５
０％が可溶形態で蓄積され、５０〜９５％が不溶性タン
パク質凝集体（「封入体」）の形態で蓄積されることが
分かった。
クターで形質転換させたＥ． ｃｏｌｉ細胞を破壊し、
そして遠心分離によって可溶性と不溶性細胞画分とを分
離した。細胞画分を分析したところ、発現条件および発
現期間に応じて、組換えヤドリギレクチンＡ鎖は５〜５
０％が可溶形態で蓄積され、５０〜９５％が不溶性タン
パク質凝集体（「封入体」）の形態で蓄積されることが
分かった。
【０１０３】可溶性および不溶性のタンパク質の存在
は、ｒＭＬＡタンパク質の再折り畳みまたは復元が可能
であるならば、ｒＭＬＡを単離する方法は少なくとも２
つあることを示す。変性条件下で沈降物を洗浄してＥ．
ｃｏｌｉタンパク質を除去した後、凝集して「封入
体」になるｒＭＬＡを溶解し（Ｂａｂｂｉｔｔ ら、１
９９０）、そして折り畳み緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
８．０）にて９０倍に希釈することによって再折り畳み
した。
は、ｒＭＬＡタンパク質の再折り畳みまたは復元が可能
であるならば、ｒＭＬＡを単離する方法は少なくとも２
つあることを示す。変性条件下で沈降物を洗浄してＥ．
ｃｏｌｉタンパク質を除去した後、凝集して「封入
体」になるｒＭＬＡを溶解し（Ｂａｂｂｉｔｔ ら、１
９９０）、そして折り畳み緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
８．０）にて９０倍に希釈することによって再折り畳み
した。
【０１０４】このような処理によって、図９に示される
ように、複元された本来不溶性の変性ｒＭＬＡ種とちょ
うど同様の完全な酵素活性を有する可溶性折り畳みタン
パク質種が得られた。抗ＭＬＡ特異抗体ＴＡ５を使用し
てイムノアフィニティクロマトグラフィーによって可溶
性ｒＭＬＡと同様に復元ｒＭＬＡを単離することができ
る（Ｔｏｎｅｖｉｔｓｋｙ ら、 １９９５）。
ように、複元された本来不溶性の変性ｒＭＬＡ種とちょ
うど同様の完全な酵素活性を有する可溶性折り畳みタン
パク質種が得られた。抗ＭＬＡ特異抗体ＴＡ５を使用し
てイムノアフィニティクロマトグラフィーによって可溶
性ｒＭＬＡと同様に復元ｒＭＬＡを単離することができ
る（Ｔｏｎｅｖｉｔｓｋｙ ら、 １９９５）。
【０１０５】可溶形態ならびに不溶性「封入体」の形態
のｒＭＬＢが存在することから、組換えヤドリギレクチ
ンＢ鎖を単離するための方法は２つあることが分かる。
のｒＭＬＢが存在することから、組換えヤドリギレクチ
ンＢ鎖を単離するための方法は２つあることが分かる。
【０１０６】Ｅ． ｃｏｌｉ細胞質の強還元環境から可
溶性ｒＭＬＢ鎖を単離するために、還元および酸化させ
たグルタチオンからなるレドックス系の存在下でこれを
インキュベートして鎖間ジスルフィド橋を構築し、リガ
ンドβ−ラクトースの存在下でインキュベートして活性
折り畳み生成物を安定させる。折り畳み反応活性から、
単一工程プロセスにおいて、ラクトシルアガロースまた
はＮ−アセチルガラクトサミンアガロースを使用するア
フィニティクロマトグラフィーによって、炭水化物結合
ｒＭＬＢ鎖を選択的に単離および／または精製した。
溶性ｒＭＬＢ鎖を単離するために、還元および酸化させ
たグルタチオンからなるレドックス系の存在下でこれを
インキュベートして鎖間ジスルフィド橋を構築し、リガ
ンドβ−ラクトースの存在下でインキュベートして活性
折り畳み生成物を安定させる。折り畳み反応活性から、
単一工程プロセスにおいて、ラクトシルアガロースまた
はＮ−アセチルガラクトサミンアガロースを使用するア
フィニティクロマトグラフィーによって、炭水化物結合
ｒＭＬＢ鎖を選択的に単離および／または精製した。
【０１０７】「封入体」として存在する不溶性発現生成
物画分からｒＭＬＢを単離するために、Ｅ． ｃｏｌｉ
細胞の完全細胞破壊の沈降物を洗浄してＥ． ｃｏｌｉ
タンパク質を除去し（Ｂａｂｂｉｔｔ ら、１９９
０）、そして変性および還元条件下で溶解した。還元お
よび酸化させたグルタチオンからなるレドックス系の存
在下ならびにリガンドβ−ラクトースの存在下で、希釈
によって復元を行った。Ｎ−アセチルガラクトサミンア
ガロースまたはラクトシルアガロースを使用するアフィ
ニティクロマトグラフィーによって、復元反応物から活
性炭水化物結合ｒＭＬＢ鎖を選択的に単離して精製し
た。
物画分からｒＭＬＢを単離するために、Ｅ． ｃｏｌｉ
細胞の完全細胞破壊の沈降物を洗浄してＥ． ｃｏｌｉ
タンパク質を除去し（Ｂａｂｂｉｔｔ ら、１９９
０）、そして変性および還元条件下で溶解した。還元お
よび酸化させたグルタチオンからなるレドックス系の存
在下ならびにリガンドβ−ラクトースの存在下で、希釈
によって復元を行った。Ｎ−アセチルガラクトサミンア
ガロースまたはラクトシルアガロースを使用するアフィ
ニティクロマトグラフィーによって、復元反応物から活
性炭水化物結合ｒＭＬＢ鎖を選択的に単離して精製し
た。
【０１０８】本発明はさらに、本発明によるポリペプチ
ドまたは本発明によるポリペプチドダイマーおよび／ま
たは後述する本発明によるイムノトキシンを、任意に薬
学的に許容可能な担体と混合して含有する薬学組成物に
関する。
ドまたは本発明によるポリペプチドダイマーおよび／ま
たは後述する本発明によるイムノトキシンを、任意に薬
学的に許容可能な担体と混合して含有する薬学組成物に
関する。
【０１０９】本発明によるポリペプチド、その会合物ま
たは修飾物は、天然に存在するヤドリギレクチンで知ら
れている薬理学的特性と同様にガンまたは感染症の治療
における様々な用途に役立つ。
たは修飾物は、天然に存在するヤドリギレクチンで知ら
れている薬理学的特性と同様にガンまたは感染症の治療
における様々な用途に役立つ。
【０１１０】体が本来持っている免疫防御作用を直接的
および／または間接的に刺激し、腫瘍および考えられる
転移とより効果的に闘うことができるようにすること
で、免疫刺激作用を腫瘍治療に利用することができる。
感染症、特にウイルスによる感染症についても同じこと
が言える。
および／または間接的に刺激し、腫瘍および考えられる
転移とより効果的に闘うことができるようにすること
で、免疫刺激作用を腫瘍治療に利用することができる。
感染症、特にウイルスによる感染症についても同じこと
が言える。
【０１１１】本発明によるポリペプチドを、インターフ
ェロン、サイトカインまたはコロニー刺激因子などの他
の免疫刺激剤と組み合わせて投与し、相乗効果を達成し
たり、あるいは組み合わせ調製物の必要用量を減らして
副作用を少なくすることもできる。
ェロン、サイトカインまたはコロニー刺激因子などの他
の免疫刺激剤と組み合わせて投与し、相乗効果を達成し
たり、あるいは組み合わせ調製物の必要用量を減らして
副作用を少なくすることもできる。
【０１１２】静細胞因子または放射線療法と組み合わせ
ることで、従来の治療方法によって引き起こされる免疫
系の機能低下が軽減されるため、白血球減少症／骨髄抑
制の副作用を緩和または軽減することができる。
ることで、従来の治療方法によって引き起こされる免疫
系の機能低下が軽減されるため、白血球減少症／骨髄抑
制の副作用を緩和または軽減することができる。
【０１１３】グリコシダーゼ活性を有するポリペプチド
の直接的な細胞傷害作用は、腫瘍細胞のアポトーシスの
原因となるものであり、治療の目的で使用することもで
きる。本発明によるポリペプチドが適切な抗体と結合さ
れれば、この原理をイムノトキシンの投与により具体的
に使用することができる。このため、本発明はさらに、
本発明によるポリペプチドまたはポリペプチドダイマー
を少なくとも１つ含むイムノトキシンにも関する。例え
ば、活性Ａ鎖またはホロタンパク質は、タンパク質化学
の方法によって抗体またはそのフラグメントと結合する
ことができる。このような結合方法は当業者間で公知で
あり、対応の抱合体は多くの用途に有用である（Ｖｉｔ
ｅｔｔａ， １９９３）。あるいは、例えば抗体および
これに加えて本発明によるポリペプチドの細胞傷害フラ
グメントから得られる抗原結合ドメインを含有する、対
応して構成された融合タンパク質構成物を発現させるこ
とができる。
の直接的な細胞傷害作用は、腫瘍細胞のアポトーシスの
原因となるものであり、治療の目的で使用することもで
きる。本発明によるポリペプチドが適切な抗体と結合さ
れれば、この原理をイムノトキシンの投与により具体的
に使用することができる。このため、本発明はさらに、
本発明によるポリペプチドまたはポリペプチドダイマー
を少なくとも１つ含むイムノトキシンにも関する。例え
ば、活性Ａ鎖またはホロタンパク質は、タンパク質化学
の方法によって抗体またはそのフラグメントと結合する
ことができる。このような結合方法は当業者間で公知で
あり、対応の抱合体は多くの用途に有用である（Ｖｉｔ
ｅｔｔａ， １９９３）。あるいは、例えば抗体および
これに加えて本発明によるポリペプチドの細胞傷害フラ
グメントから得られる抗原結合ドメインを含有する、対
応して構成された融合タンパク質構成物を発現させるこ
とができる。
【０１１４】さらに、腫瘍細胞が他の細胞に結合するの
を阻害できれば、転移病巣が形成されるのを防止するこ
とができる。本発明によるポリペプチドを使用して、競
合レクチン結合を利用することでこのような結合を防止
することができる。
を阻害できれば、転移病巣が形成されるのを防止するこ
とができる。本発明によるポリペプチドを使用して、競
合レクチン結合を利用することでこのような結合を防止
することができる。
【０１１５】本発明はさらに、本発明による核酸分子ま
たはその相補鎖と特異的にハイブリダイズするプライマ
ーおよび／またはプライマー対にも関する。
たはその相補鎖と特異的にハイブリダイズするプライマ
ーおよび／またはプライマー対にも関する。
【０１１６】本発明はさらに、少なくとも ａ） 本発明による核酸分子と、 ｂ） 本発明による核酸分子またはその相補鎖と特異的
にハイブリダイズするプライマーおよび／またはプライ
マー対および／または ｃ） 本発明によるポリペプチドおよび／または本発明
によるポリペプチドダイマーと、を含有する診断組成物
にも関する。
にハイブリダイズするプライマーおよび／またはプライ
マー対および／または ｃ） 本発明によるポリペプチドおよび／または本発明
によるポリペプチドダイマーと、を含有する診断組成物
にも関する。
【０１１７】例えば薬学的に興味深いレクチンをコード
し得る新たなレクチン遺伝子を見いだすなどの目的で、
プライマーおよび／またはプライマー対を含有する本発
明による診断組成物を使用してレクチン遺伝子の存在に
関して生物をスクリーニングすることができる。本発明
による診断組成物に含まれる本発明による核酸分子を使
用し、例えばサザンブロットまたはノーザンブロット法
によって、このようなレクチン遺伝子の存在について生
物をスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼ
ーションのストリンジェント性を変化させることによっ
て、関連のレクチン遺伝子をスクリーニングすることが
できる。ポリペプチド（ダイマー）を使用して、例えば
それ自体公知の方法によって様々な生物中のそれぞれの
（ヤドリギ）レクチンを検出することができる抗体また
は抗血清を生成することができる。
し得る新たなレクチン遺伝子を見いだすなどの目的で、
プライマーおよび／またはプライマー対を含有する本発
明による診断組成物を使用してレクチン遺伝子の存在に
関して生物をスクリーニングすることができる。本発明
による診断組成物に含まれる本発明による核酸分子を使
用し、例えばサザンブロットまたはノーザンブロット法
によって、このようなレクチン遺伝子の存在について生
物をスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼ
ーションのストリンジェント性を変化させることによっ
て、関連のレクチン遺伝子をスクリーニングすることが
できる。ポリペプチド（ダイマー）を使用して、例えば
それ自体公知の方法によって様々な生物中のそれぞれの
（ヤドリギ）レクチンを検出することができる抗体また
は抗血清を生成することができる。
【０１１８】最後に、本発明は、本発明によるポリペプ
チドおよび／または本発明によるポリペプチドダイマー
を含有する植物保護因子に関する。植物のヤドリギレク
チンについて論じられている機能に基づいて、本発明に
よるポリペプチド、その会合物または修飾物を植物保護
因子として使用することができる。抗ウイルス保護とし
てのヤドリギレクチンの機能は、食べられることに対す
る植物の保護対策としての有毒な特性ならびに膜の透過
性および構成に影響する特性がゆえに論じられている。
チドおよび／または本発明によるポリペプチドダイマー
を含有する植物保護因子に関する。植物のヤドリギレク
チンについて論じられている機能に基づいて、本発明に
よるポリペプチド、その会合物または修飾物を植物保護
因子として使用することができる。抗ウイルス保護とし
てのヤドリギレクチンの機能は、食べられることに対す
る植物の保護対策としての有毒な特性ならびに膜の透過
性および構成に影響する特性がゆえに論じられている。
【０１１９】以下の実施例は、本発明を例示するための
ものである。
ものである。
【０１２０】
【実施例】（実施例１） （一次増幅オリゴヌクレオチドの構築）ヤドリギレクチ
ン（ＭＬ）は、様々な系統由来の植物で広く一般的なタ
ンパク質ファミリーを表すリボソーム不活性化タンパク
質のクラスに属している（Ｓｔｉｒｐｅ ら、１９９
２）。ＭＬは、そのサブユニットの活性がゆえにＩＩ型
リボソーム不活性化タンパク質のグループに属していた
（Ｅｎｄｏ ら、１９８８ａ）。
ン（ＭＬ）は、様々な系統由来の植物で広く一般的なタ
ンパク質ファミリーを表すリボソーム不活性化タンパク
質のクラスに属している（Ｓｔｉｒｐｅ ら、１９９
２）。ＭＬは、そのサブユニットの活性がゆえにＩＩ型
リボソーム不活性化タンパク質のグループに属していた
（Ｅｎｄｏ ら、１９８８ａ）。
【０１２１】しかしながら、Ｖｉｓｃｕｍ ａｌｂｕｍ
ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーをス
クリーニングする自明なアプローチは、ＭＬ遺伝子配列
を見つけるには全く不適切である。様々なＤＮＡプロー
ブを使用したにもかかわらず、Ｖｉｓｃｕｍ ａｌｂｕ
ｍポリＡ＋ＲＮＡからの遺伝子ライブラリーでＭＬ特異
性クローンを同定することはできなかった。ＭＬ遺伝子
配列はイントロンを含有していないという仮定に基づい
て、ＰＣＲ方法を実施した。Ｎ−末端アミノ酸配列はＭ
ＬＡ鎖およびＭＬＢ鎖の両方について知られている（Ｄ
ｉｅｔｒｉｃｈら、１９９２； Ｇａｂｉｕｓ ら、１
９９２）ため、周知のペプチドから誘導された縮重増幅
オリゴヌクレオチド（図１ａ）を使用してＭＬＡコード
領域を増幅することは可能であるように思われた。低縮
重度の有用なオリゴヌクレオチドはＭＬＡ鎖のＮ−末端
（ＲＭＬＡ１、図１ｂ）から誘導できるため、対応の十
分に特異なオリゴヌクレオチドをＭＬＢ鎖のＮ−末端
（ＲＭＬＢ１、ＲＭＬＢ２、ＲＭＬＢ３、図１ｂ）から
構築することは不可能である。
ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーをス
クリーニングする自明なアプローチは、ＭＬ遺伝子配列
を見つけるには全く不適切である。様々なＤＮＡプロー
ブを使用したにもかかわらず、Ｖｉｓｃｕｍ ａｌｂｕ
ｍポリＡ＋ＲＮＡからの遺伝子ライブラリーでＭＬ特異
性クローンを同定することはできなかった。ＭＬ遺伝子
配列はイントロンを含有していないという仮定に基づい
て、ＰＣＲ方法を実施した。Ｎ−末端アミノ酸配列はＭ
ＬＡ鎖およびＭＬＢ鎖の両方について知られている（Ｄ
ｉｅｔｒｉｃｈら、１９９２； Ｇａｂｉｕｓ ら、１
９９２）ため、周知のペプチドから誘導された縮重増幅
オリゴヌクレオチド（図１ａ）を使用してＭＬＡコード
