WO2020130519A1 - 암 세포주 유래 amf를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물 - Google Patents

암 세포주 유래 amf를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물 Download PDF

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WO2020130519A1
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amf
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    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia

Definitions

  • the present invention relates to an anticancer composition containing AMF derived from a cancer cell line as an active ingredient, and more particularly, to a pharmaceutical composition for anticancer containing AMF derived from a colon cancer, bladder cancer, leukemia or stomach cancer cell line as an active ingredient.
  • Cancer is one of the three major causes of death along with infectious diseases and cardiovascular diseases worldwide, and is a major disease that is expected to increase rapidly in the future due to environmental problems, prolonged lifespan, and westernization of food culture. Although many studies on cancer have been conducted to develop more effective anticancer drugs, the development of new anticancer drugs that have little side effects and overcome resistance due to diversification of cancer pathogenesis is still urgent.
  • cell competition is a comparison process between cell growth adaptation and survival, and cells pushed out of competition can be killed.
  • Cell competition is closely related to the occurrence of cancer, and the surrounding cells, which are inferior in growth adaptability to cancer cells, may disappear.
  • cells that dominate the competition have been hypothesized to secrete a death signal at the beginning of the cell competition, but have not been identified.
  • AMF autocrine motility factor
  • GPI glucose-6-phosphate isomerase
  • Korean Patent Publication No. 2016-0050773 discloses AMFR-Fc fusion protein and its anti-cancer use, but the anti-cancer composition containing the AMF derived from the cancer cell line of the present invention as an active ingredient has not been disclosed.
  • the present invention was derived by the above-mentioned needs, and provides a composition for anticancer containing AMF derived from a cancer cell line as an active ingredient, and by confirming that the composition inhibits the proliferation of cancer and causes apoptosis, the present invention was completed.
  • the present invention provides an anticancer pharmaceutical composition containing an autocrine motility factor (AMF) derived from a cancer cell line as an active ingredient.
  • AMF autocrine motility factor
  • the present invention provides a method for inhibiting the proliferation or apoptosis of cancer cells, comprising administering the pharmaceutical composition for anticancer to an individual.
  • the present invention relates to an anticancer composition containing AMF derived from a cancer cell line as an active ingredient, wherein the AMF derived from a cancer cell line of the present invention is selected from the group consisting of leukemia, colorectal cancer, laryngeal cancer, breast cancer, prostate cancer, brain cancer and bladder cancer. Since the effect of suppressing the proliferation of the above cancer and causing apoptosis is excellent, the composition of the present invention containing AMF derived from a cancer cell line as an active ingredient may be used as a material for cancer treatment.
  • Figure 1 is a colon cancer cell conditioned medium (conditioned medium, CM) when treated with other cancer cell lines, is a result showing the cell proliferation rate of the CM-treated group compared to the control group not treated with CM through MTT analysis.
  • A549 is a lung cancer cell line
  • HeLa is a cervical cancer cell line
  • Hep G2 is a liver cancer cell line
  • HL-60 is a leukemia cell line
  • U-87 MG is a brain cancer cell line
  • MCF-7 is a breast cancer cell line.
  • Figure 2 is a result of comparing the amino acid sequence of recombinant AMF and GPI isoforms derived from colon cancer (Genbank accession number: BC004982.1).
  • A is the amino acid sequence of the GPI isoform (SEQ ID NO: 11)
  • B is the amino acid sequence of recombinant AMF derived from colon cancer (SEQ ID NO: 1).
  • Figure 3 is a result of comparing the cell number of the leukemia cells (HL-60) by measuring the recombinant AMF-derived recombinant colon-derived cancer compared with the control group not treated with recombinant AMF.
  • rAMF is a recombinant AMF derived from colon cancer.
  • Figure 4 is a bladder cancer cell conditioned medium (conditioned medium, CM) when treated with other cancer cell lines, is a result showing the cell proliferation rate of the CM-treated group compared to the control group not treated with CM through MTT analysis.
  • DU145 is a prostate cancer cell line
  • HeLa is a cervical cancer cell line
  • Hep 2 is a laryngeal cancer cell line
  • A172 is a brain cancer cell line
  • HT-29 is a colon cancer cell line
  • MCF-7 is a breast cancer cell line.
  • FIG. 5 is a result of comparing the amino acid sequence of the bladder cancer-derived recombinant AMF and GPI isoform (Genbank accession number: BC004982.1).
  • A is the amino acid sequence of the GPI isoform
  • B is the amino acid sequence of the recombinant AMF derived from bladder cancer (SEQ ID NO: 2).
  • Figure 6 is a result of comparing the control of the untreated recombinant AMF by measuring the change in cell number by treatment for each concentration of recombinant AMF derived from the bladder cancer.
  • rAMF is a recombinant AMF derived from bladder cancer
  • HT-29 is colon cancer cells
  • Hep 2 is laryngeal cancer cells.
  • CM-treated group is a result showing the cell proliferation rate of the CM-treated group compared to the control group not treated with CM, when treated with other cancer cell lines, when the conditioned medium (CM) is treated with conditioned medium (CM).
  • DU145 is a prostate cancer cell line
  • HeLa is a cervical cancer cell line
  • Hep 2 is a laryngeal cancer cell line
  • U-87 MG is a brain cancer cell line
  • HT-29 is a colon cancer cell line
  • MCF-7 is a breast cancer cell line
  • SKOV3 is an ovarian cancer cell line
  • A549 is lung cancer
  • the cell line Hep G2 is a liver cancer cell line
  • 253J is a bladder cancer cell line.
