KR20150079771A - Rtrail 변이체 및 이의 모노메틸 오리스타틴 e 접합체 - Google Patents

Rtrail 변이체 및 이의 모노메틸 오리스타틴 e 접합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 rTRAIL 변이체 및 이의 모노메틸 오리스타틴 E (MMAE) 접합체에 관한 것이다. 상기 아미노산 서열은 서열번호 1로 표기되며, 본 발명은 또한 rTRAIL 변이체를 코딩하는 유전자 및 상기 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 시스템, 재조합 벡터 및 발현 유니트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 rTRAIL 변이체-vcMMAE 접합체, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 접합체는 rTRAIL 변이체 및 MMAE 모두의 생물학적 기능을 갖고; 상기 MMAE는 rTRAIL 변이체 및 종양 세포 표면의 사멸 수용체 사이에서의 특이적 결합을 통하여 종양세포로 직접 전달되어, 분비되고 종양세포에서 효과를 발휘하므로, TRAIL에 대하여 덜 민감하거나 또는 심지어 내성을 나타내는 종양 세포를 사멸하고 MMA의 개별적 투여로 인하여 발생하는 독성을 감소시키는 효과를 발휘한다.

Description

RTRAIL 변이체 및 이의 모노메틸 오리스타틴 E 접합체 {RTRAIL MUTANT AND MONOMETHYL AURISTATIN E CONJUGATE THEREOF}
본 발명은 생명공학 및 의약품 분야, 특히, rTRAIL 변이체(mutant) 및 모노메틸 오리스타틴 E (monomethyl auristatin E; MMAE) 접합체(conjugate)에 관한 것이다.
종양괴사인자관련 세포사멸-유도 리간드 {TNF(Tumor necrosis factor) related apoptosis-inducing ligand; TRAIL, 또는 Apo2L 또는 TNFSF10}는 TNF 및 FasL 이후에 발견되는 TNF 과 (family) 중 세 번째 세포사멸 인자 (apoptosis factor)이며, 유망한 항암 생물학적 의약품으로 간주되고 있다. TRAIL 은 윌리 등 (Wiley et al.)의 방법으로 심근성 (myocardial) cDNA 라이브러리(library)로부터 클론화되고(cloned), 그 아미노산 서열이 TNF 상과 (superfamily)의 구조적 특성을 갖는 것 때문이 아니라, 쥬르카트 세포(Jurkat cells) 및 EB 바이러스(virus)-형질전환 인간 임파구 (transformed human lymphocytes)의 세포사멸을 유도할 수 있기에 부각되고 있다. TRAIL은 2형(type Ⅱ) 막전위 단백질(transmembrane protein)에 속하며 281 개 아미노산으로 구성되어 있다. 이의 N 말단(terminal; 1~17번째 아미노산)은 세포 내에 위치하고 이의 C 말단 (39 ~281 번째 아미노산) 은 세포 바깥으로 연장되어 있는데, 여기에서 114 ~ 281번째 아미노산들이 주요 기능을 수행한다.
다수의 전임상 연구자들은 TRAIL이 정상세포에 부작용이 없이 다양한 암세포의 세포사멸을 유도가능함을 확인한 바가 있다. 현재까지, TRAIL 및 이의 수용체-작동제 항체(receptor-agonist antibody)에 대한 1상(phase Ⅰ) 및 2상 임상 실험 (Ⅱ clinical trials)들이 해외에서 수행되어 왔으며, 예비적 효능이 확인되었다. 이외에도, TRAIL 은 NF-κB에만 매우 미약한 활성화 효과를 발휘하므로 전신적으로 투여하더라도 TNF-α 및 Fas-L에 의한 심각한 염증 반응과 같은 심각한 염증 반응을 유도하지 않을 것이다. 결론적으로, TRAIL 은 새로운 세대를 구성하는 항암용 의약품으로 개발가능성이 매우 높다.
세포막상에 위치함으로서, TRAIL은 NK 세포, T 세포, 대식세포(macrophage) 및 수지상 세포(dendritic cell)를 포함한 면역체계 세포들속에서 발현되며, 이는 시스테인 프로테아제(cysteine protease)에 의하여 수용성 형태(soluble form)로 변형될 수 있다. TRAIL 은 세포막 수용체와 결합하여 세포사멸-유도 역할을 수행한다. 현재까지, TRAIL-R1 (DR4, TNFSF10a) 및 TRAIL-R2 (DR5, TNFRSF10b); TRAIL-R3 (DcR1, TNFRSF10c) 및 TRAIL-R4 (DcR2, TNFRSF10d); 및 순환성(circulating) 오스테오프로테게린(osteoprotegerin; OPG, TNFRSF11b)을 포함한, 5 종의 TRAIL 수용체(receptors)들이 발견되었다. DR4 및 DR5은 사멸 도메인(death domain; DD)의 한 단편을 갖으며, 이는 수용체들과 결합하여, TRAIL 이후의 세포 사멸을 유도하는데 필수적이다. 기능성 사멸 도메인(functional death domain; DD)이 결여되어 있어, 기타 3 개의 수용체들은 TRAIL과 결합가능함에도 불구하고 세포사멸을 유도할 수 없다.
TRAIL의 DR4 또는 DR5과의 결합은 미토콘드리아-의존성(mitochondrial-dependent) 및 비 미토콘드리아-의존성 (non mitochondrial-dependent) 세포사멸 신호 전달체계 (apoptosis signaling pathways) 모두를 활성화하고, 세포로 전달될 사멸 신호 (death signal)를 매개하고, 효능자(effector)인 카스파제(Caspase)-3를 개시시키고, 결국 종양 세포 사멸(tumor cell apoptosis)을 유도가능하다.
최근에는, 재조합 수용성(recombinant soluble) TRAIL이 광범위한 인간 종양 세포주(human tumor cell lines)의 세포사멸을 유도함을 발견하였다. 그러나, 예를 들어, 모든 인간 흑색종 세포주(human melanoma cell lines), 대부분의 유방암 세포주 (breast cancer cell lines), 전립선 세포주 (prostate cancer cell line) LNcaP 등과 같은 특정한 종양세포들은 TRAIL에 대하여 낮은 민감도 (sensitivity) 또는 내성 (resistance)를 나타낸다. DR4 또는 DR5이 이러한 세포들 표면 상에서 다소 발현됨에도 불구하고 TRAIL의 DR4 또는 DR5의 결합은 세포의 세포사멸 경로와 관련된 주요 효소의 존재 또는 변이 및 기타 세포사멸 저해 단백질의 높은 발현 수준 때문에 세포의 최종 세포사멸을 유도할 수 없다.
이러한 세포들에 의해 생성된 고형암 치료를 위하여, 호환적인 치료 수단들이 긴급하게 필요하거나 또는 다른 측면에서, 예를 들어, 낮은 민감도 또는 내성을 갖는 종양 세포를 죽일 수 있도록 TRAIL을 변형하는 것도 또한 필요하다. 본 연구에서 나타난 바와 같이, 방사선 치료법 및 화학요법제로 수용성 재조합 (soluble recombinant) TRAIL (rTRAIL)과의 조합된 치료법이 rTRAIL에 대한 종양세포의 민감도를 증가시킬 수 있으며, 즉, 상기 두 가지 치료법으로 상승적 효과를 발휘할 수 있다. 현재, 전세계적으로 적용되는 rTRAIL은 95 ~ 281 번째 아미노산들의 단편들이다. 상기 rTRAIL 단량체(monomer)는 보다 우수한 생물학적 활성을 갖는 삼량체 (trimer)를 형성하는 경향을 갖고, 여기에서, 상기 삼량체의 상단은 삼량체 배위(conformation)를 안정화시키는 중요한 역할을 발휘하는 아연 이온 결합 부위를 갖는다.
