KR102167382B1

KR102167382B1 - 대장암 세포주 유래 amf를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물

Info

Publication number: KR102167382B1
Application number: KR1020180163372A
Authority: KR
Inventors: 박희성
Original assignee: 대구가톨릭대학교산학협력단
Priority date: 2018-12-17
Filing date: 2018-12-17
Publication date: 2020-10-19
Also published as: KR20200074686A

Abstract

본 발명은 대장암 세포주 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명의 대장암 세포주 유래 AMF는 백혈암의 증식을 억제하고, 세포사멸을 일으키는 효과가 우수하므로, 대장암 세포주 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 항암치료제로 사용될 수 있다.

Description

대장암 세포주 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물{Anticancer composition comprising colon cancer cell line-derived autocrine motility factor as effective component}

본 발명은 대장암 세포주 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 백혈암에 대하여 항암 효과를 나타내는 대장암 세포주 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물에 관한 것이다.

암은 세계적으로 감염성 질환 및 심혈관계 질환과 더불어 3대 사망원인 중 하나로, 환경문제, 수명연장, 식문화의 서구화 등으로 인해 향후 암 발생인구가 급격하게 증가할 것으로 예상되는 주요 질환이다. 보다 더욱 효과적인 항암제의 개발을 위해 암에 대한 많은 연구가 진행되고 있음에도 불구하고 암의 발병기전의 다양화로 인해 부작용이 적고 내성을 극복할 수 있는 새로운 항암제의 개발이 여전히 절실한 상황이다.

한편, 세포경쟁은 세포간 생장 적응 및 생존의 비교 과정으로, 경쟁에서 밀리는 세포는 사멸될 수 있다. 세포경쟁은 암 발생과 밀접한 연관성을 지니는데 암세포에 비해 생장 적응력이 열세인 주변의 세포는 사라질 수 있다. 현재까지 경쟁에서 우위를 점하는 세포(winner cell)가 세포경쟁 초기에 세포사멸신호(death signal)를 분비할 것으로 가정되어 왔으나 규명된 바 없다.

한편, AMF(autocrine motility factor)는 하우스키핑(housekeeping) 단백질로서 세포 내에서 에너지 대사와 관련하여 해당작용(glycolysis)의 두 번째 과정의 글루코오스-6-포스페이트(glucose-6-phosphate)와 프락토오스-6-포스페이트(fructose-6-phosphate)를 상호전환(interconversion)하는 역할을 하는 것으로 알려졌으며, 이러한 기능으로 인해 글루코오스-6-포스페이트 이성질화제(glucose-6-phosphate isomerase, GPI)라고 불리기도 한다. 종양에서 분비되는 사이토카인인 AMF는 종양 부위에 풍부하며 종양의 증식, 분화 및 생존에 중요 역할을 지니는 것으로 알려져 있다.

한편, 한국공개특허 제2016-0050773호에는 AMFR-Fc 융합 단백질 및 이의 항암용도를 개시하고 있지만, 본 발명의 암세포 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물은 개시된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 대장암 세포주 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물을 제공하고, 상기 조성물이 백혈암의 증식을 억제하고, 세포사멸을 일으킨다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 대장암 세포주 유래 AMF(autocrine motility factor)를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항암용 약학 조성물을 인간을 제외한 포유동물 내에 투여하는 단계를 포함하는 암세포의 증식억제 또는 세포사멸 증진방법을 제공한다.

본 발명은 대장암 세포주 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 대장암 세포주 유래 AMF는 백혈암의 증식을 억제하고, 세포사멸을 일으키는 효과가 우수하므로, 대장암 세포주 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 항암치료용 소재로 사용될 수 있다.