  • A is the amino acid sequence of the GPI isoform
  • B is the amino acid sequence of the recombinant AMF derived from leukemia (SEQ ID NO: 3).
  • rAMF is a recombinant AMF derived from leukemia
  • MCF-7 is a breast cancer cell
  • DU145 is a prostate cancer cell
  • HT-29 is a colon cancer cell
  • U-87 MG is a brain cancer cell
  • Hep 2 is a laryngeal cancer cell
  • 253J is a bladder cancer cell.
  • Figure 10 is a gastric cancer cell conditioned medium (conditioned medium, CM) when treated with other cancer cell lines, is a result showing the cell proliferation rate of the CM-treated group compared to the control group not treated with CM through MTT analysis.
  • A549 is a lung cancer cell line
  • HeLa is a cervical cancer cell line
  • Hep G2 is a liver cancer cell line
  • U-87 MG is a brain cancer cell line
  • HT-29 is a colon cancer cell line
  • MCF-7 is a breast cancer cell line.
  • rAMF is a recombinant AMF derived from gastric cancer
  • U-87 MG is brain cancer cells
  • HT-29 is colorectal cancer cells.
  • the present invention relates to an anticancer pharmaceutical composition containing an autocrine motility factor (AMF) derived from a cancer cell line as an active ingredient.
  • AMF autocrine motility factor
  • AMF derived from the cancer cell line may be any one selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • the AMF consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is an AMF derived from a colon cancer cell line, preferably a human derived colon cancer cell line HT-29 derived AMF, but is not limited thereto.
  • the AMF consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is AMF derived from the bladder cancer cell line, and preferably AMF derived from the human bladder cancer cell line 253J, but is not limited thereto.
  • the AMF consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is AMF derived from a leukemia cell line, preferably AMF derived from HL-60, a human-derived leukemia cell line, but is not limited thereto.
  • the AMF consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is AMF derived from a stomach cancer cell line, preferably AMF derived from SNU484, a human-derived stomach cancer cell line, but is not limited thereto.
  • the range of AMF derived from the cancer cell line of the present invention includes functional equivalents of proteins having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4.
  • the term “functional equivalent” refers to at least 70%, preferably 80% or more, more preferably 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, More preferably, it has a sequence homology of 95% or more, and refers to a protein having substantially the same physiological activity as the proteins represented by SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • peptides that exhibit substantially the same physiological activity as AMF derived from cancer are included.
  • “Substantially homogeneous physiological activity” means activity against cancer prevention or treatment.
  • anti-cancer refers to inhibiting the proliferation of cancer cells or killing cancer cells.
  • the composition of the present invention may exhibit an anti-cancer effect in one or more selected from the group consisting of leukemia, colorectal cancer, laryngeal cancer, breast cancer, prostate cancer, brain cancer and bladder cancer, preferably AMF derived from the colon cancer cell line of SEQ ID NO:1
  • the composition comprising may exhibit anti-cancer effect in leukemia, AMF derived from bladder cancer cell line of SEQ ID NO: 2 may exhibit anti-cancer effect in one or more selected from the group consisting of colon cancer and laryngeal cancer, and leukemia of SEQ ID NO: 3
  • the composition comprising the cell line derived AMF may exhibit anti-cancer effect in at least one selected from the group consisting of breast cancer, prostate cancer, colon cancer, brain cancer, laryngeal cancer and bladder cancer, and the composition comprising AMF derived from the stomach cancer cell line of SEQ ID NO: 4
  • the composition may inhibit the proliferation of cancer and induce apoptosis, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is formulated in the form of oral dosage forms such as capsules, powders, granules, tablets, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method.
  • oral dosage forms such as capsules, powders, granules, tablets, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method.
  • oral dosage forms such as capsules, powders, granules, tablets, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical compositions of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate , Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations include at least one excipient in the pharmaceutical composition, such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc. It is prepared by mixing. In addition, lubricants such as magnesium stearate and talc are used in addition to simple excipients.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, intravenous solutions, emulsions, syrups, etc.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • Witepsol, Macrogol, Tween 61, cacao butter, laurin butter, and glycerogelatin may be used as a base for suppositories.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the invention may be variously prescribed by factors such as formulation method, mode of administration, patient's age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and response sensitivity. Can be.
  • composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, topically applied to the skin, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, and the like.
  • the human cancer cell line used in this experiment was purchased from the Korea Cell Line Bank (Seoul, Korea). Colon cancer cells HT-29, lung cancer cells A549, cervical cancer cells HeLa, liver cancer cells HepG2, leukemia cells HL-60, brain cancer cells U-87 MG and A172, breast cancer cells MCF-7, bladder cancer Cells 253J, prostate cancer cells DU145, laryngeal cancer cells Hep 2, ovarian cancer cells SKOV3 and gastric cancer cells SNU484 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS), 100 U/mL penicillin Cultured in RPMI or DMEM medium containing G and 100 ⁇ g/ml streptomycin at 37° C. under 5% CO 2 conditions.
  • FBS fetal bovine serum
  • HT-29 colorectal cancer cell line 253J bladder cancer cell line, HL-60 leukemia cell line, or SNU484 gastric cancer cell line grew at a rate of approximately 80% in a 175 cm 2 culture flask, phosphate-buffered saline (PBS) After washing with 3 times, the cells were cultured for 24 hours by replacing them with serum-free medium, and then serum-free media (hereinafter referred to as CM) were obtained.