조합 치료요법 프로토콜 (Combined treatment protocol)은 rTRAIL을 이러한 상기 약물들과의 동시투여법만을 포함하나, 이러한 이들 사이의 연계과정은 아직 정립되지 않아, 이는 직접적으로 이러한 약물들의 종양 세포로의 수송 실패를 초래한다. 따라서, 정상세포들의 이러한 위험성을 방지하기 위하여 저용량 (low-dose) 및 저 독성 (low-toxicity)을 갖는 약물들만을 통상 선택한다. 결국 보다 우수한 효력을 달성할 수 없다. 보다 강력한 종양 세포-사멸 약물(tumor cell-killing drugs)들의 사용이 종양 치료법에 보다 도움이 될 것이다. 예를 들어, 화학요법제 약물(chemotherapeutic drug)로 알려진 바가 있는 MMAE (Monomethyl auristatin E)은 합성 향 종양 소분자(synthetic anti-tumor small molecule)이며, 이는 세포 내에서 튜블린 (tubulin)의 이량화 (dimerization)를 저해함으로서 세포사멸을 유도한다. 그러나, 이러한 높은 비특이적 독성(unspecific toxicity)에 기인하여 , MMAE는 정상세포를 손상시킬 수 있다. 그러므로, MMAE 자체만으로 의약품으로 개발될 수는 없다. 이외에도, TRAIL 변이체 (mutants) 및 TRAIL 수용체(receptors)에 대한 항체(antibodies)에 대한 연구가 아직 진행중이나, 그 효능은 만족스럽지 못한 실정이다.
본 발명의 근본적인 해결 과제는 MMAE와의 접합 (conjugation)이 달성되고, 상기 단백질의 종양 세포-사멸능력 (tumor cell-killing ability)이 유의적으로 감소되지 않도록, 특정 아미노산이 시스테인(cysteine)으로 변이된, rTRAIL 변이체(mutant)를 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 측면으로서, 본 발명은 서열 번호(SEQ ID No.) 1로 표기되는 아미노산 서열을 갖는 rTRAIL 변이체 (mutant)를 제공하는 것이다.
상기 변이체는 TRAIL 단백질의 전장(full-length) 아미노산 서열 내에서 95 ~ 281 번째 아미노산 서열로부터 유래된 것이며, 109 번째 아스파라긴 (asparagine; Asn)이 시스테인(cysteine; Cys)으로 변이된 것이다.
본 발명의 또 하나의 측면으로서, 본 발명은 염기 서열(base sequence)이 서열번호 2로 표기되는, rTRAIL 변이체(mutant)를 코딩하는(encoding) 유전자를 제공한다. 상기 109 번째 아스파라긴 (asparagine; Asn)의 코돈(codon) AAT가 시스테인(Cys)의 코돈(codon)인 TGT로 변이된 것이다.
본 발명의 또 하나의 측면으로서, 본 발명은 상기 유전자를 함유한 발현 유니트 (expression unit), 재조합 벡터(recombinant vector) 또는 발현 시스템(expression system)을 제공하는 것이다.
상기 발현 유니트의 프로모터(promoter)는 T7이다. 상기 프로모터(promotor)들의 작용하에, rTRAIL 변이체는 대장균 (Escherichiacoli ; E. coli) 숙주 세포(host cells)에서 세포내 (intracellularly)에서 수용성 발현(soluble expression)을 직접적으로 달성가능하다.
상기 재조합 벡터의 원본 벡터(original vector)는 pET-28a(+)이다.
상기 발현 시스템은 박테리아(bacterium), 효모(yeast), 곤충세포(insect cell) 또는 포유동물 세포(mammalian cell) 발현 시스템, 바람직하게는, 박테리아 발현 시스템, 가장 바람직하게는, 대장균(E. coli) 발현 시스템으로부터 선택가능하다.
본 발명의 또 하나의 측면으로서, 본 발명은 MMAE을 rTRAIL 변이체 (mutant) 삼량체 (trimer)와 링커 (linker)를 통하여 접합시킴으로서(conjugating) 형성된, rTRAIL 변이체 (mutant) - MMAE 접합체 (conjugate)를 제공하는 것이다. 상기 MMAE의 합성 방법은 US 특허 문헌 (Patent No. 5,635,483, Tumer inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides)에 개시되어 있는 것이다.
본 발명에 사용된 상기 링커는 말레이미드-변형 (maleimide-modified) 발린(valine)-시트룰린(citrulline) 디펩티드(dipeptide)이며, 이는 문헌(Gene M.D., et al, Cathepsin B-Labile Dipeptide Linkers for Lysosomal Release of Doxorubicin from Internalizing Immunoconjugates: Model Studies of Enzymatic Drug Release and Antigen-Specific In Vitro Anticancer Activity, Bioconjugate Chem., 13(4), 855869 (2002))에 개시된 방법으로 합성가능하다.
본 발명의 링커를 갖는 MMAE (vcMMAE)은 회사 (Jiangyin Concortis Biotechnology Co., Ltd)에 위탁하거나 또는 문헌 (Svetlana O.D., et al, Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy [J], Nature Biotechnology., 21(7) 778-784(2003) 참조)에 설시된 방법으로 합성가능하다. 접합시에, 궁긍적으로, 본 발명의 접합체를 제조하기 위하여 알킬화 반응(alkylation reaction)은 발린(valine) 상의 말레이미드 (maleimide) 및 rTRAIL 변이체의 시스테인(cysteine) 설프하이드릴기 (sulfhydryl group) 사이에 수행되는 것이다.
본 발명의 또 하나의 측면으로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 rTRAIL 변이체-MMAE 접합체 (conjugate)를 제조하는 제조방법을 제공한다:
(1) rTRAIL 변이체 삼량체(mutant trimer)를 제조하기 위하여 rTRAIL 변이체 중합체(mutant polymer)를 해중합 (depolymerizd) 및 재중합 (re-polymerized)하는 단계; 상기 단계는 특히, 상기 rTRAIL 변이체를 아연이온(zinc ion)을 포함하는 완충액에서 용해시키는 단계; 여기에 트리스 (β-클로로에틸) 포스페이트 {tris(β-chloroethyl) phosphate (TCEP)}을 첨가하는 단계 및 수욕조 하에서 30℃ 내지 40℃ 온도 범위에서 1 내지 3 시간 동안 반응하는 단계;
상기 단계에서 TCEP를 첨가하는 목적은 중합체(polymer)가 rTRAIL 변이체들 사이에 디설피드 결합 (disulfide bond)에 의하여 생성가능하기에 단량 상태 (monomeric state)를 유지하기 위하여 상기 불안정한 중합체를 해중합 (depolymerized)이 되도록 하는 것이다. 한편, 상기 반응 시스템에서 아연 이온은 나아가 rTRAIL 변이체 단량체(mutant monomers)들이 안정한 삼량체(stable trimers)를 생성하도록 촉진 가능하다.
(2) 커플링 반응(coupling reaction)을 수행하기 위하여, 상기 rTRAIL 변이체 삼량체(mutant trimer)들을 링커를 갖는 MMAE와 혼합시키는 단계. 상기 커플링 반응 후에, 개개 삼량체는 1~3 MMAE 분자(들)과 결합가능하다; 상기 커플링 반응은 0 내지 4℃ 반응온도 및 30 내지 60분 동안 수행함이 바람직하다;
(3) 상기 반응 완료 후에, 분리 및 정제 공정을 통하여 상기 rTRAIL 변이체-MMAE 접합체를 수득하는 단계.
본 발명의 rTRAIL 변이체-MMAE 접합체 단량체의 분자량이 23 kDa이고 모든 기타 분자들의 분자량은 10 kDa 이하이기에 10kDa MWCO (분자량 컷-오프: Molecular Weight Cutoff)을 갖는 초여과용 튜브 (Ultrafiltration tube)가 상기 시스템의 소분자들을 제거하기에 적합하다. 그리고, 상등액을 얻기 위하여 원심분리법으로 침전물을 제거하고, 이후에 본 발명의 접합체를 수득하기 위하여 여과법 (filtration)으로 멸균하는 것이다.
