KR20190080814A

KR20190080814A - Baf57 재조합 융합 단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20190080814A
Application number: KR1020180172534A
Authority: KR
Inventors: 김정호; 김범석
Original assignee: 주식회사 굳티셀
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2019-07-08
Also published as: KR102315997B1; WO2019132610A1

Abstract

본 발명은 신규한 BAF57 재조합 융합 단백질과 이의 용도로 염증성 질환, 면역 관련 질환 또는 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 융합 단백질은 세포 내로 전달되어 BAF155 또는 다른 BAF 콤플렉스의 서브 유닛과 결합하여, 세포 내에 존재하는 BAF57의 경쟁적 저해제로써 작용함으로써 단백질 분해 기작에 의해 BAF57의 발현 수준을 낮출 수 있고, 이에 따라 염증성 질환, 면역 관련 질환 또는 암 등의 다양한 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

Description

BAF57 재조합 융합 단백질 및 이의 용도{Recombinant fusion protein of BAF57 and uses thereof}

본 발명은 신규한 BAF57 재조합 융합 단백질과 이의 용도로 염증성 질환, 면역 관련 질환 또는 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

히스톤(histone)은, 사람을 비롯한 다세포 생물부터 진균류(곰팡이, 효모)로 대표되는 단세포 생물에 이르기까지, 진핵 세포의 핵 내에 공통으로 존재하고, 게놈 DNA와 이온 결합하는 염기성 단백질이다. 히스톤은 통상 5종류의 성분(H1, H2A, H2B, H3 및 H4)으로 이루어져 있고, 생물종을 초월하여 고도로 유사하다. 예컨대 히스톤 H4의 경우, 출아효모 히스톤 H4(전체 길이 102 아미노산 배열)와 사람 히스톤 H4(전체 길이 102 아미노산 배열)에서는 92%의 아미노산 배열이 일치하고, 차이는 겨우 8잔기 뿐이다. 생물 중에 수만 종류 존재하는 것으로 상정되고 있는 천연 단백질 중에서, 히스톤은 진핵 생물 종 간에서 가장 고도로 보존된 단백질인 것이 알려져 있다. 게놈 DNA는 이 히스톤과의 규칙적인 결합에 의해 포개져 있고, 양자의 복합체는 뉴클레오솜(nucleosome)이라는 기본적인 구조 단위를 형성한다. 그리고, 이 뉴클레오솜이 응집하는 것에 의해 염색체의 크로마틴 구조가 형성되어 있다. 히스톤은 히스톤테일이라고 불리는 N-말단 부분에서, 아세틸화, 메틸화, 인산화, 유비퀴틴화 및 SUMO화 등의 수식을 받고, 크로마틴 구조를 유지 또는 특이적으로 구조 변환하는 것에 의해 유전자 발현, DNA 복제, DNA 수복 등의 염색체 DNA상에서 생기는 반응이 조절된다. 히스톤의 번역 후 수식은 후성적인 조절 메커니즘이고, 진핵세포의 유전자 조절에 대하여 필수로 생각되고 있다. 최근의 연구를 통해 뉴클레오좀 구조를 변형하여 전사인자와 DNA와의 접근을 촉진시키는 SWI/SNF, RSC, NURF, NRD 등과 같은 염색질 재형성 인자(chromatin remodeling factor), 히스톤의 아세틸화 상태를 조절하는 히스톤 아세틸전이효소(histone acetyltransferases, HATs)와 히스톤 디아세틸라제(HDACs)가 중요한 조절 인자로 작용함이 밝혀졌다(국내출원특허 10-2011-0081688).

한편, 히스톤의 아세틸화 리신에 결합하는 단백질의 도메인 구조로서 브로모도메인이 알려져 있다. 사람에서는 30여 종류의 브로모도메인 함유 단백질이 존재한다. 이러한 브로모도메인 함유 단백질 중 BAF 콤플렉스는 T 세포 발달 및 활성화 신호 전달에서 중요하다고 알려져 있는 염색체 리모델링 과정에 관여하는 다양한 염색체 리모델러 중에 하나인데, 이러한 리모델러는 ATP를 이용하여 염색체를 변화시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. BAF 콤플렉스는 여러 서브 유닛(subunit)으로 이루어져 있으며, 이러한 서브 유닛 중 BRG1은 아세틸화 히스톤과 상호 작용하는 단백질로서 염색질 재형성 인자인 SWI/SNF 복합체의 핵심 구성 단백질로 잘 알려져 있고, T 세포 발달 및 활성화 신호 전달에서의 역할에 대해서는 많은 연구가 되고 있다. 그러나 다른 종류의 서브 유닛인 BAF57(BRG1 or HBRM-associated factors 57)의 경우에는 T 세포 내 역할에 대해서 잘 알려지지 않은 실정이다.

본 발명의 일 목적은 신규한 BAF57 재조합 융합 단백질에 관한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 BAF57 재조합 융합 단백질을 이용하여 염증성 질환 또는 면역 관련 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 BAF57 재조합 단백질을 이용하여 암을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, BAF57(BRG1 or HBRM-associated factors 57) 단백질의 전부 또는 일부; 및 단백질 운반 도메인을 포함하는, 융합 단백질에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 BAF57 단백질의 전부 또는 일부는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등을 포함하는 포유류로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 BAF57 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 혹은 서열번호 2로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 BAF57 단백질의 일부는 상기 BAF57 단백질의 어느 일 단편을 의미하는 것으로, 구체적인 부위를 특별히 제한하지 않으나, BAF155 또는 다른 BAF 콤플렉스 서브 유닛(subunit)과 결합하여 세포 내에 존재하는 BAF57의 경쟁적 저해제로써 작용할 수 있는 폴리펩티드 단편이라면 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 예시로 상기 BAF57 단백질의 일부는, 상기 BAF57 단백질에서 DNA-결합(DNA binding) 도메인인 HMG 도메인과 N-터미널(N-terminal) 부분인 프롤린 리치 (proline-rich) 도메인이 제거된 폴리펩티드 단편일 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 혹은 서열번호 4로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 단백질 운반 도메인은 7 ~ 50개의 아미노산으로 이루어져 있는 소수성이 강한 짧은 펩타이드로, 120 kDa 이상의 분자량을 단백질뿐만 아니라, DNA 또는 RNA를 세포 내로 전달할 수 있는 도메인을 의미하는 것으로, 예를 들면, Hph-1, Mph-1, Sim-2, Tat, VP22, Antp(antennapedia), Pep-1(peptide-1), PTD-5(protein transduction domain-5), MAP, K-FGF, 페네트라틴(penetratin), 트랜스포탄(transportan), 폴리아르기닌, 11R, 7R 및 CTP(cytoplamic transduction peptide)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 여기서 상기 "11R" 및 "7R"은 알기닌(arginine)이 각각 11개 및 7개로 구성된 펩타이드를 의미한다.

본 발명의 일 예시로서, 상기 단백질 운반 도메인은 Hph-1일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 혹은 서열번호 6으로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 예시로서 상기 단백질 운반 도메인은 상기 BAF57 단백질의 전부 또는 일부의 N-터미널(N-terminal) 또는 C-터미널(C-terminal)에 연결될 수 있으며, 바람직하게는 N-터미널에 연결될 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 분리 및 정제를 위한 태그(tag)를 추가로 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 태그는 친화성 태그(affinity tag) 및 에피토프 태그(epitope tag) 중 적어도 하나일 수 있다.

본 발명의 일 예시로 상기 친화성 태그는 히스티틴 태그(histidine tag), 글루타치온 전이효소(glutathione s transferase, GST), 인테인(Intein), 키틴 결합 단백질(chitin binding protein, CBP), 말토스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP), 아비딘 태그(avidin tag) 또는 스트렙트아비딘 태그(streptavidin tag)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 예시로 상기 에피토프 태그는 플래그 태그(FLAG tag), Myc 태그, V5 태그, HA 태그(Hemagglutinin tag), 스팟 태그(Spot tag) 또는 NE 태그일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 예시로서, 상기 태그는 플래그 태그일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 혹은 서열번호 8로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 예시로서 상기 태그는 상기 BAF57 단백질의 전부 또는 일부의 N-터미널 또는 C-터미널에 연결될 수 있으며, 바람직하게는 N-터미널에 연결될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 예시로, 상기 융합 단백질은 서열번호 9 내지 11 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 세포 내로 전달되어 BAF155 또는 다른 BAF 콤플렉스의 서브 유닛과 결합하여, 세포 내에 존재하는 BAF57의 경쟁적 저해제로써 작용함으로써 단백질 분해 기작에 의해 BAF57의 발현 수준을 낮추고, BAF155의 발현이 증가되는 것 또한 억제할 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 핵산 분자는 본 발명에서 제공하는 융합 단백질의 아미노산 서열을 당업자에게 알려진 바와 같이 폴리뉴클레오티드 서열로 번역된 핵산 분자 모두를 포함한다. 그러므로 ORF(open reading frame)에 의한 다양한 폴리뉴클레오티드 서열이 제조될 수 있으며 이 또한 모두 본 발명의 핵산 분자에 포함된다.

본 발명의 바람직한 일 예시로 상기 핵산 분자는 서열번호 12 내지 14 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서 상기 "벡터"는 어떤 핵산 분자가 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 상기 핵산 분자이다. 벡터의 한 가지 유형은, 추가적인 DNA 세그멘트가 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA를 가리키는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스성 벡터로, 추가적인 DNA 세그멘트가 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 어떤 벡터들은 그들이 유입된 숙주세포에서 자율적인 복제를 할 수 있다(예컨대, 박테리아성 벡터는 박테리아성 복제 기원을 갖는 에피솜 포유류 벡터). 기타 벡터(예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주세포에 유입되면서 숙주세포의 게놈에 통합될 수 있고, 그럼으로써, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 어떤 벡터는 이들이 작동차원에서 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이와 같은 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 단순히 "발현 벡터"라 명명된다. 일반적으로 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"는, 플라스미드가 벡터 중 가장 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에, 상호 교환하여 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 발현 벡터의 구체적인 예시로는 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하고, 발현 벡터를 선택할 때에는 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 숙주 세포로의 벡터 도입 시 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 바람직하게 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 함유하나 이에 한정되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터를 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선별되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한을 두지 않는다.

본 발명의 핵산 분자를 정제를 용이하게 하기 위하여 태그 서열을 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다.

다만, 본 발명에서 상기 태그는 상기 열거한 종류로 한정되는 것은 아니며 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 다르면, 본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다.

본 발명에서 상기 "숙주 세포"에는 폴리펩티드 삽입물의 편입을 위한 벡터(들)의 수령자(recipient)일 수 있거나 또는 수령자였던 개별적인 세포 또는 세포 배양물이 포함된다. 숙주 세포에는 단일 숙주 세포의 자손이 포함되고, 상기 자손은 자연적인, 우발적인 또는 고의의 돌연변이 때문에 반드시 원래 모세포와 완전히 동일(형태학상 또는 게놈 DNA 보완체에서)하지 않을 수 있다. 숙주 세포에는 본원의 폴리펩티드(들)로 체내에서 형질 주입된 세포가 포함된다.