  • CM, 253J CM, HL-60 CM or SNU484 CM were obtained.
  • HT-29 CM, 253J CM, HL-60 CM or SNU484 CM were filtered to 0.22 ⁇ m and freeze-dried and stored at minus 70°C.
  • Cells were cultured for 24 hours in a 24-well culture dish, and then treated with HT-29 CM, 253J CM, HL-60 CM, or SNU484 CM in cultured cells at a concentration of 5% (v/v) with respect to the culture medium. The culture was incubated for 72 hours.
  • HT-29 CM, 253J CM, HL-60 CM or SNU484 CM was dissolved in Tris buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5) and dialyzed against the same buffer at 4°C. After dialysis, samples of HT-29 CM, 253J CM, HL-60 CM or SNU484 CM were loaded onto a column containing 30 ml of DEAE sepharose pre-equilibrated in Tris buffer. The bound protein was eluted from the column using a linear gradient of 0-1.0 M sodium chloride (NaCl) in Tris buffer at a flow rate of 0.7 ml per minute.
  • Tris buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.5
  • Elution fractions containing the main peaks with bioactivity were collected and concentrated in a dialysis tube (7000 MWCO) by dialysis against sucrose.
  • the concentrated sample was re-fractionated on a column filled with 0.8 x 30 cm Sephacryl S-200 pre-equilibrated in Tris buffer.
  • the bioactive fraction was selected at a flow rate of 0.1 ml per minute and concentrated by dialysis as described above.
  • Physiological activity was evaluated by HL-60, HT-29 or U-87 MG cell activity analysis using MTT analysis, and after confirming the size of the sample showing physiological activity on a 12% SDS-PAGE gel, malditope for protein identification (MALDI-TOF) Mass spectrometry was performed.
  • MALDI-TOF malditope for protein identification
  • the forward primer containing the Nde I restriction enzyme site used in PCR and the reverse primer containing the Xho I restriction enzyme site were constructed based on a DNA sequence encoding a GPI (genbank accession number: BC004982.1).
  • Reverse primer 5'-ATCTCGAGTTATTGGACTCTGGCCTCGCGCTGCT-3' (SEQ ID NO: 6)
  • the PCR product of about 1.7 kb in length confirmed the DNA sequence, and was cloned into the pCold DNA1 vector to construct pHT-29-AMF, p253J-AMF, pHL-60-AMF or pSNU484-AMF.
  • E. coli BL21 containing pHT-29-AMF, p253J-AMF, pHL-60-AMF or pSNU484-AMF was cultured in LB medium containing 100 ⁇ g/ml ampicillin at 200 rpm for 16 hours at 37° C. Diluted 1:100 in fresh medium and incubated for 2 hours under conditions of 200 rpm and 37°C.
  • the cells were treated with 0.5 mM IPTG and incubated for 24 hours under conditions of 200 rpm and 15°C.
  • the harvested cells are resuspended in a buffer solution (20mM Tris-HCl pH 8.0, 200mM NaCl and 0.5mM PMSF), and then a French pressure cell press (Model FA-078A, Thermo IEC, Milford, MA, USA). Cells were crushed using, and centrifuged at 12000 rpm at 4° C. for 20 minutes to obtain a lysed fraction. The fraction obtained was passed through a 0.22 ⁇ m syringe filter.
  • HT-29 recombinant AMF (HT-29 rAMF), 253J recombinant AMF (253J rAMF), HL-60 recombinant AMF (HL-60 rAMF), or SNU484 recombinant AMF (SNU484 rAMF) according to the supplier's method His60 Ni resin Chin Purification was performed by chemical chromatography (Promega, Madison, WI, USA), and the content of the purified protein was quantified using a Bio-Rad protein analysis reagent.
  • Example 1 Anticancer effect of AMF derived from colorectal cancer cell line
  • HT-29 CM In order to confirm the cancer cell proliferation inhibitory effect of HT-29 CM, MTT analysis was performed by treating HT-29 CM on various cancer cells except colon cancer. As a result, the cell growth inhibition rate of the HT-29 CM treated group relative to the control group not treated with HT-29 CM was shown for each cell.
  • Proteins were purified and identified in order to analyze the proteins showing the inhibitory effect on cancer cell proliferation contained in HT-29 CM.
  • the fraction showing physiological activity among the DEAE sepharose fraction and the DEAE sepharose fraction is re-fractionated using a column filled with Sephacryl S-200, and the fraction having the excellent physiological activity among the re-fractions Confirmed.
  • Physiological activity was confirmed by inhibiting the proliferation of cancer cells by treating the fraction with HL-60 cells.
  • AMF a protein related to the mobility and proliferation of cancer cells
  • HT-29 AMF cDNA was amplified through reverse transcription and PCR using HT-29 RNA, and then cloned into a pCold DNA1 vector to construct pHT-29-AMF.
  • the DNA sequence was analyzed as shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence of the predicted recombinant AMF was analyzed, and as shown in FIG. 2, 99% homology with the GPI isoform (Genbank accession number: BC004982.1) It is confirmed that several mutations appear.
  • the recombinant AMF was purified, it was treated with cancer cells to confirm the effect on cell proliferation.