변이를 위한 TRAIL 분자는 인간 종양(human tumor) 치료에 보다 유용하기 때문에 인간 또는 동물, 바람직하게는, 천연 인간-유래 TRAIL 분자 (natural human-derived TRAIL molecules)로부터 유래될 수 있다. 시스테인 하이드릴 기(cysteine sulfhydryl groups)는 안정한 삼량체를 형성하는데 모두 사용되는, 천연 rTRAIL 단량체 분자 (natural rTRAIL monomer molecules) 표면상에도 존재하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 삼량체 분자 표면상에 자유 설프하이드릴기(free sulfhydryl groups)가 없기에 접합 부위(conjugating site)가 없다.
결론적으로, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 시스테인 변이 부위(cysteine mutation site)를 포함하는, rTRAIL 변이체를 제조하기 위한 PCR 부위(site) - 지향 변이(directed mutation)를 제공하는 것이다:
(1) cDNA 라이브러리(library)를 얻기 위하여, 역전사(reverse transcription)를 위한 템플레이트(template)로 제공하기 위한 총 (Total) RNA을 인체 조직으로부터 추출하는 단계;
(2) TRAIL 코딩 서열(coding sequence)을 얻기 위하여, 프라이머(Primer) P1 및 P2을 템플레이트인 상기 cDNA과 함께 PCR 증폭 공정 (amplification)에 이용하는 단계;
(3) 변이된 서열 (mutated sequence)을 얻기 위하여, 프라이머(Primer) P3 및 P4을 템플레이트인 상기 TRAIL 코딩 서열(coding sequence)과 함께 PCR 부위(site)-지향(directed) 변이 증폭 공정(mutation amplification)에 이용하는 단계;
(4) 숙주 세포를 형질전환(transform)시키기 위하여, 상기 변이된 서열을 벡터(vector)에 실시가능하게 연계하는 단계;
(5) 상기 rTRAIL 변이체를 얻기 위하여, 상기 형질 전환된 숙주세포를 융합 단백질(fusion protein)을 발현하도록 유도하는 단계.
상기 프라이머 P1 및 P2 서열은 하기와 같다:
P1: 5’-ATGGCTATGATGGAGGTCCAGG-3’;
P2: 5’-TTAGCCAACTAAAAAGGCCCCG-3’;
상기 프라이머 P3 및 P4 서열은 하기와 같다:
P3: 5’-TATACCATGGGCACCTCTGAGGAAACCATT
TCTACAGTTCAAGAAAAGCAACAATGTATTTCT-3’;
P4: 5’-TTCTCGAGTTAGCCAACTAAAAAGGCCCC
GAAAAAACTGGCTTCATGGTCCATGTCCATGTC-3’.
본 발명의 또 하나의 측면으로서, 본 발명은 항-종양 약물(anti-tumor drugs)을 제조하기 위한 상기 rTRAIL 변이체-MMAE 접합체의 용도(Use)를 제공하는 것이다.
상기 항-종양 약물은 유효량의 상기 rTRAIL 변이체-MMAE 접합체 및 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 전달체 (carriers), 희석제(diluents) 또는 담체(excipients)를 포함하는 것이다. 통상 적으로 활성성분(active ingredient)은 담체와 혼합, 또는 담체로 희석되거나 또는 제조시 캡슐제(capsule) 또는 사케트 (sachet) 형태로 존재가능한 전달체(carriers)로 캡슐화(encapsulated) 가능하다. 담체가 희석제(diluents)로서 작용하는 경우에, 고체상(solid), 반고체상(semi-solid) 또는 액상 물질(liquid substances)들이 활성 성분의 담체, 전달체, 또는 매개체 (media)로서 적용된다. 따라서, 조성물(composition)은 정제(tablet), 환제 (pill), 산제(powder), 액제(solution), 시럽제(syrup) 및 멸균 주사제(sterilized injection) 등의 형태로 존재가능하다.
적절한 담체로는 락토스(lactose), 글루코스(glucose), 수크로스(sucrose), 소르비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol), 전분(starch), 미세결정성 셀룰로오스 (microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈 (polyvinyl pyrrolidone), 셀룰로오스(cellulose), 물(water) 등을 포함한다. 또한 상기 제제는 습윤제 (wetting agent), 현탁제(emulsifier), 방부제 {preservative; 예를 들어, 메틸 히드록시벤조에이트(methyl hydroxybenzoate) 및 프로필 히드록시벤조에이트 (propyl hydroxybenzoate)}, 감미제 (sweetener) 등을 포함할 수 도 있다. 상기 항-종양 약물은 단위 투여 형태 (unit dosage form) 또는 다수-단위 투여 형태 (multiple-unit dosage form) 또는 적절한 약학적으로 허용가능한 담체 및 예측된 효력을 계산한 미리 정한 양의 상기 rTRAIL 변이체-MMAE 접합체를 포함하는 개개 투여 형태로 제조가능하다.
상기 항-종양 약물들은 이에 제한되지는 않으나, 근육내(intramuscularly), 복강내(intraperitoneally), 정맥내(intravenously), 경피적 (subcutaneously), 피내 (intradermally) 및 국소적(locally) 투여법 등을 포함하는 당업계에 보편적인 방법으로 투여가능하다.
상기 약물을 사용시에는, 안전하고 유효한 양의 상기 rTRAIL 변이체-MMAE 접합체를 인간에게, 바람직하게는 0.5~50mg/kg 체중 (BW), 보다 바람직하게는, 1~10mg/kg BW 범위로 투여되는 것이다. 물론, 당업계의 숙련된 의사의 능력 범위 내에서, 투여경로, 환자의 건강상태 및 기타 인자들을 용량을 결정하는데 검토되어야 한다.
추가적으로, 본 발명의 상기 rTRAIL 변이체-MMAE 접합체는 이에 제한되는 않으나, IFN, TNF, IL-2 등과 같은 다양한 종류의 시토킨 (cytokines)을 포함하는 기타 약물; 예를 들어, 5-FU 및 메토트렉세이트 (methotrexate)와 같은 핵산 생합성에 영향을 미치는 약물; 니트로겐 머스타드(nitrogen mustard) 및 시클로포스파미드 (cyclophosphamide)와 같은 알킬화제 (alkylating agents); 아드리아마이신(adriamycin) 및 악티노마이신 (actinomycin) D와 같은 전사 (transcription) 저해 (interfering) 및 RNA 생합성 저해 약물 (RNA synthesis preventing drugs); 빈크리스틴(vincristine) 및 캠프토데신 (camptothecin)과 같은 단백질 생합성에 영향을 미치는 약물과 같은 다양한 종류의 종양 화학치료요법 약물 (tumor chemotherapeutic drugs); 및 몇몇 호르몬 약물 (hormone drugs) 등과 같은 기타 약물과 조합하여 사용가능하다.
선행 발명 또는 선행기술들과 비교시에 본 발명은 하기와 같은 보다 유익한 효과를 나타낸다:
(1) 본 발명의 상기 접합체는 종양 세포 외부에서 세포사멸을 유도하는 rTRAIL 변이체의 능력 및 세포 내에서 튜블린(tubulin)을 저해함으로서 세포사멸을 유도하는 MMAE의 능력을 포함하는, rTRAIL 변이체 및 MMAE 모두의 생물학적 기능을 갖는다. 상기 2개의 협력하에 항 종양 효력은 유의적으로 증강된다.