領域を増幅することは可能であるように思われた。低縮
重度の有用なオリゴヌクレオチドはＭＬＡ鎖のＮ−末端
（ＲＭＬＡ１、図１ｂ）から誘導できるため、対応の十
分に特異なオリゴヌクレオチドをＭＬＢ鎖のＮ−末端
（ＲＭＬＢ１、ＲＭＬＢ２、ＲＭＬＢ３、図１ｂ）から
構築することは不可能である。
【０１２２】したがって、関連のタンパク質のタンパク
質データを含ませることで、それまで知られていなかっ
たＭＬ配列領域から増幅オリゴヌクレオチドを誘導する
ことを可能にする他の戦略を展開せざるを得なかった。
Ｉ型およびＩＩ型のリボソーム不活性化タンパク質のア
ミノ酸配列分析を行ったところ、配列相同性の高い多数
の保存領域が認められた。図１ｃは、リシンの活性中心
についてのＩ型ＲＩＰとＩＩ型ＲＩＰとの共通度の高さ
を示す。配列モチーフＭＩＳＥＡＡＲＦ内で、Ｅ１７７
およびＲ１８０に関して、これらは酵素メカニズムに何
らかの役割を果たしていると論じられた（Ｋｉｍ ら、
１９９２； Ｌｏｒｄ ら、１９９４）。少なくともこ
れら２つの残基はＭＬ配列中に存在しているという結論
に達した。コドン利用の縮重度が低いものに特に注意を
払って個々の残基の存在に関してさらに構造面から熟考
したところ、増幅オリゴヌクレオチドＲＭＬＡ２の構築
が得られた。このオリゴヌクレオチドの配列を図１ｃに
示す。
質データを含ませることで、それまで知られていなかっ
たＭＬ配列領域から増幅オリゴヌクレオチドを誘導する
ことを可能にする他の戦略を展開せざるを得なかった。
Ｉ型およびＩＩ型のリボソーム不活性化タンパク質のア
ミノ酸配列分析を行ったところ、配列相同性の高い多数
の保存領域が認められた。図１ｃは、リシンの活性中心
についてのＩ型ＲＩＰとＩＩ型ＲＩＰとの共通度の高さ
を示す。配列モチーフＭＩＳＥＡＡＲＦ内で、Ｅ１７７
およびＲ１８０に関して、これらは酵素メカニズムに何
らかの役割を果たしていると論じられた（Ｋｉｍ ら、
１９９２； Ｌｏｒｄ ら、１９９４）。少なくともこ
れら２つの残基はＭＬ配列中に存在しているという結論
に達した。コドン利用の縮重度が低いものに特に注意を
払って個々の残基の存在に関してさらに構造面から熟考
したところ、増幅オリゴヌクレオチドＲＭＬＡ２の構築
が得られた。このオリゴヌクレオチドの配列を図１ｃに
示す。
【０１２３】（実施例２） （ＭＬ遺伝子特異ＤＮＡフラグメントの調製）Ｂａｕｒ
ら （１９９３）の方法に準じて、新鮮なＶｉｓｃｕ
ｍ ａｌｂｕｍ葉（宿主樹木Ｐｏｐｕｌｕｓ ｗｉｌｓ
ｏｎｉｉ）から高分子ゲノムＤＮＡを単離した。ＰＣＲ
によってＭＬ遺伝子特異ＤＮＡフラグメントを調製する
ために、各増幅反応に１００ｎｇのゲノムＤＮＡを使用
した。ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１．
５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．２５ｍＭ
ｄＮＴＰ、ｐＨ８．３）、プライマーＲＭＬＡ１を７
８ｐｍｏｌおよびＲＭＬＡ２を５０ｐｍｏｌ（反応２）
または１００ｐｍｏｌ（反応１）を含有する全容量５０
μｌで増幅を実施した。Ｂｉｏｍｅｔｒａサーモサイク
ラーにて、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍの
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１．５Ｕ／反応）を使用
してＰＣＲを実施した。ＰＣＲパラメーターは、９０℃
での変性１分、５０℃でのアニーリング１分、７２℃で
の延長１分を全部で３０サイクルとした。５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動および臭化エチジウム（ｅｔｈ
ｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）を用いた染色によって増
幅生成物を分析した（図２）。反応２において得られた
大きさ約５００ｂｐの特異増幅生成物をゲル溶出によっ
て単離し、ＴＡベクターでのクローニングに供した。
ら （１９９３）の方法に準じて、新鮮なＶｉｓｃｕ
ｍ ａｌｂｕｍ葉（宿主樹木Ｐｏｐｕｌｕｓ ｗｉｌｓ
ｏｎｉｉ）から高分子ゲノムＤＮＡを単離した。ＰＣＲ
によってＭＬ遺伝子特異ＤＮＡフラグメントを調製する
ために、各増幅反応に１００ｎｇのゲノムＤＮＡを使用
した。ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１．
５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．２５ｍＭ
ｄＮＴＰ、ｐＨ８．３）、プライマーＲＭＬＡ１を７
８ｐｍｏｌおよびＲＭＬＡ２を５０ｐｍｏｌ（反応２）
または１００ｐｍｏｌ（反応１）を含有する全容量５０
μｌで増幅を実施した。Ｂｉｏｍｅｔｒａサーモサイク
ラーにて、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍの
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１．５Ｕ／反応）を使用
してＰＣＲを実施した。ＰＣＲパラメーターは、９０℃
での変性１分、５０℃でのアニーリング１分、７２℃で
の延長１分を全部で３０サイクルとした。５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動および臭化エチジウム（ｅｔｈ
ｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）を用いた染色によって増
幅生成物を分析した（図２）。反応２において得られた
大きさ約５００ｂｐの特異増幅生成物をゲル溶出によっ
て単離し、ＴＡベクターでのクローニングに供した。
【０１２４】（実施例３） （クローニング方法）一次ＰＣＲに使用される増幅オリ
ゴヌクレオチドの誘導を実施例１（図１ａ）に示し、以
下、「ａ」と呼ぶＶｉｓｃｕｍ ａｌｂｕｍ ＭＬ遺伝
子の一次遺伝子フラグメントの調製を実施例２（図２）
に示す。クローン化した遺伝子フラグメント「ａ」配列
から開始して、ＭＬ遺伝子はイントロンを持たないとい
う仮定から、フラグメント「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」およ
び「ｅ」の増幅を可能にする配列特異５’オリゴヌクレ
オチドを誘導することが可能であった。「ｃ」の３’オ
リゴヌクレオチドも「ａ」のＤＮＡ配列から誘導された
が、Ｉ型（「ｂ」）およびＩＩ型（「ｄ」、「ｅ」、
「ｇ」）ＲＩＰタンパク質の均一領域を分析することに
よって、遺伝子フラグメント「ｂ」、「ｄ」、「ｅ」お
よび「ｇ」の増幅用の縮重３’プライマーを構成しなけ
ればならなかった。タンパク質ファミリー内での配列比
較を再度使用して、コドン使用の縮重度が低い残基に特
に注意を払って個々の残基の存在を推定した。特に、既
知のリシンおよびアブリンｃＤＮＡおよび誘導タンパク
質配列を使用して、約５０のＭＬ特異オリゴヌクレオチ
ドの組み合わせを構成した。図３は、特異増幅生成物と
してクローン化可能かつさらに分析可能な遺伝子フラグ
メントのみを示す。その他のオリゴヌクレオチドの組み
合わせから開始すると、ＭＬ特異増幅生成物を生成する
ことはできなかった。遺伝子フラグメント「ｆ」（ＭＬ
Ａ鎖をコードする）および「ｇ」（ＭＬＢ鎖をコードす
る）の調製については、それぞれ実施例５および６にお
いて詳細に説明する。
ゴヌクレオチドの誘導を実施例１（図１ａ）に示し、以
下、「ａ」と呼ぶＶｉｓｃｕｍ ａｌｂｕｍ ＭＬ遺伝
子の一次遺伝子フラグメントの調製を実施例２（図２）
に示す。クローン化した遺伝子フラグメント「ａ」配列
から開始して、ＭＬ遺伝子はイントロンを持たないとい
う仮定から、フラグメント「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」およ
び「ｅ」の増幅を可能にする配列特異５’オリゴヌクレ
オチドを誘導することが可能であった。「ｃ」の３’オ
リゴヌクレオチドも「ａ」のＤＮＡ配列から誘導された
が、Ｉ型（「ｂ」）およびＩＩ型（「ｄ」、「ｅ」、
「ｇ」）ＲＩＰタンパク質の均一領域を分析することに
よって、遺伝子フラグメント「ｂ」、「ｄ」、「ｅ」お
よび「ｇ」の増幅用の縮重３’プライマーを構成しなけ
ればならなかった。タンパク質ファミリー内での配列比
較を再度使用して、コドン使用の縮重度が低い残基に特
に注意を払って個々の残基の存在を推定した。特に、既
知のリシンおよびアブリンｃＤＮＡおよび誘導タンパク
質配列を使用して、約５０のＭＬ特異オリゴヌクレオチ
ドの組み合わせを構成した。図３は、特異増幅生成物と
してクローン化可能かつさらに分析可能な遺伝子フラグ
メントのみを示す。その他のオリゴヌクレオチドの組み
合わせから開始すると、ＭＬ特異増幅生成物を生成する
ことはできなかった。遺伝子フラグメント「ｆ」（ＭＬ
Ａ鎖をコードする）および「ｇ」（ＭＬＢ鎖をコードす
る）の調製については、それぞれ実施例５および６にお
いて詳細に説明する。
【０１２５】ＭＬ遺伝子の翻訳配列領域および非翻訳配
列領域の５’領域および３’領域を分析するために、
５’および３’ＲＡＣＥの条件（Ｆｒｏｈｍａｎ ら、
１９８８）を確立した。これは、フラグメント「ｈ」、
「ｉ」および「ｊ」の生成を引き起こすものである。し
たがって、ＲＡＣＥ−ＰＣＲによるフラグメント「ｊ」
の増幅は、完全なＭＬＢ遺伝子フラグメントの調製に代
わるものである。逆転写によってヤドリギ葉から単離さ
れたＶｉｓｃｕｍ ａｌｂｕｍ全ＲＮＡから調製された
ｃＤＮＡ（宿主樹木Ｐｏｐｕｌｕｓ ｗｉｌｓｏｎｉ
ｉ）を使用してＲＡＣＥ反応を実施した。
列領域の５’領域および３’領域を分析するために、
５’および３’ＲＡＣＥの条件（Ｆｒｏｈｍａｎ ら、
１９８８）を確立した。これは、フラグメント「ｈ」、
「ｉ」および「ｊ」の生成を引き起こすものである。し
たがって、ＲＡＣＥ−ＰＣＲによるフラグメント「ｊ」
の増幅は、完全なＭＬＢ遺伝子フラグメントの調製に代
わるものである。逆転写によってヤドリギ葉から単離さ
れたＶｉｓｃｕｍ ａｌｂｕｍ全ＲＮＡから調製された
ｃＤＮＡ（宿主樹木Ｐｏｐｕｌｕｓ ｗｉｌｓｏｎｉ
ｉ）を使用してＲＡＣＥ反応を実施した。
【０１２６】（実施例４） （ＤＮＡ配列および翻訳生成物ｒＭＬＡおよびｒＭＬ
Ｂ）様々なＭＬ特異オリゴヌクレオチドを使用して、
「プライマー歩行」方法（２つの鎖の完全に重複してい
る配列の検出）を利用する標準的な手順によって発現ベ
クターｐＴ７−ＭＬＡおよびｐＴ７−ＭＬＢの挿入断片
の配列を決定した（図４ａ、ｂ）。下線を付した配列領
域は、ｐＴ７発現ベクターへのクローニング用の制限部
位を示す。実施例５および６において説明するような発
現ベクターの構成スキームに基づいて、２つの遺伝子フ
ラグメントを修飾した。図４ｃは、上記のフラグメント
から誘導された完全なＭＬ遺伝子配列を示す。この配列
は、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ならびにエン
ドペプチドおよびシグナルペプチドコード領域を有す
る。
Ｂ）様々なＭＬ特異オリゴヌクレオチドを使用して、
「プライマー歩行」方法（２つの鎖の完全に重複してい
る配列の検出）を利用する標準的な手順によって発現ベ
クターｐＴ７−ＭＬＡおよびｐＴ７−ＭＬＢの挿入断片
の配列を決定した（図４ａ、ｂ）。下線を付した配列領
域は、ｐＴ７発現ベクターへのクローニング用の制限部
位を示す。実施例５および６において説明するような発
現ベクターの構成スキームに基づいて、２つの遺伝子フ
ラグメントを修飾した。図４ｃは、上記のフラグメント
から誘導された完全なＭＬ遺伝子配列を示す。この配列
は、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ならびにエン
ドペプチドおよびシグナルペプチドコード領域を有す
る。
【０１２７】（実施例５） （発現ベクターｐＴ７−ＭＬＡの構成）異種発現用に、
複合ゲノムヤドリギＤＮＡから開始して特異的ＰＣＲに
よってヤドリギレクチンＡ鎖をコードする配列を調製
し、末端修飾した。使用するプライマーオリゴヌクレオ
チドの非相補的領域を介して翻訳調節要素ならびに制限
エンドヌクレアーゼの認識配列を加え、これによってゲ
ノムプレプロヤドリギレクチンに基づくヤドリギレクチ
ンＡ鎖のクローニングおよび別個の発現を可能にした。
複合ゲノムヤドリギＤＮＡから開始して特異的ＰＣＲに
よってヤドリギレクチンＡ鎖をコードする配列を調製
し、末端修飾した。使用するプライマーオリゴヌクレオ
チドの非相補的領域を介して翻訳調節要素ならびに制限
エンドヌクレアーゼの認識配列を加え、これによってゲ
ノムプレプロヤドリギレクチンに基づくヤドリギレクチ
ンＡ鎖のクローニングおよび別個の発現を可能にした。
【０１２８】図５ｂは、ＰＣＲによるＭＬＡコード遺伝
子フラグメントの調製を示す。ＭＬＡコード遺伝子配列
を増幅するために、ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、それぞれ０．２５ｍＭの
ｄＮＴＰ、ｐＨ８．３）中のゲノムＶｉｓｃｕｍ ａｌ
ｂｕｍ ＤＮＡを２００ｎｇと、１．５ｍＭ（反応１）
または２．５ｍＭ（反応２）塩化マグネシウムと、プラ
イマーオリゴヌクレオチドＲＭＬ１６およびＲＭＬ１７
をそれぞれ４０ｐｍｏｌとを全容量５０μｌで使用し
た。９４℃で変性を１分、５２℃でアニーリングを１
分、７２℃で延長を１．５分の温度プロファイルを全部
で３０サイクルとして、Ｔａｑポリメラーゼ（１．５Ｕ
／反応、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を
使用してＰＣＲを実施した。１％アガロースゲル電気泳
動および臭化エチジウムを用いた染色によって増幅生成
物を分析し（図５ｂ）、ゲル溶出によってＴＡベクター
でのクローニングに供した。
子フラグメントの調製を示す。ＭＬＡコード遺伝子配列
を増幅するために、ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、それぞれ０．２５ｍＭの
ｄＮＴＰ、ｐＨ８．３）中のゲノムＶｉｓｃｕｍ ａｌ
ｂｕｍ ＤＮＡを２００ｎｇと、１．５ｍＭ（反応１）
または２．５ｍＭ（反応２）塩化マグネシウムと、プラ
イマーオリゴヌクレオチドＲＭＬ１６およびＲＭＬ１７
をそれぞれ４０ｐｍｏｌとを全容量５０μｌで使用し
た。９４℃で変性を１分、５２℃でアニーリングを１
分、７２℃で延長を１．５分の温度プロファイルを全部
で３０サイクルとして、Ｔａｑポリメラーゼ（１．５Ｕ
／反応、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を
使用してＰＣＲを実施した。１％アガロースゲル電気泳
動および臭化エチジウムを用いた染色によって増幅生成
物を分析し（図５ｂ）、ゲル溶出によってＴＡベクター
でのクローニングに供した。
【０１２９】２つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイ
ゼーションおよびクローニングならびに翻訳開始コドン
の追加によって、アミノ酸配列残基チロシン1−チロシ
ン17と対応するｒＭＬＡをコードする配列の５’領域
（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ら、１９９２； Ｇａｂｉｕｓ
ら、１９９２）を合成遺伝子フラグメントとして調製し
た。このように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに
おいて強く発現する遺伝子について説明されているよう
にコドンの選択に関して遺伝子配列を最適化した（Ｇｒ
ｉｂｓｋｏｖ ら、１９８４）。ＰＣＲによって得られ
る合成ｒＭＬＡ遺伝子フラグメントの３’末端ならびに
ｒＭＬＡ遺伝子フラグメントの５’末端において、ＴＡ