  • FIG. 3 when recombinant AMFs of various concentrations (2, 10 and 50 ng/ml) were treated for 3 days, leukemia (HL-60) was concentration-dependent compared to the untreated control (control, 100%). ) It was confirmed that cell proliferation is suppressed.
  • Proteins were purified and identified in order to analyze the proteins showing the inhibitory effect on cancer cell proliferation contained in 253J CM.
  • the fraction showing physiological activity among the DEAE sepharose fraction and the DEAE sepharose fraction is re-fractionated using a column filled with Sephacryl S-200, and the fraction having the excellent physiological activity among the re-fractions Confirmed.
  • Physiological activity was confirmed by inhibiting the proliferation of cancer cells by treating the fraction with HT-29 cells.
  • AMF a protein related to the mobility and proliferation of cancer cells
  • 253J AMF cDNA was amplified through reverse transcription and PCR using 253J RNA, and then cloned into a pCold DNA1 vector to construct p253J-AMF.
  • SEQ ID NO: 8 the DNA sequence was analyzed as shown in SEQ ID NO: 8
  • amino acid sequence of the predicted recombinant AMF was analyzed, and as shown in FIG. 5, 98% homology to the GPI isoform (Genbank accession number: BC004982.1). It is confirmed that several mutations appear.
  • the recombinant AMF was purified, it was treated with cancer cells to confirm the effect on cell proliferation.
  • the concentration-dependent colon cancer HT-29
  • the untreated control control, 100%
  • laryngeal cancer Hep 2
  • MTT analysis was performed by treating HL-60 CM on various cancer cells except leukemia. The results showed the cell proliferation inhibition rate of the HL-60 CM treatment group for each control cell for the control group not treated with HL-60 CM.
  • HL-60 CM proliferates breast cancer (MCF-7), prostate cancer (DU145), colon cancer (HT-29), brain cancer (U-87 MG), laryngeal cancer (Hep 2), and bladder cancer (253J) cells. It was confirmed that it specifically inhibited.
  • Proteins were purified and identified in order to analyze proteins showing the inhibitory effect on cancer cell proliferation contained in HL-60 CM.
  • the fraction showing physiological activity among the DEAE sepharose fraction and the DEAE sepharose fraction is re-fractionated using a column filled with Sephacryl S-200, and the fraction having the excellent physiological activity among the re-fractions Confirmed.
  • Physiological activity was confirmed by inhibiting the proliferation of cancer cells by treating the fraction with HT-29 cells.
  • AMF a protein related to the mobility and proliferation of cancer cells
  • HL-60 AMF cDNA was amplified through reverse transcription and PCR using HL-60 RNA, and then cloned into a pCold DNA1 vector to construct pHL-60-AMF.
  • SEQ ID NO: 9 the DNA sequence was analyzed as shown in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence of the predicted recombinant AMF was analyzed.
  • FIG. 8 89% homology with the GPI isoform (Genbank accession number: BC004982.1) It is confirmed that several mutations appear.
  • SNU484 CM was treated on various cancer cells except gastric cancer to perform MTT analysis.
  • the cell proliferation inhibition rate of the SNU484 CM treated group relative to the control group not treated with SNU484 CM was shown for each cell.
  • Proteins were purified and identified in order to analyze the proteins showing the inhibitory effect on cancer cell proliferation contained in SNU484 CM.
  • the fraction showing physiological activity among the DEAE sepharose fraction and the DEAE sepharose fraction is re-fractionated using a column filled with Sephacryl S-200, and a fraction having excellent physiological activity among the re-fraction fractions Confirmed.
  • Physiological activity was confirmed by inhibiting the proliferation of cancer cells by treating the fraction with U-87 MG cells.
  • AMF a protein related to the mobility and proliferation of cancer cells
  • pSNU484-AMF was constructed by cloning the pCold DNA1 vector.
  • the DNA sequence was analyzed as shown in SEQ ID NO: 10, and the amino acid sequence of the predicted recombinant AMF was analyzed, and as shown in FIG. 11, 99% homology with the GPI isoform (Genbank accession number: BC004982.1). It is confirmed that several mutations appear.
  • the recombinant AMF was purified, it was treated with cancer cells to confirm the effect on cell proliferation.
  • FIG. 12 when treated with recombinant AMF at various concentrations (2, 10 and 50 ng/ml) for 3 days, brain cancer (U-87 MG) was concentration-dependent compared to the untreated control (control, 100%). ) And colon cancer (HT-29) cells were confirmed to be proliferated.

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Abstract

본 발명은 암 세포주 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명의 암 세포주 유래 AMF는 백혈암, 대장암, 후두암, 유방암, 전립선암, 뇌암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 암의 증식을 억제하고, 세포사멸을 일으키는 효과가 우수하므로, 암 세포주 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 항암치료제로 사용될 수 있다.

Description

암 세포주 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물
본 발명은 암 세포주 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 대장암, 방광암, 백혈암 또는 위암 세포주 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물에 관한 것이다.
암은 세계적으로 감염성 질환 및 심혈관계 질환과 더불어 3대 사망원인 중 하나로, 환경문제, 수명연장, 식문화의 서구화 등으로 인해 향후 암 발생인구가 급격하게 증가할 것으로 예상되는 주요 질환이다. 보다 더욱 효과적인 항암제의 개발을 위해 암에 대한 많은 연구가 진행되고 있음에도 불구하고 암의 발병기전의 다양화로 인해 부작용이 적고 내성을 극복할 수 있는 새로운 항암제의 개발이 여전히 절실한 상황이다.