도 1은 대장암세포 조정배지(conditioned medium, CM)를 타 암세포주에 처리하였을 때, CM을 처리하지 않은 대조군 대비 CM 처리군의 세포 증식율을 MTT 분석을 통해 나타낸 결과이다. A549는 폐암 세포주, HeLa는 자궁경부암 세포주, Hep G2는 간암 세포주, HL-60은 백혈암 세포주, U-87 MG는 뇌암 세포주, MCF-7은 유방암 세포주이다.
도 2는 대장암 유래 재조합 AMF와 GPI 동형단백질(Genbank accession number: BC004982.1)의 아미노산 서열을 비교한 결과이다. (A)는 GPI 동형단백질의 아미노산 서열이고, (B)는 대장암 유래 재조합 AMF의 아미노산 서열이다.
도 3은 정제한 대장암 유래 재조합 AMF 처리에 의한 백혈암 세포(HL-60)의 세포 수 변화를 측정하여 재조합 AMF를 처리하지 않은 대조군과 비교한 결과이다. rAMF는 대장암 유래 재조합 AMF이다.

본 발명은 대장암 세포주 유래 AMF(autocrine motility factor)를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 대장암 세포주는 인간 유래의 대장암 세포주인 HT-29인 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 대장암 세포주 유래 AMF는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 DNA 서열로 구성된다.

본 발명의 대장암 세포주 유래 AMF의 범위는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 또한, 대장암 세포주 유래 AMF와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 포함한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 암 예방 또는 치료에 대한 활성을 의미한다.

본 발명에서 항암이란 암세포의 증식을 억제하거나 암세포를 죽이는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물은 백혈암에서 항암 효과를 나타내는 것일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 항암용 약학 조성물에 있어서, 상기 조성물은 암의 증식을 억제하고, 세포사멸을 유도할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당하는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항암용 약학 조성물을 인간을 제외한 포유동물 내에 투여하는 단계를 포함하는, 암세포의 증식억제 또는 세포사멸 증진 방법을 제공한다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

재료 및 방법

1. 세포배양

본 실험에 사용된 인간 암 세포주는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구매하였다. 대장암 세포인 HT-29, 폐암 세포인 A549, 자궁경부암 세포인 HeLa, 간암 세포인 HepG2, 백혈암 세포인 HL-60, 뇌암 세포인 U-87 MG, 유방암 세포인 MCF-7을 10%(v/v) 소태아혈청(fetal bovine serum , FBS), 100U/㎖의 페니실린 G 및 100㎍/㎖의 스트렙토마이신이 포함된 RPMI 또는 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건하에 배양하였다.

2. 무혈청 조정배지(serum-free conditioned medium, CM)의 준비

HT-29 대장암 세포주가 175㎠ 배양 플라스크(culture flask)에 대략 80% 비율로 자랐을 때, 인산완충생리식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 3번 세척한 후, 무혈청 배지로 교체하여 24시간 동안 세포를 배양한 다음 무혈청 조정배지(이하 CM)를 획득하였으며, 그 후 24시간 간격을 두고 최종 72시간 동안 수득하여 HT-29 CM을 얻었다. HT-29 CM은 0.22㎛로 필터한 후 동결 건조하여 영하 70℃에서 보관하였다.

3. 세포 성장 분석

세포는 24 웰 배양 접시에서 24시간 동안 배양한 후, 배양한 세포에 HT-29 CM을 배양 배지에 대하여 5%(v/v) 농도로 처리하여 48시간에서 72시간 동안 재배양하였다.

세포 성장은 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; thiazolyl blue) 분석을 통해 570㎚의 파장에서 관찰하였다.

또한, 생존 세포 수 측정을 위해 트립판 블루 배제 분석(Trypan blue exclusion assay)을 수행하였다.

4. 단백질 정제(purification) 및 동정(identification)