ＣからＴＡＴへのチロシン17コドンの特異的な交換によ
ってＳｓｐＩ制限部位を導入した。この制限部位によっ
て、ベクターｐＭＬ１４−１７を得ながら２つのｒＭＬ
Ａ遺伝子フラグメントを融合させることができた（図
５）。
ゼーションおよびクローニングならびに翻訳開始コドン
の追加によって、アミノ酸配列残基チロシン1−チロシ
ン17と対応するｒＭＬＡをコードする配列の５’領域
（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ら、１９９２； Ｇａｂｉｕｓ
ら、１９９２）を合成遺伝子フラグメントとして調製し
た。このように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに
おいて強く発現する遺伝子について説明されているよう
にコドンの選択に関して遺伝子配列を最適化した（Ｇｒ
ｉｂｓｋｏｖ ら、１９８４）。ＰＣＲによって得られ
る合成ｒＭＬＡ遺伝子フラグメントの３’末端ならびに
ｒＭＬＡ遺伝子フラグメントの５’末端において、ＴＡ
ＣからＴＡＴへのチロシン17コドンの特異的な交換によ
ってＳｓｐＩ制限部位を導入した。この制限部位によっ
て、ベクターｐＭＬ１４−１７を得ながら２つのｒＭＬ
Ａ遺伝子フラグメントを融合させることができた（図
５）。
【０１３０】ＤＮＡ配列決定（図４ａ）によってｒＭＬ
Ａをコードする完全生成配列を確認した。Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいてｒＭＬＡを発現させるた
めに、遺伝子配列をベクターｐＭＬ１４−１７から単離
し、発現ベクターＰＴ７−７に挿入することによってこ
れをＴ７−ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよび転写
ターミネーターの制御下においた。得られた発現ベクタ
ーｐＴ７−ＭＬＡ（図５）を使用して、Ｅ． ｃｏｌｉ
発現菌株ＢＬ２１を形質転換した。
Ａをコードする完全生成配列を確認した。Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいてｒＭＬＡを発現させるた
めに、遺伝子配列をベクターｐＭＬ１４−１７から単離
し、発現ベクターＰＴ７−７に挿入することによってこ
れをＴ７−ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよび転写
ターミネーターの制御下においた。得られた発現ベクタ
ーｐＴ７−ＭＬＡ（図５）を使用して、Ｅ． ｃｏｌｉ
発現菌株ＢＬ２１を形質転換した。
【０１３１】（実施例６） （発現ベクターｐＴ７−ＭＬＢの構築）ヤドリギレクチ
ンＢ鎖の異種発現のために、使用するプライマーオリゴ
ヌクレオチドの非相補的領域を介して翻訳調節要素なら
びに制限エンドヌクレアーゼの認識配列を導入して、特
異的ＰＣＲによって複合ゲノムＶｉｓｃｕｍ ａｌｂｕ
ｍ ＤＮＡからＭＬＢをコードする完全配列を増幅し
た。
ンＢ鎖の異種発現のために、使用するプライマーオリゴ
ヌクレオチドの非相補的領域を介して翻訳調節要素なら
びに制限エンドヌクレアーゼの認識配列を導入して、特
異的ＰＣＲによって複合ゲノムＶｉｓｃｕｍ ａｌｂｕ
ｍ ＤＮＡからＭＬＢをコードする完全配列を増幅し
た。
【０１３２】図６ｂは、ｒＭＬＢを完全にコードする全
遺伝子フラグメントのＰＣＲによる調製を示す。ＰＣＲ
緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣ
ｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、それぞれ０．２５ｍＭの
ｄＮＴＰ、ｐＨ８．３）およびゲノムＶｉｓｃｕｍ ａ
ｌｂｕｍ ＤＮＡを２００ｎｇ、プライマーオリゴヌク
レオチドＲＭＬ２５を５０ｐｍｏｌおよびプライマーオ
リゴヌクレオチドＲＭＬ２６を３０ｐｍｏｌ（反応１）
および１０ｐｍｏｌ（反応２）の全容量５０μｌでＰＣ
Ｒ反応物においてｒＭＬＢコードＤＮＡフラグメントの
増幅を実施した。９４℃で変性を１分、５２℃でアニー
リングを１分、７２℃で延長を１．５分を全部で３０サ
イクルとして、Ｔａｑポリメラーゼ（１．５Ｕ／反応、
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して
ＰＣＲを実施した。１％アガロースゲル電気泳動および
臭化エチジウムを用いた染色によってＰＣＲ生成物を分
析した。結果は０．８ｋｂｐのＰＣＲ生成物であり、こ
れをゲル溶出によって単離してＴＡベクターでのクロー
ニングに供した。このｒＭＬＢコード遺伝子フラグメン
トを、発現ベクターＰＴ７−７に挿入することによって
翻訳調節要素の制御下におき、得られた発現ベクターｐ
Ｔ７−ＭＬＢで発現菌株Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１を形
質転換した。ｒＭＬＢをコードするＰＣＲ生成完全配列
の完全性をＤＮＡ配列決定によって確認した（図４
ｂ）。
遺伝子フラグメントのＰＣＲによる調製を示す。ＰＣＲ
緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣ
ｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、それぞれ０．２５ｍＭの
ｄＮＴＰ、ｐＨ８．３）およびゲノムＶｉｓｃｕｍ ａ
ｌｂｕｍ ＤＮＡを２００ｎｇ、プライマーオリゴヌク
レオチドＲＭＬ２５を５０ｐｍｏｌおよびプライマーオ
リゴヌクレオチドＲＭＬ２６を３０ｐｍｏｌ（反応１）
および１０ｐｍｏｌ（反応２）の全容量５０μｌでＰＣ
Ｒ反応物においてｒＭＬＢコードＤＮＡフラグメントの
増幅を実施した。９４℃で変性を１分、５２℃でアニー
リングを１分、７２℃で延長を１．５分を全部で３０サ
イクルとして、Ｔａｑポリメラーゼ（１．５Ｕ／反応、
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して
ＰＣＲを実施した。１％アガロースゲル電気泳動および
臭化エチジウムを用いた染色によってＰＣＲ生成物を分
析した。結果は０．８ｋｂｐのＰＣＲ生成物であり、こ
れをゲル溶出によって単離してＴＡベクターでのクロー
ニングに供した。このｒＭＬＢコード遺伝子フラグメン
トを、発現ベクターＰＴ７−７に挿入することによって
翻訳調節要素の制御下におき、得られた発現ベクターｐ
Ｔ７−ＭＬＢで発現菌株Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１を形
質転換した。ｒＭＬＢをコードするＰＣＲ生成完全配列
の完全性をＤＮＡ配列決定によって確認した（図４
ｂ）。
【０１３３】（実施例７） （ｒＭＬＡおよびｒＭＬＢの発現、免疫学的分析、再生
およびインビトロでの再会合） （（Ｉ） Ｅ． ｃｏｌｉでのｒＭＬＡの発現）組換え
ヤドリギレクチンＡ鎖を発現させるために、定常成長さ
せたＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１／ｐＴ７−ＭＬＡのＬＢ
Amp前培養物５ｍｌと共にＬＢAmp培地１０００ｍｌを２
リットルの溝付組織培養フラスコに接種し、振盪しなが
ら３７℃で培養した。５７８ｎｍの比濁分析によって成
長を観察した。細胞密度が約ＯＤ 578０．９〜１．０に
達したら０．５ｍＭ ＩＰＴＧを加えて遺伝子発現を誘
導した。収穫するために、５，０００ｒｐｍの遠心分離
によって２０分間４℃でＧＳ−３ローター（Ｓｏｒｖａ
ｌｌ）にて誘導後に細胞を２時間沈降させ、培養液をデ
カントした。１リットルの培養容積から開始して、３〜
４ｇ（含水重量）の細胞塊を単離した。
およびインビトロでの再会合） （（Ｉ） Ｅ． ｃｏｌｉでのｒＭＬＡの発現）組換え
ヤドリギレクチンＡ鎖を発現させるために、定常成長さ
せたＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１／ｐＴ７−ＭＬＡのＬＢ
Amp前培養物５ｍｌと共にＬＢAmp培地１０００ｍｌを２
リットルの溝付組織培養フラスコに接種し、振盪しなが
ら３７℃で培養した。５７８ｎｍの比濁分析によって成
長を観察した。細胞密度が約ＯＤ 578０．９〜１．０に
達したら０．５ｍＭ ＩＰＴＧを加えて遺伝子発現を誘
導した。収穫するために、５，０００ｒｐｍの遠心分離
によって２０分間４℃でＧＳ−３ローター（Ｓｏｒｖａ
ｌｌ）にて誘導後に細胞を２時間沈降させ、培養液をデ
カントした。１リットルの培養容積から開始して、３〜
４ｇ（含水重量）の細胞塊を単離した。
【０１３４】Ｆｒｅｎｃｈ−Ｐｒｅｓｓ（ＳＭＬ Ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して細胞破壊を行った。細
胞沈降物を破壊緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ
ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ８．０）２０ｍｌに
再懸濁させ、そして二工程Ｆｒｅｎｃｈ−Ｐｒｅｓｓに
よって１，５００ｐｓｉで破壊した。続いて、１０，０
００ｒｐｍで３０分間、４℃でＳＳ−３４ローター（Ｓ
ｏｒｖａｌｌ）にて遠心分離を行って不溶性細胞画分お
よび考えられる「封入体」を沈降させ、そしてこれを上
清に残った可溶性Ｅ． ｃｏｌｉタンパク質または可溶
性発現生成物から分離した。
ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して細胞破壊を行った。細
胞沈降物を破壊緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ
ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ８．０）２０ｍｌに
再懸濁させ、そして二工程Ｆｒｅｎｃｈ−Ｐｒｅｓｓに
よって１，５００ｐｓｉで破壊した。続いて、１０，０
００ｒｐｍで３０分間、４℃でＳＳ−３４ローター（Ｓ
ｏｒｖａｌｌ）にて遠心分離を行って不溶性細胞画分お
よび考えられる「封入体」を沈降させ、そしてこれを上
清に残った可溶性Ｅ． ｃｏｌｉタンパク質または可溶
性発現生成物から分離した。
【０１３５】発現を分析するために、１２．５％ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマシーブリ
リアントブルーでの染色ならびにＭＬＡ特異抗血清ＴＡ
５を使用するウェスタンブロットによって等容量の細胞
破壊画分を試験した（図７ａ）。モノクローナル抗体Ｔ
Ａ５（Ｔｏｎｅｖｉｔｓｋｙ ら、１９９５）を著者か
ら入手した。本発明において使用する他の抗体と同様
に、これらの抗体もそれぞれの免疫原（ＴＡ５の場合に
は、ＭＬ−１またはＭＬＡ）を使用する標準的な技術に
よって調製され得る。発現を検出するために、Ｅ． ｃ
ｏｌｉ破壊物の等容量の可溶性画分（レーン２、４、
６、８）ならびに不溶性「封入体」画分（レーン１、
３、５、７）をｒＭＬＡ含有量について試験した。発現
経過を示すために、遺伝子発現の誘導前（レーン１およ
び２）、２時間後（レーン３および４）、４時間後（レ
ーン５および６）および６時間後（レーン７および８）
を使用した。発現は、ｒＭＬＡに対応する免疫反応性の
２５ｋＤａの発現生成物の発生によって誘導１時間後に
すでに特徴付けされており、その最大発現は誘導２時間
後に達成されている。誘導２時間後の可溶性および不溶
性の細胞破壊画分にわたるｒＭＬＡの分布はそれぞれ約
５０％であり、発現期間が長くなると不溶性「封入体」
の形成量が増加する。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマシーブリ
リアントブルーでの染色ならびにＭＬＡ特異抗血清ＴＡ
５を使用するウェスタンブロットによって等容量の細胞
破壊画分を試験した（図７ａ）。モノクローナル抗体Ｔ
Ａ５（Ｔｏｎｅｖｉｔｓｋｙ ら、１９９５）を著者か
ら入手した。本発明において使用する他の抗体と同様
に、これらの抗体もそれぞれの免疫原（ＴＡ５の場合に
は、ＭＬ−１またはＭＬＡ）を使用する標準的な技術に
よって調製され得る。発現を検出するために、Ｅ． ｃ
ｏｌｉ破壊物の等容量の可溶性画分（レーン２、４、
６、８）ならびに不溶性「封入体」画分（レーン１、
３、５、７）をｒＭＬＡ含有量について試験した。発現
経過を示すために、遺伝子発現の誘導前（レーン１およ
び２）、２時間後（レーン３および４）、４時間後（レ
ーン５および６）および６時間後（レーン７および８）
を使用した。発現は、ｒＭＬＡに対応する免疫反応性の
２５ｋＤａの発現生成物の発生によって誘導１時間後に
すでに特徴付けされており、その最大発現は誘導２時間
後に達成されている。誘導２時間後の可溶性および不溶
性の細胞破壊画分にわたるｒＭＬＡの分布はそれぞれ約
５０％であり、発現期間が長くなると不溶性「封入体」
の形成量が増加する。
【０１３６】（（ＩＩ） 不溶性「封入体」からのｒＭ
ＬＡの単離）Ｂａｂｉｔｔ ら （１９９０）に従っ
て、Ｅ． ｃｏｌｉ完全細胞破壊物の沈降物を、それぞ
れＳＴＥＴ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８％
（ｗ／ｖ）スクロース、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１．５％
（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ７．４）２
０ｍｌで２回洗浄し、Ｅ． ｃｏｌｉタンパク質を除去
した。「封入体」を含有する残りの沈降物を、室温にて
１６時間、一定攪拌下でインキュベートすることによっ
て変性緩衝液（６Ｍ塩化グアニジニウム（ｇｕａｎｉｄ
ｉｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ）、１００ｍＭ ＤＴＴ、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）２０ｍｌに
溶解した。
ＬＡの単離）Ｂａｂｉｔｔ ら （１９９０）に従っ
て、Ｅ． ｃｏｌｉ完全細胞破壊物の沈降物を、それぞ
れＳＴＥＴ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８％
（ｗ／ｖ）スクロース、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１．５％
（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ７．４）２
０ｍｌで２回洗浄し、Ｅ． ｃｏｌｉタンパク質を除去
した。「封入体」を含有する残りの沈降物を、室温にて
１６時間、一定攪拌下でインキュベートすることによっ
て変性緩衝液（６Ｍ塩化グアニジニウム（ｇｕａｎｉｄ
ｉｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ）、１００ｍＭ ＤＴＴ、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）２０ｍｌに
溶解した。
【０１３７】ｒＭＬＡを再生するために、変性緩衝液中
に存在するタンパク質溶液を、９０倍容量の折り畳み緩
衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）にゆっくりと滴下して
加え、そして攪拌しながら室温にて１６時間インキュベ
ートした。ＧＳ−３ローター（Ｓｏｒｖａｌｌ）におい
て６，０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心分離するこ
とによって、沈殿したタンパク質を分離した。ｒＭＬＡ
含有上清を、保存のために２０％（ｖ／ｖ）グリセロー
ルに調整し、４℃で保存した。
に存在するタンパク質溶液を、９０倍容量の折り畳み緩
衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）にゆっくりと滴下して
加え、そして攪拌しながら室温にて１６時間インキュベ
ートした。ＧＳ−３ローター（Ｓｏｒｖａｌｌ）におい
て６，０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心分離するこ
とによって、沈殿したタンパク質を分離した。ｒＭＬＡ
含有上清を、保存のために２０％（ｖ／ｖ）グリセロー
ルに調整し、４℃で保存した。
【０１３８】（（ＩＩＩ） イムノアフィニティークロ
マトグラフィーによるｒＭＬＡの精製）イムノアフィニ
ティークロマトグラフィーによるｒＭＬＡ（可溶性発現
生成物画分または再折り畳みタンパク質）の一工程精製
のために、Ｈａｒｌｏｗ および Ｓｐｕｒ （１９８
８）の方法に従って、ヤドリギレクチンＡ鎖に対して方
向付けられたモノクローナル抗体抗ｎＭＬＡ−ＩｇＧ
（ＴＡ５， Ｔｏｎｅｖｉｔｓｋｙ ら、１９９５）２
６０μｇを、プロテインＡセファロースＣＬ４Ｂ（Ｓｉ
ｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）上に共有結合的に
固定した。イムノアフィニティーマトリックスをｒＭＬ
Ａ試料とともにインキュベートし、このマトリックスを
１０カラム床容量（ｃｏｌｕｍｎ ｂｅｄ ｖｏｌｕｍ
ｅ）の洗浄緩衝液１（１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸
緩衝液、ｐＨ７．０）および１０カラム床容量の洗浄緩
衝液２（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）で洗浄し
て非特異的に結合したタンパク質を除去した後、特異的
に結合したｒＭＬＡを、溶出緩衝液（０．１Ｍグリシ
ン、ｐＨ２．５）で溶出した。溶出を行ってｐＨ８．０
の１Ｍリン酸緩衝液を含む容器中でｐＨを再調整した。
マトグラフィーによるｒＭＬＡの精製）イムノアフィニ
ティークロマトグラフィーによるｒＭＬＡ（可溶性発現
生成物画分または再折り畳みタンパク質）の一工程精製
のために、Ｈａｒｌｏｗ および Ｓｐｕｒ （１９８
８）の方法に従って、ヤドリギレクチンＡ鎖に対して方
向付けられたモノクローナル抗体抗ｎＭＬＡ−ＩｇＧ
（ＴＡ５， Ｔｏｎｅｖｉｔｓｋｙ ら、１９９５）２
６０μｇを、プロテインＡセファロースＣＬ４Ｂ（Ｓｉ
ｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）上に共有結合的に
固定した。イムノアフィニティーマトリックスをｒＭＬ
Ａ試料とともにインキュベートし、このマトリックスを
１０カラム床容量（ｃｏｌｕｍｎ ｂｅｄ ｖｏｌｕｍ
ｅ）の洗浄緩衝液１（１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸
緩衝液、ｐＨ７．０）および１０カラム床容量の洗浄緩
衝液２（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）で洗浄し
て非特異的に結合したタンパク質を除去した後、特異的
に結合したｒＭＬＡを、溶出緩衝液（０．１Ｍグリシ
ン、ｐＨ２．５）で溶出した。溶出を行ってｐＨ８．０
の１Ｍリン酸緩衝液を含む容器中でｐＨを再調整した。
【０１３９】（（ＩＶ） Ｅ． ｃｏｌｉでのｒＭＬＢ
の発現）組換えヤドリギレクチンＢ鎖を発現させるため
に、定常増殖させたＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１／ｐＴ７
−ＭＬＢのＬＢAmp前培養物５ｍｌと共にＬＢAmp培地１
０００ｍｌを２Ｌの溝付組織培養フラスコに接種し、そ
して振盪下で３７℃にて培養した。５７８ｎｍの比濁分
析によって増殖を観察した。細胞密度ＯＤ578が約０．
９〜１．０に達したときに、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを加
えて遺伝子発現を誘導した。回収するために、誘導４時
間後、ＧＳ−３ローター（Ｓｏｒｖａｌｌ）における
５，０００ｒｐｍで２０分間４℃にての遠心分離によっ
て細胞を沈降させ、そして培養培地をデカントした。
の発現）組換えヤドリギレクチンＢ鎖を発現させるため
に、定常増殖させたＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１／ｐＴ７
−ＭＬＢのＬＢAmp前培養物５ｍｌと共にＬＢAmp培地１
０００ｍｌを２Ｌの溝付組織培養フラスコに接種し、そ
して振盪下で３７℃にて培養した。５７８ｎｍの比濁分
析によって増殖を観察した。細胞密度ＯＤ578が約０．
９〜１．０に達したときに、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを加
えて遺伝子発現を誘導した。回収するために、誘導４時
間後、ＧＳ−３ローター（Ｓｏｒｖａｌｌ）における
５，０００ｒｐｍで２０分間４℃にての遠心分離によっ
て細胞を沈降させ、そして培養培地をデカントした。
【０１４０】Ｆｒｅｎｃｈ−ＰｒｅｓｓTM（ＳＬＭ Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して細胞を破壊した。細
胞沈降物を、破壊緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸緩衝液、５
０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳ
Ｆ、ｐＨ７．２）２０ｍｌに再懸濁し、そして２回のＦ
ｒｅｎｃｈ−Ｐｒｅｓｓ工程によって１，５００ｐｓｉ
で破壊した。続いて、ＳＳ−３４ローター（Ｓｏｒｖａ
ｌｌ）において１０，０００ｒｐｍで３０分間、４℃で
遠心分離を行うことによって不溶性細胞画分および考え
られる「封入体」を沈降させ、そしてこれを上清に残る
可溶性Ｅ． ｃｏｌｉタンパク質または可溶性発現生成
物から分離した。
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して細胞を破壊した。細
胞沈降物を、破壊緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸緩衝液、５
０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳ
Ｆ、ｐＨ７．２）２０ｍｌに再懸濁し、そして２回のＦ
ｒｅｎｃｈ−Ｐｒｅｓｓ工程によって１，５００ｐｓｉ
で破壊した。続いて、ＳＳ−３４ローター（Ｓｏｒｖａ
ｌｌ）において１０，０００ｒｐｍで３０分間、４℃で
遠心分離を行うことによって不溶性細胞画分および考え
られる「封入体」を沈降させ、そしてこれを上清に残る
可溶性Ｅ． ｃｏｌｉタンパク質または可溶性発現生成
物から分離した。
【０１４１】発現を分析するために、１２．５％ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびクーマシーブ
リリアントブルーでの染色、ならびにＭＬＢ特異的抗血
清ＴＢ３３を使用するウェスタンブロットによって、等
容量の細胞破壊画分を試験した（図７ｂ）。モノクロー
ナル抗体ＴＢ３３（Ｔｏｎｅｖｉｔｓｋｙ ら、１９９
５）を著者から入手した。この抗体は標準的な技術によ
って調製された。対応する抗体は、ＭＬ−１またはＭＬ
Ｂを免疫原として使用する標準的な技術によって、当業
者により調製され得る。発現を分析するために、Ｅ．
ｃｏｌｉの等容量の可溶性画分（レーン２、４、６、
８）および不溶性「封入体」画分（レーン１、３、５、
７）をｒＭＬＢ含有量について試験した。発現経過を示
すために、遺伝子発現の誘導前（レーン１および２）、
２時間後（レーン３および４）、４時間後（レーン５お
よび６）および６時間後（レーン７および８）の試料を
使用した。発現は、ｒＭＬＢに対応する免疫反応性の３
１ｋＤａ発現生成物の出現によって誘導１時間後にすで
に特徴付けられており、その最大発現は誘導４時間後に
達成される。誘導４時間後の可溶性および不溶性の細胞
破壊画分にわたるｒＭＬＢの分布はそれぞれ約５０％で
あり、より長い発現期間は不溶性「封入体」の形態での
発現ｒＭＬＢの蓄積が生じる。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびクーマシーブ
リリアントブルーでの染色、ならびにＭＬＢ特異的抗血
清ＴＢ３３を使用するウェスタンブロットによって、等
容量の細胞破壊画分を試験した（図７ｂ）。モノクロー
ナル抗体ＴＢ３３（Ｔｏｎｅｖｉｔｓｋｙ ら、１９９
５）を著者から入手した。この抗体は標準的な技術によ
って調製された。対応する抗体は、ＭＬ−１またはＭＬ
Ｂを免疫原として使用する標準的な技術によって、当業
者により調製され得る。発現を分析するために、Ｅ．
ｃｏｌｉの等容量の可溶性画分（レーン２、４、６、
８）および不溶性「封入体」画分（レーン１、３、５、
７）をｒＭＬＢ含有量について試験した。発現経過を示
すために、遺伝子発現の誘導前（レーン１および２）、
２時間後（レーン３および４）、４時間後（レーン５お
よび６）および６時間後（レーン７および８）の試料を
使用した。発現は、ｒＭＬＢに対応する免疫反応性の３
１ｋＤａ発現生成物の出現によって誘導１時間後にすで
に特徴付けられており、その最大発現は誘導４時間後に
達成される。誘導４時間後の可溶性および不溶性の細胞
破壊画分にわたるｒＭＬＢの分布はそれぞれ約５０％で
あり、より長い発現期間は不溶性「封入体」の形態での
発現ｒＭＬＢの蓄積が生じる。
【０１４２】（（Ｖ） 不溶性「封入体」からのｒＭＬ
Ｂの単離）Ｂａｂｉｔｔ ら （１９９０）に従って、
Ｅ． ｃｏｌｉ完全細胞破壊物の沈降物を、それぞれＳ
ＴＥＴ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８％（ｗ
／ｖ）スクロース、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１．５％（ｖ
／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ７．４）２０
ｍｌで２回洗浄し、Ｅ． ｃｏｌｉタンパク質を除去し
た。「封入体」を含有する残りの沈降物を、室温にて１
６時間、振盪させながらインキュベートすることによっ
て変性緩衝液（６Ｍ塩化グアニジニウム、１００ｍＭ
ＤＴＴ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）２
０ｍｌに溶解した。
Ｂの単離）Ｂａｂｉｔｔ ら （１９９０）に従って、
Ｅ． ｃｏｌｉ完全細胞破壊物の沈降物を、それぞれＳ
ＴＥＴ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８％（ｗ
／ｖ）スクロース、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１．５％（ｖ
／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ７．４）２０
ｍｌで２回洗浄し、Ｅ． ｃｏｌｉタンパク質を除去し
た。「封入体」を含有する残りの沈降物を、室温にて１
６時間、振盪させながらインキュベートすることによっ
て変性緩衝液（６Ｍ塩化グアニジニウム、１００ｍＭ
ＤＴＴ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）２
０ｍｌに溶解した。
【０１４３】ｒＭＬＡＢを再生するために、変性緩衝液
中に存在するタンパク質溶液を、９０倍容量の折り畳み
緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液、５０ｍＭ ＫＣｌ、１
ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭグルコース、１０％（ｖ／
ｖ）グリセロール、１０ｍＭβ−ラクトース、ｐＨ５．
５）にゆっくりと滴下して加え、攪拌しながら室温にて
１６時間インキュベートした。ＧＳ−３ローター（Ｓｏ
ｒｖａｌｌ）において６，０００ｒｐｍで３０分間、４
℃で遠心分離することによって、沈殿したタンパク質を
可溶性折り畳みｒＭＬＧ画分から分離した。
中に存在するタンパク質溶液を、９０倍容量の折り畳み
緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液、５０ｍＭ ＫＣｌ、１
ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭグルコース、１０％（ｖ／
ｖ）グリセロール、１０ｍＭβ−ラクトース、ｐＨ５．
５）にゆっくりと滴下して加え、攪拌しながら室温にて
１６時間インキュベートした。ＧＳ−３ローター（Ｓｏ
ｒｖａｌｌ）において６，０００ｒｐｍで３０分間、４
℃で遠心分離することによって、沈殿したタンパク質を
可溶性折り畳みｒＭＬＧ画分から分離した。
【０１４４】（（ＶＩ） Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクト
サミンアガロースでのアフィニティークロマトグラフィ
ーによるｒＭＬＢの単離）活性な炭水化物結合ｒＭＬＢ
を単離するために、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンアガ
ロースアフィニティーマトリックス（ＰＩＥＲＣＥ，
ＵＳＡ）を、１０カラム床容量のクロマトグラフィー緩
衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液、３００ｍＭＮａＣｌ、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．
０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎョ−２０、ｐＨ７．０）で
平衡化した。ｒＭＬＢ含有試料溶液中で少なくとも２時
間４℃でアフィニティーマトリックスをバッチインキュ
ベートすることによって、試料の適用を実施した。クロ
マトグラフィー緩衝液でアフィニティーマトリックスを
洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去した後、
ｐＨ４．０のクロマトグラフィー緩衝液中で０．３Ｍ
Ｎ−アセチル−ガラクトサミンとの競合的置換によって
結合ｒＭＬＢを溶出させた。
サミンアガロースでのアフィニティークロマトグラフィ
ーによるｒＭＬＢの単離）活性な炭水化物結合ｒＭＬＢ
を単離するために、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンアガ
ロースアフィニティーマトリックス（ＰＩＥＲＣＥ，
ＵＳＡ）を、１０カラム床容量のクロマトグラフィー緩
衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液、３００ｍＭＮａＣｌ、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．
０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎョ−２０、ｐＨ７．０）で
平衡化した。ｒＭＬＢ含有試料溶液中で少なくとも２時
間４℃でアフィニティーマトリックスをバッチインキュ
ベートすることによって、試料の適用を実施した。クロ
マトグラフィー緩衝液でアフィニティーマトリックスを
洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去した後、
ｐＨ４．０のクロマトグラフィー緩衝液中で０．３Ｍ
Ｎ−アセチル−ガラクトサミンとの競合的置換によって
結合ｒＭＬＢを溶出させた。
【０１４５】（（ＶＩＩ） ホロタンパク質を調製する
ためのインビトロでのヤドリギレクチン鎖の再会合）組