한편, 세포경쟁은 세포간 생장 적응 및 생존의 비교 과정으로, 경쟁에서 밀리는 세포는 사멸될 수 있다. 세포경쟁은 암 발생과 밀접한 연관성을 지니는데 암세포에 비해 생장 적응력이 열세인 주변의 세포는 사라질 수 있다. 현재까지 경쟁에서 우위를 점하는 세포(winner cell)가 세포경쟁 초기에 세포사멸신호(death signal)를 분비할 것으로 가정되어 왔으나 규명된 바 없다.
한편, AMF(autocrine motility factor)는 하우스키핑(housekeeping) 단백질로서 세포 내에서 에너지 대사와 관련하여 해당작용(glycolysis)의 두 번째 과정의 글루코오스-6-포스페이트(glucose-6-phosphate)와 프락토오스-6-포스페이트(fructose-6-phosphate)를 상호전환(interconversion)하는 역할을 하는 것으로 알려졌으며, 이러한 기능으로 인해 글루코오스-6-포스페이트 이성질화제(glucose-6-phosphate isomerase, GPI)라고 불리기도 한다. 종양에서 분비되는 사이토카인인 AMF는 종양 부위에 풍부하며 종양의 증식, 분화 및 생존에 중요 역할을 지니는 것으로 알려져 있다.
한편, 한국공개특허 제2016-0050773호에는 AMFR-Fc 융합 단백질 및 이의 항암용도를 개시하고 있지만, 본 발명의 암 세포주 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물은 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 암 세포주 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물을 제공하고, 상기 조성물이 암의 증식을 억제하고, 세포사멸을 일으킴을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 암 세포주 유래 AMF(autocrine motility factor)를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항암용 약학 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암세포의 증식억제 또는 세포사멸 증진방법을 제공한다.
본 발명은 암 세포주 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 암 세포주 유래 AMF는 백혈암, 대장암, 후두암, 유방암, 전립선암, 뇌암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 암의 증식을 억제하고, 세포사멸을 일으키는 효과가 우수하므로, 암 세포주 유래 AMF를 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 암 치료용 소재로 사용될 수 있다.
도 1은 대장암세포 조정배지(conditioned medium, CM)를 타 암세포주에 처리하였을 때, CM을 처리하지 않은 대조군 대비 CM 처리군의 세포 증식율을 MTT 분석을 통해 나타낸 결과이다. A549는 폐암 세포주, HeLa는 자궁경부암 세포주, Hep G2는 간암 세포주, HL-60은 백혈암 세포주, U-87 MG는 뇌암 세포주, MCF-7은 유방암 세포주이다.
도 2는 대장암 유래 재조합 AMF와 GPI 동형단백질(Genbank accession number: BC004982.1)의 아미노산 서열을 비교한 결과이다. (A)는 GPI 동형단백질의 아미노산 서열(서열번호 11)이고, (B)는 대장암 유래 재조합 AMF의 아미노산 서열(서열번호 1)이다.
도 3은 정제한 대장암 유래 재조합 AMF 처리에 의한 백혈암 세포(HL-60)의 세포 수 변화를 측정하여 재조합 AMF를 처리하지 않은 대조군과 비교한 결과이다. rAMF는 대장암 유래 재조합 AMF이다.
도 4는 방광암세포 조정배지(conditioned medium, CM)를 타 암세포주에 처리하였을 때, CM을 처리하지 않은 대조군 대비 CM 처리군의 세포 증식율을 MTT 분석을 통해 나타낸 결과이다. DU145는 전립선암 세포주, HeLa는 자궁경부암 세포주, Hep 2는 후두암 세포주, A172는 뇌암 세포주, HT-29는 대장암 세포주, MCF-7은 유방암 세포주이다.
도 5는 방광암 유래 재조합 AMF와 GPI 동형단백질(Genbank accession number: BC004982.1)의 아미노산 서열을 비교한 결과이다. (A)는 GPI 동형단백질의 아미노산 서열이고, (B)는 방광암 유래 재조합 AMF의 아미노산 서열(서열번호 2)이다.
도 6은 정제한 방광암 유래 재조합 AMF 농도별 처리에 의한 세포 수 변화를 측정하여 재조합 AMF를 처리하지 않은 대조군과 비교한 결과이다. rAMF는 방광암 유래 재조합 AMF이고, HT-29는 대장암 세포, Hep 2는 후두암 세포이다.
도 7은 백혈암세포 조정배지(conditioned medium, CM)를 타 암세포주에 처리하였을 때, CM을 처리하지 않은 대조군 대비 CM 처리군의 세포 증식율을 MTT 분석을 통해 나타낸 결과이다. DU145는 전립선암 세포주, HeLa는 자궁경부암 세포주, Hep 2는 후두암 세포주, U-87 MG는 뇌암 세포주, HT-29는 대장암 세포주, MCF-7은 유방암 세포주, SKOV3는 난소암 세포주, A549는 폐암 세포주, Hep G2는 간암 세포주, 253J는 방광암 세포주이다.
도 8은 백혈암 유래 재조합 AMF와 GPI 동형단백질(Genbank accession number: BC004982.1)의 아미노산 서열을 비교한 결과이다. (A)는 GPI 동형단백질의 아미노산 서열이고, (B)는 백혈암 유래 재조합 AMF의 아미노산 서열(서열번호 3)이다.