동결건조된 HT-29 CM은 트리스 완충액(50mM Tris-HCl, pH 7.5)에 용해시키고, 4℃에서 같은 완충액에 대해 투석하였다. 투석 후 HT-29 CM 샘플을 트리스 완충액에서 예비 평형된 DEAE 세파로오스(diethylaminoethyl group sepharose) 30㎖를 함유하는 칼럼에 로딩하였다. 결합 단백질(bound protein)은 1분당 0.7㎖의 유속에서 트리스 완충액 중 0 내지 1.0 M 염화나트륨(NaCl)의 선형 구배를 사용하여 칼럼으로부터 용리되었다. 생체 활성을 갖는 주요 피크를 포함하는 용출 분획을 모아 수크로오즈에 대한 투석에 의해 투석 튜브(7000 MWCO)에서 농축시켰다. 농축된 샘플을 트리스 완충액에서 미리 평형화된 0.8×30㎝ Sephacryl S-200이 충진된 칼럼에서 재분획하였다. 1분당 0.1㎖의 유속에서 생리활성 분획을 선택하고, 상기 기재된 바와 같이 투석에 의해 농축시켰다. 생리활성은 MTT 분석을 이용하여 HL-60 세포 활성 분석으로 평가하였고, 생리활성을 나타낸 샘플을 12% SDS-PAGE 젤에서 크기를 확인한 후 단백질 동정을 위해 말디토프(MALDI-TOF) 질량 분석을 실시하였다.

5. DNA 클로닝 및 재조합 단백질 발현

HT-29 세포로부터 RNA를 추출하여 역전사한 후 이를 PCR(95℃에서 30초, 58℃에서 30초 및 72℃에서 100초를 30회 반복)에 의해 AMF cDNA를 증폭시키기 위한 주형으로 사용하였다.

PCR에 사용한 NdeⅠ 제한효소 사이트가 포함된 정방향 프라이머와 XhoⅠ 제한효소 사이트가 포함된 역방향 프라이머는 GPI(genbank accession number: BC004982.1)를 암호화하는 DNA 서열을 기초로 제작되었다.

정방향 프라이머: 5'-TACATATGGCCGCTCTCACCCGGGACCCCCAGTTCCAGAA-3'(서열번호 3)

역방향 프라이머: 5'-ATCTCGAGTTATTGGACTCTGGCCTCGCGCTGCT-3'(서열번호 4)

1.7kb 길이의 PCR 산물은 DNA 서열을 확인하였고, pCold DNA1 벡터에 클로닝하여 pHT-29-AMF를 구축하였다. pHT-29-AMF를 함유한 대장균 BL21을 100㎍/㎖의 암피실린이 함유된 LB 배지에서 200rpm, 37℃의 조건하에서 16시간 동안 배양한 후 새 배지에서 1:100으로 희석하고, 200rpm, 37℃의 조건하에서 2시간 동안 재배양하였다. 그 후 세포에 0.5mM의 IPTG를 처리하고 200rpm, 15℃의 조건하에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 수확된 세포를 완충용액(20mM Tris-HCl pH 8.0, 200mM NaCl 및 0.5mM PMSF)에 재현탁시키고, 그 후 French pressure cell press (Model FA-078A, Thermo IEC, Milford, MA, USA)를 사용하여 세포를 파쇄하고, 4℃에서 12000rpm으로 20분 동안 원심분리하여 용해된 분획물을 획득하였다. 획득한 분획물은 0.22㎛ 주사기 필터를 통과하였다. HT-29 재조합 AMF(HT-29 rAMF)는 공급업체의 방법에 따라 His60 Ni 수지 친화성 크로마토그래피(Promega, Madison, WI, USA)로 정제하였으며, 정제된 단백질의 함량은 Bio-Rad 단백질 분석 시약을 사용하여 정량하였다.

실시예 1. HT-29 CM의 암세포 증식 억제효과

HT-29 CM의 암세포 증식 억제효과를 확인하기 위해 대장암을 제외한 다양한 암세포에 HT-29 CM을 처리하여, MTT 분석을 실시하였다. 결과는 HT-29 CM을 처리하지 않은 대조군에 대한 HT-29 CM 처리군의 세포 성장 억제율을 각 세포별로 나타냈다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 대장암 유래 세포인 HT-29 CM을 처리한 백혈암(HL-60) 세포의 성장이 억제되는 것을 확인하였으나, 기타 암세포의 활성에는 영향이 크게 나타나지 않았다. 이를 통해 HT-29 CM은 백혈암(HL-60) 세포의 성장을 특이적으로 억제하는 것을 확인하였다.

