KR101944810B1

KR101944810B1 - 자궁경부암 유래 amf를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물

Info

Publication number: KR101944810B1
Application number: KR1020170074533A
Authority: KR
Inventors: 박희성
Original assignee: 대구가톨릭대학교산학협력단
Priority date: 2017-06-14
Filing date: 2017-06-14
Publication date: 2019-02-01
Also published as: WO2018230874A1; US20210275631A1; KR20180136052A; US11123402B1

Abstract

본 발명은 자궁경부암 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명의 자궁경부암 유래 AMF는 간암, 췌장암, 유방암, 폐암, 전립선암 및 대장암의 증식을 억제하고, 세포사멸을 일으키는 효과가 우수하므로, 자궁경부암 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 항암치료제로 사용될 수 있다.

Description

자궁경부암 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물{Anticancer composition comprising cervical cancer-derived autocrine motility factor as effective component}

본 발명은 자궁경부암 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 간암, 췌장암, 유방암, 폐암, 전립선암 및 대장암에 대하여 항암 효과를 나타내는 자궁경부암 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물에 관한 것이다.

암은 세계적으로 감염성 질환 및 심혈관계 질환과 더불어 3대 사망원인 중 하나로, 환경문제, 수명연장, 식문화의 서구화 등으로 인해 향후 암 발생인구가 급격하게 증가할 것으로 예상되는 주요 질환중 하나이다. 보다 더욱 효과적인 항암제의 개발을 위해 암에 대한 많은 연구가 진행되고 있음에도 불구하고 암에 대한 발병기전의 다양화로 인해 부작용이 적고 내성을 극복할 수 있는 새로운 항암제의 개발이 여전히 절실한 상황이다.

한편, 세포경쟁은 세포간 생장 적응 및 생존의 비교 과정으로, 경쟁에서 밀리는 세포는 사멸될 수 있다. 세포경쟁은 암 발생과 밀접한 연관성을 지니는데 암세포에 비해 생장 적응력이 열세인 주변의 세포는 사라질 수 있다. 현재까지 경쟁에서 우위를 점하는 세포(winner cell)가 세포경쟁 초기에 세포사멸신호(death signal)를 분비할 것으로 가정되어 왔으나 규명된 바 없다.

한편, AMF(autocrine motility factor)는 하우스키핑(housekeeping) 단백질로서 세포 내에서 에너지 대사와 관련하여 해당작용(glycolysis)의 두 번째 과정의 글루코오스-6-포스페이트(glucose-6-phosphate)와 프락토오스-6-포스페이트(fructose-6-phosphate)를 상호전환(interconversion)하는 역할을 하는 것으로 알려졌으며, 이러한 기능으로 인해 글루코오스-6-포스페이트 이성질화제(glucose-6-phosphate isomerase, GPI)라고 불리기도 한다. 종양에서 분비되는 사이토카인인 AMF는 종양 부위에 풍부하며 종양의 증식, 분화 및 생존에 중요 역할을 지닌다.

한편, 한국공개특허 제2016-0050773호에는 AMFR-Fc 융합 단백질 및 이의 항암용도를 개시하고 있지만, 본 발명의 암세포 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물은 개시된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 자궁경부암 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물을 제공하고, 상기 조성물이 특정암, 더욱 상세하게는 간암, 췌장암, 유방암, 폐암, 전립선암 및 대장암의 증식을 억제하고, 세포사멸을 일으킴을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 자궁경부암 유래 AMF(autocrine motility factor)를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 자궁경부암 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 자궁경부암 유래 AMF는 간암, 췌장암, 유방암, 폐암, 전립선암 및 대장암의 증식을 억제하고, 세포사멸을 일으키는 효과가 우수하므로, 자궁경부암 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 항암치료용 소재로 사용될 수 있다.