도 9는 정제한 백혈암 유래 재조합 AMF 농도별 처리에 의한 세포 수 변화를 측정하여 재조합 AMF를 처리하지 않은 대조군과 비교한 결과이다. rAMF는 백혈암 유래 재조합 AMF이고, MCF-7은 유방암 세포, DU145는 전립선암 세포, HT-29는 대장암 세포, U-87 MG는 뇌암 세포, Hep 2는 후두암 세포, 253J는 방광암 세포이다.
도 10은 위암세포 조정배지(conditioned medium, CM)를 타 암세포주에 처리하였을 때, CM을 처리하지 않은 대조군 대비 CM 처리군의 세포 증식율을 MTT 분석을 통해 나타낸 결과이다. A549는 폐암 세포주, HeLa는 자궁경부암 세포주, Hep G2는 간암 세포주, U-87 MG는 뇌암 세포주, HT-29는 대장암 세포주, MCF-7은 유방암 세포주이다.
도 11은 위암 유래 재조합 AMF와 GPI 동형단백질(Genbank accession number: BC004982.1)의 아미노산 서열을 비교한 결과이다. (A)는 GPI 동형단백질의 아미노산 서열이고, (B)는 위암 유래 재조합 AMF의 아미노산 서열(서열번호 4)이다. ·은 (A) 및 (B)가 동일하다는 것을 의미한다.
도 12는 정제한 위암 유래 재조합 AMF 농도별 처리에 의한 세포 수 변화를 측정하여 재조합 AMF를 처리하지 않은 대조군과 비교한 결과이다. rAMF는 위암 유래 재조합 AMF이고, U-87 MG는 뇌암 세포, HT-29는 대장암 세포이다.
본 발명은 암 세포주 유래 AMF(autocrine motility factor)를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 암 세포주 유래 AMF는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 AMF는 대장암 세포주 유래 AMF이고, 바람직하게는 인간 유래의 대장암 세포주인 HT-29 유래 AMF인 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 AMF는 방광암 세포주 유래 AMF이고, 바람직하게는 인간 유래의 방광암 세포주인 253J 유래 AMF인 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 AMF는 백혈암 세포주 유래 AMF이고, 바람직하게는 인간 유래의 백혈암 세포주인 HL-60 유래 AMF인 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 AMF는 위암 세포주 유래 AMF이고, 바람직하게는 인간 유래의 위암 세포주인 SNU484 유래 AMF인 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 암 세포주 유래 AMF의 범위는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1 내지 4로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 또한, 암 유래 AMF와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 포함한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 암 예방 또는 치료에 대한 활성을 의미한다.
본 발명에서 항암이란 암세포의 증식을 억제하거나 암세포를 죽이는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물은 백혈암, 대장암, 후두암, 유방암, 전립선암, 뇌암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에서 항암 효과를 나타내는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1의 대장암 세포주 유래 AMF를 포함하는 조성물은 백혈암에서 항암효과를 나타내는 것일 수 있고, 서열번호 2의 방광암 세포주 유래 AMF는 대장암 및 후두암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에서 항암효과를 나타내는 것일 수 있고, 서열번호 3의 백혈암 세포주 유래 AMF를 포함하는 조성물은 유방암, 전립선암, 대장암, 뇌암, 후두암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에서 항암효과를 나타내는 것일 수 있으며, 서열번호 4의 위암 세포주 유래 AMF를 포함하는 조성물은 뇌암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에서 항암효과를 나타내는 것일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 항암용 약학 조성물에 있어서, 상기 조성물은 암의 증식을 억제하고, 세포사멸을 유도할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당하는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항암용 약학 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암세포의 증식억제 또는 세포사멸 증진 방법을 제공한다. 상기 개체는 암, 바람직하게는 백혈암, 대장암, 후두암, 유방암, 전립선암, 뇌암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 암에 걸린 개체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
재료 및 방법
1. 세포배양
본 실험에 사용된 인간 암 세포주는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구매하였다. 대장암 세포인 HT-29, 폐암 세포인 A549, 자궁경부암 세포인 HeLa, 간암 세포인 HepG2, 백혈암 세포인 HL-60, 뇌암 세포인 U-87 MG 및 A172, 유방암 세포인 MCF-7, 방광암 세포인 253J, 전립선암 세포인 DU145, 후두암 세포인 Hep 2, 난소암 세포인 SKOV3 및 위암 세포인 SNU484를 10%(v/v) 소태아혈청(fetal bovine serum , FBS), 100U/㎖의 페니실린 G 및 100㎍/㎖의 스트렙토마이신이 포함된 RPMI 또는 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO 2 조건하에 배양하였다.
2. 무혈청 조정배지(serum-free conditioned medium, CM)의 준비
HT-29 대장암 세포주, 253J 방광암 세포주, HL-60 백혈암 세포주 또는 SNU484 위암 세포주가 175㎠ 배양 플라스크(culture flask)에 대략 80% 비율로 자랐을 때, 인산완충생리식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 3번 세척한 후, 무혈청 배지로 교체하여 24시간 동안 세포를 배양한 다음 무혈청 조정배지(이하 CM)를 획득하였으며, 그 후 24시간 간격을 두고 최종 72시간 동안 수득하여 HT-29 CM, 253J CM, HL-60 CM 또는 SNU484 CM을 얻었다. HT-29 CM, 253J CM, HL-60 CM 또는 SNU484 CM은 0.22㎛로 필터한 후 동결 건조하여 영하 70℃에서 보관하였다.