換えヤドリギレクチンホロタンパク質（ｒＭＬ）は、単
離した折り畳みヤドリギレクチンＡおよびヤドリギレク
チンＢ鎖から開始するか、あるいは変性ヤドリギレクチ
ン鎖（共折り畳みによって再生された）から開始して調
製し得る。
ためのインビトロでのヤドリギレクチン鎖の再会合）組
換えヤドリギレクチンホロタンパク質（ｒＭＬ）は、単
離した折り畳みヤドリギレクチンＡおよびヤドリギレク
チンＢ鎖から開始するか、あるいは変性ヤドリギレクチ
ン鎖（共折り畳みによって再生された）から開始して調
製し得る。
【０１４６】単離した折り畳み一本鎖を再会合するため
に、単離したヤドリギレクチンＢ鎖（ｎＭＬＢまたはｒ
ＭＬＢ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液、５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．２中で４℃で１６〜４
８時間、モル過剰のｒＭＬＡとともにインキュベートし
た。鎖間ジスルフィド架橋を形成させるために、６ｍＭ
グルタチオン（還元型対酸化型の比５：１）または１０
ｍＭグルタチオン（還元型対酸化型の比２：１）＋１μ
Ｍタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のレドックス系の存在下
で反応物をインキュベートした。
に、単離したヤドリギレクチンＢ鎖（ｎＭＬＢまたはｒ
ＭＬＢ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液、５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．２中で４℃で１６〜４
８時間、モル過剰のｒＭＬＡとともにインキュベートし
た。鎖間ジスルフィド架橋を形成させるために、６ｍＭ
グルタチオン（還元型対酸化型の比５：１）または１０
ｍＭグルタチオン（還元型対酸化型の比２：１）＋１μ
Ｍタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のレドックス系の存在下
で反応物をインキュベートした。
【０１４７】共折り畳みにより変性一本鎖から開始する
再会合のために、ｒＭＬＡ鎖を、６Ｍ塩化グアニジニウ
ム、２ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．０に濃度２ｍｇ／ｍｌまで溶解した。システイン
残基を完全に還元するために、ｒＭＬＢ鎖を、６Ｍ塩化
グアニジニウム、１００ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に溶解し、室温で２０分間の
インキュベーションの後、ＰＤ−１０（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ， Ｓｗｅｄｅｎ）でのゲル浸透によって６Ｍ塩化
グアニジニウム、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
８．０で再び緩衝化し、そして濃度２００μｇ／ｍｌに
調整した。カップリング緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１
０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１００ｍＭグルコース、
２０ｍＭラクトース、ｐＨ８．０）中でグアニジウム溶
液を１：３０までゆっくりと希釈し、そして４℃で１６
時間インキュベートすることにより、ｒＭＢＬをモル過
剰のｒＭＬＡと共折り畳みすることによって再会合を実
施した。鎖間ジスルフィド架橋を形成させるために、２
ｍＭグルタチオン（還元型対酸化型の比１：１）のレド
ックス系の存在下で反応物をインキュベートした。
再会合のために、ｒＭＬＡ鎖を、６Ｍ塩化グアニジニウ
ム、２ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．０に濃度２ｍｇ／ｍｌまで溶解した。システイン
残基を完全に還元するために、ｒＭＬＢ鎖を、６Ｍ塩化
グアニジニウム、１００ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に溶解し、室温で２０分間の
インキュベーションの後、ＰＤ−１０（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ， Ｓｗｅｄｅｎ）でのゲル浸透によって６Ｍ塩化
グアニジニウム、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
８．０で再び緩衝化し、そして濃度２００μｇ／ｍｌに
調整した。カップリング緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１
０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１００ｍＭグルコース、
２０ｍＭラクトース、ｐＨ８．０）中でグアニジウム溶
液を１：３０までゆっくりと希釈し、そして４℃で１６
時間インキュベートすることにより、ｒＭＢＬをモル過
剰のｒＭＬＡと共折り畳みすることによって再会合を実
施した。鎖間ジスルフィド架橋を形成させるために、２
ｍＭグルタチオン（還元型対酸化型の比１：１）のレド
ックス系の存在下で反応物をインキュベートした。
【０１４８】カップリング反応物を、保存緩衝液（５０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、３００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、
０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎョ−２０、ｐＨ８．
０）に対して透析した。非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥおよびこれに続くヤドリギレクチンＡ鎖またはヤド
リギレクチンＢ鎖に対する特異的モノクローナル抗体
（ＴＡ５またはＴＢ３３）を使用するウェスタンブロッ
ト分析によって、形成されたヘテロダイマーのアッセイ
および同定を実施した。（ＶＩ）において説明したよう
に、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンセファロースまたは
ラクトシルアガロースでのアフィニティークロマトグラ
フィーによって、形成されたホロタンパク質の単離、ま
たは遊離ｒＭＬＡまたはｒＭＬＡ凝集体の分離を実施し
た。
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、３００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、
０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎョ−２０、ｐＨ８．
０）に対して透析した。非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥおよびこれに続くヤドリギレクチンＡ鎖またはヤド
リギレクチンＢ鎖に対する特異的モノクローナル抗体
（ＴＡ５またはＴＢ３３）を使用するウェスタンブロッ
ト分析によって、形成されたヘテロダイマーのアッセイ
および同定を実施した。（ＶＩ）において説明したよう
に、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンセファロースまたは
ラクトシルアガロースでのアフィニティークロマトグラ
フィーによって、形成されたホロタンパク質の単離、ま
たは遊離ｒＭＬＡまたはｒＭＬＡ凝集体の分離を実施し
た。
【０１４９】（実施例８） （ｒＭＬＡおよびｒＭＬＢの等電同質性）ｒＭＬＡ、天
然に存在するＭＬＡ、ｒＭＬＢ、天然に存在するＭＬＢ
またはＭＬホロタンパク質１〜２μｇを、ＩＥＦタンパ
ク質標準（ＢｉｏＲａｄ， ＵＳＡ）と一緒に、Ｓｅｒ
ｖａｌｙｔ ＰｒｅＮｅｔｓ ＩＥＦゲル（ｐＨ ３〜
１０、１２５×１２５ｍｍ、１５０μｍ、Ｓｅｒｖａ
Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）上の一点に置いた（ｆｏｃｕ
ｓ）。分析のために、これらのタンパク質を、ニトロセ
ルロースメンブラン（０．２μｍ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄａｓｓｅｌ）上での半乾
燥エレクトロブロッティングによって固定した。ｒＭＬ
ＡおよびｎＭＬＡについてはモノクローナルＭＬＡ特異
抗体（ＴＡ５、Ｔｏｎｅｖｉｔｓｋｙ ら、１９９５）
を使用し、あるいはｒＭＬＢ、ｎＭＬＢおよびＭＬホロ
タンパク質についてはモノクローナルＭＬＢ特異抗体
（ＴＢ３３、Ｔｏｎｅｖｉｔｓｋｙ ら、１９９５）を
使用して、免疫染色を実施した。アルカリホスファター
ゼと結合した抗マウスＩｇＧ−ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，
Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）を使用し、基質であるＮＢＴ
およびＢＣＩＰを反応させて免疫複合体を染色した（図
８）。
然に存在するＭＬＡ、ｒＭＬＢ、天然に存在するＭＬＢ
またはＭＬホロタンパク質１〜２μｇを、ＩＥＦタンパ
ク質標準（ＢｉｏＲａｄ， ＵＳＡ）と一緒に、Ｓｅｒ
ｖａｌｙｔ ＰｒｅＮｅｔｓ ＩＥＦゲル（ｐＨ ３〜
１０、１２５×１２５ｍｍ、１５０μｍ、Ｓｅｒｖａ
Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）上の一点に置いた（ｆｏｃｕ
ｓ）。分析のために、これらのタンパク質を、ニトロセ
ルロースメンブラン（０．２μｍ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄａｓｓｅｌ）上での半乾
燥エレクトロブロッティングによって固定した。ｒＭＬ
ＡおよびｎＭＬＡについてはモノクローナルＭＬＡ特異
抗体（ＴＡ５、Ｔｏｎｅｖｉｔｓｋｙ ら、１９９５）
を使用し、あるいはｒＭＬＢ、ｎＭＬＢおよびＭＬホロ
タンパク質についてはモノクローナルＭＬＢ特異抗体
（ＴＢ３３、Ｔｏｎｅｖｉｔｓｋｙ ら、１９９５）を
使用して、免疫染色を実施した。アルカリホスファター
ゼと結合した抗マウスＩｇＧ−ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，
Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）を使用し、基質であるＮＢＴ
およびＢＣＩＰを反応させて免疫複合体を染色した（図
８）。
【０１５０】高純度の植物性ヤドリギレクチンＡ鎖およ
び高純度のヤドリギレクチンＢ鎖は、ｎＭＬＡの等電点
が５．２：５．４：５．５：６．２で、ｎＭＬＢの等電
点が７．１：７．３である等電的に非同質なタンパク質
である一方、等電点６．８を有する組換えｒＭＬＡ鎖お
よび等電点５．１を有する組換えｒＭＬＢ鎖は、均一な
タンパク質である（図８）。このため、天然に存在する
ＭＬホロタンパク質については多数の異質な分子変異体
が存在する（図８下）一方、組換えヤドリギレクチンタ
ンパク質の均一な移動度から、ｒＭＬの同質性および植
物性ヤドリギレクチンの微小異質性が明らかになる。
び高純度のヤドリギレクチンＢ鎖は、ｎＭＬＡの等電点
が５．２：５．４：５．５：６．２で、ｎＭＬＢの等電
点が７．１：７．３である等電的に非同質なタンパク質
である一方、等電点６．８を有する組換えｒＭＬＡ鎖お
よび等電点５．１を有する組換えｒＭＬＢ鎖は、均一な
タンパク質である（図８）。このため、天然に存在する
ＭＬホロタンパク質については多数の異質な分子変異体
が存在する（図８下）一方、組換えヤドリギレクチンタ
ンパク質の均一な移動度から、ｒＭＬの同質性および植
物性ヤドリギレクチンの微小異質性が明らかになる。
【０１５１】（実施例９） （ｒＭＬＡの酵素的なリボソーム不活化活性の検出）イ
ムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製さ
れたｒＭＬＡ（再折り畳み）およびｒＭＬＡ（可溶）の
タンパク質濃度ならびに天然に存在するＭＬＡ鎖（ｎＭ
ＬＡ）のタンパク質濃度を、ＢＳＡ標準を使用してＢｒ
ａｄｆｏｒｄ（１９７６）に従って測定した。
ムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製さ
れたｒＭＬＡ（再折り畳み）およびｒＭＬＡ（可溶）の
タンパク質濃度ならびに天然に存在するＭＬＡ鎖（ｎＭ
ＬＡ）のタンパク質濃度を、ＢＳＡ標準を使用してＢｒ
ａｄｆｏｒｄ（１９７６）に従って測定した。
【０１５２】ＭＬＡの酵素的ｒＲＮＡ−Ｎ−グリコシダ
ーゼ活性の検出および定量のために、「ＴＮＴ結合網状
赤血球系」（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ）を使用して非
放射活性試験系を確立した。反応ごとに、等量（２０μ
ｌ）のＴＮＴ系を、３０℃にて１５分間プレインキュベ
ートした。翻訳阻害の定量化のために、対応の緩衝液２
０μｌをコントロール反応物に添加し、そしてグラジエ
ントＭＬＡ希釈物２μｌ（濃度範囲３５０〜０ｐＭ）を
試験反応物に添加した。各反応から、８分間の間隔で２
つの試料を採取し、そして液体窒素中で凍結して反応を
停止させた。翻訳活性の尺度として、生物発光試験にお
いて、シンチレーションカウンターによって相対ルシフ
ェラーゼ量（ｃｐｍの平方根）を測定した。各反応につ
いて、異なる時点に採取された試料の測定されたｃｐｍ
の平方根の差を相対翻訳活性の尺度として決定した。Ｒ
ＩＰを含まないコントロール反応物の活性を、０％不活
化率（ＩＡＲ）に設定した。
ーゼ活性の検出および定量のために、「ＴＮＴ結合網状
赤血球系」（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ）を使用して非
放射活性試験系を確立した。反応ごとに、等量（２０μ
ｌ）のＴＮＴ系を、３０℃にて１５分間プレインキュベ
ートした。翻訳阻害の定量化のために、対応の緩衝液２
０μｌをコントロール反応物に添加し、そしてグラジエ
ントＭＬＡ希釈物２μｌ（濃度範囲３５０〜０ｐＭ）を
試験反応物に添加した。各反応から、８分間の間隔で２
つの試料を採取し、そして液体窒素中で凍結して反応を
停止させた。翻訳活性の尺度として、生物発光試験にお
いて、シンチレーションカウンターによって相対ルシフ
ェラーゼ量（ｃｐｍの平方根）を測定した。各反応につ
いて、異なる時点に採取された試料の測定されたｃｐｍ
の平方根の差を相対翻訳活性の尺度として決定した。Ｒ
ＩＰを含まないコントロール反応物の活性を、０％不活
化率（ＩＡＲ）に設定した。
【０１５３】使用したｒＭＬＡ濃度に対して相対翻訳不
活化率を適用して、非線形回帰によってコントロール反
応物と比較した場合に翻訳活性の５０％阻害を生じるタ
ンパク質濃度を決定した。このＩＣ50値は、系に依存す
る値であり、これは、ｒＭＬＡ（可溶）、ｒＭＬＡ（再
折り畳み）およびｎＭＬＡの酵素活性の検出および定量
を可能にする（図９）。
活化率を適用して、非線形回帰によってコントロール反
応物と比較した場合に翻訳活性の５０％阻害を生じるタ
ンパク質濃度を決定した。このＩＣ50値は、系に依存す
る値であり、これは、ｒＭＬＡ（可溶）、ｒＭＬＡ（再
折り畳み）およびｎＭＬＡの酵素活性の検出および定量
を可能にする（図９）。
【０１５４】図９は、組換えＭＬＡ鎖の酵素的リボソー
ム不活化活性の検出を示す。可溶性発現生成物内容を単
離すること（可溶ｒＭＬＡ）、および「封入体」から単
離されたタンパク質を再び折り畳むこと（再折り畳みｒ
ＭＬＡ）によって、酵素的に活性な発現生成物を入手し