(2) rTRAIL 변이체가 특이적으로 종양 세포 표면상에 사멸 수용체 (death receptors)와 결합하면서, 본 발명의 접합체는 MMAE를 종양 세포에 지향적으로 수송하고, 이는 이후에 그 역할을 발휘하기 위하여 종양 세포 내에서 분비되고, TRAIL에 대하여 낮은 민감도 및 심지어 내성을 갖는 종양세포를 죽일뿐만 아니라, MMAE 단독 투여로 기인하는 독한 부작용을 감소시킨다.
(3) 본 발명 접합체의 rTRAIL 변이체가 MMAE와 접합된 이후에, 이의 수용액은 rTRAIL 분자 단독의 안정성보다 매우 우수한 안정성을 갖으며, 반복된 냉동 및 해동 이후에도 침전을 나타내지 않는 효과를 발휘한다.
(1) 본 발명의 상기 접합체는 종양 세포 외부에서 세포사멸을 유도하는 rTRAIL 변이체의 능력 및 세포 내에서 튜블린(tubulin)을 저해함으로서 세포사멸을 유도하는 MMAE의 능력을 포함하는, rTRAIL 변이체 및 MMAE 모두의 생물학적 기능을 갖고, 상기 2개의 협력하에 항 종양 효력이 유의적으로 증강되며; (2) rTRAIL 변이체가 특이적으로 종양 세포 표면상에 사멸 수용체 (death receptors)와 결합하면서, 본 발명의 접합체는 MMAE을 종양 세포에 지향적으로 수송하고, 이는 이후에 그 역할을 발휘하기 위하여 종양 세포 내에서 분비되고, TRAIL에 대하여 낮은 민감도 및 심지어 내성을 갖는 종양세포를 죽일뿐만 아니라, MMAE 단독 투여로 기인하는 독한 부작용을 감소시키며, (3) 본 발명 접합체의 rTRAIL 변이체가 MMAE와 접합된 이후에, 이의 수용액은 rTRAIL 분자 단독의 안정성보다 매우 우수한 안정성을 갖으며, 반복된 냉동 및 해동 이후에도 침전되지 않는 등의 선행 발명 또는 선행 기술보다 유익한 기술적 효과를 발휘한다.
도 1은 대장균(E. coli.)에 의하여 발현된 rTRAIL 변이체 N109C의 전기이동도(electrophoretogram)를 나타낸 도이며(여기에서 M은 저분자량 마커(marker)이며; 레인(lane) 1은 비유도성(non-induced) 박테리아 액체 (bacterial liquid)이며; 레인(lane) 2 및 3은 유도된 박테리아 액체이며; 레인(lane) 4 는 용해된 비유도성(non-induced) 박테리아 액체 (bacterial liquid)를 원심분리하여 얻은 상등액(수용성 분획: soluble fraction)을 나타내며; 레인(lane) 5 및 6는 용해된 유도성(induced) 박테리아 액체 (bacterial liquid)를 원심분리하여 얻은 상등액(수용성 분획)을 나타내며; 레인(lane) 7, 8 및 9 은 8M 우레아(urea)로 재조성된 유도되고 비-유도성(non-induced) 침전물 시료를 나타냄);
도 2은 rTRAIL 변이체 N109C의 친화성 정제 결과를 나타내는 전기이동도(electrophoretogram)를 나타낸 도이며(여기에서 M은 저분자량 마커(marker)이며; 레인(lane) 1 은 IPTG로 유도된 박테리아 액체이며 ; 레인(lane) 2 는 박테리아 용해후 상등액을 의미하며; 레인(lane) 3은 Ni 컬럼(column)을 통과한 통과액(flow-through)을 의미하며; 레인(lane) 4는 이미다졸 (10mM)의 유출물을(eluate) 의미하며; 레인(lane) 5은 이미다졸 (60mM)의 유출물을(eluate) 의미하며; 레인(lane) 6은 이미다졸 (500mM)의 유출물을(eluate) 의미함).
도 3은 rTRAIL 변이체 N109C의 SP 강한 양이온 교환 수지 컬럼 정제 결과를 나타내는 전기이동도(electrophoretogram)를 나타낸 도이며(여기에서 레인(lane) 1은 이미다졸 유출액(10mM)과 함께 탈염된 단백질 용액을 의미하며; 레인(lane) 2 및 3은 SP 컬럼으로 유출된 단백질, 즉, 정제된 N109C을 의미하며; 레인(lane) 4은 N109C의 비-변성(non-denaturing) 전기영동 실험 결과를 나타냄);
도 4은 N109C 및 이의 MMAE 접합체의 전기이동도(electrophoretogram)를 나타낸 도이며(여기에서 레인(lane) 1 은 N109C이며; 레인(lane) 2는 N109C-vcMMAE 접합체이며; 레인(lane) 3는 탈염된 N109C-vcMMAE 접합체이며; 레인(lane) 4, 5 및 6은 비-변성(non-denatured) 조건하에서 각각 레인(lane) 1, 2, 및 3 중 시료의 정기영동 실험 결과를 나타냄);
도 5은 rTRAIL 변이체-vcMMAE 접합체의 다양한 부위 중에서의 연관관계를 나타내는 개략도이며;
도 6은 다양한 세포주에 대한 다양한 TRAIL 성분들의 사멸 능력을 나타낸 도이며;
도 7은 종양-발생 마우스(tumor-bearing mice)에서의 N109C-vcMMAE 접합체의 분포를 나타낸 도이며;
도 8은 종양 세포에 의한 N109C-vcMMAE 접합체의 세포 식포작용 실험 결과를 나타낸 도이며;
도 9은 rTRAIL 변이체-vcMMAE 접합체의 세포사멸-유도 기전을 나타내는 개략도이다.
본 발명은 나아가 구현예 및 장점들이 적용됨을 나타내는 도면, 실시예 및 서열목록에 의해 기술된다.
하기의 예들은 단지 본 발명의 설명의 목적을 설명하고자 하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 제한하고자 함이 아니다.
실시예 1. rTRAIL 변이체 - vcMMAE 접합체 제조
1-1. 인간 전립선 cDNA 라이브러리(cDNA library)의 확립
(1) 인간 전립선으로부터 총 mRNA 의 추출
인간 전립선 조직 (human prostate tissue)의 냉동된 조그만 조직 (약 100mg)을 액체 질소에서 분말 형태로 갈고, TRIZOL 시약 (1mL)을 첨가하여 반복적으로 갈고 1.5ml RNase-제거(RNase-free) 에펜도르프 튜브 {eppendorf (EP) tube}에 옮겼다. 튜브를 5분간 상온에서 방치하고 0.2mL 클로로포름을 첨가한 후에 15초간 격렬하게 진탕하고 3분간 상온에서 방치하였다. 4℃에서 15분간 12000g로 원심분리하였다. 상부의 수상(aqueous phase)을 다른 RNase-제거(RNase-free) 에펜도르프 튜브로 옮겼다. RNA를 침전시키기 위하여 이소프로판올 (0.5mL)을 첨가하고 10분간 상온에 방치하였다. 12000g로 10분간 4℃에서 원심분리하고 상등액을 제거하였다. 얻은 침전물을 75% 에탄올로 세척하였다. 12000g로 5분간 4℃에서 원심분리하고 상등액을 제거하였다. 펠렛(pellet)을 건조하고 50μL DEPC 물로 용해시키고, -70℃에서 보관하였다.
(2) 역전사 (RT) PCR
프라이머 (primer)인 oligodT와 같이, 템플레이트(template)인 인간 전립선 (human prostate) 총(total) RNA, AMV 역전사효소(reverse transcriptase)을 첨가하여, 하기와 같은 단계를 포함하는 역전사(Reverse)-PCR을 수행하여 cDNA 라이브러리(library)를 수득하였다:
1. RNA 전-변성(pre-denaturation): 5μg 인간 전립선 RNA+25μg OligodT를 0.1% DEPC와 같이 10μL가 되도록 제조하였고, mRNA의 부차적 구조(secondary structure)를 제거하기 위하여 수욕조에서 5분간 70℃에서 반응시키고 상온으로 냉각시켰다.