도 1은 자궁경부암세포 조정배지(conditioned medium, CM)를 타 암세포주에 처리하였을 때, 암세포의 증식을 MTT 분석(A), 세포 카운팅(counting)(B) 및 콜로니 형성(C)으로 확인한 결과이다. A549는 폐암 세포주, DU145 및 PC3는 전립선암 세포주, AsPC-1은 췌장암 세포주, Hep3B는 간암 세포주, MDA-MB-231 및 MCF-7은 유방암 세포주, HT-29는 대장암 세포주, HL-60은 백혈암 세포주, SKOV3는 난소암 세포주 및 SNU 484는 위암 세포주이다.
도 2는 자궁경부암세포 조정배지의 DEAE 칼럼 분획물 및 DEAE 칼럼 분획물 중 생리활성을 나타내는 분획물을 다시 젤 필터 칼럼으로 분획하여 암세포에 처리하였을 때 세포 증식 정도를 확인하고(A), 세포증식이 가장 억제된 분획물에서 3개의 단백질(모에신, 케톨전달효소 및 AMF)을 확인(B)한 결과이다. 1M NaCl은 0M~1M까지 NaCl의 농도를 높여가며 생리활성물질을 분획하였음을 의미하고, S-200은 젤 필터 크로마토그래피의 생리활성 분획이다.
도 3은 자궁경부암세포 조정배지의 세포 증식 억제효과가 AMF에 의한 것임을 확인한 결과이다. Con은 음성대조군이고, HeLa CM은 자궁경부암세포 조정배지이고, HeLa CM+E4P는 자궁경부암세포 조정배지에 AMF의 활성억제제를 처리한 군이며, IP-HeLa CM은 AMF 항체를 이용하여 AMF가 제거된 자궁경부암세포 조정배지이다. DU145 및 PC3는 전립선암 세포주, AsPC-1은 췌장암 세포주, Hep3B는 간암 세포주, MDA-MB-231 및 MCF-7은 유방암 세포주, HT-29는 대장암 세포주, HL-60은 백혈암 세포주, SKOV3는 난소암 세포주 및 SNU 484는 위암 세포주이다.
도 4는 자궁경부암 유래 재조합 AMF와 GPI 동형단백질(Genbank accession number: BC004982.1)의 아미노산 서열을 비교한 결과이다. (A)는 GPI 동형단백질의 아미노산 서열이고, (B)는 자궁경부암 유래 재조합 AMF의 아미노산 서열이다. *은 (A)와 (B)의 서열이 동일함을 나타낸다.
도 5는 정제한 자궁경부암 유래 재조합 AMF(A)가 암세포의 사멸을 일으키는 것을 현미경으로 모니터링하고(B), 세포수를 측정한 결과(C)이다. rAMF는 자궁경부암 유래 재조합 AMF이고, A549는 폐암 세포, AsPC-1은 췌장암 세포이다.
도 6은 자궁경부암 유래 재조합 AMF가 HER2의 길항제(antagonist)로 작용하여 세포사멸을 일으키는 것을 확인한 결과이다. rAMF는 자궁경부암 유래 재조합 AMF이고, A549 폐암 세포를 사용하였다.

본 발명은 자궁경부암 유래 AMF(autocrine motility factor)를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 자궁경부암 유래 AMF는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된다. 본 발명의 자궁경부암 유래 AMF의 범위는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 또한, 자궁경부암 유래 AMF와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 포함한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 암 예방 또는 치료에 대한 활성을 의미한다.

본 발명에서 항암이란 암세포의 증식을 억제하거나 암세포를 죽이는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물은 간암, 췌장암, 유방암, 폐암, 전립선암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에서 항암 효과를 나타내는 것일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 항암용 약학 조성물에 있어서, 상기 조성물은 암의 증식을 억제하고, 세포사멸을 유도할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당하는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항암용 약학 조성물을 인간을 제외한 포유동물 내에 투여하는 단계를 포함하는, 암세포의 증식억제 또는 세포사멸 증진 방법을 제공한다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

재료 및 방법

1. 세포배양

본 실험에 사용된 인간 암 세포주를 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구매하였다. 자궁경부암세포인 HeLa, 췌장암 세포인 AsPC-1, 유방암 세포인 MCF-7 및 MDA-MB-22, 폐암 세포인 A549, 전립선암 세포인 PC3, DU145, 백혈암 세포인 HL-60, 난소암 세포인 SKOV3, 대장암 세포인 HT-29 및 위암 세포 SNU 484를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum , FBS), 100U/㎖의 페니실린 G 및 100㎍/㎖의 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건하에 배양하였다.