得る。ｒＭＬＡ（可溶）およびｒＭＬＡ（再折り畳み）
は、ＩＣ50値が１０．７±１．３ｐＭまたは１５．６±
６．６ｐＭである対応の活性を示す。従って、これら
は、天然に存在するＭＬＡ鎖（ＩＣ50１．１±０．７ｐ
Ｍ）よりも低い毒性活性を示す。
ム不活化活性の検出を示す。可溶性発現生成物内容を単
離すること（可溶ｒＭＬＡ）、および「封入体」から単
離されたタンパク質を再び折り畳むこと（再折り畳みｒ
ＭＬＡ）によって、酵素的に活性な発現生成物を入手し
得る。ｒＭＬＡ（可溶）およびｒＭＬＡ（再折り畳み）
は、ＩＣ50値が１０．７±１．３ｐＭまたは１５．６±
６．６ｐＭである対応の活性を示す。従って、これら
は、天然に存在するＭＬＡ鎖（ＩＣ50１．１±０．７ｐ
Ｍ）よりも低い毒性活性を示す。
【０１５５】（実施例１０） （ヤドリギレクチンＢ鎖の炭水化物結合活性）組換えヤ
ドリギレクチンＢ鎖の炭水化物結合活性の検出ならびに
組換えレクチンＢ鎖と植物性ヤドリギレクチンＢ鎖との
炭水化物結合活性および特異性の比較を、競合炭水化物
の存在下で、酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）に
よって実施する。圧倒的なガラクトースおよびＮ−アセ
チル−ガラクトサミン残基に固定化したアシアロフェチ
ュインマトリックスを使用することならびに圧倒的なシ
アル酸残基に固定したフェチュインマトリックスを使用
することによって、ｎＭＬＢおよびｒＭＬＢ鎖の結合を
確立した。
ドリギレクチンＢ鎖の炭水化物結合活性の検出ならびに
組換えレクチンＢ鎖と植物性ヤドリギレクチンＢ鎖との
炭水化物結合活性および特異性の比較を、競合炭水化物
の存在下で、酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）に
よって実施する。圧倒的なガラクトースおよびＮ−アセ
チル−ガラクトサミン残基に固定化したアシアロフェチ
ュインマトリックスを使用することならびに圧倒的なシ
アル酸残基に固定したフェチュインマトリックスを使用
することによって、ｎＭＬＢおよびｒＭＬＢ鎖の結合を
確立した。
【０１５６】炭水化物マトリックスを固定化するため
に、ＰＢＳ １１ｍｌ中のアシアロフェチュイン（Ｓｉ
ｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）１．１ｍｇの溶液
またはフェチュイン（Ｓｉｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｎｈｏ
ｆｅｎ）１．１ｍｇの溶液１００μｌを、ＭａｘｉＳｏ
ｒｐ Ｃ９６ マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，
Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ）のウェルに移し、そして室温にて
１６時間インキュベートした。マイクロタイタープレー
トを１５０μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔ（１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％
（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎョ−２０、ｐＨ７．２）で３回
洗浄した後、このマイクロタイタープレートを、２００
μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔ−１％ ＢＳＡ（１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１
％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎョ−２０、１％（ｗ／ｖ）
ＢＳＡ、ｐＨ７．２）とともに３６℃で１時間インキュ
ベートして非特異的結合部位をブロックし、続いて上述
したように洗浄した。試験を行うために、濃度１００〜
５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは４００ｎｇ／ｍｌでＢ鎖
含有調製物１００μｌを使用した。試料をＰＢＳ−０．
０５％ ＢＳＡ（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１
３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ｐ
Ｈ７．２）に希釈することによって試験濃度を調整し
た。試験濃度およびコントロールごとに、２〜３のレプ
リカを調製した。ＰＢＳ−０．０５％ＢＳＡまたはそれ
ぞれの調製緩衝液を用いてコントロール測定を実施し
た。結合特異性を測定するために、遊離競合糖の存在下
で試料をインキュベートした。アシアロフェチュインま
たはフェチュインマトリックスへの結合からのｒＭＬ
Ｂ、ｎＭＬＢまたはＭＬホロタンパク質の置換のため
に、好ましくは濃度範囲が０〜２８０ｍＭのガラクトー
ス、濃度範囲０〜２８０ｍＭのＮ−アセチル−ガラクト
サミン、濃度範囲０〜１４０ｍＭのラクトースまたは濃
度範囲０〜１４０ｍＭのシアル酸を使用した。
に、ＰＢＳ １１ｍｌ中のアシアロフェチュイン（Ｓｉ
ｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）１．１ｍｇの溶液
またはフェチュイン（Ｓｉｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｎｈｏ
ｆｅｎ）１．１ｍｇの溶液１００μｌを、ＭａｘｉＳｏ
ｒｐ Ｃ９６ マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，
Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ）のウェルに移し、そして室温にて
１６時間インキュベートした。マイクロタイタープレー
トを１５０μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔ（１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％
（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎョ−２０、ｐＨ７．２）で３回
洗浄した後、このマイクロタイタープレートを、２００
μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔ−１％ ＢＳＡ（１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１
％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎョ−２０、１％（ｗ／ｖ）
ＢＳＡ、ｐＨ７．２）とともに３６℃で１時間インキュ
ベートして非特異的結合部位をブロックし、続いて上述
したように洗浄した。試験を行うために、濃度１００〜
５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは４００ｎｇ／ｍｌでＢ鎖
含有調製物１００μｌを使用した。試料をＰＢＳ−０．
０５％ ＢＳＡ（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１
３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ｐ
Ｈ７．２）に希釈することによって試験濃度を調整し
た。試験濃度およびコントロールごとに、２〜３のレプ
リカを調製した。ＰＢＳ−０．０５％ＢＳＡまたはそれ
ぞれの調製緩衝液を用いてコントロール測定を実施し
た。結合特異性を測定するために、遊離競合糖の存在下
で試料をインキュベートした。アシアロフェチュインま
たはフェチュインマトリックスへの結合からのｒＭＬ
Ｂ、ｎＭＬＢまたはＭＬホロタンパク質の置換のため
に、好ましくは濃度範囲が０〜２８０ｍＭのガラクトー
ス、濃度範囲０〜２８０ｍＭのＮ−アセチル−ガラクト
サミン、濃度範囲０〜１４０ｍＭのラクトースまたは濃
度範囲０〜１４０ｍＭのシアル酸を使用した。
【０１５７】ロード後、プレートを３６℃で２時間イン
キュベートし、続いて上述したように洗浄した。ロード
したウェルに、１００μｌ／ウェルのヤギ抗ヤドリギレ
クチン血清（ＰＢＳ−Ｔ−０．１％ ＢＳＡ−Ｔｘ（１
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１３０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、０．１％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎョ−２０、０．１
％（ｗ／ｖ） ＢＳＡ、１％（ｖ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ
ョＸ１００、ｐＨ７．２）における血清プールの１：１
９８００希釈物）を添加し、３６℃で２時間インキュベ
ートし、次いで上述のように洗浄した。免疫複合体をア
ッセイするために、ロードしたウェルごとに、ＰＢＳ−
１％ ＢＳＡ（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１３
０ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ） ＢＳＡ、ｐＨ７．
２）中の１：３５００希釈物に西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ（Ｓｉｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）と結合
した１００μｌの抗ヤギＩｇＧ−ＩｇＧを添加し、そし
て３６℃で１時間インキュベートした。次に、これらの
ウェルを１５０μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔ で６回洗浄
した。発色のために、１００μｌ／ウェルの基質溶液
（２５ｍｌの６５ｍＭクエン酸（ｐＨ５．０）＋１０μ
ｌの３０％過酸化水素中に ｏ−フェニレンジアミン錠
（Ｓｉｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）１個）を添
加し、暗所にて室温で２０分間インキュベートした。１
００μｌ／ウェルの１Ｍ硫酸を添加することによって反
応を停止させた。参照波長６９０ｎｍの４５０ｎｍでの
吸光光度法により、そして測定データの４パラメータフ
ィットで表されるＩＣ50値の算出によって評価を行っ
た。
キュベートし、続いて上述したように洗浄した。ロード
したウェルに、１００μｌ／ウェルのヤギ抗ヤドリギレ
クチン血清（ＰＢＳ−Ｔ−０．１％ ＢＳＡ−Ｔｘ（１
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１３０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、０．１％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎョ−２０、０．１
％（ｗ／ｖ） ＢＳＡ、１％（ｖ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ
ョＸ１００、ｐＨ７．２）における血清プールの１：１
９８００希釈物）を添加し、３６℃で２時間インキュベ
ートし、次いで上述のように洗浄した。免疫複合体をア
ッセイするために、ロードしたウェルごとに、ＰＢＳ−
１％ ＢＳＡ（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１３
０ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ） ＢＳＡ、ｐＨ７．
２）中の１：３５００希釈物に西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ（Ｓｉｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）と結合
した１００μｌの抗ヤギＩｇＧ−ＩｇＧを添加し、そし
て３６℃で１時間インキュベートした。次に、これらの
ウェルを１５０μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔ で６回洗浄
した。発色のために、１００μｌ／ウェルの基質溶液
（２５ｍｌの６５ｍＭクエン酸（ｐＨ５．０）＋１０μ
ｌの３０％過酸化水素中に ｏ−フェニレンジアミン錠
（Ｓｉｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）１個）を添
加し、暗所にて室温で２０分間インキュベートした。１
００μｌ／ウェルの１Ｍ硫酸を添加することによって反
応を停止させた。参照波長６９０ｎｍの４５０ｎｍでの
吸光光度法により、そして測定データの４パラメータフ
ィットで表されるＩＣ50値の算出によって評価を行っ
た。
【０１５８】図１０は、ＥＬＬ系において観察された、
Ｄガラクトース（図１０ａ）、β−ラクトース（図１０
ｂ）またはＮ−アセチルガラクトサミン（図１０ｃ）の
量を増加させることによる固定アシアロフェチュインリ
ガンドからのｒＭＬＢおよびｎＭＬＢの置換の値、なら
びにシアル酸（図１０ｄ）の量を増加させることによる
固定フェチュインリガンドからの置換の値を示す。最大
置換の半値に関するＩＣ５０値によってｎＭＬＢおよび
ｒＭＬＢの結合特性を表す。
Ｄガラクトース（図１０ａ）、β−ラクトース（図１０
ｂ）またはＮ−アセチルガラクトサミン（図１０ｃ）の
量を増加させることによる固定アシアロフェチュインリ
ガンドからのｒＭＬＢおよびｎＭＬＢの置換の値、なら
びにシアル酸（図１０ｄ）の量を増加させることによる
固定フェチュインリガンドからの置換の値を示す。最大
置換の半値に関するＩＣ５０値によってｎＭＬＢおよび
ｒＭＬＢの結合特性を表す。
【０１５９】植物性ｎＭＬＢ鎖の炭水化物結合は、主に
ガラクトース（ＩＣ５０＝４．５ｍＭ）およびβ−ラク
トース（ＩＣ５０＝４．９ｍＭ）によって競合される
が、驚くべきことに組換えｒＭＬＢ鎖は、明らかに変化
していた炭水化物特異性を有する。ｎＭＬＢとは対照的
に、ｒＭＬＢの炭水化物結合活性は、ガラクトースによ
って競合され得ず（ＩＣ５０検出不能）、β−ラクトー
スによっては限られた程度にしか競合され得ない（ＩＣ
５０＞７０ｍＭ）。ガラクトースおよびβ−ラクトース
に対する劇的に低下した親和性を除けば、組換えｒＭＬ
Ｂ鎖はＮ−アセチルガラクトサミンに対する顕著な特異
性を有する（ＩＣ５０＝１０９ｍＭ）。ｎＭＬＢについ
て表されたシアル酸リガンドに対する他の結合活性もま
た、組換えＭＬＢ鎖について検出され得る（図１０
ｄ）。植物性ｎＭＬＢ鎖（ＩＣ５０＝４９．８ｍＭ）お
よび組換えｒＭＬＢ鎖（ＩＣ５０＝４７．１ｍＭ）につ
いて、同じ結合親和性が検出された。
ガラクトース（ＩＣ５０＝４．５ｍＭ）およびβ−ラク
トース（ＩＣ５０＝４．９ｍＭ）によって競合される
が、驚くべきことに組換えｒＭＬＢ鎖は、明らかに変化
していた炭水化物特異性を有する。ｎＭＬＢとは対照的
に、ｒＭＬＢの炭水化物結合活性は、ガラクトースによ
って競合され得ず（ＩＣ５０検出不能）、β−ラクトー
スによっては限られた程度にしか競合され得ない（ＩＣ
５０＞７０ｍＭ）。ガラクトースおよびβ−ラクトース
に対する劇的に低下した親和性を除けば、組換えｒＭＬ
Ｂ鎖はＮ−アセチルガラクトサミンに対する顕著な特異
性を有する（ＩＣ５０＝１０９ｍＭ）。ｎＭＬＢについ
て表されたシアル酸リガンドに対する他の結合活性もま
た、組換えＭＬＢ鎖について検出され得る（図１０
ｄ）。植物性ｎＭＬＢ鎖（ＩＣ５０＝４９．８ｍＭ）お
よび組換えｒＭＬＢ鎖（ＩＣ５０＝４７．１ｍＭ）につ