3. 세포 성장 분석
세포는 24 웰 배양 접시에서 24시간 동안 배양한 후, 배양한 세포에 HT-29 CM, 253J CM, HL-60 CM 또는 SNU484 CM을 배양 배지에 대하여 5%(v/v) 농도로 처리하여 48시간에서 72시간 동안 재배양하였다.
세포 성장은 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; thiazolyl blue) 분석을 통해 570㎚의 파장에서 관찰하였다.
또한, 생존 세포 수 측정을 위해 트립판 블루 배제 분석(Trypan blue exclusion assay)을 수행하였다.
4. 단백질 정제(purification) 및 동정(identification)
동결건조된 HT-29 CM, 253J CM, HL-60 CM 또는 SNU484 CM은 트리스 완충액(50mM Tris-HCl, pH 7.5)에 용해시키고, 4℃에서 같은 완충액에 대해 투석하였다. 투석 후 HT-29 CM, 253J CM, HL-60 CM 또는 SNU484 CM 샘플을 트리스 완충액에서 예비 평형된 DEAE 세파로오스(diethylaminoethyl group sepharose) 30㎖를 함유하는 칼럼에 로딩하였다. 결합 단백질(bound protein)은 1분당 0.7㎖의 유속에서 트리스 완충액 중 0 내지 1.0 M 염화나트륨(NaCl)의 선형 구배를 사용하여 칼럼으로부터 용리되었다. 생체 활성을 갖는 주요 피크를 포함하는 용출 분획을 모아 수크로오즈에 대한 투석에 의해 투석 튜브(7000 MWCO)에서 농축시켰다. 농축된 샘플을 트리스 완충액에서 미리 평형화된 0.8×30㎝ Sephacryl S-200이 충진된 칼럼에서 재분획하였다. 1분당 0.1㎖의 유속에서 생리활성 분획을 선택하고, 상기 기재된 바와 같이 투석에 의해 농축시켰다. 생리활성은 MTT 분석을 이용하여 HL-60, HT-29 또는 U-87 MG 세포 활성 분석으로 평가하였고, 생리활성을 나타낸 샘플을 12% SDS-PAGE 젤에서 크기를 확인한 후 단백질 동정을 위해 말디토프(MALDI-TOF) 질량 분석을 실시하였다.
5. DNA 클로닝 및 재조합 단백질 발현
HT-29, 253J, HL-60 또는 SNU484 세포로부터 RNA를 추출하여 역전사한 후 이를 PCR(95℃에서 30초, 58℃에서 30초 및 72℃에서 100초를 30회 반복)에 의해 AMF cDNA를 증폭시키기 위한 주형으로 사용하였다.
PCR에 사용한 NdeⅠ 제한효소 사이트가 포함된 정방향 프라이머와 XhoⅠ 제한효소 사이트가 포함된 역방향 프라이머는 GPI(genbank accession number: BC004982.1)를 암호화하는 DNA 서열을 기초로 제작되었다.
정방향 프라이머: 5'-TACATATGGCCGCTCTCACCCGGGACCCCCAGTTCCAGAA-3'(서열번호 5)
역방향 프라이머: 5'-ATCTCGAGTTATTGGACTCTGGCCTCGCGCTGCT-3'(서열번호 6)
약 1.7kb 길이의 PCR 산물은 DNA 서열을 확인하였고, pCold DNA1 벡터에 클로닝하여 pHT-29-AMF, p253J-AMF, pHL-60-AMF 또는 pSNU484-AMF를 구축하였다. pHT-29-AMF, p253J-AMF, pHL-60-AMF 또는 pSNU484-AMF를 함유한 대장균 BL21을 100㎍/㎖의 암피실린이 함유된 LB 배지에서 200rpm, 37℃의 조건하에서 16시간 동안 배양한 후 새 배지에서 1:100으로 희석하고, 200rpm, 37℃의 조건하에서 2시간 동안 재배양하였다. 그 후 세포에 0.5mM의 IPTG를 처리하고 200rpm, 15℃의 조건하에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 수확된 세포를 완충용액(20mM Tris-HCl pH 8.0, 200mM NaCl 및 0.5mM PMSF)에 재현탁시키고, 그 후 French pressure cell press (Model FA-078A, Thermo IEC, Milford, MA, USA)를 사용하여 세포를 파쇄하고, 4℃에서 12000rpm으로 20분 동안 원심분리하여 용해된 분획물을 획득하였다. 획득한 분획물은 0.22㎛ 주사기 필터를 통과하였다. HT-29 재조합 AMF(HT-29 rAMF), 253J 재조합 AMF(253J rAMF), HL-60 재조합 AMF(HL-60 rAMF) 또는 SNU484 재조합 AMF(SNU484 rAMF)는 공급업체의 방법에 따라 His60 Ni 수지 친화성 크로마토그래피(Promega, Madison, WI, USA)로 정제하였으며, 정제된 단백질의 함량은 Bio-Rad 단백질 분석 시약을 사용하여 정량하였다.