2. 무혈청 조정배지(serum-free conditioned medium, CM)의 준비

각각의 암 세포주가 75㎠ 배양 플라스크(culture flask)에 대략 80% 비율로 자랐을 때, 인산완충생리식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 3번 세척한 후, 무혈청 배지로 교체하였다. 무혈청 배지는 24시간 후에 수득하여 0.22㎛로 필터한 후 영하 20℃에서 보관하였다.

유사한 방법으로 175㎠ 배양 플라스크(culture flask)에 HeLa 세포를 배양하여 준비하고, PBS로 세척한 후, 신선한 무혈청 배지로 교체하여 24시간 동안 세포를 배양하여 무혈청 조정배지(이하 CM)를 획득하였으며, 그 후 24시간 간격을 두고 최종 72시간 동안 수득하여 총 5ℓ의 HeLa CM을 얻었다. HeLa CM은 0.22㎛로 필터한 후 영하 20℃에서 보관하였다.

3. 세포 성장 분석

세포는 24 웰 배양 접시에서 24시간 동안 배양한 후, 배양한 세포에 HeLa CM을 처리하여 48시간에서 72시간 동안 재배양하였다.

세포 성장은 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; thiazolyl blue) 분석을 통해 570㎚의 파장에서 관찰하였다.

또한, 생존 세포 수 측정을 위해 트립판 블루 배제 분석(Trypan blue exclusion assay)을 수행하였다.

또한, 집략형성 분석법(Clonogenic assay)을 위해 24 웰 배양 접시에 세포를 접종한 후 37℃에서 12시간 동안 배양하고, 배양된 세포에 5%(v/v) HeLa CM을 처리하고 콜로니가 형성될 때까지 배양하였다. 콜로니가 형성되면 PBS로 세척하고, 100% 메탄올로 5분 동안 고정한 후, 0.5%(w/v) 크리스탈 바이올렛으로 2시간 동안 염색한 다음 증류수에 침지시켜 세척 후 관찰하였다.

4. 단백질 정제(purification) 및 동정(identification)

동결건조된 HeLa CM은 트리스 완충액(50mM Tris-HCl, pH 7.5)에 용해시키고, 4℃에서 같은 완충액에 대해 투석하였다. 투석 후 HeLa CM 샘플을 트리스 완충액에서 예비 평형된 DEAE 세파로오스(diethylaminoethyl group sepharose) 30㎖를 함유하는 칼럼에 로딩하였다. 결합 단백질(bound protein)은 1분당 0.7㎖의 유속에서 트리스 완충액 중 0 내지 1.0 M 염화나트륨(NaCl)의 선형 구배를 사용하여 칼럼으로부터 용리되었다. 생체 활성을 갖는 주요 피크를 포함하는 용출 분획을 모아 수크로오즈에 대한 투석에 의해 투석 튜브(7000 MWCO)에서 농축시켰다. 농축된 샘플을 트리스 완충액에서 미리 평형화된 0.8×30㎝ Sephacryl S-200이 충진된 칼럼에서 재분획하였다. 1분당 0.1㎖의 유속에서 생리활성 분획을 선택하고, 상기 기재된 바와 같이 투석에 의해 농축시켰다. 생리활성은 트립판 블루 배제 분석(Trypan blue exclusion assay)을 이용하여 A549 세포 성장 분석으로 평가하였고, 생리활성을 나타낸 샘플을 12% SDS-PAGE 젤에서 크기를 확인한 후 단백질 동정을 위해 말디토프(MALDI-TOF) 질량 분석을 실시하였다.