いて、同じ結合親和性が検出された。
【０１６０】植物性の主にガラクトース／β−ラクトー
ス特異的ｎＭＬＢ鎖に対して、組換え調製したｒＭＬＢ
鎖は、Ｎ−アセチルガラクトサミン／シアル酸結合の方
向にシフトした明らかに異なる炭水化物特異性を有す
る。
ス特異的ｎＭＬＢ鎖に対して、組換え調製したｒＭＬＢ
鎖は、Ｎ−アセチルガラクトサミン／シアル酸結合の方
向にシフトした明らかに異なる炭水化物特異性を有す
る。
【０１６１】（実施例１１） （ヒトリンパ性白血病細胞に対するインビトロで再会合
したｒＭＬホロタンパク質の細胞傷害性の検出）ヒト単
核（リンパ性）白血病細胞ＭＯＬＴ−４株（Ｅｕｒｏｐ
ｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ
Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｎｏ．８５０１１４１
３）に対する細胞傷害性を定量分析することによって、
ヤドリギレクチンホロタンパク質の完全性を検出した。
したｒＭＬホロタンパク質の細胞傷害性の検出）ヒト単
核（リンパ性）白血病細胞ＭＯＬＴ−４株（Ｅｕｒｏｐ
ｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ
Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｎｏ．８５０１１４１
３）に対する細胞傷害性を定量分析することによって、
ヤドリギレクチンホロタンパク質の完全性を検出した。
【０１６２】ＭＯＬＴ−４細胞を無血清ＭＤＣ−１培地
（ＰＡＮ ＳＹＳＴＥＭＳ， Ａｉｄｅｎｂａｃｈ）に
おいて培養し、そして試験のために生存可能性＞９８％
で細胞密度１．５×１０5 ＭＯＬＴ−４細胞／ｍｌに
調整した。細胞傷害性を測定するために、９６ウェルマ
イクロタイタープレートのウェルごとに、１８０００細
胞／ウェルに対応するＭＯＬＴ−４細胞懸濁液９０μｌ
を加え、そして試料溶液１０μｌと混合した。
（ＰＡＮ ＳＹＳＴＥＭＳ， Ａｉｄｅｎｂａｃｈ）に
おいて培養し、そして試験のために生存可能性＞９８％
で細胞密度１．５×１０5 ＭＯＬＴ−４細胞／ｍｌに
調整した。細胞傷害性を測定するために、９６ウェルマ
イクロタイタープレートのウェルごとに、１８０００細
胞／ウェルに対応するＭＯＬＴ−４細胞懸濁液９０μｌ
を加え、そして試料溶液１０μｌと混合した。
【０１６３】試験を行うために、ヤドリギレクチンホロ
タンパク質調製物（ラクトシルセファロース（Ｆｒａｎ
ｚ ら、１９７７）を使用する標準的な技術によってヤ
ドリギ葉またはヤドリギ茶から単離されたバッチＮｏ．
２２０７９３ （Ｍａｄａｕｓ）およびＢＲＡＩＮ
１２／９４）、ならびに濃度範囲１〜１００ｐｇ／ｍｌ
のインビトロで再会合したｒＭＬホロタンパク質を、希
釈系列をＭＤＣ−１細胞培養培地において調製して、対
応させて使用（１．６ｆＭ〜１．６６ｐＭ）した。各試
料濃度およびコントロールごとに、６つのレプリカを調
製した。
タンパク質調製物（ラクトシルセファロース（Ｆｒａｎ
ｚ ら、１９７７）を使用する標準的な技術によってヤ
ドリギ葉またはヤドリギ茶から単離されたバッチＮｏ．
２２０７９３ （Ｍａｄａｕｓ）およびＢＲＡＩＮ
１２／９４）、ならびに濃度範囲１〜１００ｐｇ／ｍｌ
のインビトロで再会合したｒＭＬホロタンパク質を、希
釈系列をＭＤＣ−１細胞培養培地において調製して、対
応させて使用（１．６ｆＭ〜１．６６ｐＭ）した。各試
料濃度およびコントロールごとに、６つのレプリカを調
製した。
【０１６４】細胞をインキュベーター中で３７℃で５％
ＣＯ2にて７２時間インキュベートした。対応のＣｅ
ｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ
ＷＳＴ−１ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）を使用するＷＳＴ−１法（Ｓｃｕｄｉｅｒｏ ら、
１９８８）に従って、可溶性ホルマザン染料を使用して
細胞の生存可能性を測定することによって細胞傷害効果
の定量化を行った。
ＣＯ2にて７２時間インキュベートした。対応のＣｅ
ｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ
ＷＳＴ−１ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）を使用するＷＳＴ−１法（Ｓｃｕｄｉｅｒｏ ら、
１９８８）に従って、可溶性ホルマザン染料を使用して
細胞の生存可能性を測定することによって細胞傷害効果
の定量化を行った。
【０１６５】組換えホロタンパク質およびキメラホロタ
ンパク質ｒＭＬＢ／ｎＭＬＢは、天然に存在するタンパ
ク質に対して同じ生物学的活性を示し、ＭＯＬＴ−４細
胞傷害性に関するＩＣ５０値は約１０〜３０ｐｇ／ｍｌ
である。しかし、試験した濃度範囲（最大１ｎｇ／ｍｌ
のｒＭＬＢ）では、ｒＭＬＢは細胞傷害活性を示さな
い。
ンパク質ｒＭＬＢ／ｎＭＬＢは、天然に存在するタンパ
ク質に対して同じ生物学的活性を示し、ＭＯＬＴ−４細
胞傷害性に関するＩＣ５０値は約１０〜３０ｐｇ／ｍｌ
である。しかし、試験した濃度範囲（最大１ｎｇ／ｍｌ
のｒＭＬＢ）では、ｒＭＬＢは細胞傷害活性を示さな
い。
【０１６６】（実施例１２） （組換えヤドリギレクチン（ｒＭＬ）によってヒト単球
細胞Ｕ９３７株について示されるアポトーシスの誘導）
核を蛍光染料ＤＡＰＩ（Ｈｏｔｚ ら、１９９２）で染
色することによって、組換えヤドリギレクチン（ｒＭＬ
Ａ／ｒＭＬＢ）によるアポトーシスプロセスの誘導を検
出する。核の形態の代表的なアポトーシス性変化は、顕
微鏡下で観察され得、そして１試料あたり５００〜１０
０個の細胞を計数することによって定量化し得る。血清
タンパク質の存在は利用可能なレクチンの量を劇的に減
少させる（１０％ＦＣＳで約４０分の１、Ｒｉｂｅｒｅ
ａｕ−Ｇａｙｏｎ ら、１９９５）ので、アッセイの感
度のためには無血清培地を使用することが必須である。
２４時間の誘導時間は、ＭＯＬＴアッセイとの直接相関
を部分的にのみ可能にする。なぜなら、細胞傷害効果
は、生存可能性アッセイにおいて７２時間後にやっと明
らかに肉眼で認められるが、アポトーシスはより早く検
出され得る効果であるからである。インキュベーション
時間が長すぎる場合、アポトーシスは二次壊死によって
消滅する。
細胞Ｕ９３７株について示されるアポトーシスの誘導）
核を蛍光染料ＤＡＰＩ（Ｈｏｔｚ ら、１９９２）で染
色することによって、組換えヤドリギレクチン（ｒＭＬ
Ａ／ｒＭＬＢ）によるアポトーシスプロセスの誘導を検
出する。核の形態の代表的なアポトーシス性変化は、顕
微鏡下で観察され得、そして１試料あたり５００〜１０
０個の細胞を計数することによって定量化し得る。血清
タンパク質の存在は利用可能なレクチンの量を劇的に減
少させる（１０％ＦＣＳで約４０分の１、Ｒｉｂｅｒｅ
ａｕ−Ｇａｙｏｎ ら、１９９５）ので、アッセイの感
度のためには無血清培地を使用することが必須である。
２４時間の誘導時間は、ＭＯＬＴアッセイとの直接相関
を部分的にのみ可能にする。なぜなら、細胞傷害効果
は、生存可能性アッセイにおいて７２時間後にやっと明
らかに肉眼で認められるが、アポトーシスはより早く検
出され得る効果であるからである。インキュベーション
時間が長すぎる場合、アポトーシスは二次壊死によって
消滅する。
【０１６７】図１２は、組換えＭＬホロタンパク質での
処理後のアポトーシスＵ９３７細胞の率の顕著な増加を
示す。７０ｐｇ／ｍｌで、無血清培地における２つの異
なる培養物中の２４時間後のアポトーシス細胞の数は３
倍に増加する。このため、天然に存在するタンパク質の
ような組換えヤドリギレクチン（Ｊａｎｓｓｅｎ ら、
１９９３）はアポトーシス性の細胞死を誘導し得る。
処理後のアポトーシスＵ９３７細胞の率の顕著な増加を
示す。７０ｐｇ／ｍｌで、無血清培地における２つの異
なる培養物中の２４時間後のアポトーシス細胞の数は３
倍に増加する。このため、天然に存在するタンパク質の
ような組換えヤドリギレクチン（Ｊａｎｓｓｅｎ ら、
１９９３）はアポトーシス性の細胞死を誘導し得る。
【０１６８】（実施例１３） （ＰＢＭＣモデルにおける組換えヤドリギレクチンの免
疫刺激効果）サイトカインであるＴＮＦ−α（単球、マ
クロファージ）およびＩＦＮ−γ（Ｔヘルパー細胞）
は、ヒトの免疫学的システムの複雑なネットワーク内の
中心メディエータである。
疫刺激効果）サイトカインであるＴＮＦ−α（単球、マ
クロファージ）およびＩＦＮ−γ（Ｔヘルパー細胞）
は、ヒトの免疫学的システムの複雑なネットワーク内の
中心メディエータである。
【０１６９】健康な血液ドナー由来のヒト単核細胞（Ｐ
ＢＭＣ、単球およびリンパ球を含む）を、ＦＩＣＯＬＬ
−ＰＡＱＵＥョ密度勾配遠心分離により生産者（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ， Ｓｗｅｄｅｎ）の指示に従って単離し
た。
ＢＭＣ、単球およびリンパ球を含む）を、ＦＩＣＯＬＬ
−ＰＡＱＵＥョ密度勾配遠心分離により生産者（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ， Ｓｗｅｄｅｎ）の指示に従って単離し
た。
【０１７０】ＴＮＦ−αの放出を誘導するために、細胞
（４×１０6単核細胞／ｍｌ）を、１０％（ｖ／ｖ）ウ
シ胎仔血清と、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌと、ストレプ
トマイシン１００μｇ／ｍｌとを含有するＲＰＭＩ １
６４０培地で、気体を供給したインキュベーター内のＵ
字型マイクロタイター細胞培養プレート中で、３７℃、
５％ ＣＯ2および相対湿度＞９５％にて、最初は組換
えヤドリギレクチンタンパク質のみとともに１８時間、
続いて同時刺激因子としてＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｂ
ｏｒｔｕｓ ｅｑｕｉ由来のリポ多糖１μｇ／ｍｌとと
もにさらに２４時間インキュベートした。次に、無細胞
上清において任意のＥＬＩＳＡ（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｄｉ
ａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｒｕｅｓｓｅｌｓｈｅｉｍ）に
よってＴＮＦ−αの濃度を定量した。
（４×１０6単核細胞／ｍｌ）を、１０％（ｖ／ｖ）ウ
シ胎仔血清と、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌと、ストレプ
トマイシン１００μｇ／ｍｌとを含有するＲＰＭＩ １
６４０培地で、気体を供給したインキュベーター内のＵ
字型マイクロタイター細胞培養プレート中で、３７℃、
５％ ＣＯ2および相対湿度＞９５％にて、最初は組換
えヤドリギレクチンタンパク質のみとともに１８時間、
続いて同時刺激因子としてＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｂ
ｏｒｔｕｓ ｅｑｕｉ由来のリポ多糖１μｇ／ｍｌとと
もにさらに２４時間インキュベートした。次に、無細胞
上清において任意のＥＬＩＳＡ（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｄｉ
ａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｒｕｅｓｓｅｌｓｈｅｉｍ）に
よってＴＮＦ−αの濃度を定量した。
【０１７１】ＩＦＮ−γの放出を誘導するために、細胞
を、上述の培地において、組換えヤドリギレクチンタン
パク質のみとともに１時間、次いで上述のような同時刺
激因子としてのフィトヘムアグルチニンＬ ０．５μｇ
／ｍｌとともにさらに６５時間インキュベートした。次
に、ＩＦＮ−γのそれぞれの濃度を、ＥＬＩＳＡ（ＥＮ
ＤＯＧＥＮ ＩＮＣ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＳ
Ａ）によって無細胞上清において定量した。
を、上述の培地において、組換えヤドリギレクチンタン
パク質のみとともに１時間、次いで上述のような同時刺
激因子としてのフィトヘムアグルチニンＬ ０．５μｇ
／ｍｌとともにさらに６５時間インキュベートした。次
に、ＩＦＮ−γのそれぞれの濃度を、ＥＬＩＳＡ（ＥＮ
ＤＯＧＥＮ ＩＮＣ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＳ
Ａ）によって無細胞上清において定量した。
【０１７２】（実施例１４） （皮膚2ＺＫ１２００モデルにおける組換えヤドリギレ
クチンの免疫刺激効果）バイオアッセイとして確立され
た皮膚2モデルは、三次元の線維芽細胞含有皮膚および
角質化していないケラチノサイト由来の構造表皮からな
る（これらの細胞自身が天然に分泌するマトリックス
中）（Ｊｏｌｌｅｒ ら、１９９６）。皮膚組織片（１
１×１１ｍｍ2、ヒトから調製、一次細胞、Ａｄｖａｎ
ｃｅｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．
（ＡＴＳ）， Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡ）はアガロー
ス中のナイロングリッドで提供され、これを受領時にす
みやかにｓｐｅｃｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ Ａ（ＡＴＳ，
Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＵＳＡ）に移した。
クチンの免疫刺激効果）バイオアッセイとして確立され
た皮膚2モデルは、三次元の線維芽細胞含有皮膚および
角質化していないケラチノサイト由来の構造表皮からな
る（これらの細胞自身が天然に分泌するマトリックス
中）（Ｊｏｌｌｅｒ ら、１９９６）。皮膚組織片（１
１×１１ｍｍ2、ヒトから調製、一次細胞、Ａｄｖａｎ
ｃｅｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．
（ＡＴＳ）， Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡ）はアガロー
ス中のナイロングリッドで提供され、これを受領時にす
みやかにｓｐｅｃｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ Ａ（ＡＴＳ，
Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＵＳＡ）に移した。
【０１７３】ＩＬ−１αおよびＩｌ−６はいずれもヒト
の免疫学的システムの関連刺激サイトカインである。
の免疫学的システムの関連刺激サイトカインである。
【０１７４】ＩＬ−１αまたはＩＬ−６の放出を誘導す
るために、皮膚2組織片を、試験物質とともにｓｐｅｃ
ｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ Ｂ（ＡＴＳ， Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ，ＵＳＡ）２ｍｌ中にて３７℃、空気中５％のＣ
Ｏ2、相対湿度＞９５％で、１２カップの細胞培養プレ
ート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ Ｗｏｒｋｓ， Ｃ
ｏｒｎｉｎｇ， ＵＳＡ）において２４時間インキュベ
ートした。次に、ＩＬ−１α（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ
ｈｕｍａｎ ＩＬ−１α Ａｓｓａｙ、Ｒ ＆Ｄ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，