2. RT: 합성 조건은 하기 표 1과 같다:
합성 조건
성 분 부 피
상기 RNA 혼합 용액(mixed solution) 10 μL
dNTP (각 10 mM) 3 μL
RNase 저해제（40 U/μL） 20 U
역전사효소 (Reverse transcriptase) 15 U
5× 완충액 (Buffer) 4 μL
0.1% DEPC 20 μL로 제조
PCR 프로그램은 (1) 역전사 공정(42℃, 60분), (2) 역전사 효소 불활성화(70℃, 10분) 조건을 수행하였다.
얻은 cDNA은 추후에 사용하기 위해 -20℃에서 보관하였다.
1-2. TRAIL 코딩 서열(coding sequence) 획득
템플레이트(template)로서의 cDNA, 상방향 (upstream) 및 하방향 (downstream) 프라이머로서의 P1 및 P2와 함께, TRAIL의 코딩 서열을 Taq DNA 폴리머라제 (polymerase)의 촉매(catalysis) 작용하에 합성 및 증폭하였다. 서열분석을 통하여 얻어진 DNA서열은 유전자 은행 (GenBank; NM_003842.4)에 등록된 TRAIL 코딩 서열, 즉, TRAIL 코딩 서열과 동일함을 확인하였다. 프라이머 서열은 하기와 같다:
P1: 5’-ATGGCTATGATGGAGGTCCAGG-3’;
P2: 5’-TTAGCCAACTAAAAAGGCCCCG-3’.
PCR 반응 시스템 조건은 하기 표 2과 같다:
PCR 반응 시스템 조건
성 분 부 피
5×PCR 완충액 (마그네슘 이온 함유) 10 μL
dNTP 혼합물 (각 2.5mM) 4 μL
P1 1 μL
P2 1 μL
cDNA 2 μL
효소 (Prime Star High-Fidelity enzyme; 2.5U/μL) 0.5 μL
ddH2O 31.5 μL
PCR 반응 프로그램은 하기 표 3과 같다:
PCR 반응 프로그램
전-변성 (pre-denaturation) 95℃ 3 분
변성 (denaturation) 95℃ 30초 30회 반복
풀림 (Annealing) 55℃ 30초
연장 (Extension) 72℃ 1 분
연장 (Extension) 72℃ 10 분
정지 (Hold) 4℃ 정지
1-3. TRAIL 95~281 ( rTRAIL ) 변이 서열 획득
(1) rTRAIL N109C 변이 서열(mutant sequence) 획득
템플레이트(template)로서의 TRAIL 코딩 서열(coding sequence), 상방향 (upstream) 및 하방향 (downstream) 프라이머로서의 P3 및 P4와 함께, rTRAIL N109C 변이체의 코딩 서열을 Taq DNA 폴리머라제 (polymerase)의 촉매(catalysis) 작용하에 합성 및 증폭하였다. 서열분석을 통하여 얻어진 DNA서열은 예상된 서열 번호 2 (SEQ ID No. 2)임을 확인하였다. 프라이머 서열은 하기와 같다:
P3: 5’-TATACCATGGGCACCTCTGAGGAAACCATT
TCTACAGTTCAAGAAAAGCAACAATGTATTTCT-3’;
P4: 5’-TTCTCGAGTTAGCCAACTAAAAAGGCCCC
GAAAAAACTGGCTTCATGGTCCATGTCCATGTC-3’.
프라이머들과 템플레이트를 제외하고, PCR 반응 시스템과 프로그램은 상기 1-2 단계와 동일하게 수행되었다.
(2) rTRAIL S96C변이 서열(mutant sequence) 획득
템플레이트(template)로서의 TRAIL 코딩 서열(coding sequence), 상방향 (upstream) 및 하방향 (downstream) 프라이머로서의 P5 및 P6와 함께, rTRAIL N109C 변이체의 코딩 서열을 Taq DNA 폴리머라제 (polymerase)의 촉매(catalysis) 작용하에 합성 및 증폭하였다. 서열분석을 통하여 얻어진 DNA서열은 예상된 서열 번호 4 (SEQ ID No. 4)임을 확인하였다. 프라이머 서열은 하기와 같다:
P5: 5’-TATACCATGGGCACCTGTGAGGAAACCATT
TCTACAGTTCAAGAAAAGCAACAAAATATTTCT-3’；
P6: 5’-TTCTCGAGTTAGCCAACTAAAAAGGCCCC
GAAAAAACTGGCTTCATGGTCCATGTCCATGTC-3’。
프라이머들과 템플레이트를 제외하고, PCR 반응 시스템과 프로그램은 상기 1-2 단계와 동일하게 수행되었다.
본원에서는 지금부터 rTRAIL N109C 변이체 서열(mutant sequence)을 rTRAIL 변이체(mutant)의 제조 및 접합체 구성을 추가로 상세하게 설명하기 위하여 실제 대표예로서 채택하여 설명하였다. rTRAIL S96C 변이체의 제조 및 접합체의 구성도 동일하다.
1-4. rTRAIL 변이체 서열(mutant sequence)을 포함하는 발현 벡터의 구성
rTRAIL N109C 변이체 서열 및 pET28a(+)을 NcoI/XhoI으로 각각 이중-소화 (double-digested)시키고 다음에 T4 라가제(ligase, Takara)와 몰 비(3:1)로 결찰(ligated)시켰다. 상기 결찰 산물을 E. coli DH5a 상응 세포(competent cells)에 형질전환시켰고, 양성 클론들(positive clones)을 선별하고 배양하였다. 플라즈미드 (plasmid)를 추출한 후에, NcoI/XhoI 이중-소화작용을 이들의 결찰을 확인하기 위하여 사용하고 염기서열결정(sequencing)을 추가 확인을 위하여 이용하였으며, 결국, rTRAIL 변이체 발현 벡터(mutant expression vectors)인 pET28a(+)-rTRAIL N109C을 수득하였다.
1-5. 조작된 박테리아 (engineered bacteria) 확립을 위한 대장균(E. coli )으로의 발현 벡터의 형질전환
발현 벡터 pET28a(+)-rTRAIL N109C를 대장균 (E. coli) 발현 숙주(expression host, BL21 (DE3), Novagen사 구입)으로 형질전환시켰고, 단일클론 (monoclone)을 카나마이신 (kanamycin) 플레이트로부터 선별하였으며 37℃에서 160 rpm 속도로 하룻밤동안 배양하였다. 박테리아 액체 (bacterial liquid) PCR 방법을 rTRAIL 변이체 발현벡터 (mutant expression vector)가 발현 숙주로 형질전환되었는지 여부를 확인하는데 이용하였다. 템플레이트(template)로서의 박테리아 액체(bacterial liquid), 프라이머로서 P3 및 P4과 함께, PCR을 수행하였다. 확인된 양성 단일클론이 원하는 조작된 박테리아(engineered bacteria)로 동정되었으며 상기 박테리아 액체를 10~15% 글리콜(glycerol) 첨가 후에 -80℃에서 보관하였다.
1-6. rTRAIL 변이체 제조 및 정제
구성된 조작된 박테리아(constructed engineered bacteria)를 LB 배양용 배지 (200mL, 15μg/mL 카나마이신 함유)에 접종하고, 박테리아 액체 (bacterial liquid) OD600가 약 0.8에 도달할 때까지 37℃에서 160 rpm 회전 속도로 진탕하면서 배양하였다. 12시간의 유도시간(induction time)으로 융합 단백질(fusion protein)을 발현시키고 BL21 (DE3)를 유도하기 위하여 IPTG (최종 농도: 1mM)를 첨가하였다. 10분간 7200g로 원심분리하여 BL21 박테리아를 획득하였다.