5. AMF 차단 분석(blocking assay)

HeLa CM, 0.5 mM E4P(AMF 활성 억제제)가 포함된 HeLa CM 또는 면역침강법(immunoprecipitation, IP)으로 AMF가 제거된 IP-HeLa CM의 처리 또는 무처리 조건 하에서 세포 배양 2일 후에 생존 세포수를 측정하였다. IP-HeLa CM을 준비하기 위해 1㎖의 HeLa CM을 1㎍의 항-GPI/AMF 항체와 1시간 동안 배양한 후, 1㎕의 단백질 A/G아가로오스 비드(agarose bead)를 1시간 동안 처리했다. 그 후 항원-항체 복합체가 결합된 비드를 제거하기 위해 3000rpm에서 2분 동안 원심분리를 수행하였다.

6. DNA 클로닝 및 재조합 단백질 발현

HeLa cDNA 라이브러리(B-Bridge Co., Tokyo, Japan)는 PCR(95℃에서 30초, 58℃에서 30초 및 72℃에서 100초를 30회 반복)에 의해 AMF cDNA를 증폭시키기 위한 주형으로 사용되었다.

NdeⅠ 제한효소 사이트가 포함된 정방향 프라이머와 XhoⅠ 제한효소 사이트가 포함된 역방향 프라이머는 GPI(genbank accession number: AK301103.1)를 암호화 하는 DNA 서열을 기초로 제작되었다.

forward primer: 5'-TACATATGGCCGCTCTCACCCGG-3'(서열번호 2)

reverse primer: 5'-GCAGCGCGAGGCCAGAGTCCAACTCGAG-3'(서열번호 3)

1.7kb 길이의 PCR 산물은 서열을 확인하였고, pET-21b 벡터에 클로닝하여 pHeLa-AMF를 구축하였다. pHeLa-AMF를 함유한 대장균 BL21을 200㎍/㎖의 암피실린이 함유된 LB배지에서 200rpm, 37℃의 조건하에서 16시간 동안 배양한 후 새 배지에서 1:100으로 희석하고, 200rpm, 37℃의 조건하에서 3시간 동안 재배양하였다. 그 후 세포에 0.5mM의 IPTG를 처리하고 100rpm, 20℃의 조건하에서 16시간 동안 배양하였다. 수확된 세포를 1㎎/㎖의 리소자임이 포함된 완충용액(20mM Tris-HCl pH 8.0, 200mM NaCl, 1mM DTT 및 0.5mM PMSF)에 재현탁시키고, 얼음 위에서 30분 동안 반응하였다. 반응 후, French pressure cell press (Model FA-078A, Thermo IEC, Milford, MA, USA)를 사용하여 세포를 파쇄하고, 4℃의 온도조건하에서 12000rpm으로 20분 동안 원심분리하여 용해된 분획물을 획득하였다. 획득한 분획물은 0.22㎛ 주사기 필터를 통과하였다. HeLa 재조합 AMF(HeLa rAMF)는 공급업체의 방법에 따라 His60 Ni 수지 친화성 크로마토그래피(Promega, Madison, WI, USA)로 정제하였다. 정제된 단백질 샘플은 20mM Tris-HCl 및 50mM 염화나트륨(NaCl)으로 사전 평형화된 Sephacryl S-200 크로마토그래피를 사용하여 추가 정제하였다. 단백질 함량은 Bio-Rad 단백질 분석 시약을 사용하여 정량화하였다.

7. 단백질 추출 및 웨스턴블랏(Western blot)

세포를 고무 스크레이퍼를 사용하여 배양 접시로부터 분리하고, 원심분리(3000rpm, 5분)에 의해 수집한 후, PBS로 2회 세척하였다. 세포 펠렛은 단백질 분해효소 억제 칵테일을 함유하는 차가운 RIPA 완충액(50mM Tris-HCl pH7.4, 1% NP-40, 0.5% Na-deoxycholate, 0.1% SDS, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 50mM NaF)에 부유시키고, 세포 용해를 위해 30분 동안 얼음 위에서 반응하였다. 반응 후 상기 혼합물을 원심분리(13000rpm, 20분, 4℃)하여 맑은 용해물을 얻었다. 이후 샘플별 같은 양의 단백질을 넣고 12% SDS-PAGE로 분리하여 PVDF 막으로 옮겼다. 막에 결합된 단백질은 ECL 시스템을 이용하여 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 진행하였다.