본 발명에 있어서, 상기 숙주 세포로는 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있고, 예를 들면 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포, 피치아 파스 토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, Chinese hamster ovary cells), SP2/0(생쥐 골수종), 인간 림프아구(Human lymphoblastoid), COS, NSO(생쥐 골 수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, Baby Hamster Kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, Human Embryonic Kidney cells) 또는 PERC.6(인간 망막 세포)의 동물 세포; 또는 식물 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 숙주 세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 융합 단백질을 유효 성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 융합 단백질은 세포 내로 전달되어 BAF155 또는 다른 BAF 콤플렉스의 서브 유닛과 결합하여, 세포 내에 존재하는 BAF57의 경쟁적 저해제로써 작용함으로써 단백질 분해 기작에 의해 BAF57의 발현 수준을 낮추고, BAF155의 발현이 증가되는 것 또한 억제할 수 있다. 또한, 본 발명의 융합 단백질은 T 세포의 활성화를 억제하고, 염증성 사이토카인의 발현 수준을 낮춰 염증성 질환 및 면역 관련 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 상기 "염증성 질환"은 염증 유발 인자 또는 방사선 조사 등 유해한 자극으로 인해 면역 체계를 과도하게 항진시켜 대식 세포와 같은 면역 세포에서 분비되는 TNF-α, IL-1, IL-6, 프로스타글란딘(prostaglandin), 루코트리엔(leukotriene) 또는 NO와 같은 염증 유발 물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 의미한다. 본 발명에서 상기 염증성 질환의 예시로는 천식, 습진, 건선, 알러지, 류마티스 관절염, 건선 관절염, 아토피성 피부염, 여드름, 아토피성 비염, 폐염증, 알레르기성 피부염, 만성 부비동염, 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrheic dermatitis), 위염, 통풍, 통풍 관절염, 궤양, 만성 기관지염, 크론병, 궤양성 대장염, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 패혈증, 맥관염, 활액낭염, 루프스, 류마티스 다발성 근육통, 측두 동맥염, 다발성 경화증, 고형암, 알츠하이머병, 동맥경화증, 비만 또는 바이러스 감염 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 "면역 관련 질환"은 다양한 면역 세포 및 염증 세포들의 과도화된 활성화 및 발현에 의하여 유도되는 질환으로, 예를 들면, 자가면역질환; 이식편대숙주 질환; 또는 세포, 조직 또는 기관의 이식 거부 질환; 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 상기 "자가면역질환"은 자기 관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 발생하여 자기항원에 대한 면역 반응이 일어나, 이로 인해 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는 과정에 의해 발병되는 질환을 의미한다. 상기 자기 관용이란 자기(self)를 구성하고 있는 항원 물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness)을 말한다. 본 발명에서 상기 자가면역질환의 예시로는 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 섬유조직염, 결절성 다발성 동맥염, 인슐린-의존성 당뇨병, 실험적 자가면역 뇌척수염, 실험적 자가면역 관절염, 중증 근무력증, 실험적 형태의 포도막염, 원발성 점액수종, 갑상샘 중독증, 악성 빈혈, 자가면역 위축 위염, 애디슨 질환, 조기 폐경, 남성 불임증, 소아 당뇨병, 굿파스처 증후군, 보통 천포창, 유천포창, 교감성 안염, 수정체성 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소, 원발성 담관 경화증, 만성 활동성 간염 Hbs-ve, 잠재성 간경변증, 궤양성 대장염, 경피증, 베게너 육아종증, 다발근육염/피부근육염 또는 원판상 LE 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 융합 단백질을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

일반적으로 유방암 및 전립선 암 등의 암 발생에 중요한 역할을 수행하는 에스트로겐 수용체(estrogen receptor)와 안드로겐 수용체(androgen receptor)의 유전자 발현에 BAF57이 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 281, NO. 32, pp. 22656-22664, August 11, 2006; MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Mar. 2005, p. 2200-2215; Cancer Res 2008; 68: (12). June 15, 2008). 그 외에 BAF155가 간암 등의 암 줄기세포를 활성시킨다고 알려져 있다(Nature Communications volume 7, Article number: 13608 (2016)).

그런데 본 발명의 융합 단백질은 세포 내로 전달되어 BAF155 또는 다른 BAF 콤플렉스의 서브 유닛과 결합하여, 세포 내에 존재하는 BAF57의 경쟁적 저해제로써 작용함으로써 단백질 분해 기작에 의해 BAF57의 발현 수준을 낮추고, BAF155의 발현이 증가되는 것 또한 억제할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 융합 단백질을 사용하는 경우 암을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 상기 암은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리키는 것으로, 그 발생 부위에 따라 난소암, 대장암, 췌장암, 위암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 다른 항암제와 함께 병용 투여되어 항암제의 항암 효과를 증강시키는 어쥬번트 효과(adjuvant effect)를 나타낼 수 있다. 여기서 상기 항암제로는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 마시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 파조파닙, 토세라닙, 닌테다닙, 레고라페닙, 세막사닙, 티보자닙, 포나티닙, 카보잔티닙 카보플라틴, 소라페닙, 렌바티닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 케페시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 올라파립, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴, 보리노스텟, 엔티노스텟 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 본 발명에서, "예방"은 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환의 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서, "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항 응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 상기 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.

본 발명에서 상기 "비경구"란, 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 상기 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 치료를 필요로 하는 대상에게 본 발명의 융합 단백질 또는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 또는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 치료를 필요로 하는 대상은 염증성 질환 또는 면역 관련 질환이 있거나, 그 증상이 의심되는 개체일 수 있다.

본 발명에서 상기 융합 단백질 및 약학 조성물과 염증성 질환 및 면역 관련 질환은 앞서 기재한 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡을 피하기 위하여 이하의 기재에서는 생략한다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 치료를 필요로 하는 대상에게 본 발명의 융합 단백질 또는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 융합 단백질 및 약학 조성물과 암은 앞서 기재한 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡을 피하기 위하여 이하의 기재에서는 생략한다.

[서열목록]