ＵＳＡ）の濃度およびＩＬ−６（ｈ−ｉｎｔｅｒｌｅｕ
ｋｉｎ ６ ＥＬＩＳＡ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ）の濃度を、無細胞上清におい
てＥＬＩＳＡによって定量した。
るために、皮膚2組織片を、試験物質とともにｓｐｅｃ
ｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ Ｂ（ＡＴＳ， Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ，ＵＳＡ）２ｍｌ中にて３７℃、空気中５％のＣ
Ｏ2、相対湿度＞９５％で、１２カップの細胞培養プレ
ート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ Ｗｏｒｋｓ， Ｃ
ｏｒｎｉｎｇ， ＵＳＡ）において２４時間インキュベ
ートした。次に、ＩＬ−１α（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ
ｈｕｍａｎ ＩＬ−１α Ａｓｓａｙ、Ｒ ＆Ｄ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，
ＵＳＡ）の濃度およびＩＬ−６（ｈ−ｉｎｔｅｒｌｅｕ
ｋｉｎ ６ ＥＬＩＳＡ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ）の濃度を、無細胞上清におい
てＥＬＩＳＡによって定量した。
【０１７５】０．２５〜８ｎｇ ｒＭＬ／ｍｌで誘導し
たＩＬ−１αの用量依存的放出および０．２５〜８ｎｇ
ｒＭＬ／ｍｌで誘導したＩＬ−６の用量依存的放出に
よって皮膚2モデルを特徴付けた（図１４）。驚くべき
ことに、組換えｒＭＬＢ鎖だけでは上述したサイトカイ
ン放出はいずれも達成し得なかった。この知見は、免疫
刺激活性が主にＢ鎖のレクチン活性に起因するという従
来技術の知識（Ｈａｊｔｏ ら、１９９０）とは絶対的
に矛盾する。
たＩＬ−１αの用量依存的放出および０．２５〜８ｎｇ
ｒＭＬ／ｍｌで誘導したＩＬ−６の用量依存的放出に
よって皮膚2モデルを特徴付けた（図１４）。驚くべき
ことに、組換えｒＭＬＢ鎖だけでは上述したサイトカイ
ン放出はいずれも達成し得なかった。この知見は、免疫
刺激活性が主にＢ鎖のレクチン活性に起因するという従
来技術の知識（Ｈａｊｔｏ ら、１９９０）とは絶対的
に矛盾する。
【０１７６】（実施例１５） （組換えヤドリギレクチンＢ鎖（ｒＭＬＢ）による免疫
担当細胞の活性化）細胞表面タンパク質ＣＤ６９の誘導
を使用して免疫担当細胞の活性化を試験した。ＣＤ６９
は、Ｔ細胞、Ｂ細胞および特にナチュラルキラー細胞
（ＮＫ細胞）の活性化後に最初の細胞表面抗原の１つと
して現れる。これらの細胞は、その新生物細胞を認識し
そして溶解する能力のために、腫瘍に対する天然の防御
において中心的な役割を果たす。細胞表面タンパク質は
休止リンパ球では発現しないので、ＣＤ６９は上述の免
疫担当細胞集団の活性化マーカーである。さらに、誘導
可能なＣＤ６９表面タンパク質については、ＮＫ細胞お
よびＴｃＲγ／δＴ細胞の細胞溶解活性に対する伝達機
能を検出することができた（Ｍｏｒｅｔｔａ ら、１９
９１）。
担当細胞の活性化）細胞表面タンパク質ＣＤ６９の誘導
を使用して免疫担当細胞の活性化を試験した。ＣＤ６９
は、Ｔ細胞、Ｂ細胞および特にナチュラルキラー細胞
（ＮＫ細胞）の活性化後に最初の細胞表面抗原の１つと
して現れる。これらの細胞は、その新生物細胞を認識し
そして溶解する能力のために、腫瘍に対する天然の防御
において中心的な役割を果たす。細胞表面タンパク質は
休止リンパ球では発現しないので、ＣＤ６９は上述の免
疫担当細胞集団の活性化マーカーである。さらに、誘導
可能なＣＤ６９表面タンパク質については、ＮＫ細胞お
よびＴｃＲγ／δＴ細胞の細胞溶解活性に対する伝達機
能を検出することができた（Ｍｏｒｅｔｔａ ら、１９
９１）。
【０１７７】フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によっ
てヒト単核細胞上の表面マーカーを検出するために、実
施例１３と同様のＨｙｐａｑｕｅ （Ｓｉｇｍａ）での
密度勾配によってＰＢＭＣを単離した。細胞を、５％Ｆ
ＣＳを含むＲＰＭＩ １６０培地に溶解し、マイクロタ
イタープレートの１カップあたり約２５００００細胞を
播種した後、この溶液を、１、１０、３０および１００
ｎｇの試験物質ｒＭＬＢとともに４時間インキュベート
した。氷浴中で蛍光標識抗ＣＤ６９ ＭＡｂとの２０分
間のインキュベーション後、５％ ＦＣＳを含むＨａｎ
ｋ溶液で洗浄した。沈降した標識細胞をＳｈｅａｔｈ
Ｆｌｕｉｄ ２００μｌに添加し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂ
ｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で測定した。細胞１
個あたりのＣＤ６９細胞表面マーカーの数および全細胞
集合団においてＣＤ６９陽性細胞が占める率に対応して
蛍光の中央値を適用する。
てヒト単核細胞上の表面マーカーを検出するために、実
施例１３と同様のＨｙｐａｑｕｅ （Ｓｉｇｍａ）での
密度勾配によってＰＢＭＣを単離した。細胞を、５％Ｆ
ＣＳを含むＲＰＭＩ １６０培地に溶解し、マイクロタ
イタープレートの１カップあたり約２５００００細胞を
播種した後、この溶液を、１、１０、３０および１００
ｎｇの試験物質ｒＭＬＢとともに４時間インキュベート
した。氷浴中で蛍光標識抗ＣＤ６９ ＭＡｂとの２０分
間のインキュベーション後、５％ ＦＣＳを含むＨａｎ
ｋ溶液で洗浄した。沈降した標識細胞をＳｈｅａｔｈ
Ｆｌｕｉｄ ２００μｌに添加し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂ
ｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で測定した。細胞１
個あたりのＣＤ６９細胞表面マーカーの数および全細胞
集合団においてＣＤ６９陽性細胞が占める率に対応して
蛍光の中央値を適用する。
【０１７８】濃度範囲１〜１００ｎｇ／ｍｌで、細胞表
面でのＣＤ６９の出現率およびＣＤ６９陽性細胞が占め
る率の両方に関して、単核細胞の活性化を検出し得た。
釣り鐘状の用量依存曲線が観察できた。ｒＭＬＢの最高
濃度１００ｎｇ／ｍｌでさえも、本実施例において試験
したＰＢＭＣに対する細胞傷害効果は検出できなかっ
た。
面でのＣＤ６９の出現率およびＣＤ６９陽性細胞が占め
る率の両方に関して、単核細胞の活性化を検出し得た。
釣り鐘状の用量依存曲線が観察できた。ｒＭＬＢの最高
濃度１００ｎｇ／ｍｌでさえも、本実施例において試験
したＰＢＭＣに対する細胞傷害効果は検出できなかっ
た。
【０１７９】本発明は、成熟後にヤドリギレクチンダイ
マーの生物学的活性を有するプレプロタンパク質をコー
ドする核酸分子、そのような核酸分子を含有するベクタ
ー、該ベクターで形質転換された宿主、およびこれらの
核酸分子によってコードされるポリペプチドおよび／ま
たはポリペプチドダイマーに関する。本発明のポリペプ
チドおよび／またはポリペプチドダイマーは、治療上広
く適用可能である。したがって、本発明はさらに、本発
明のポリペプチドおよび／またはポリペプチドダイマー
を含有するイムノトキシンならびに医薬組成物に関す
る。さらに、本発明は、本発明の核酸分子、本発明のポ
リペプチドおよび／またはポリペプチドダイマーおよび
／または本発明の核酸分子と特異的にハイブリダイズす
るプライマーを有する診断組成物に関する。最後に、本
発明は、本発明のポリペプチドおよび／または本発明の
ポリペプチドダイマーを有する植物保護因子に関する。
マーの生物学的活性を有するプレプロタンパク質をコー
ドする核酸分子、そのような核酸分子を含有するベクタ
ー、該ベクターで形質転換された宿主、およびこれらの
核酸分子によってコードされるポリペプチドおよび／ま
たはポリペプチドダイマーに関する。本発明のポリペプ
チドおよび／またはポリペプチドダイマーは、治療上広
く適用可能である。したがって、本発明はさらに、本発
明のポリペプチドおよび／またはポリペプチドダイマー
を含有するイムノトキシンならびに医薬組成物に関す
る。さらに、本発明は、本発明の核酸分子、本発明のポ
リペプチドおよび／またはポリペプチドダイマーおよび
／または本発明の核酸分子と特異的にハイブリダイズす
るプライマーを有する診断組成物に関する。最後に、本
発明は、本発明のポリペプチドおよび／または本発明の
ポリペプチドダイマーを有する植物保護因子に関する。
【０１８０】
【発明の効果】ヤドリギレクチンを純粋な形態で、そし
て大規模でのその利用が可能になる量で提供する。この
課題は、請求の範囲において特徴付けられる実施態様に
よって解決される。
て大規模でのその利用が可能になる量で提供する。この
課題は、請求の範囲において特徴付けられる実施態様に
よって解決される。
【０１８１】
【化２】
【図１】図１は、一次増幅オリゴヌクレオチドの構築で
ある。
ある。
【図２】図２は、一次Ｖｉｓｃｕｍ ａｌｂｕｍ ＭＬ
増幅生成物である。
増幅生成物である。
【図３】図３は、ＭＬ遺伝子を得るためのクローニング
方法である。
方法である。
【図４ａｂ】図４ａ＋ｂは、ｒＭＬＡおよびｒＭＬＢ用
の発現ベクターの挿入断片の遺伝子配列である。
の発現ベクターの挿入断片の遺伝子配列である。
【図４ｃ】図４ｃは、完全なＭＬ遺伝子配列である。
【図５】図５は、ｒＭＬＡについての構築スキーム発現
ベクターである。
ベクターである。
【図６】図６は、ｒＭＬＢについての構築スキーム発現
ベクターである。
ベクターである。
【図７】図７は、ｒＭＬＡ、ｒＭＬＢの発現および免疫
検出である。
検出である。
【図８】図８は、ｒＭＬＡおよびｒＭＬＢ対天然ＭＬの
ＩＥＦクロマトフォーカシングである。
ＩＥＦクロマトフォーカシングである。
【図９】図９は、ｒＭＬＡ（ＲＩＰ）の酵素活性であ
る。
る。
【図１０】図１０は、ｒＭＬＢの炭水化物結合特性であ
る。
る。
【図１１】図１１は、ｒＭＬのＭＯＬＴ４細胞傷害性で
ある。
ある。
【図１２】図１２は、ｒＭＬによるアポトーシスの誘導
である。
である。
【図１３】図１３は、ＰＢＭＣモデルにおける組換えヤ
ドリギレクチンの免疫刺激作用である。
ドリギレクチンの免疫刺激作用である。
【図１４】図１４は、皮膚2モデルにおける組換えヤド
リギレクチンの免疫刺激作用である。
リギレクチンの免疫刺激作用である。
【図１５】図１５は、ＰＢＭＣにおける細胞表面マーカ
ーＣＤ６９の誘導である。
ーＣＤ６９の誘導である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 37/04 35/00 43/00 １０５ 37/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 43/00 １０５ Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 アクセル バウアー ドイツ国 メアーブッシュ 40668， オ ッスム 13アー， ハウス グリップスワ ルド (72)発明者 ホルガー ジンケ ドイツ国 ビッケンバッハ 64404， ハ ルテナウエル シュトラーセ 49 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA03 DA06 EA04 4C084 AA02 AA07 AA17 BA05 CA13 CA53 NA06 NA14 ZB092 ZB222 ZB262 ZB322 ZB332 ZC412 4C085 AA14 AA25 CC21 CC23
Claims (1)
- 【請求項１】 核酸分子であって、 （ａ） 成熟後にヤドリギレクチンダイマーの生物学的
機能を示し、かつ以下の図： 【化１】 に示される核酸配列を有するプレプロタンパク質をコー
ドする； （ｂ） （ａ）に記載のプレプロタンパク質のフラグメ
ントであって、ヤドリギレクチンダイマーの生物学的に
活性な部分であるフラグメントをコードする； （ｃ） （ａ）または（ｂ）に記載の核酸分子とは遺伝
子コードの縮重に起因して異なる；または（ｄ） スト
リンジェントな条件下で（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）
に記載の核酸分子とハイブリダイズし、かつ（ａ）また
は（ｂ）に示される生物学的機能または活性を有するポ
リペプチドをコードする、核酸分子。
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| CN1104438C (zh) * | 1997-06-02 | 2003-04-02 | 山东医科大学附属医院 | 槲寄生提取物及其用途 |
| DE19804210A1 (de) * | 1998-02-03 | 1999-08-12 | Biosyn Arzneimittel Gmbh | Rekombinante Mistellektine |
| KR20010011330A (ko) * | 1999-07-27 | 2001-02-15 | 김종배 | 한국산 겨우살이 추출물과 이로부터 분리한 단백질 및 상기 단백질에서 분리한 렉틴 |
| DE10044027A1 (de) * | 2000-09-06 | 2002-03-14 | Viscum Ag | Rekombinant erzeugtes Mistellektin (ML III) |
| NZ526202A (en) * | 2000-11-14 | 2005-08-26 | Ian Pryme | Orally ingestible preparation of mistletoe lectins, ML-I, ML-II and ML-III and methods fro treating cancer and autoimmune diseases |
| DE60220068T2 (de) | 2001-07-09 | 2008-01-24 | University Of Copenhagen | Verfahren und ableger für die massenvermehrung von pflanzenparasiten |
| DE10149030A1 (de) | 2001-10-05 | 2003-04-10 | Viscum Ag | Stabile galenische gefriergetrocknete Arzneimittelzubereitung von rViscumin |
| ATE362106T1 (de) * | 2001-12-21 | 2007-06-15 | Viscum Ag | Verfahren zur bestimmung der responsivität eines individuums für mistellektin |
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| EP2723374B1 (de) * | 2011-06-27 | 2017-09-06 | Melema Pharma GmbH | Rekombinantes mistellektin und dessen verwendung als adjuvans |
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| DE4341476A1 (de) * | 1993-12-02 | 1995-06-08 | Uwe Dr Pfueller | Mittel zur Untersuchung und Beeinflussung zellulärer Veränderungen auf Lektinbasis |
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