실시예 1. HeLa CM의 암세포 증식 억제효과

HeLa CM의 암세포 증식 억제효과를 확인하기 위해 자궁경부암을 제외한 다양한 암세포에 HeLa CM을 처리하여, MTT 분석, 트리판 블루 배제 분석 및 집략형성 분석을 실시하였다. 그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 자궁경부암 유래 세포인 HeLa의 CM을 처리한 간암(Hep3B), 췌장암(AsPC-1), 유방암(MDA-MB-231, MCF-7), 폐암(A549), 전립선암(DU145, PC3), 대장암(HT-29) 세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였으나, 백혈암(HL60), 난소암(SKOV3), 위암(SNU 484) 세포의 증식에는 영향을 미치지 않거나 오히려 증식을 촉진하는 효과가 나타난 것을 확인하였다.

이를 통해 HeLa CM은 간암(Hep3B), 췌장암(AsPC-1), 유방암(MDA-MB-231, MCF-7), 폐암(A549), 전립선암(DU145, PC3), 대장암(HT-29) 세포의 증식을 특이적으로 억제하는 것을 확인하였다.

실시예 2. HeLa 분비 단백질의 분석

HeLa CM에 포함된 암세포 증식 억제효과를 나타내는 단백질을 분석하기 위해 단백질을 정제하고 동정하였다. 도 2A에 나타난 바와 같이 DEAE 세파로오스(sepharose) 분획물 및 DEAE 세파로오스(sepharose) 분획물 중 생리활성을 나타내는 분획물을 Sephacryl S-200이 충진된 칼럼을 이용하여 재분획하고, 상기 재분획물 중 우수한 생리활성을 가지는 분획을 확인하였다. 생리활성은 분획물을 A549 세포에 처리하여 암세포의 증식을 억제하는 것으로 확인하였다. 또한, 도 2B에 나타난 바와 같이 우수한 생리활성을 나타내는 분획에서 75, 70 및 60kDa의 단백질을 확인하였으며, 말디토프를 이용한 질량 분석 결과, 3개의 단백질은 모에신(moesin), 케톨전달효소(transketolase) 및 AMF로 확인되었다. 모에신은 세포막을 구성하는 확장 스파이크 단백질(spike protein)이고, 케톨전달효소는 펜토오스인산회로에서 중요한 기능을 하는 효소이며, AMF는 암세포의 이동성과 증식과 관련되어 있는 단백질이다. 이 중 암세포와 관련이 있으며 분비성 단백질인 AMF를 이용하여 이후 실험을 진행하였다.

실시예 3. AMF 활성 억제효과

HeLa CM 내에 존재하는 AMF가 세포의 증식을 억제하는지 확인하기 위해 AMF 차단 분석을 시행하였다. 그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, HeLa CM에 AMF의 활성억제물질인 E4P를 처리하거나(HeLa CM+E4P), AMF 항체를 이용하여 사전에 HeLa CM 내의 AMF를 제거하였을 경우(IP-HeLa CM), HeLa CM에 의해 증식이 억제되었던 간암(Hep3B), 췌장암(AsPC-1), 유방암(MDA-MB-231, MCF-7), 전립선암(DU145, PC3), 대장암(HT-29) 세포에 대한 효과가 회복되는 것을 확인하였다. 이를 통해 HeLa CM 내의 AMF가 특정 암세포의 증식을 억제하는 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.

실시예 4. HeLa 유래 AMF 유전자 구조 분석

HeLa cDNA 라이브러리를 이용하여 HeLa AMF cDNA를 증폭시킨 후 pET-21b 벡터에 클로닝하여 pHeLa-AMF를 구축하였다. pHeLa-AMF를 통해 생산된 재조합 AMF의 아미노산 서열을 분석한 결과 GPI 동형단백질(Genbank accession number: BC004982)과 98.9%의 상동성을 나타내는 것을 확인하였으나, 도 4에 나타난 바와 같이 몇 가지 돌연변이가 나타났다.