서열번호 1: BAF57 전장 아미노산 서열

MSKRPSYAPP PTPAPATQMP STPGFVGYNP YSHLAYNNYR LGGNPGTNSR VTASSGITIP 60

KPPKPPDKPL MPYMRYSRKV WDQVKASNPD LKLWEIGKII GGMWRDLTDE EKQEYLNEYE 120

AEKIEYNESM KAYHNSPAYL AYINAKSRAE AALEEESRQR QSRMEKGEPY MSIQPAEDPD 180

DYDDGFSMKH TATARFQRNH RLISEILSES VVPDVRSVVT TARMQVLKRQ VQSLMVHQRK 240

LEAELLQIEE RHQEKKRKFL ESTDSFNNEL KRLCGLKVEV DMEKIAAEIA QAEEQARKRQ 300

EEREKEAAEQ AERSQSSIVP EEEQAANKGE EKKDDENIPM ETEETHLEET TESQQNGEEG 360

TSTPEDKESG QEGVDSMAEE GTSDSNTGSE SNSATVEEPP TDPIPEDEKK E

서열번호 2: BAF57 전장 염기 서열

atgtcaaaaa gaccatctta tgccccacct cccaccccag ctcctgcaac acaaatgccc 60

agcacaccag ggtttgtggg atacaatcca tacagtcatc tcgcctacaa caactacagg 120

ctgggaggga acccgggcac caacagccgg gtcacggcat cctctggtat cacgattcca 180

aaacccccaa agccaccaga taagccgctg atgccctaca tgaggtacag cagaaaggtc 240

tgggaccaag taaaggcttc caaccctgac ctaaagttgt gggagattgg caagattatt 300

ggtggcatgt ggcgagatct cactgatgaa gaaaaacaag aatatttaaa cgaatacgaa 360

gcagaaaaga tagagtacaa tgaatctatg aaggcctatc ataattcccc cgcgtacctt 420

gcttacataa atgcaaaaag tcgtgcagaa gctgctttag aggaagaaag tcgacagaga 480

caatctcgca tggagaaagg agaaccgtac atgagcattc agcctgctga agatccagat 540

gattatgatg atggcttttc aatgaagcat acagccaccg cccgtttcca gagaaaccac 600

cgcctcatca gtgaaattct tagtgagagt gtggtgccag acgttcggtc agttgtcaca 660

acagctagaa tgcaggtcct caaacggcag gtccagtcct taatggttca tcagcgaaaa 720

ctagaagctg aacttcttca aatagaggaa cgacaccagg agaagaagag gaaattcctg 780

gaaagcacag attcatttaa caatgaactt aaaaggttgt gcggtctgaa agtagaagtg 840

gatatggaga aaattgcagc tgagattgca caggcagagg aacaggcccg caaaaggcag 900

gaggaaaggg agaaggaggc cgcagagcaa gctgagcgca gtcagagcag catcgttcct 960

gaggaagaac aagcagctaa caaaggcgag gagaagaaag acgacgagaa cattccgatg 1020

gagacagagg agacacacct tgaagaaaca acagagagcc aacagaatgg tgaagaaggc 1080

acgtctactc ctgaggacaa ggagagtggg caggaggggg tcgacagtat ggcagaggaa 1140

ggaaccagtg atagtaacac tggctcggag agcaacagtg caacagtgga ggagccacca 1200

acagatccca taccagaaga tgagaaaaaa gaa

서열번호 3: BAF57 단편 아미노산 서열

AYHNSPAYLA YINAKSRAEA ALEEESRQRQ SRMEKGEPYM SIQPAEDPDD YDDGFSMKHT 60

ATARFQRNHR LISEILSESV VPDVRSVVTT ARMQVLKRQV QSLMVHQRKL EAELLQIEER 120

HQEKKRKFLE STDSFNNELK RLCGLKVEVD MEKIAAEIAQ AEEQARKRQE EREKEAAEQA 180

ERSQSSIVPE EEQAANKGEE KKDDENIPME TEETHLEETT ESQQNGEEGT STPEDKESGQ 240

EGVDSMAEEG TSDSNTGSES NSATVEEPPT DPIPEDEKKE

서열번호 4: BAF57 단편 염기 서열

GCCTATCATA ATTCCCCCGC GTACCTTGCT TACATAAATG CAAAAAGTCG TGCAGAAGCT 60

GCTTTAGAGG AAGAAAGTCG ACAGAGACAA TCTCGCATGG AGAAAGGAGA ACCGTACATG 120

AGCATTCAGC CTGCTGAAGA TCCAGATGAT TATGATGATG GCTTTTCAAT GAAGCATACA 180

GCCACCGCCC GTTTCCAGAG AAACCACCGC CTCATCAGTG AAATTCTTAG TGAGAGTGTG 240

GTGCCAGACG TTCGGTCAGT TGTCACAACA GCTAGAATGC AGGTCCTCAA ACGGCAGGTC 300

CAGTCCTTAA TGGTTCATCA GCGAAAACTA GAAGCTGAAC TTCTTCAAAT AGAGGAACGA 360

CACCAGGAGA AGAAGAGGAA ATTCCTGGAA AGCACAGATT CATTTAACAA TGAACTTAAA 420

AGGTTGTGCG GTCTGAAAGT AGAAGTGGAT ATGGAGAAAA TTGCAGCTGA GATTGCACAG 480

GCAGAGGAAC AGGCCCGCAA AAGGCAGGAG GAAAGGGAGA AGGAGGCCGC AGAGCAAGCT 540

GAGCGCAGTC AGAGCAGCAT CGTTCCTGAG GAAGAACAAG CAGCTAACAA AGGCGAGGAG 600

AAGAAAGACG ACGAGAACAT TCCGATGGAG ACAGAGGAGA CACACCTTGA AGAAACAACA 660

GAGAGCCAAC AGAATGGTGA AGAAGGCACG TCTACTCCTG AGGACAAGGA GAGTGGGCAG 720

GAGGGGGTCG ACAGTATGGC AGAGGAAGGA ACCAGTGATA GTAACACTGG CTCGGAGAGC 780

AACAGTGCAA CAGTGGAGGA GCCACCAACA GATCCCATAC CAGAAGATGA GAAAAAAGAA

서열번호 5: Hph-1 아미노산 서열

YARVRRRGPR R

서열번호 6: Hph-1 염기 서열

tatgcacgtg ttcggaggcg tggaccccgc cgc

서열번호 7: FLAG tag 아미노산 서열

DYKDDDDK

서열번호 8: FLAG tag 염기 서열

gactacaagg acgacgatga caag

서열번호 9: 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 융합 단백질의 아미노산 서열

YARVRRRGPR RAYHNSPAYL AYINAKSRAE AALEEESRQR QSRMEKGEPY MSIQPAEDPD 60

DYDDGFSMKH TATARFQRNH RLISEILSES VVPDVRSVVT TARMQVLKRQ VQSLMVHQRK 120

LEAELLQIEE RHQEKKRKFL ESTDSFNNEL KRLCGLKVEV DMEKIAAEIA QAEEQARKRQ 180

EEREKEAAEQ AERSQSSIVP EEEQAANKGE EKKDDENIPM ETEETHLEET TESQQNGEEG 240

TSTPEDKESG QEGVDSMAEE GTSDSNTGSE SNSATVEEPP TDPIPEDEKK E

서열번호 10: 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 융합 단백질의 아미노산 서열

YARVRRRGPR RDYKDDDDKA YHNSPAYLAY INAKSRAEAA LEEESRQRQS RMEKGEPYMS 60

IQPAEDPDDY DDGFSMKHTA TARFQRNHRL ISEILSESVV PDVRSVVTTA RMQVLKRQVQ 120

SLMVHQRKLE AELLQIEERH QEKKRKFLES TDSFNNELKR LCGLKVEVDM EKIAAEIAQA 180

EEQARKRQEE REKEAAEQAE RSQSSIVPEE EQAANKGEEK KDDENIPMET EETHLEETTE 240

SQQNGEEGTS TPEDKESGQE GVDSMAEEGT SDSNTGSESN SATVEEPPTD PIPEDEKKE

서열번호 11: 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 융합 단백질의 아미노산 서열(ntBAF57-△PH)

MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MASGYARVRR RGPRRGDYKD DDDKEFGAYH NSPAYLAYIN 60

AKSRAEAALE EESRQRQSRM EKGEPYMSIQ PAEDPDDYDD GFSMKHTATA RFQRNHRLIS 120

EILSESVVPD VRSVVTTARM QVLKRQVQSL MVHQRKLEAE LLQIEERHQE KKRKFLESTD 180

SFNNELKRLC GLKVEVDMEK IAAEIAQAEE QARKRQEERE KEAAEQAERS QSSIVPEEEQ 240

AANKGEEKKD DENIPMETEE THLEETTESQ QNGEEGTSTP EDKESGQEGV DSMAEEGTSD 300

SNTGSESNSA TVEEPPTDPI PEDEKKE

서열번호 12: 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 융합 단백질의 염기 서열

tatgcacgtg ttcggaggcg tggaccccgc cgcgcctatc ataattcccc cgcgtacctt 60

gcttacataa atgcaaaaag tcgtgcagaa gctgctttag aggaagaaag tcgacagaga 120

caatctcgca tggagaaagg agaaccgtac atgagcattc agcctgctga agatccagat 180

gattatgatg atggcttttc aatgaagcat acagccaccg cccgtttcca gagaaaccac 240

cgcctcatca gtgaaattct tagtgagagt gtggtgccag acgttcggtc agttgtcaca 300

acagctagaa tgcaggtcct caaacggcag gtccagtcct taatggttca tcagcgaaaa 360

ctagaagctg aacttcttca aatagaggaa cgacaccagg agaagaagag gaaattcctg 420

gaaagcacag attcatttaa caatgaactt aaaaggttgt gcggtctgaa agtagaagtg 480

gatatggaga aaattgcagc tgagattgca caggcagagg aacaggcccg caaaaggcag 540

gaggaaaggg agaaggaggc cgcagagcaa gctgagcgca gtcagagcag catcgttcct 600

gaggaagaac aagcagctaa caaaggcgag gagaagaaag acgacgagaa cattccgatg 660

gagacagagg agacacacct tgaagaaaca acagagagcc aacagaatgg tgaagaaggc 720

acgtctactc ctgaggacaa ggagagtggg caggaggggg tcgacagtat ggcagaggaa 780

ggaaccagtg atagtaacac tggctcggag agcaacagtg caacagtgga ggagccacca 840

acagatccca taccagaaga tgagaaaaaa gaa

서열번호 13: 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 융합 단백질의 염기 서열

tatgcacgtg ttcggaggcg tggaccccgc cgcgactaca aggacgacga tgacaaggcc 60

tatcataatt cccccgcgta ccttgcttac ataaatgcaa aaagtcgtgc agaagctgct 120

ttagaggaag aaagtcgaca gagacaatct cgcatggaga aaggagaacc gtacatgagc 180

attcagcctg ctgaagatcc agatgattat gatgatggct tttcaatgaa gcatacagcc 240

accgcccgtt tccagagaaa ccaccgcctc atcagtgaaa ttcttagtga gagtgtggtg 300

ccagacgttc ggtcagttgt cacaacagct agaatgcagg tcctcaaacg gcaggtccag 360

tccttaatgg ttcatcagcg aaaactagaa gctgaacttc ttcaaataga ggaacgacac 420

caggagaaga agaggaaatt cctggaaagc acagattcat ttaacaatga acttaaaagg 480

ttgtgcggtc tgaaagtaga agtggatatg gagaaaattg cagctgagat tgcacaggca 540

gaggaacagg cccgcaaaag gcaggaggaa agggagaagg aggccgcaga gcaagctgag 600

cgcagtcaga gcagcatcgt tcctgaggaa gaacaagcag ctaacaaagg cgaggagaag 660

aaagacgacg agaacattcc gatggagaca gaggagacac accttgaaga aacaacagag 720

agccaacaga atggtgaaga aggcacgtct actcctgagg acaaggagag tgggcaggag 780

ggggtcgaca gtatggcaga ggaaggaacc agtgatagta acactggctc ggagagcaac 840

agtgcaacag tggaggagcc accaacagat cccataccag aagatgagaa aaaagaa

서열번호 14: 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 융합 단백질의 염기 서열(ntBAF57-△PH)

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagcg gctatgcacg tgttcggagg cgtggacccc gccgcggcga ctacaaggac 120

gacgatgaca aggaattcgg agcctatcat aattcccccg cgtaccttgc ttacataaat 180

gcaaaaagtc gtgcagaagc tgctttagag gaagaaagtc gacagagaca atctcgcatg 240

gagaaaggag aaccgtacat gagcattcag cctgctgaag atccagatga ttatgatgat 300

ggcttttcaa tgaagcatac agccaccgcc cgtttccaga gaaaccaccg cctcatcagt 360

gaaattctta gtgagagtgt ggtgccagac gttcggtcag ttgtcacaac agctagaatg 420

caggtcctca aacggcaggt ccagtcctta atggttcatc agcgaaaact agaagctgaa 480

cttcttcaaa tagaggaacg acaccaggag aagaagagga aattcctgga aagcacagat 540

tcatttaaca atgaacttaa aaggttgtgc ggtctgaaag tagaagtgga tatggagaaa 600

attgcagctg agattgcaca ggcagaggaa caggcccgca aaaggcagga ggaaagggag 660

aaggaggccg cagagcaagc tgagcgcagt cagagcagca tcgttcctga ggaagaacaa 720

gcagctaaca aaggcgagga gaagaaagac gacgagaaca ttccgatgga gacagaggag 780

acacaccttg aagaaacaac agagagccaa cagaatggtg aagaaggcac gtctactcct 840

gaggacaagg agagtgggca ggagggggtc gacagtatgg cagaggaagg aaccagtgat 900

agtaacactg gctcggagag caacagtgca acagtggagg agccaccaac agatcccata 960

ccagaagatg agaaaaaaga atag

서열번호 15: 비교예로서 재조합 융합 단백질의 아미노산 서열(BAF57-△PH)

MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MASDYKDDDD KEFGAYHNSP AYLAYINAKS RAEAALEEES 60

RQRQSRMEKG EPYMSIQPAE DPDDYDDGFS MKHTATARFQ RNHRLISEIL SESVVPDVRS 120

VVTTARMQVL KRQVQSLMVH QRKLEAELLQ IEERHQEKKR EFLESTDSFN NELKRLCGLK 180

VEVDMEKIAA EIAQAEEQAR KRQEEREKEA AEQAERSQSS IVPEEEQAAN KGEEKKDDEN 240

IPMETEETHL EETTESQQNG EEGTSTPEDK ESGQEGVDSM AEEGTSDSNT GSESNSATVE 300

EPPTDPIPED EKKE

서열번호 16: 비교예로서 재조합 융합 단백질의 염기 서열(BAF57-△PH)

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagcg actacaagga cgacgatgac aaggaattcg gagcctatca taattccccc 120

gcgtaccttg cttacataaa tgcaaaaagt cgtgcagaag ctgctttaga ggaagaaagt 180

cgacagagac aatctcgcat ggagaaagga gaaccgtaca tgagcattca gcctgctgaa 240

gatccagatg attatgatga tggcttttca atgaagcata cagccaccgc ccgtttccag 300

agaaaccacc gcctcatcag tgaaattctt agtgagagtg tggtgccaga cgttcggtca 360

gttgtcacaa cagctagaat gcaggtcctc aaacggcagg tccagtcctt aatggttcat 420

cagcgaaaac tagaagctga acttcttcaa atagaggaac gacaccagga gaagaagagg 480

gaattcctgg aaagcacgga ttcatttaac aatgaactta aaaggttgtg cggtctgaaa 540

gtagaagtgg atatggagaa aattgcagct gagattgcac aggcagagga acaggcccgc 600

aaaaggcagg aggaaaggga gaaggaggcc gcagagcaag ctgagcgcag tcagagcagc 660

atcgttcctg aggaagaaca agcagctaac aaaggcgagg agaagaaaga cgacgagaac 720

attccgatgg agacagagga gacacacctt gaagaaacaa cagagagcca acagaatggt 780

gaagaaggca cgtctactcc tgaggacaag gagagtgggc aggagggggt cgacagtatg 840

gcagaggaag gaaccagtga tagtaacact ggctcggaga gcaacagtgc aacagtggag 900

gagccaccaa cagatcccat accagaagat gagaaaaaag aatag

본 발명에서 제공하는 융합 단백질은 염증성 질환, 면역 관련 질환 또는 암 등의 다양한 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