실시예 2. HT -29 분비 단백질의 분석

HT-29 CM에 포함된 암세포 증식 억제효과를 나타내는 단백질을 분석하기 위해 단백질을 정제하고 동정하였다. DEAE 세파로오스(sepharose) 분획물 및 DEAE 세파로오스(sepharose) 분획물 중 생리활성을 나타내는 분획물을 Sephacryl S-200이 충진된 칼럼을 이용하여 재분획하고, 상기 재분획물 중 우수한 생리활성을 가지는 분획을 확인하였다. 생리활성은 분획물을 HL-60 세포에 처리하여 암세포의 증식을 억제하는 것을 통해 확인하였다.

우수한 생리활성을 나타내는 분획을 말디토프를 이용하여 질량 분석한 결과, 암세포의 이동성 및 증식과 관련되어 있는 단백질인 AMF를 확인하였으며, 이후 AMF를 이용하여 실험을 진행하였다.

실시예 3. HT -29 유래 AMF 유전자 구조 분석

HT-29 RNA를 이용한 역전사 및 PCR을 통하여 HT-29 AMF cDNA를 증폭시킨 후 pCold DNA1 벡터에 클로닝하여 pHT-29-AMF를 구축하였다. 그 결과, 서열번호 2와 같이 DNA 서열이 분석되었으며, 예측되는 재조합 AMF의 아미노산 서열을 분석한 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 GPI 동형단백질(Genbank accession number: BC004982)과 99%의 상동성을 나타내며, 몇 가지 돌연변이가 나타나는 것을 확인하였다.

실시예 4. HT -29 유래 재조합 AMF에 의한 세포 증식 억제 효과

상기 실시예 3에서 재조합된 AMF를 정제한 후 암세포에 처리하여 세포 증식에 미치는 효과를 확인하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 다양한 농도(2, 10 및 50ng/㎖)의 재조합 AMF를 3일 동안 처리하였을 경우 무처리 대조군(control, 100%)에 비하여 농도의존적으로 백혈암(HL-60) 세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였다.

<110> DAEGU CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Anticancer composition comprising colon cancer cell line-derived autocrine motility factor as effective component <130> PN18567 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 560 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ala Leu Thr Arg Asp Pro Gln Phe Gln Lys Leu Gly Arg Ala 1 5 10 15 Thr Glu Tyr Arg Glu His Arg Ser Glu Leu Asn Leu Arg Arg Leu Phe 20 25 30 Asp Ala Asn Lys Asp Arg Phe Asn His Phe Ser Leu Thr Leu Asn Thr 35 40 45 Asn His Gly His Ile Leu Val Asp Tyr Ser Lys Asn Leu Val Thr Glu 50 55 60 Asp Val Met Arg Met Leu Val Asp Leu Ala Lys Ser Arg Gly Val Glu 65 70 75 80 Ala Ala Arg Glu Arg Met Phe Asn Gly Glu Lys Ile Asn Tyr Thr Glu 85 90 95 Gly Arg Ala Val Leu His Val Ala Leu Arg Asn Arg Ser Asn Thr Pro 100 105 110 Ile Leu Val Asp Gly Lys Asp Val Met Pro Glu Val Asn Lys Val Leu 115 120 125 Asp Lys Met Lys Ser Phe Cys Gln Arg Val Arg Ser Gly Asp Trp Lys 130 135 140 Gly Tyr Thr Gly Lys Thr Ile Thr Asp Val 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<210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 tacatatggc cgctctcacc cgggaccccc agttccagaa 40 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 atctcgagtt attggactct ggcctcgcgc tgct 34

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 대장암 세포주 HT-29 유래 AMF(autocrine motility factor)를 유효성분으로 함유하는 백혈암에 대한 항암용 약학 조성물.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 대장암 세포주 HT-29 유래 AMF는 암세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 백혈암에 대한 항암용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 대장암 세포주 HT-29 유래 AMF는 암세포의 세포사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 백혈암에 대한 항암용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약학조성물은 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제조하는 것을 특징으로 하는 백혈암에 대한 항암용 약학 조성물.
제1항, 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 백혈암에 대한 항암용 약학 조성물을 인간을 제외한 포유동물 내에 투여하는 단계를 포함하는 백혈암 세포의 증식억제 또는 세포사멸 증진방법.