실시예 5. HeLa 유래 재조합 AMF에 의한 세포 증식 억제 효과

도 5A에 나타난 바와 같이 정제된 재조합 AMF를 확인한 후 암세포에 처리하여 세포 증식에 미치는 효과를 확인하였다. 그 결과, 도 5B에 나타난 바와 같이 1㎍/㎖의 재조합 AMF를 AsPC-1 및 A549 암세포에 처리하였을 때, 세포 증식의 억제효과가 나타나는 것을 확인하였으며, 도 5C에 나타난 바와 같이 다양한 농도(0.01, 0.1 및 1㎍/㎖)의 재조합 AMF를 처리하였을 경우 무처리 대조군에 비하여 농도의존적으로 세포 증식이 억제됨을 확인하였다.

실시예 6. HeLa 유래 재조합 AMF에 의한 세포사멸 관련 인자 발현 변화

A549 세포에 재조합 AMF를 시간별(6, 12 및 24시간)로 처리 후 세포사멸과 관련한 인자의 발현변화를 확인하였다. 그 결과 도 6에 나타난 바와 같이 항세포사멸인자인 Bcl-2는 재조합 AMF를 처리하였을 경우 시간이 지남에 따라 발현이 감소하는 것을 확인하였고, 세포사멸 인자인 쪼개진 caspase-3(cleaved caspase-3) 및 쪼개진 PARP(cleaved PARP)의 발현은 증가됨을 확인하였다.