도 1은 실시예 1에서 BAF57 야행성 단백질, 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질; 및 대조군인 BAF57-△PH 재조합 융합 단백질의 모식도를 나타낸 도면이다.
도 2는 실시예 1에서 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 실시예 2에서 CD4+ T 세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별로 처리한 뒤 세포 내 상기 재조합 융합 단백질의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 2에서 CD4+ T 세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 시간 별로 처리한 뒤 세포 내 상기 재조합 융합 단백질의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 2에서 HeLa 세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 공초점 현미경을 이용하여 상기 세포 내 전달된 상기 재조합 융합 단백질의 위치를 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 3에서 마우스 CD4+ T 세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별로 처리한 뒤 상기 세포의 생존율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 3에서 Jurkat T 세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별로 처리한 뒤 상기 세포의 생존율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 4에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킨 뒤 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별로 처리한 뒤 T 세포 초기 활성화 표지 마커인 CD69의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실시예 4에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킨 뒤 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별로 처리한 뒤 T 세포의 활성화 마커인 CD25의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 실시예 4에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킨 뒤 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별로 처리한 후 세포 배양액 내 인터루킨-2의 분비량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 실시예 4에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킨 뒤 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별로 처리한 후 CD69의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 실시예 4에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킨 뒤 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 시간 별로 처리한 후 CD69의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 실시예 5에서 나이브 CD4+ T 세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리하고 활성화시킨 뒤 인산화된 단백질의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 실시예 5에서 나이브 CD4+ T 세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리하고 활성화시킨 뒤 인산화된 ZAP70 및 Erk의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 실시예 5에서 Jurkat T 세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리하고 활성화시킨 뒤 Erk 및 Akt의 발현 수준과, 인산화된 Erk 및 Akt의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 실시예 6에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시키며 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 NFAT1의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 실시예 6에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시키며 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 p65의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 실시예 6에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시키며 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 c-Fos의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 실시예 6에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시키며 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 phospho c-Fos의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 실시예 7에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시키며 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 침전된 BAF155 콤플렉스 내에 상기 재조합 융합 단백질이 존재하는 지 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 실시예 7에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시키며 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 상기 CD4+ T 세포 내 BAF57의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 실시예 7에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시키며 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 상기 CD4+ T 세포 내 BAF57의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 실시예 8에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시키며 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 BAF57 및 BAF155의 mRNA 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 실시예 9에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킨 뒤 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질과 함께 프로테아좀 억제제인 MG132 또는 리소좀 억제제인 NH₄Cl을 처리한 후 CD69의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 실시예 9에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킨 뒤 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질과 함께 프로테아좀 억제제인 MG132 또는 리소좀 억제제인 NH₄Cl을 처리한 후 BAF155의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 실시예 10의 LPS-유도 패혈증 마우스 모델에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질의 실험 설계도를 나타낸 것이다.
도 27은 실시예 10에서 LPS-유도 패혈증 마우스 모델에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 생존율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 실시예 10에서 LPS-유도 패혈증 마우스 모델에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 혈청 내 TNF-α의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 29는 실시예 10에서 LPS-유도 패혈증 마우스 모델에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 혈청 내 IL-1β의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 30은 실시예 10에서 LPS-유도 패혈증 마우스 모델에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 비장 내 CD4+CD69+ T 세포의 비율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 31은 실시예 10에서 LPS-유도 패혈증 마우스 모델에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 비장 내 CD4+CD69+ T 세포에서 BAF57 단백질의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

[실시예 1] BAF57의 기능 저해용 재조합 융합 단백질의 제작

하기 도 1과 같이 재조합 DNA를 제작하였다. 구체적으로는, BAF57의 DNA 결합 도메인인 HMG 도메인과 N-터미널 부분인 프롤린 리치 (proline-rich) 도메인을 제거한 BAF57-PH 도메인(서열번호 4)의 N-터미널에 단백질 운반 도메인인 Hph-1(서열번호 6)과 FLAG 태그(서열번호 8)를 융합시켜 재조합 DNA(ntBAF57-△PH; 서열번호 14)를 제작하였다. 또한 대조군으로 BAF57-PH 도메인(서열번호 4)의 N-터미널에 FLAG 태그(서열번호 8)만을 융합시킨 재조합 DNA(BAF57-△PH; 서열번호 16)를 제작하였다. 이들 재조합 DNA를 pET28a(+) 플라스미드에 클로닝한 뒤, BL21 Codon Plus (DE3)-RIPL 균주에 형질 전환 시켰다. 형질 전환된 균주를 37 ℃에서 배양한 후 1 mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, Duchefa)를 첨가하고 37 ℃에서 6 시간 동안 배양하였다. 6 시간 후 배양된 세포를 모아 용해용 완충액(10 mM 이미다졸, 300 mM NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, pH 8.0)으로 풀어준 뒤 4 ℃에서 10 분간 분쇄기를 통해 세포를 분쇄시켰다. 분쇄된 용액에서 상층액을 분리하고 Ni-NTA 비드를 섞어 4 ℃에서 1 시간 동안 결합시켜주었다. 이후 비드와 결합된 용액을 컬럼(Poly-prep Chromatography Columns, BIO-RAD)에 첨가하고 세척용 완충액(30 mM 이미다졸, 300 mM NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, pH 8.0)으로 비특이적으로 결합한 단백질을 충분히 세척한 후 용출용 완충액 (250 mM 이미다졸, 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, pH 8.0)을 통해 재조합 단백질을 비드에서 분리하였다. 세포 실험에 적용하기 위해서 완충액 조성을 PBS로 변화시키고자 PD-10 컬럼(GE Healthcare)에 정제된 단백질을 넣어 10 % 글리세롤 PBS 완충액으로 단백질을 정제하였으며, 이 후 -80 ℃에 단백질을 저장하였다. 정제된 단백질(ntBAF57-△PH: 서열번호 11/ BAF57-△PH: 서열번호 15)의 사이즈와 농도를 확인하기 위해 SDS-PAGE를 통해 쿠마시 블루 염색으로 단백질을 확인하였으며, FLAG 태그를 이용하여 웨스턴 블럿을 이용하여 단백질의 크기 및 순도를 분석하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.

[실시예 2] 재조합 융합 단백질의 세포 내 전달능 확인

1. 재조합 융합 단백질의 처리 농도 별 세포 내 전달능 확인

상기 실시예 1의 방법으로 제작된 재조합 융합 단백질이 세포막을 세포질 및 세포의 핵 내로 전달되는지 확인하기 위해 10⁶ 개의 마우스 CD4+ T 세포에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별(0.5 μM ~ 4 μM)로 1 시간 동안 처리하고, 음성 대조군으로 BAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 4 μM의 농도로 처리하였다. 이후 세포 내에 존재하는 단백질의 양을 확인하기 위해 세포를 고정/투과 버퍼(fixation/permeabilization buffer)(eBioscience)를 통해 고정시킨 뒤 항 FLAG-FITC 항체(Sigma Aldrich)를 이용하여 염색하였다. 그리고 염색된 세포의 양을 확인하기 위해 FACS Calibur (BD Bioscience)를 이용하여 측정하였고, Flowjo V10 프로그램을 이용하여 분석하였다.

그 결과 도 3에서 보는 바와 같이 CD4+ T 세포에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 높은 농도로 처리할수록 세포 내 단백질의 발현 수준이 증가되는 것을 확인되었다. 하지만, 단백질 운반 도메인이 포함되지 않은 BAF57-△PH 재조합 융합 단백질의 경우에는 세포 내로 단백질이 투과되지 못하는 것을 확인할 수 있었다.

2. 재조합 융합 단백질의 처리 시간 별 세포 내 전달능 확인

10⁶ 개의 마우스 CD4+ T 세포에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 시간 별(1 ~ 24 시간)로 처리하고, 상기 1.과 동일한 방법으로 세포 내 단백질의 발현 수준을 확인하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.

그 결과 도 4에서 보는 바와 같이 CD4+ T 세포에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 1 시간 동안 세포에 처리하였을 때부터 세포 내에서 단백질이 확인되었으며, 24 시간까지도 세포 내에 단백질이 존재하고 있음을 확인할 수 있었다.

3. 재조합 융합 단백질의 세포 내 위치 확인

이 후 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질의 세포 내 위치를 확인하기 위해서, 5 x 10⁴ 개의 HeLa 세포에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 1시간 동안 처리한 뒤 PBS로 남은 단백질을 세척하였다. 이 후 4 % 포름알데히드와 0.2 % Triton X-100(Sigma Aldrich)을 이용하여 세포를 고정화시킨 뒤 항 FLAG-FITC 항체를 이용하여 단백질을 염색하였다. 그 이후 DAPI 염색을 통해 세포 내 핵을 염색한 뒤 공초점 현미경(Carl zeiss)을 이용하여 세포 내 전달된 재조합 융합 단백질의 위치를 확인하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 보는 바와 같이 세포 내로 전달된 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질의 대부분은 세포 내 핵으로 이동하여 위치하였으며, 일부 세포질 내에서도 관찰되었다.

[실시예 3] 재조합 융합 단백질의 세포 독성 확인

실시예 1의 방법으로 제작된 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질이 세포 내로 전달되어 세포 독성으로 인한 부작용을 나타내는지 확인하기 위하여, 세포 독성 실험을 실시하였다. 1 x 10⁵ 개의 마우스 CD4+ T 세포 또는 Jurkat T 세포에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별 (0.1 μM ~ 4 μM)로 24 시간 동안 처리한 뒤 CCK-8을 처리하고 4 시간 동안 37 ℃에서 배양한 뒤 세포 생존율을 측정하여 그 결과를 도 6 및 7에 나타내었다.

도 6 및 7에서 보는 바와 같이, 마우스 CD4+ T 세포 또는 Jurkat T 세포에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 최대 4 μM까지 처리하더라도 세포 생장에 영향이 없음을 확인할 수 있었다.

[실시예 4] T 세포 활성화 과정에서 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질의 기능 확인

1. T 세포 초기 활성화 표지 마커인 CD69의 발현 확인

상기 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 이용하여 T 세포 활성화 과정에서 BAF57의 기능을 확인하기 위하여, 마우스 나이브 CD4+ T 세포를 정상 C57BL/6 마우스의 비장 세포로부터 추출하여 항 CD3, CD28 항체 (BD Pharmingen; 2 μg/ml)를 통해 활성화시켰다. 활성화와 동시에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 세포에 농도 별(1 μM ~ 4 μM)로 처리한 뒤 12 시간 후 T 세포 초기 활성화 표지 마커인 CD69의 발현 수준을 유세포 분석기를 통해 확인하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.

그 결과 도 8에서 보는 바와 같이, ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 세포에서 CD69의 발현이 농도 의존적으로 현저히 낮아짐을 확인하였으며, 면역 억제제로 사용되고 있는 사이클로스포린 A(cyclosporin A)를 처리한 세포와 비슷한 정도로 활성화가 저해됨을 확인하였다.