상기 박테리아를 완충액 (buffer) A를 적재하여 재현탁시키고 프레스 (French press)로 파괴시켰다. 30분간 7200g 원심분리한 후에, 상등액을 0.22μm 수막(water membrane)을 통하여 여과하고 Ni-NTA 친화 컬럼 (affinity column; GE)으로 금속 친화 크로마토그래피(metal affinity chromatography)를 수행하였다. 이미다졸 (Imidazole; 10mM)을 불순물인 기타 단백질을 용출시키기 위하여 사용하고 이미다졸 (Imidazole; 60mM)을 이용하여 목표 단백질 (target protein)을 수득하였다. 이미다졸 (Imidazole; 60mM)로 용출된 분획물을 이의 완충액을 완충액 (buffer) B로 치환시키기 위하여 탈염 컬럼(desalinization column, GE)으로 처리하였으며, 이후 SP 강한 양이온 교환 수지 컬럼 (SP strong cation exchange column; GE)을 이용한 이온 교환 수지 크로마토그래피법을 수행하였다. 완충액(Buffer) C를 이온교환 수지 컬럼 상에 단백질을 용출시키기 위하여 사용하였다.
여기에서, 개개 완충액의 성분은 하기와 같다:
완충액(Buffer) A: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 7.4
완충액(Buffer) B: 20 mM NaH2PO4, pH 6.0
완충액(Buffer) C: 20 mM NaH2PO4, 1 M NaCl，pH 6.0
도 1, 도 2 및 도 3은 원핵성 발현(prokaryotic expression)의 전기이동도(electrophoretogram) 및 rTRAIL N109C 변이체의 정제과정을 나타낸 것이다. 도 1에 나타난 바와 같이, rTRAIL N109C 변이체는 대장균(E. coli)에서 수용성 발현(soluble expression)을 성공적으로 달성하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, rTRAIL N109C 변이체를 이미다졸 (10mM)로 용출을 개시하였고 이의 순도(purity)는 예비 정제(preliminary purification) 완료 후에 85%이하로 나타났다. 도 3에 나타난 바와 같이, 기타 단백질의 일부를 SP 컬럼을 이용한 정제과정을 통하여 제거가능하나 아직 3개의 미약한 원치않는 밴드(bands)가 발견되었다. 또한, 비-변성(non-denaturing) 겔 전기영동(gel electrophoresis) 분석결과로, 이량체(dimers), 사량체(tetramers) 등이 실질적으로 정제된 rTRAIL N109C 변이체에서 아직 발견되었으며, 이는 변이 단백질 분자(mutant protein molecule) 사이의 디설피드 결합(disulfide bond)에 기인한다.
얻어진 N109C 변이체의 아미노산 서열(amino acid sequence)은 서열번호 (SEQ ID No.) 1로 나타났으며, 얻어진 S96C 변이체의 아미노산 서열(amino acid sequence)은 서열번호 (SEQ ID No.) 3으로 나타났다.
1-7. rTRAIL 변이체 및 MMAE 과의 접합(Conjugation)
0.5mg rTRAIL N109C 변이체를 0.8 mL PBS (pH 6.0, 10 μM ZnCl2 함유)에 용해시키고, 6μL TCEP을 첨가하고 수욕조 상에서 37℃에서 2시간 유지시켰다. 교반하면서, 50μL 30% 아세토니드릴/물(acetonitrile/water)에 용해시킨 10-배 과량의 vcMMAE을 첨가하고 4℃에서 40분 동안 반응시키고 상기 반응을 과량의 시스테인(cysteine)을 첨가하여 중지시켰다. {상기 vcMMAE는 회사(Jiangyin Concortis Biotechnology Co., Ltd)에서 합성되고, 10-배(fold) 과량은 반응계에서 몰량(molar quantity)의 vcMMAE이 N109C의 몰량의 10배 이상 또는 동등함을 의미한다}. 반응계에서 소분자들을 제거하기 위하여 10kDa MWCO (Millipore)을 갖는 초여과 튜브(Ultrafiltration tube)를 사용하였다. 박테리아를 제거하기 위하여, 얻은 접합체를 0.22μm (pore size) 수막(water membrane)을 통하여 여과시키고 추후 사용을 위하여 -20℃에서 보관하였다.
도 4는 N109C 및 MMAE의 접합을 위한 전기이동도를 나타낸 도이다. 도에 나타난 바와 같이, 단백질 밴드는 접합체(conjugate)가 생성시에 명백하게 이동하였고, 이는 소분자인 MMAE가 전기영동 형상이 변화한 것과 같이, 단백질과 접합한 것이다. 레인(lane) 4를 레인(lane) 1와 비교시에, 1개의 시스테인 기(cysteine residue)가 N109C에서 변이되었으므로 중합체가 존재함을 보여준다. 추가적으로, 레인(lane) 6를 레인(lane) 3와 비교시에, 접합 도중에, rTRAIL N109C 중합체는 TCEP에 의하여 해중합되고 (deploymerized), 아연 이온 (zinc ion)은 N109C 단량체 (monomer)를 안정된 삼량체 (trimer)로 변화하는 것을 촉진시켰다. 이의 시스테인 설프하이드릴기 (cysteine sulfhydryl group) 및 vcMMAE의 말레이미드기(maleimide group) 사이에, 상이한 수의 MMAE와 결합된 접합체를 수득하기 위하여 알킬화 반응(alkylation reaction)이 수행되었다. rTRAIL 변이체-vcMMAE 접합체의 다양한 부위(portions) 중에서의 연관관계를 도 5에 나타냈다.
1-8. 접합체의 시험관내 (in vitro) 항-종양 활성 측정
rTRAIL 변이체 및 MMAE 접합체의 시험관내(in vitro) 항-종양 활성을 측정하기 위하여 하기 4종의 세포를 선택하였다: TRAIL 민감형(sensitive type) (NCI-H460), TRAIL 불감형 (insensitive type) (Hela), TRAIL 내성형 (resistant type) (MCF-7) 및 정상 세포(normal cells) (HEK293). 상기 모든 4종의 세포들은 그 표면에 TRAIL 사멸 수용체(death receptor)를 갖고 있다.
지금부터, TRAIL 민감형 (sensitive type) NCI-H460 세포를 하기 단계를 포함하는 실험 과정의 상세한 설명을 위하여 실제 대표예로서 채택하여 설명하였다:
(1) NCI-H460 세포를 개별 세포로 소화시킨 후에(Digesting), 1×104 cells/mL로 희석하고, 세포들을 96-웰 플레이트(well plate)에 분산시키고 (개개 웰 당 100μL), 정상 조건하에 24시간동안 세포를 배양하였다.
(2) 배양배지로 N109C, N109C-vcMMAE 및 S96C-vcMMAE를 각각 희석한 후에, 이들을 시험 군(test groups)으로서, 상기 셀 플레이트에 최종농도 32, 63, 125, 250, 500, 1000ng/mL로 첨가하였으며, 양성 대조군(positive control group)으로서 표준(standard) TRAIL (114~281), 음성 대조군(negative control group)으로서 완충액(buffer, 시험 시료 용해에 사용, 동일한 방법으로 배양 배지에 희석함), 블랭크 대조군(blank control group)으로서 배양 배지(어떠한 용액도 무첨가)를 각각 이용하였다. 모든 대조군 (control groups) 및 시험군 (test groups)은 삼중치(triplicate)로 시험하였다.
(3) 대조군 (control groups) 및 시험군 (test groups) 중 시료를 개개 셀플레이트에 첨가한 후에, 37℃에서 96시간 동안 배양하고, 대조군 (control groups) 및 시험군 (test groups)의 목표 세포(target cells)를 사멸시키는 능력을 관찰하였다.