또한, AMF는 AMF 수용기와 결합하여 세포내 PI3K/AKT 신호전달에 관여하여 암세포의 증식과 혈관형성을 조절하고, HER2와 결합하여 종양세포의 성장을 촉진시킨다는 것이 공지되어 있으므로, 재조합 AMF가 HER2 및 AKT의 인산화에 미치는 영향을 확인하였다. 제조합 AMF를 처리하였을 때 HER2 및 AKR의 인산화가 감소하는 것으로 보아, 자신이 분비하는 AMF와는 다른 재조합 AMF를 처리하였을 경우 암세포의 HER2 발현을 억제시키며, AMF가 HER2의 길항제로 작용할 수 있음을 확인하였다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY OF DAEGU INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Anticancer composition comprising cervical cancer-derived autocrine motility factor as effective component <130> PN17203 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 559 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ala Leu Thr Arg Asp Pro Gln Phe Gln Lys Leu Gln Gln Trp 1 5 10 15 Tyr Arg Glu His Arg Ser Glu Leu Asn Leu Arg Arg Leu Phe Asp Ala 20 25 30 Asn Lys Asp Arg Phe Asn His Phe Ser Leu Thr Leu Asn Thr Asn His 35 40 45 Gly His Ile Leu Val Asp Tyr Ser Lys Asn Leu Val Thr Glu Asp Val 50 55 60 Met Arg Met Leu Val Asp Leu Ala Lys Ser Arg Gly Val Glu Ala Ala 65 70 75 80 Arg Glu Arg Met Phe Asn Gly Glu Lys Ile Asn Tyr Thr Glu Gly Arg 85 90 95 Ala Val Leu His Val Ala Leu Arg Asn Arg Ser Asn Thr Pro Ile Leu 100 105 110 Val Asp Gly Lys Asp Val Met Pro Glu Val Asn Lys Val Leu Asp Lys 115 120 125 Met Lys Ser Phe Cys Gln Arg Val Arg Ser Gly Asp Trp Lys Gly Tyr 130 135 140 Thr Gly Lys Thr Ile Thr Asp Val Ile Asn Ile Gly Ile Gly Gly Ser 145 150 155 160 Asp Leu Gly Pro Leu Met Val Thr Glu Ala Leu Lys Pro Tyr Ser Ser 165 170 175 Gly Gly Pro Arg Val Trp Tyr Val Ser Asn Ile Asp Gly Thr His Ile 180 185 190 Ala Lys Thr Leu Ala Gln Leu Asn Pro Glu Ser Ser Leu Phe Ile Ile 195 200 205 Ala Ser Lys Thr Phe Thr Thr Gln Glu Thr Ile Thr Asn Ala Glu Thr 210 215 220 Ala Lys Glu Trp Phe Leu Gln Ala Ala Lys Asp Pro Ser Ala Val Ala 225 230 235 240 Lys His Phe Val Ala Leu Ser Thr Asn Thr Thr Lys Val Lys Glu Phe 245 250 255 Gly Ile Asp Pro Gln Asn Met Phe Glu Phe Trp Asp Trp Val Gly Gly 260 265 270 Arg Tyr Ser Leu Trp Ser Ala Ile Gly Leu Ser Ile Ala Trp His Val 275 280 285 Gly Phe Asp Asn Phe Glu Gln Leu Leu Ser Gly Ala His Trp Met Asp 290 295 300 His His Phe Arg Thr Thr Pro Leu Glu Lys Asn Ala Pro Val Leu Leu 305 310 315 320 Ala Leu Leu Gly Ile Trp Tyr Ile Asn Cys Leu Trp Gly Cys Glu Thr 325 330 335 His Ala Met Leu Pro Tyr Asp Gln Tyr Leu Gln Arg Phe Ala Ala Tyr 340 345 350 Phe Gln Gln Gly Asp Leu Glu Ser Asn Gly Lys Tyr Ile Thr Lys Ser 355 360 365 Gly Thr Arg Val Asp His Gln Thr Gly Pro Ile Val Trp Gly Glu Pro 370 375 380 Gly Thr Asn Gly Gln His Ala Phe Tyr Gln Leu Ile His Gln Gly Thr 385 390 395 400 Lys Met Ile Pro Cys Asp Phe Leu Ile Pro Val Gln Thr Gln His Pro 405 410 415 Ile Arg Lys Gly Leu His His Lys Ile Leu Leu Ala Asn Phe Leu Ala 420 425 430 Gln Thr Glu Ala Leu Met Arg Gly Lys Ser Thr Glu Glu Ala Arg Lys 435 440 445 Glu Leu Gln Ala Ala Gly Lys Ser Pro Glu Asp Leu Glu Arg Leu Leu 450 455 460 Pro His Lys Val Phe Glu Gly Asn Arg Pro Thr Asn Ser Ile Val Phe 465 470 475 480 Thr Lys Leu Thr Pro Phe Met Leu Gly Ala Leu Val Ala Met Tyr Glu 485 490 495 His Lys Ile Phe Val Gln Gly Ile Ile Trp Asp Ile Asn Ser Phe Asp 500 505 510 Gln Trp Gly Val Glu Leu Gly Lys Gln Leu Ala Lys Lys Ile Glu Pro 515 520 525 Glu Leu Asp Gly Ser Ala Gln Val Thr Ser His Asp Ala Ser Thr Asn 530 535 540 Gly Leu Ile Asn Phe Ile Lys Gln Gln Arg Glu Ala Arg Val Gln 545 550 555 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 tacatatggc cgctctcacc cgg 23 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 3 gcagcgcgag gccagagtcc aactcgag 28

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 자궁경부암 유래 AMF(autocrine motility factor)를 유효성분으로 함유하는 간암, 췌장암, 유방암, 폐암, 전립선암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 암종에 대한 항암용 약학 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 자궁경부암 유래 AMF는 암세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 항암용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 자궁경부암 유래 AMF는 암세포의 세포사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 항암용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약학조성물은 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제조하는 것을 특징으로 하는 항암용 약학 조성물.
제1항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항암용 약학 조성물을 인간을 제외한 포유동물 내에 투여하는 단계를 포함하는 간암, 췌장암, 유방암, 폐암, 전립선암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 암종에 대한 암세포의 증식억제 또는 세포사멸 증진방법.