2. T 세포 활성화 마커인 CD25 확인

또한 다른 T 세포 활성화 마커인 CD25의 발현 수준을 확인하기 위하여, 나이브 CD4+ T 세포를 항 CD3, CD28 항체로 활성화시키는 동시에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 세포에 농도 별(1 μM ~ 4 μM)로 처리한 뒤 48 시간 후 CD25의 발현 수준을 유세포 분석기를 통해 확인하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.

그 결과 도 9에서 보는 바와 같이, ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 세포에서 CD69와 마찬가지로 상기 재조합 융합 단백질의 농도 의존적으로 CD25의 발현이 감소하였으며, 사이클로스포린 A을 처리한 군에 비해 억제 효과가 더 높게 나타나는 것을 확인하였다.

3. T 세포 활성화에 의해 분비되는 인터루킨-2의 분비 억제 효과 확인

또한 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질에 의해 T 세포 활성화에 의해 분비되는 인터루킨-2(interleukin-2; IL-2)의 분비가 억제되는지 확인하기 위해 마우스 나이브 CD4+ T 세포를 항 CD3, CD28 항체로 활성화 신호를 제공하며, 동시에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별(1 μM ~ 4 μM)로 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 그리고 세포 배양액을 모아 인터루킨-2 엘라이자 어세이 키트 (eBioscience)를 통해 인터루킨-2의 발현 수준을 측정해 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에서 보는 바와 같이, ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 세포에서 인터루킨-2의 분비가 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었다.

4. T 세포 활성화 억제 기작 확인

상기 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질에 의해 T 세포 활성화 신호가 어떠한 기작을 통해 억제되는지 확인하기 위하여, 상기 재조합 융합 단백질 처리를 시간 별로 다르게 해 T 세포의 활성화가 억제되는지 확인하였다. 구체적으로는 마우스 나이브 CD4+ T 세포를 분리한 뒤 24시간 동안 항 CD3, CD28 항체를 통해 활성화시킨 후 24시간이 경과하였을 때에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별(1 μM ~ 4 μM)로 처리하고 유세포 분석기를 이용하여 CD69의 발현 수준을 확인하였다.

그 결과 도 11에서 보는 바와 같이 T 세포의 활성화와 동시에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리하였을 때는 CD69의 발현이 억제되었지만, 24 시간 경과 후 상기 재조합 융합 단백질을 처리한 경우 CD69의 발현이 억제되지 않는 것을 확인할 수 있었다.

또한, T 세포 활성화 신호가 빠른 시간 내에 전달된다는 기존 문헌을 참고하여, 상기 마우스 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킨 후 10 분, 30 분, 1 시간, 3 시간, 6 시간, 12 시간 및 24 시간이 경과하였을 때에 상기 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질 4 μM을 처리하고 유세포 분석기를 이용하여 CD69의 발현 수준을 확인하였다.

그 결과, 도 12에서 보는 바와 같이, 상기 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 T 세포의 활성화 신호 이후 빠르게 처리할수록 CD69의 발현 억제 효과가 더욱 크게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들을 통해 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질에 의한 T 세포 활성화 억제 효과는 활성화 신호 초기에 발생하는 T 세포 수용기 근위 신호 전달이나 유전자 발현을 억제하는 것으로 예측할 수 있었다.

[실시예 5] ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질에 의한 T 세포 활성화 신호 전달 단백질 인산화 저해 효과 확인

상기 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질에 의한 T 세포 활성화 억제 효과의 기작을 확인하기 위해 초기 신호 전달 시스템에서 가장 중요한 역할을 하는 신호 전달 매개 단백질의 인산화를 확인하였다. T 세포의 CD3, CD28에 의해 자극이 주어지면 10분 이내에 신호 전달 단백질은 인산화를 통해 빠르게 세포 내부로 신호를 전달하며, 이로 인해 NFAT, NF-kB 및 AP-1과 같은 주요 전사 인자들이 발현하게 된다. 따라서 상기 실험을 통해 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질이 T 세포 활성화 초기에 억제 효과를 나타내었기 때문에 활성화 신호에 의한 타이로신 인산화에 영향이 있는지 확인하였다. 이를 위해 2 x 10⁶개의 마우스 나이브 CD4+ T 세포를 분리하여 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질 (1 μM 또는 4 μM)을 1 시간 동안 37 ℃에서 처리한 뒤 항 CD3, CD28 항체 (5 μg/ml)을 4 ℃에서 30 분간 세포 표면에 결합시킨 후 37 ℃에서 10 분간 세포를 활성화하였다. 10 분 뒤 세포를 RIPA 완충액을 통해 용해시켜준 뒤 항 포스포 티로신(phospho tyrosine) 항체 (1:1,000; Cell Signaling)를 이용하여 웨스턴 블럿을 진행하였다.

그 결과 도 13에서 보는 바와 같이, 나이브 CD4+ T 세포에 비해 활성화된 T 세포의 경우 인산화된 단백질이 상당히 증가됨을 확인할 수 있었는데, ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질 또는 사이클로스포린 A를 처리할 경우 인산화 단백질의 양이 감소하여 활성화가 저해됨을 확인할 수 있었다.

또한, T 세포 활성화 과정에서 가장 중요한 신호 전달 단백질로 알려진 ZAP70와 Erk의 인산화 정도를 비교해 보았다. 구체적으로는 2 x 10⁶개의 마우스 나이브 CD4+ T 세포를 분리하여 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질 (1 μM 또는 4 μM)을 1 시간 동안 37 ℃에서 처리한 뒤 항 CD3, CD28 항체 (5 μg/ml)을 4 ℃에서 30 분간 세포 표면에 결합시킨 후 37 ℃에서 10 분간 세포를 활성화하고, 이후 RIPA 완충액을 이용하여 세포를 용해시킨 뒤 항 인산화 ZAP70, 인산화 Erk 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.

그 결과 도 14에서 보는 바와 같이, 항 CD3, CD28 항체를 이용하여 활성화한 T 세포에 비하여 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질 또는 사이클로스포린 A를 처리한 경우 인산화된 ZAP70, Erk의 양이 감소됨을 확인할 수 있었다.

마우스 T 세포 이외에도 인간 T 세포에서도 tBAF57-PH 단백질의 효과가 나타나는지 확인하기 위해 2 x 10⁶개의 Jurkat T 세포에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질 (1 μM 또는 4 μM)을 1 시간 동안 37 ℃에서 처리한 뒤 항 CD3, CD28 항체를 4 ℃에서 30 분간 세포에 결합시킨 뒤 37 ℃에서 10분간 활성화시켰다. 이후 RIPA 완충액을 이용하여 세포를 용해시킨 뒤 항 Erk, Akt, 인산화 Erk, 인산화 Akt 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.

도 15에서 보는 바와 같이, ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질에 의해 인산화 되지 않은 Erk 및 Akt의 발현 수준에는 변화가 없었지만, 인산화된 Erk, Akt의 경우 활성화된 T 세포에 비해 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질 또는 사이클로스포린 A를 처리한 군에서 그 발현 수준이 상당히 감소함을 확인할 수 있었다.

[실시예 6] T 세포 활성화 및 증식에 관련된 전사 인자의 발현 억제 확인

상기 실시예 5에서 T 세포의 CD3, CD28 수용체 하위 신호 전달체의 인산화의 억제 효과를 확인하였고, 이와 동일하게 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질이 T 세포 활성화 및 증식에 관련된 단백질을 전사시키는 주요 전사인자 (NFAT, NF-kB, AP-1)의 발현 또는 기능을 하기 위한 인산화에는 어떠한 영향을 미치는 지 확인하였다. 구체적으로, 마우스 나이브 CD4+ T 세포를 항 CD3, CD28 항체 (5 μg/ml)를 통해 활성화한 뒤 동시에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질 (1 μM 또는 4 μM) 및 사이클로스포린 A를 처리하고 24 시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 이 후 세포 내 전사 인자의 발현 및 인산화를 측정하기 위해 세포를 고정화시킨 뒤 항 NFAT1, p65, c-Fos 및 phospho c-Fos 항체를 넣고 APC 형광이 표지된 2차 항체를 통해 세포 내 전사 인자를 염색하였다. 유세포 측정기를 통해 NFAT1, p65, c-Fos 및 phospho c-Fos의 발현 수준을 확인하여 그 결과를 도 16 내지 19에 나타내었다.

도 16 내지 19에서 보는 바와 같이, 활성화가 진행된 T 세포에 비하여 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 경우 NFAT1, p65, c-Fos 및 phospho c-Fos의 발현 수준이 나이브 T 세포에서 발현하는 수준 정도까지 감소하였으며, 사이클로스포린 A를 처리한 경우와 유사한 발현 수준을 나타내었다.

상기 결과를 통하여, ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질이 T 세포 수용체 하위 신호 전달 체계에서 중요한 역할을 하고 있으며, 전사 인자의 발현까지 조절하여 근본적인 활성화 기작을 억제하고 있음을 알 수 있었다.

[실시예 7] tBAF57-PH 단백질 및 세포 내부 BAF 콤플렉스의 관계

BAF57이 세포 내에서 또 다른 BAF 콤플렉스 서브 유닛인 BAF155와 결합하여 단백질 안정성을 확보해 결합하지 못할 경우, 프로테아좀에 의해 BAF57의 단백질이 분해되는 지 확인하기 위하여, ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질이 다른 BAF 콤플렉스 서브 유닛과의 상호 작용을 통해 BAF 콤플렉스의 형성을 경쟁적으로 억제하는지 확인하였다.

1. BAF155의 발현 억제 확인

구체적으로 마우스 나이브 CD4+ T 세포를 항 CD3, CD28 항체를 통해 활성화시키고, 동시에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 이 후 RIPA 완충액을 통해 세포를 용해시키고, 항 BAF155 항체를 이용하여 12 시간 동안 4 ℃에서 세포 내 BAF155와 결합시킨 뒤 단백질 A(Protein A) 비드를 통해 BAF155와 결합한 항체를 면역 침전시켰다. 침전된 BAF155 콤플렉스 내에 전달한 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질이 존재하는지 확인하기 위해 항 FLAG 항체를 이용해서 웨스턴 블럿을 수행하고 그 결과를 도 20에 나타내었다.

도 20에서 보는 바와 같이 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 세포 내에서만 FLAG가 감지됨을 확인하였다. 또한 BAF155 발현 수준의 경우 나이브 T 세포에 비하여 활성화시킨 T 세포에서 BAF155가 높은 수준으로 발현되었으나, ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리하자 BAF155의 발현 수준이 증가하지 못한 것을 확인할 수 있었다.

2. BAF57의 발현 억제 확인

또한 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질이 세포 내에 존재하는 BAF57와 경쟁적으로 BAF155에 결합하여 세포 내 BAF57의 양이 감소됨을 확인하기 위하여 이하의 실험을 수행하였다. 구체적으로는 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킴과 동시에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 동시에 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 이 후 세포 내 BAF57의 발현 수준을 확인하기 위해 세포를 고정화한 뒤 항 BAF57 항체를 주입하여 세포 내 발현 수준을 확인하였다.

그 결과 도 21 및 22에서 보는 바와 같이 활성화 신호를 준 뒤 1일 만에 세포 내 BAF57의 발현 수준이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그런데 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 군에서 세포 내 BAF57의 발현 수준이 감소함을 확인할 수 있었다.