(4) 배양 완료후, 10μL CCK-8 색상(color)-전개용 용액 (developing solution)을 개개 웰(well)에 첨가하고, 배양기에서 1시간 동안 색상 전개 (color-developing)를 위하여 시료를 배양하고, 이들을 빼서 450nm 및 630nm의 이중-파장(dual-wavelength)에서 측정하였다.
(5) 결과 계산: 음성 군(negative group)의 동일 희석액의 OD 값(value)보다 큰 OD 값을 갖는 시험군(test group) 중 시료를 양성(positive)으로 간주하였다 (t-test, P<0.01). 계산 결과를 도 6에 나타냈다.
도 6에 나타난 바와 같이, 4개의 서로 상이한 세포들에 대하여, rTRAIL mutant-vcMMAE 접합체는 rTRAIL 변이체보다 종양 세포에 대하여 보다 강력한 사멸 능력(killing ability)을 나타냈다.
NCI-H460 세포에 대해서, rTRAIL 변이체 및 이의 MMAE 접합체는 TRAIL (114~281)의 활성보다 우수하지 않았다.
Hela 및 MCF-7세포에 대해서, rTRAIL 변이체-vcMMAE 접합체는 TRAIL (114~281)과 비교시 고농도에서 보다 강력한 사멸능력을 발휘하였으나, 저농도 (＜250 ng/mL)에서는 약간 미약한 사멸능력을 나타냈다. 그 이유는 세포에 의하여 세포내 이입된 (endocytosed) rTRAIL 변이체-vcMMAE 접합체는 저농도에서는 세포사멸을 유도하기에 충분한 양을 축적하지 못한 것 같다. 따라서, 보다 높은 고농도는 보다 우수한 사멸 능력을 발휘하였다. 게다가, N109C-vcMMAE은 저농도 및 고농도 모두에서 S96C-vcMMAE보다 강력한 사멸능력을 나타냈다.
정상(normal HEK2930 세포에 대해서, TRAIL (114~281), rTRAIL 변이체 및 이의 MMAE 접합체 모두가 매우 낮은 독성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
1-9. 종양-발생(tumor-bearing) 동물 모델에서의 접합체의 분포
N109C-vcMMAE 을 실제 례 (example)로서 채택하고, 접합체를 접합체의 종양 목표 능력(tumor targeting ability)을 관찰하기 위하여 형광표지 방법(Fluorescent labeling method)으로 마우스에서 실시간(real-time) 추적 조사하였다.
(1) 종양-발생(tumor-bearing) 동물 모델의 확립
20g의 무흉선(Athymic) 마우스(mice)를 선택하고 107NCI-H460 세포를 앞다리 한 측면 겨드랑이에 경피적으로 주사하였다. 3일 후, 종양 생성을 확실하게 관찰할 수 있었다.
(2) 접합체의 형광 표지(Fluorescent labeling)
동물 피부를 통과시켜 형광성을 촉진시키고 실시간 활력도 관찰(vital observation) 목표를 달성하기 위하여, Near-IR-활성 염료(activated dye)인 Cy5를 형광표지에 사용하였다. Cy5 표지법(labeling)의 구체적인 방법에 관해서는 제조자((Lumiprobe 사)로부터 제공되는 지시내용(instruction)을 참조바람.
(3) 투여 및 실시간 관찰
약 50μg Cy5-표지(labeled) 접합체(conjugate)를 함유하는 200μL 시료를 꼬리 정맥을 통하여 종양-발생 마우스에 주사하였고, 동일 용량의 보통 식염수(normal saline)를 블랭크 대조군(blank control group)으로 주사하였다.
소형 생존 동물 현상기(Small living animal imager, NightOWLN320)로 매 24시간 마다 마우스에의 형광도 분포를 관찰하기 위하여 사용하였다. 관찰 전에, 12 시간 절식시킨 후에 마우스를 에테르로 마취시키고 마우스의 전신적 형광 현상(systemic fluorescence)이 완전하게 소실될 때까지 4일간 연속적으로 관찰하였다. 4일째 후에 마우스를 살생하고 심장, 간, 비장, 폐, 신장 및 종양 세포를 분리하였다. 시험군에서 개개 동물 조직에서의 접합체의 특이적 분포를 소형 생존 동물 현상기로 관찰하였다. 현상 결과는 도 7에 나타냈다. 백색 화살표(white arrow)는 종양 부위를 나타낸다.
도 7에 나타난 바와 같이, 대부분의 형광현상은 3일째에 동양 부위에 모아 졌고, 종양 부위만이 4일째에 형광을 나타냈다. 동물을 살생한 후에, 생체내 (in vivo)에서 실시간으로 탐지되는 형광 현상과 본 실험 결과가 일치하였으며, 이는 N109C-vcMMAE 가 매우 추수한 종양-목표화 효과(tumor-targeting effect)를 나타냄을 확인한다.
1-10. 항 종양 활성에 대한 접합체의 분자적 기전연구
NCI-H460 세포를 실제 례 (example)로서 채택하고, 하기 과정을 포함하는 레이져 공초점 기술 (laser confocal technology)에 의하여 종양세포에서의 rTRAIL 변이체-vcMMAE 접합체의 양성을 관찰하였다:
(a) 커버슬립(coverslip)을 1M HCl 및 70% 에탄올(ethanol) 용액에 침적시키고, 30분간 초음파 처치(ultrasonic treatment)를 수행하고, 멸균으로 이중증류된 증류수로 5~6 회 세척하고 추후 사용을 위하여 멸균시켰다;
(b) 완전-멸균된 커버슬립을 24-웰 플레이트에 위치하고, 세포를 104 세포/웰(well)로 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다;
(c) 투여: N109C-vcMMAE 및 S96C-vcMMAE을 1μg/mL 최종농도가 되도록 각각 희석하고, 세포를 서로 다른 시점들(1, 4, 8 및 12 시간째)에서 하기 단계 (d)에 따라 처치하고, 약물-제거(drug-free) 배양 배지를 블랭크 대조군(blank control group)으로 사용하였다;
(d) 커버슬립을 3회 냉(cold) PBS로 세척하고 상온에서 10분간 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정시켰다;
(e) PBS를 다시 3회 커버슬립을 세척하는데 이용하였다;
(f) 0.1% Triton X-100를 상온에서 10분간 투과되도록 첨가하였다;
(g) 2% BSA 를 PBS로 3회 세척후 30분간 반응을 차단하기 위하여 첨가하였다;
(h) 1차 항체 배양(Primary antibody incubation): 토끼 항-인간(rabbit anti-human) rTRAIL 다클론성 항체(polyclonal antibody)을 1% BSA/PBS으로 1 μg/mL 농도로 희석하고 상온에서 45분간 동안 배양하였다;
(i) 2차 항체 배양(Secondary antibody incubation): FITC-표지 염소 항-토끼 2차 항체(labeled goat anti-rabbit secondary antibody)를 1% BSA/PBS로 500배 희석하고 상온에서 45분간 배양하였다;
(j) 세포 핵(cell nucleus)의 DAPI 염색: PBS 세척 (3회) 후에, PBS로 DAPI를 1000-배 희석액을 한 후에, 개개 커버슬립 (세포를 바로 덮기에 적절함)에 점적하고, 커버슬립을 25℃에서 약 2분간 배양하였다;
(k) 봉입(Mounting): PBS 세척 후에, 봉입 배지(Anti-fade Fluorescence Mounting Medium) 한방울을 커버슬립에 첨가하고 커버슬립을 슬라이드 글래스 (glass slide) 상에 뒤집어 위치시키고 커버슬립 주위를 네일 폴리쉬 (nail polish)로 밀봉시켰다;
(l) 공초점 탐지(Cofocal detection): 탐지 결과를 도 8에 나타냈다.