[실시예 8] ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질에 의한 BAF57 mRNA 및 BAF155 mRNA의 발현 수준의 증감 확인

ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질에 의해 세포 내 BAF57 또는 BAF155 단백질의 발현 수준이 감소하는 효과가 유전자 수준에서의 감소에 의한 것인지 확인하기 위하여, 나이브 CD4+ T 세포, 1일간 활성화된 T 세포 및 활성화 시 2 μM의 ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질을 처리한 세포에서 TRIzol을 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 이 후 MMLV 역전사 효소(reverse transcriptase)를 이용하여 단일 가닥 cDNA(single strand cDNA)를 합성한 뒤 Ex Taq 폴리머레이즈를 이용하여 RT-PCR을 진행하였다 (95 ℃에서 30 초, 60 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 30 초간 40 사이클 진행). 사용한 프라이머의 시퀀스는 하기 표 1과 같다. 이 후 전기 영동을 통해 젤을 이용하여 밴드를 확인하였다.

그 결과 도 23에서 보는 바와 같이, CD3/28에 의해 활성화된 T 세포에서는 BAF57 및 BAF155의 mRNA 발현 수준이 증가하였는데, 상기 실시예 7에서와는 달리 ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질을 처리한 세포에서는 BAF57 및 BAF155의 mRNA 발현 수준에는 아무런 변화가 없었다.

프라이머 종류	서열
BAF57 정방향 프라이머	5'-TATGCCCCACCTCCCAC-3'
BAF57 역방향 프라이머	5'-GGTCAGGGTTGGAAGCC-3'
BAF155 정방향 프라이머	5'-GGTGCTAGTGCTGGAAGG-3'
BAF155 역방향 프라이머	5'-CAGTGCTCATCACCGGG-3'
GAPDH 정방향 프라이머	5'-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3'
GAPDH 역방향 프라이머	5'-ACACATTGGGGGTAGGAAC-3'

[실시예 9] ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질에 의한 세포 내 BAF57 및 BAF155 단백질 분해 메카니즘 확인

기존의 연구에서 BAF155 단백질이 세포 내에서 BAF57과 결합하여 단백질 분해 기작에 대해 안정성을 확보하며, BAF57과 결합하지 않는 경우 프로테아좀에 의해 단백질이 분해된다는 결과를 통해, ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질의 처리에 따른 BAF57 및 BAF155의 단백질 분해 기작을 확인하였다. 상세하게는 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킨 상태에서 프로테아좀 억제제인 MG132 또는 다른 단백질 분해 기작인 리소좀 억제제인 NH₄Cl을 ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질과 함께 처리하였다.

그 결과 도 24에서 보는 바와 같이 ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질을 처리한 경우 BAF57의 발현 수준이 감소하였으나, MG132를 처리한 세포에서는 농도에 의존적으로 BAF57의 발현 수준과 활성화 마커인 CD69의 발현 수준이 증가함을 확인할 수 있었다. 반면, NH₄Cl을 처리하였을 경우 BAF57과 CD69의 발현 수준에 변화가 없었다.

또한, 도 25에서 보는 바와 같이, ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질을 처리한 경우 BAF155의 발현 수준이 감소하였으나, MG132를 처리한 세포에서는 농도에 의존적으로 BAF155의 발현 수준이 증가함을 확인할 수 있었다.

따라서 ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질에 의해 BAF57 및 BAF155 단백질이 분해되는 기작은 프로테아좀에 의해 분해되는 것임을 알 수 있었다.

[실시예 10] ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질에 의한 LPS-유도 패혈증(sepsis) 모델의 치료 효과 확인

인 비트로(in vitro)에서 T 세포의 활성화를 강하게 억제하는 ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질의 효능을 인 비보(in vivo)에서도 확인하기 위해 LPS 감염에 의해 나타나는 패혈증(sepsis) 마우스 모델을 이용하였다. 도 26에서 나타낸 바와 같이 7주령 C57BL/6 암컷 마우스를 이용하여 15 mg/kg의 용량으로 LPS를 복강 내 주사한 뒤 2 시간, 12 시간 째에 실시예 1에서 제작한 ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질 및 BAF57-PH 재조합 융합 단백질을 각각 25 μg, 100 μg씩 복강 내 주사하였다. 이 후 144 시간까지 마우스의 생존율을 측정하여 그 결과를 도 27에 나타내었고, 48 시간 째에 마우스 혈청 내 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-1β의 농도를 측정하여 그 결과를 도 28 및 29에 나타내었으며, 유세포 분석기를 이용하여 비장 내 T 세포의 존재 수준과 BAF57 단백질의 발현 수준을 분석하여 그 결과를 각각 도 30 및 31에 나타내었다.

도 27에서 보는 바와 같이 패혈증 마우스 모델에 ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질을 처리한 결과 마우스의 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 28 및 29에서 보는 바와 같이, 패혈증 마우스 모델에 ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질을 처리한 경우 혈청 내 TNF-α 및 IL-1b의 농도가 상당히 낮아짐을 확인할 수 있었다.

또한, 도 30 및 31에서 보는 바와 같이, 패혈증 마우스 모델에 ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질을 처리한 경우 마우스의 비장 내 CD4+CD69+ T 세포의 비율이 상기 재조합 융합 단백질의 농도 의존적으로 감소하였고, CD4+ T 세포 내 BAF57 단백질의 발현 수준 또한 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Good T Cells, Inc. <120> Recombinant fusion protein of BAF57 and uses thereof <130> DPB174306k01 <150> KR 10-2017-0181969 <151> 2017-12-28 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 411 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Lys Arg Pro Ser Tyr Ala Pro Pro Pro Thr Pro Ala Pro Ala 1 5 10 15 Thr Gln Met Pro Ser Thr Pro Gly Phe Val Gly Tyr Asn Pro Tyr Ser 20 25 30 His Leu Ala Tyr Asn Asn Tyr Arg Leu Gly Gly Asn Pro Gly Thr Asn 35 40 45 Ser Arg Val Thr Ala Ser Ser Gly Ile Thr Ile Pro Lys Pro Pro Lys 50 55 60 Pro Pro Asp Lys Pro Leu Met Pro Tyr Met Arg Tyr Ser Arg Lys Val 65 70 75 80 Trp Asp Gln Val Lys Ala Ser Asn Pro Asp Leu Lys Leu Trp Glu Ile 85 90 95 Gly Lys Ile Ile Gly Gly Met Trp Arg Asp Leu Thr Asp Glu Glu Lys 100 105 110 Gln Glu Tyr Leu Asn Glu Tyr Glu Ala Glu Lys Ile Glu Tyr Asn Glu 115 120 125 Ser Met Lys Ala Tyr His Asn Ser Pro Ala Tyr Leu Ala Tyr Ile Asn 130 135 140 Ala Lys Ser Arg Ala Glu Ala Ala Leu Glu Glu Glu Ser Arg Gln Arg 145 150 155 160 Gln Ser Arg Met Glu Lys Gly Glu Pro Tyr Met Ser Ile Gln Pro Ala 165 170 175 Glu Asp Pro Asp Asp Tyr Asp Asp Gly Phe Ser Met Lys His Thr Ala 180 185 190 Thr Ala Arg Phe Gln Arg Asn His Arg Leu Ile Ser Glu Ile Leu Ser 195 200 205 Glu Ser Val Val Pro Asp Val Arg Ser Val Val Thr Thr Ala Arg Met 210 215 220 Gln Val Leu Lys Arg Gln Val Gln Ser Leu Met Val His Gln Arg Lys 225 230 235 240 Leu Glu Ala Glu Leu Leu Gln Ile Glu Glu Arg His Gln Glu Lys Lys 245 250 255 Arg Lys Phe Leu Glu Ser Thr Asp Ser Phe Asn Asn Glu Leu Lys Arg 260 265 270 Leu Cys Gly Leu Lys Val Glu Val Asp Met Glu Lys Ile Ala Ala Glu 275 280 285 Ile Ala Gln Ala Glu Glu Gln Ala Arg Lys Arg Gln Glu Glu Arg Glu 290 295 300 Lys Glu Ala Ala Glu Gln Ala Glu Arg Ser Gln Ser Ser Ile Val Pro 305 310 315 320 Glu Glu Glu Gln Ala Ala Asn Lys Gly Glu Glu Lys Lys Asp Asp Glu 325 330 335 Asn Ile Pro Met Glu Thr Glu Glu Thr His Leu Glu Glu Thr Thr Glu 340 345 350 Ser Gln Gln Asn Gly Glu Glu Gly Thr Ser Thr Pro Glu Asp Lys Glu 355 360 365 Ser Gly Gln Glu Gly Val Asp Ser Met Ala Glu Glu Gly Thr Ser Asp 370 375 380 Ser Asn Thr Gly Ser Glu Ser Asn Ser Ala Thr Val Glu Glu Pro Pro 385 390 395 400 Thr Asp Pro Ile Pro Glu Asp Glu Lys Lys Glu 405 410 <210> 2 <211> 1233 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgtcaaaaa gaccatctta tgccccacct cccaccccag ctcctgcaac acaaatgccc 60 agcacaccag ggtttgtggg atacaatcca tacagtcatc tcgcctacaa caactacagg 120 ctgggaggga acccgggcac caacagccgg gtcacggcat cctctggtat cacgattcca 180 aaacccccaa agccaccaga taagccgctg atgccctaca tgaggtacag cagaaaggtc 240 tgggaccaag taaaggcttc caaccctgac ctaaagttgt gggagattgg caagattatt 300 ggtggcatgt ggcgagatct cactgatgaa gaaaaacaag aatatttaaa cgaatacgaa 360 gcagaaaaga tagagtacaa tgaatctatg aaggcctatc ataattcccc cgcgtacctt 420 gcttacataa atgcaaaaag tcgtgcagaa gctgctttag aggaagaaag tcgacagaga 480 caatctcgca tggagaaagg agaaccgtac atgagcattc agcctgctga agatccagat 540 gattatgatg atggcttttc aatgaagcat acagccaccg cccgtttcca gagaaaccac 600 cgcctcatca gtgaaattct tagtgagagt gtggtgccag acgttcggtc agttgtcaca 660 acagctagaa tgcaggtcct caaacggcag gtccagtcct taatggttca tcagcgaaaa 720 ctagaagctg aacttcttca aatagaggaa cgacaccagg agaagaagag gaaattcctg 780 gaaagcacag attcatttaa caatgaactt aaaaggttgt gcggtctgaa agtagaagtg 840 gatatggaga aaattgcagc tgagattgca caggcagagg aacaggcccg caaaaggcag 900 gaggaaaggg agaaggaggc cgcagagcaa gctgagcgca gtcagagcag catcgttcct 960 gaggaagaac aagcagctaa caaaggcgag gagaagaaag acgacgagaa cattccgatg 1020 gagacagagg agacacacct tgaagaaaca acagagagcc aacagaatgg tgaagaaggc 1080 acgtctactc ctgaggacaa ggagagtggg caggaggggg tcgacagtat ggcagaggaa 1140 ggaaccagtg atagtaacac tggctcggag agcaacagtg caacagtgga ggagccacca 1200 acagatccca taccagaaga tgagaaaaaa gaa 1233 <210> 3 <211> 280 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Tyr His Asn Ser Pro Ala Tyr Leu Ala Tyr Ile Asn Ala Lys Ser 1 5 10 15 Arg Ala Glu Ala Ala Leu Glu Glu Glu Ser Arg Gln Arg Gln Ser Arg 20 25 30 Met Glu Lys Gly Glu Pro Tyr Met Ser Ile Gln Pro Ala Glu Asp Pro 35 40 45 Asp Asp Tyr Asp Asp Gly Phe Ser Met Lys His Thr Ala Thr Ala Arg 50 55 60 Phe Gln Arg Asn His Arg Leu Ile Ser Glu Ile Leu Ser Glu Ser Val 65 70 75 80 Val Pro Asp Val Arg Ser Val Val Thr Thr Ala Arg Met Gln Val Leu 85 90 95 Lys Arg Gln Val Gln Ser Leu Met Val His Gln Arg Lys Leu Glu Ala 100 105 110 Glu Leu Leu Gln Ile Glu Glu Arg His Gln Glu Lys Lys Arg Lys Phe 115 120 125 Leu Glu Ser Thr Asp Ser Phe Asn Asn Glu Leu Lys Arg Leu Cys Gly 130 135 140 Leu Lys Val Glu Val Asp Met Glu Lys Ile Ala Ala Glu Ile Ala Gln 145 150 155 160 Ala Glu Glu Gln Ala Arg Lys Arg Gln Glu Glu Arg Glu Lys Glu Ala 165 170 175 Ala Glu Gln Ala Glu Arg Ser Gln Ser Ser Ile Val Pro Glu Glu Glu 180 185 190 Gln Ala Ala Asn Lys Gly Glu Glu Lys Lys Asp Asp Glu Asn Ile Pro 195 200 205 Met Glu Thr Glu Glu Thr His Leu Glu Glu Thr Thr Glu Ser Gln Gln 210 215 220 Asn Gly Glu Glu Gly Thr Ser Thr Pro Glu Asp Lys Glu Ser Gly Gln 225 230 235 240 Glu Gly Val Asp Ser Met Ala Glu Glu Gly Thr Ser Asp Ser Asn Thr 245 250 255 Gly Ser Glu Ser Asn Ser Ala Thr Val Glu Glu Pro Pro Thr Asp Pro 260 265 270 Ile Pro Glu Asp Glu Lys Lys Glu 275 280 <210> 4 <211> 840 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Cys Cys Thr Ala Thr Cys Ala Thr Ala Ala Thr Thr Cys Cys Cys 1 5 10 15 Cys Cys Gly Cys Gly Thr Ala Cys Cys Thr Thr Gly Cys Thr Thr Ala 20 25 30 Cys Ala Thr Ala Ala Ala Thr Gly Cys Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr 35 40 45 Cys Gly Thr Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Thr 50 55 60 Thr Ala Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Thr Cys Gly 65 70 75 80 Ala Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys Ala Ala Thr Cys Thr Cys Gly Cys 85 90 95 Ala Thr Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Cys 100 105 110 Cys Gly Thr Ala Cys Ala Thr Gly Ala Gly Cys Ala Thr Thr Cys Ala 115 120 125 Gly Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Cys Cys Ala 130 135 140 Gly Ala Thr Gly Ala Thr Thr Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly 145 150 155 160 Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Ala Ala Thr Gly Ala Ala Gly Cys Ala 165 170 175 Thr Ala Cys Ala Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Cys Gly Thr 180 185 190 Thr Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Cys Cys 195 200 205 Gly Cys Cys Thr Cys Ala Thr Cys Ala Gly Thr Gly Ala Ala Ala Thr 210 215 220 Thr Cys Thr Thr Ala Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly Thr Gly Thr Gly 225 230 235 240 Gly Thr Gly Cys Cys Ala Gly Ala Cys Gly Thr Thr Cys Gly Gly Thr 245 250 255 Cys Ala Gly Thr Thr Gly Thr Cys Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys 260 265 270 Thr Ala Gly Ala Ala Thr Gly Cys Ala Gly Gly Thr Cys Cys Thr Cys 275 280 285 Ala Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Gly Thr 290 295 300 Cys Cys Thr Thr Ala Ala Thr Gly Gly Thr Thr Cys Ala Thr Cys Ala 305 310 315 320 Gly Cys Gly Ala Ala Ala Ala Cys Thr Ala Gly Ala Ala Gly Cys Thr 325 330 335 Gly Ala Ala Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Ala Ala Ala Thr Ala Gly 340 345 350 Ala Gly Gly Ala Ala Cys Gly Ala Cys Ala Cys Cys Ala Gly Gly Ala 355 360 365 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ala Thr Thr Cys 370 375 380 Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Cys Ala Cys Ala Gly Ala Thr Thr 385 390 395 400 Cys Ala Thr Thr Thr Ala Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr 405 410 415 Thr Ala Ala Ala Ala Gly Gly Thr Thr Gly Thr Gly Cys Gly Gly Thr 420 425 430 Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly Thr Ala Gly Ala Ala Gly Thr Gly Gly 435 440 445 Ala Thr Ala Thr Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr Thr Gly Cys 450 455 460 Ala Gly Cys Thr Gly Ala Gly Ala Thr Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly 465 470 475 480 Gly Cys Ala Gly Ala Gly Gly Ala Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys 485 490 495 Gly Cys Ala Ala Ala Ala Gly Gly Cys Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala 500 505 510 Ala Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Cys Cys 515 520 525 Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys 530 535 540 Gly Cys Ala Gly Thr Cys Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Thr 545 550 555 560 Cys Gly Thr Thr Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala 565 570 575 Cys Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Ala Ala Cys Ala Ala Ala Gly 580 585 590 Gly Cys Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala 595 600 605 Cys Gly Ala Cys Gly Ala Gly Ala Ala Cys Ala Thr Thr Cys Cys Gly 610 615 620 Ala Thr Gly Gly Ala Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala 625 630 635 640 Cys Ala Cys Ala Cys Cys Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Cys 645 650 655 Ala Ala Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Ala Ala Cys Ala Gly 660 665 670 Ala Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Cys Ala 675 680 685 Cys Gly Thr Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala 690 695 700 Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Cys Ala Gly 705 710 715 720 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Thr Cys Gly Ala Cys Ala Gly Thr Ala 725 730 735 Thr Gly Gly Cys Ala Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Gly Ala Ala Cys 740 745 750 Cys Ala Gly Thr Gly Ala Thr Ala Gly Thr Ala Ala Cys Ala Cys Thr 755 760 765 Gly Gly Cys Thr Cys Gly Gly Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala Cys Ala 770 775 780 Gly Thr Gly Cys Ala Ala Cys Ala Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala 785 790 795 800 Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Cys Ala Gly Ala Thr Cys Cys Cys 805 810 815 Ala Thr Ala Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Gly Ala 820 825 830 Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala 835 840 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Hph-1 <400> 5 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Hph-1 <400> 6 tatgcacgtg ttcggaggcg tggaccccgc cgc 33 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FLAG tag <400> 7 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of FLAG tag <400> 8 gactacaagg acgacgatga caag 24 <210> 9 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of fusion protein <400> 9 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Ala Tyr His Asn Ser 1 5 10 15 Pro Ala Tyr Leu Ala Tyr Ile Asn Ala Lys Ser Arg Ala Glu Ala Ala 20 25 30 Leu Glu Glu Glu Ser Arg Gln 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Gln Glu Gly Val Asp Ser 245 250 255 Met Ala Glu Glu Gly Thr Ser Asp Ser Asn Thr Gly Ser Glu Ser Asn 260 265 270 Ser Ala Thr Val Glu Glu Pro Pro Thr Asp Pro Ile Pro Glu Asp Glu 275 280 285 Lys Lys Glu 290 <210> 10 <211> 299 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of fusion protein <400> 10 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Asp Tyr Lys Asp Asp 1 5 10 15 Asp Asp Lys Ala Tyr His Asn Ser Pro Ala Tyr Leu Ala Tyr Ile Asn 20 25 30 Ala Lys Ser Arg Ala Glu Ala Ala Leu Glu Glu Glu Ser Arg Gln Arg 35 40 45 Gln Ser Arg Met Glu Lys Gly Glu Pro Tyr Met Ser Ile Gln Pro Ala 50 55 60 Glu Asp Pro Asp Asp Tyr Asp Asp Gly Phe Ser Met Lys His Thr Ala 65 70 75 80 Thr Ala Arg Phe Gln Arg Asn His Arg Leu Ile Ser Glu Ile Leu Ser 85 90 95 Glu Ser Val Val Pro Asp Val Arg Ser Val Val Thr Thr Ala Arg Met 100 105 110 Gln Val Leu Lys Arg Gln Val Gln Ser Leu Met Val His Gln Arg Lys 115 120 125 Leu Glu Ala Glu Leu Leu Gln Ile Glu Glu Arg His Gln Glu Lys Lys 130 135 140 Arg Lys Phe Leu Glu Ser Thr Asp Ser Phe Asn Asn Glu Leu Lys Arg 145 150 155 160 Leu Cys Gly Leu Lys Val Glu Val Asp Met Glu Lys Ile Ala Ala Glu 165 170 175 Ile Ala Gln Ala Glu Glu Gln Ala Arg Lys Arg Gln Glu Glu Arg Glu 180 185 190 Lys Glu Ala Ala Glu Gln Ala Glu Arg Ser Gln Ser Ser Ile Val Pro 195 200 205 Glu Glu Glu Gln Ala Ala Asn Lys Gly Glu Glu Lys Lys Asp Asp Glu 210 215 220 Asn Ile Pro Met Glu Thr Glu Glu Thr His Leu Glu Glu Thr Thr Glu 225 230 235 240 Ser Gln Gln Asn Gly Glu Glu Gly Thr Ser Thr Pro Glu Asp Lys Glu 245 250 255 Ser Gly Gln Glu Gly Val Asp Ser Met Ala Glu Glu Gly Thr Ser Asp 260 265 270 Ser Asn Thr Gly Ser Glu Ser Asn Ser Ala Thr Val Glu Glu Pro Pro 275 280 285 Thr Asp Pro Ile Pro Glu Asp Glu Lys Lys Glu 290 295 <210> 11 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of ntBAF57-PH fusion protein <400> 11 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Ala Ser Gly Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly 20 25 30 Pro Arg Arg Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Glu Phe Gly Ala 35 40 45 Tyr His Asn Ser Pro Ala Tyr Leu Ala Tyr Ile Asn Ala Lys Ser Arg 50 55 60 Ala Glu Ala Ala Leu Glu Glu Glu Ser Arg Gln Arg Gln Ser Arg Met 65 70 75 80 Glu Lys Gly Glu Pro Tyr Met Ser Ile Gln Pro Ala Glu Asp Pro Asp 85 90 95 Asp Tyr Asp Asp Gly Phe Ser Met Lys His Thr Ala Thr Ala Arg Phe 100 105 110 Gln Arg Asn His Arg Leu Ile Ser Glu Ile Leu Ser Glu Ser Val Val 115 120 125 Pro Asp Val Arg Ser Val Val Thr Thr Ala Arg Met Gln Val Leu Lys 130 135 140 Arg Gln Val Gln Ser Leu Met Val His Gln Arg Lys Leu Glu Ala Glu 145 150 155 160 Leu Leu Gln Ile Glu Glu Arg His Gln Glu Lys Lys Arg Lys Phe Leu 165 170 175 Glu Ser Thr Asp Ser Phe Asn Asn Glu Leu Lys Arg Leu Cys Gly Leu 180 185 190 Lys Val Glu Val Asp Met Glu Lys Ile Ala Ala Glu Ile Ala Gln Ala 195 200 205 Glu Glu Gln Ala Arg Lys Arg Gln Glu Glu Arg Glu Lys Glu Ala Ala 210 215 220 Glu Gln Ala Glu Arg Ser Gln Ser Ser Ile Val Pro Glu Glu Glu Gln 225 230 235 240 Ala Ala Asn Lys Gly Glu Glu Lys Lys Asp Asp Glu Asn Ile Pro Met 245 250 255 Glu Thr Glu Glu Thr His Leu Glu Glu Thr Thr Glu Ser Gln Gln Asn 260 265 270 Gly Glu Glu Gly Thr Ser Thr Pro Glu Asp Lys Glu Ser Gly Gln Glu 275 280 285 Gly Val Asp Ser Met Ala Glu Glu Gly Thr Ser Asp Ser Asn Thr Gly 290 295 300 Ser Glu Ser Asn Ser Ala Thr Val Glu Glu Pro Pro Thr Asp Pro Ile 305 310 315 320 Pro Glu Asp Glu Lys Lys Glu 325 <210> 12 <211> 873 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of fusion protein <400> 12 tatgcacgtg ttcggaggcg tggaccccgc cgcgcctatc ataattcccc cgcgtacctt 60 gcttacataa atgcaaaaag tcgtgcagaa gctgctttag aggaagaaag tcgacagaga 120 caatctcgca tggagaaagg agaaccgtac atgagcattc agcctgctga agatccagat 180 gattatgatg atggcttttc aatgaagcat acagccaccg cccgtttcca gagaaaccac 240 cgcctcatca gtgaaattct tagtgagagt gtggtgccag acgttcggtc agttgtcaca 300 acagctagaa tgcaggtcct caaacggcag gtccagtcct taatggttca tcagcgaaaa 360 ctagaagctg aacttcttca aatagaggaa cgacaccagg agaagaagag gaaattcctg 420 gaaagcacag attcatttaa caatgaactt aaaaggttgt gcggtctgaa agtagaagtg 480 gatatggaga aaattgcagc tgagattgca caggcagagg aacaggcccg caaaaggcag 540 gaggaaaggg agaaggaggc cgcagagcaa gctgagcgca gtcagagcag catcgttcct 600 gaggaagaac aagcagctaa caaaggcgag gagaagaaag acgacgagaa cattccgatg 660 gagacagagg agacacacct tgaagaaaca acagagagcc aacagaatgg tgaagaaggc 720 acgtctactc ctgaggacaa ggagagtggg caggaggggg tcgacagtat ggcagaggaa 780 ggaaccagtg atagtaacac tggctcggag agcaacagtg caacagtgga ggagccacca 840 acagatccca taccagaaga tgagaaaaaa gaa 873 <210> 13 <211> 897 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of fusion protein <400> 13 tatgcacgtg ttcggaggcg tggaccccgc cgcgactaca aggacgacga tgacaaggcc 60 tatcataatt cccccgcgta ccttgcttac ataaatgcaa aaagtcgtgc agaagctgct 120 ttagaggaag aaagtcgaca gagacaatct cgcatggaga aaggagaacc gtacatgagc 180 attcagcctg ctgaagatcc agatgattat gatgatggct tttcaatgaa gcatacagcc 240 accgcccgtt tccagagaaa ccaccgcctc atcagtgaaa ttcttagtga 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<211> 314 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of BAF57-PH fusion protein <400> 15 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Ala Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Glu 20 25 30 Phe Gly Ala Tyr His Asn Ser Pro Ala Tyr Leu Ala Tyr Ile Asn Ala 35 40 45 Lys Ser Arg Ala Glu Ala Ala Leu Glu Glu Glu Ser Arg Gln Arg Gln 50 55 60 Ser Arg Met Glu Lys Gly Glu Pro Tyr Met Ser Ile Gln Pro Ala Glu 65 70 75 80 Asp Pro Asp Asp Tyr Asp Asp Gly Phe Ser Met Lys His Thr Ala Thr 85 90 95 Ala Arg Phe Gln Arg Asn His Arg Leu Ile Ser Glu Ile Leu Ser Glu 100 105 110 Ser Val Val Pro Asp Val Arg Ser Val Val Thr Thr Ala Arg Met Gln 115 120 125 Val Leu Lys Arg Gln Val Gln Ser Leu Met Val His Gln Arg Lys Leu 130 135 140 Glu Ala Glu Leu Leu Gln Ile Glu Glu Arg His Gln Glu Lys Lys Arg 145 150 155 160 Glu Phe Leu Glu Ser Thr Asp Ser Phe Asn Asn Glu Leu Lys Arg Leu 165 170 175 Cys Gly Leu Lys Val Glu Val Asp Met Glu Lys Ile Ala Ala Glu Ile 180 185 190 Ala Gln Ala Glu Glu Gln Ala Arg Lys Arg Gln Glu Glu Arg Glu Lys 195 200 205 Glu Ala Ala Glu Gln Ala Glu Arg Ser Gln Ser Ser Ile Val Pro Glu 210 215 220 Glu Glu Gln Ala Ala Asn Lys Gly Glu Glu Lys Lys Asp Asp Glu Asn 225 230 235 240 Ile Pro Met Glu Thr Glu Glu Thr His Leu Glu Glu Thr Thr Glu Ser 245 250 255 Gln Gln Asn Gly Glu Glu Gly Thr Ser Thr Pro Glu Asp Lys Glu Ser 260 265 270 Gly Gln Glu Gly Val Asp Ser Met Ala Glu Glu Gly Thr Ser Asp Ser 275 280 285 Asn Thr Gly Ser Glu Ser Asn Ser Ala Thr Val Glu Glu Pro Pro Thr 290 295 300 Asp Pro Ile Pro Glu Asp Glu Lys Lys Glu 305 310 <210> 16 <211> 945 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of BAF57-PH fusion protein <400> 16 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60 atggctagcg actacaagga cgacgatgac aaggaattcg gagcctatca taattccccc 120 gcgtaccttg cttacataaa tgcaaaaagt cgtgcagaag ctgctttaga ggaagaaagt 180 cgacagagac aatctcgcat ggagaaagga gaaccgtaca tgagcattca gcctgctgaa 240 gatccagatg attatgatga tggcttttca atgaagcata cagccaccgc ccgtttccag 300 agaaaccacc gcctcatcag tgaaattctt agtgagagtg tggtgccaga cgttcggtca 360 gttgtcacaa cagctagaat gcaggtcctc aaacggcagg tccagtcctt aatggttcat 420 cagcgaaaac tagaagctga acttcttcaa atagaggaac gacaccagga gaagaagagg 480 gaattcctgg aaagcacgga ttcatttaac aatgaactta aaaggttgtg cggtctgaaa 540 gtagaagtgg atatggagaa aattgcagct gagattgcac aggcagagga acaggcccgc 600 aaaaggcagg aggaaaggga gaaggaggcc gcagagcaag ctgagcgcag tcagagcagc 660 atcgttcctg aggaagaaca agcagctaac aaaggcgagg agaagaaaga cgacgagaac 720 attccgatgg agacagagga gacacacctt gaagaaacaa cagagagcca acagaatggt 780 gaagaaggca cgtctactcc tgaggacaag gagagtgggc aggagggggt cgacagtatg 840 gcagaggaag gaaccagtga tagtaacact ggctcggaga gcaacagtgc aacagtggag 900 gagccaccaa cagatcccat accagaagat gagaaaaaag aatag 945