도 8에 나타낸 청색 형광 부분은 세포 핵이고 녹색 형광 부분은 rTRAIL 변이체-vcMMAE 접합체 부분이다. 투여 1시간 후에, 많은 N109C-vcMMAE이 세포 내로 진입하고 4시간 후에는 보다 많은 N109C-vcMMAE 가 진입하고 서서히 응집하기 시작했다. 8시간 후에, 세포 내에서 보다 많은 응집 포인트(aggregating point)들이 나타났다. 12시간 후에, 세포내의 상기 응집 포인트들이 점차 감소하고 세포 사멸(cell apoptosis)이 개시되고 세포핵에서 이질적으로 나타났다.
본 발명자들은 상기 rTRAIL mutant-vcMMAE 접합체의 작용 기전이 하기와 같음을 결론지었다: 상기 접합체가 rTRAIL 변이체를 통하여 종양 세포 표면상의 사멸수용체(death receptors)와 결합하고 종양 세포에 의하여 세포내 이입되어 식포 (phagosome)를 형성하고, 이는 이후에 리소솜 (lysosomes)과 융합된다. 접합체에서의 디펩티드 링커 암 (dipeptide linker arm)이 MMAE가 분비되도록, 리소솜 카텝신 (lysosomal cathepsin)에 의하여 가수분해되고, 이는 종양세포에서 중요한 역할, 즉, 튜블린(tubulin)의 이량체화 (dimerization)를 저해함으로서 세포사멸을 유도하는 역할을 수행할 것이다. 그 세포사멸-유도 기전 (apoptosis-inducing mechanism)은 도 9에 나타냈다.
SEQUENCE LISTING <110> ZHEJIANG UNIVERSITY <120> RTRAIL MUTANT AND MONOMETHYL AURISTATIN E CONJUGATE THEREOF <130> <160> 10 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 1 Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Cys Ile 1 5 10 15 Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile 20 25 30 Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys 35 40 45 Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg 50 55 60 Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu 65 70 75 80 Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe 85 90 95 Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met 100 105 110 Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu 115 120 125 Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly 130 135 140 Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp 145 150 155 160 Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His 165 170 175 Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 180 185 <210> 2 <211> 561 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 2 acctctgagg aaaccatttc tacagttcaa gaaaagcaac aatgtatttc tcccctagtg 60 agagaaagag gtcctcagag agtagcagct cacataactg ggaccagagg aagaagcaac 120 acattgtctt ctccaaactc caagaatgaa aaggctctgg gccgcaaaat aaactcctgg 180 gaatcatcaa ggagtgggca ttcattcctg agcaacttgc acttgaggaa tggtgaactg 240 gtcatccatg aaaaagggtt ttactacatc tattcccaaa catactttcg atttcaggag 300 gaaataaaag aaaacacaaa gaacgacaaa caaatggtcc aatatattta caaatacaca 360 agttatcctg accctatatt gttgatgaaa agtgctagaa atagttgttg gtctaaagat 420 gcagaatatg gactctattc catctatcaa gggggaatat ttgagcttaa ggaaaatgac 480 agaatttttg tttctgtaac aaatgagcac ttgatagaca tggaccatga agccagtttt 540 ttcggggcct ttttagttgg c 561 <210> 3 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 3 Thr Cys Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile 1 5 10 15 Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile 20 25 30 Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys 35 40 45 Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg 50 55 60 Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu 65 70 75 80 Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe 85 90 95 Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met 100 105 110 Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu 115 120 125 Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly 130 135 140 Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp 145 150 155 160 Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His 165 170 175 Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 180 185 <210> 4 <211> 561 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 4 acctgtgagg aaaccatttc tacagttcaa gaaaagcaac aaaatatttc tcccctagtg 60 agagaaagag gtcctcagag agtagcagct cacataactg ggaccagagg aagaagcaac 120 acattgtctt ctccaaactc caagaatgaa aaggctctgg gccgcaaaat aaactcctgg 180 gaatcatcaa ggagtgggca ttcattcctg agcaacttgc acttgaggaa tggtgaactg 240 gtcatccatg aaaaagggtt ttactacatc tattcccaaa catactttcg atttcaggag 300 gaaataaaag aaaacacaaa gaacgacaaa caaatggtcc aatatattta caaatacaca 360 agttatcctg accctatatt gttgatgaaa agtgctagaa atagttgttg gtctaaagat 420 gcagaatatg gactctattc catctatcaa gggggaatat ttgagcttaa ggaaaatgac 480 agaatttttg tttctgtaac aaatgagcac ttgatagaca tggaccatga agccagtttt 540 ttcggggcct ttttagttgg c 561 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 5 atggctatga tggaggtcca gg 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 6 ttagccaact aaaaaggccc cg 22 <210> 7 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 7 tataccatgg gcacctctga ggaaaccatt tctacagttc aagaaaagca acaatgtatt 60 tct 63 <210> 8 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 8 ttctcgagtt agccaactaa aaaggccccg aaaaaactgg cttcatggtc catgtccatg 60 tc 62 <210> 9 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 9 tataccatgg gcacctgtga ggaaaccatt tctacagttc aagaaaagca acaaaatatt 60 tct 63 <210> 10 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 10 ttctcgagtt agccaactaa aaaggccccg aaaaaactgg cttcatggtc catgtccatg 60 tc 62

Claims (10)

  1. 서열 번호(SEQ ID No) 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖음을 특징으로 하는 rTRAIL 변이체.
  2. 서열 번호(SEQ ID No) 2로 표시되는 염기 서열을 갖음을 특징으로 하는 제 1항의 rTRAIL 변이체를 코딩하는 유전자.
  3. 제 2항의 유전자를 함유하는 발현 유니트, 재조합 벡터 또는 발현 시스템.
  4. 모노메틸 오리스타틴 (MMAE)을 서열 번호 1로 표시되는 rTRAIL 변이체 아미노산 서열을 갖는 rTRAIL 변이체의 삼량체와 링커를 통하여 접합시킴으로서 형성됨을 특징으로 하는, rTRAIL 변이체- MMAE 접합체.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 링커는 말레이미드-변형 발린-시트룰린 디펩티드인 rTRAIL 변이체- MMAE 접합체.
  6. 항-종양 약물의 제조를 위한 제 4항 또는 제 5항에 따른 rTRAIL 변이체- MMAE 접합체의 용도.
  7. 하기 단계를 포함하는 rTRAIL 변이체-MMAE 접합체를 제조하는 제조방법:
    (1) rTRAIL 변이체 삼량체를 제조하기 위하여, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 rTRAIL 변이체의 중합체를 해중합 및 재중합하는 단계; (2) 커플링 반응을 수행하기 위하여, 상기 rTRAIL 변이체 삼량체를 말레이미드-변형 발린-시트룰린 디펩티드 링커를 갖는 MMAE와 혼합시키는 단계; (3) 상기 반응 완료 후에, 분리 및 정제 공정을 통하여 상기 rTRAIL 변이체-MMAE 접합체를 수득하는 단계.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 rTRAIL 변이체를 아연이온을 포함하는 완충액에서 용해시키는 단계; 여기에 트리스 (β-클로로에틸) 포스페이트 (TCEP)을 첨가하는 단계; 및 수욕조 하에서 30℃ 내지 40℃ 온도 범위에서 1 내지 3 시간 동안 반응하는 단계를 포함하는 방법으로 제조됨을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 커플링 반응은 4℃ 이하의 반응 온도에서 30 내지 60분 동안 수행함을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제 7항에 있어서,
    상기 분리 및 정제 공정은 초여과법 (ultrafiltration)에 의하여 반응 용액으로부터 10 kDa 이하의 분자량을 갖는 물질들을 제거하는 단계; 상등액을 얻기 위하여 원심분리법으로 침전물을 제거하는 단계; 및 rTRAIL 변이체-MMAE 접합체를 수득하기 위하여 여과법으로 상등액을 멸균하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
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