Claims

BAF57(BRG1 or HBRM-associated factors 57) 단백질의 전부 또는 일부; 및 단백질 운반 도메인을 포함하는, 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 BAF57 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는, 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 BAF57 단백질은 서열번호 2로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 것인, 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 BAF57 단백질의 일부는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는, 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 BAF57 단백질의 일부는 서열번호 4로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 것인, 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 단백질 운반 도메인은 Hph-1, Mph-1, Sim-2, Tat, VP22, Antp(antennapedia), Pep-1(peptide-1), PTD-5(protein transduction domain-5), MAP, K-FGF, 페네트라틴(penetratin), 트랜스포탄(transportan), 폴리아르기닌, 11R, 7R 및 CTP(cytoplamic transduction peptide)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 단백질 운반 도메인은 상기 BAF57 단백질의 전부 또는 일부의 N-터미널(N-terminal)에 연결되는 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 융합 단백질은 분리 및 정제를 위한 태그(tag)를 추가로 더 포함하는, 융합 단백질.
제8항에 있어서,
상기 태그는 친화성 태그(affinity tag) 및 에피토프 태그(epitope tag) 중 적어도 하나인, 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 융합 단백질은 서열번호 9 내지 11 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합 단백질.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
제11항에 있어서,
상기 핵산 분자는 서열번호 12 내지 14 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것인, 핵산 분자.
제11항의 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터.
제13항의 발현 벡터가 형질 전환된 숙주 세포.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효 성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제15항에 있어서,
상기 염증성 질환은 천식, 습진, 건선, 알러지, 류마티스 관절염, 건선 관절염, 아토피성 피부염, 여드름, 아토피성 비염, 폐염증, 알레르기성 피부염, 만성 부비동염, 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrheic dermatitis), 위염, 통풍, 통풍 관절염, 궤양, 만성 기관지염, 크론병, 궤양성 대장염, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 패혈증, 맥관염, 활액낭염, 루프스, 류마티스 다발성 근육통, 측두 동맥염, 다발성 경화증, 고형암, 알츠하이머병, 동맥경화증, 비만 또는 바이러스 감염인, 약학 조성물.
제15항에 있어서,
상기 면역 관련 질환은 자가면역질환; 이식편대숙주 질환; 또는 세포, 조직 또는 기관의 이식 거부 질환;인, 약학 조성물.
제17항에 있어서,
상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 섬유조직염, 결절성 다발성 동맥염, 인슐린-의존성 당뇨병, 실험적 자가면역 뇌척수염, 실험적 자가면역 관절염, 중증 근무력증, 실험적 형태의 포도막염, 원발성 점액수종, 갑상샘 중독증, 악성 빈혈, 자가면역 위축 위염, 애디슨 질환, 조기 폐경, 남성 불임증, 소아 당뇨병, 굿파스처 증후군, 보통 천포창, 유천포창, 교감성 안염, 수정체성 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소, 원발성 담관 경화증, 만성 활동성 간염 Hbs-ve, 잠재성 간경변증, 궤양성 대장염, 경피증, 베게너 육아종증, 다발근육염/피부근육염 또는 원판상 LE인, 약학 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제19항에 있어서,
상기 암은 난소암, 대장암, 췌장암, 위암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 약학 조성물.