실시예 1. 대장암 세포주 유래 AMF의 항암효과
1) HT-29 CM의 암세포 증식 억제효과
HT-29 CM의 암세포 증식 억제효과를 확인하기 위해 대장암을 제외한 다양한 암세포에 HT-29 CM을 처리하여, MTT 분석을 실시하였다. 결과는 HT-29 CM을 처리하지 않은 대조군에 대한 HT-29 CM 처리군의 세포 성장 억제율을 각 세포별로 나타냈다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 대장암 유래 세포인 HT-29 CM을 처리한 백혈암(HL-60) 세포의 성장이 억제되는 것을 확인하였으나, 기타 암세포의 활성에는 영향이 크게 나타나지 않았다. 이를 통해 HT-29 CM은 백혈암(HL-60) 세포의 성장을 특이적으로 억제하는 것을 확인하였다.
2) HT-29 분비 단백질의 분석
HT-29 CM에 포함된 암세포 증식 억제효과를 나타내는 단백질을 분석하기 위해 단백질을 정제하고 동정하였다. DEAE 세파로오스(sepharose) 분획물 및 DEAE 세파로오스(sepharose) 분획물 중 생리활성을 나타내는 분획물을 Sephacryl S-200이 충진된 칼럼을 이용하여 재분획하고, 상기 재분획물 중 우수한 생리활성을 가지는 분획을 확인하였다. 생리활성은 분획물을 HL-60 세포에 처리하여 암세포의 증식을 억제하는 것을 통해 확인하였다.
우수한 생리활성을 나타내는 분획을 말디토프를 이용하여 질량 분석한 결과, 암세포의 이동성 및 증식과 관련되어 있는 단백질인 AMF를 확인하였으며, 이후 AMF를 이용하여 실험을 진행하였다.
3) HT-29 유래 AMF 유전자 구조 분석
HT-29 RNA를 이용한 역전사 및 PCR을 통하여 HT-29 AMF cDNA를 증폭시킨 후 pCold DNA1 벡터에 클로닝하여 pHT-29-AMF를 구축하였다. 그 결과, 서열번호 7과 같이 DNA 서열이 분석되었으며, 예측되는 재조합 AMF의 아미노산 서열을 분석한 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 GPI 동형단백질(Genbank accession number: BC004982.1)과 99%의 상동성을 나타내며, 몇 가지 돌연변이가 나타나는 것을 확인하였다.
4) HT-29 유래 재조합 AMF에 의한 세포 증식 억제 효과
상기 재조합된 AMF를 정제한 후 암세포에 처리하여 세포 증식에 미치는 효과를 확인하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 다양한 농도(2, 10 및 50ng/㎖)의 재조합 AMF를 3일 동안 처리하였을 경우 무처리 대조군(control, 100%)에 비하여 농도의존적으로 백혈암(HL-60) 세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 2. 방광암 세포주 유래 AMF의 항암효과
1) 253J CM의 암세포 증식 억제효과
253J CM의 암세포 증식 억제효과를 확인하기 위해 방광암을 제외한 다양한 암세포에 253J CM을 처리하여, MTT 분석을 실시하였다. 결과는 253J CM을 처리하지 않은 대조군에 대한 253J CM 처리군의 세포 증식 억제율을 각각의 세포별로 나타냈다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 방광암 유래 세포인 253J CM을 처리한 대장암(HT-29) 및 후두암(Hep 2) 세포의 성장이 억제되는 것을 확인하였으나, 기타 암세포의 성장에는 영향이 나타나지 않았다. 이를 통해 253J CM은 대장암(HT-29) 또는 후두암(Hep 2) 세포의 활성을 특이적으로 억제하는 것을 확인하였다.
2) 253J 분비 단백질의 분석
253J CM에 포함된 암세포 증식 억제효과를 나타내는 단백질을 분석하기 위해 단백질을 정제하고 동정하였다. DEAE 세파로오스(sepharose) 분획물 및 DEAE 세파로오스(sepharose) 분획물 중 생리활성을 나타내는 분획물을 Sephacryl S-200이 충진된 칼럼을 이용하여 재분획하고, 상기 재분획물 중 우수한 생리활성을 가지는 분획을 확인하였다. 생리활성은 분획물을 HT-29 세포에 처리하여 암세포의 증식을 억제하는 것을 통해 확인하였다.
우수한 생리활성을 나타내는 분획을 말디토프를 이용하여 질량 분석한 결과, 암세포의 이동성 및 증식과 관련되어 있는 단백질인 AMF를 확인하였으며, 이후 AMF를 이용하여 실험을 진행하였다.
3) 253J 유래 AMF 유전자 구조 분석
253J RNA를 이용한 역전사 및 PCR을 통하여 253J AMF cDNA를 증폭시킨 후 pCold DNA1 벡터에 클로닝하여 p253J-AMF를 구축하였다. 그 결과, 서열번호 8과 같이 DNA 서열이 분석되었으며, 예측되는 재조합 AMF의 아미노산 서열을 분석한 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 GPI 동형단백질(Genbank accession number: BC004982.1)과 98%의 상동성을 나타내며, 몇 가지 돌연변이가 나타나는 것을 확인하였다.
4) 253J 유래 재조합 AMF에 의한 세포 증식 억제 효과
상기 재조합된 AMF를 정제한 후 암세포에 처리하여 세포 증식에 미치는 효과를 확인하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 다양한 농도(2, 10 및 50ng/㎖)의 재조합 AMF를 3일 동안 처리하였을 경우 무처리 대조군(control, 100%)에 비하여 농도의존적으로 대장암(HT-29) 및 후두암(Hep 2) 세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 3. 백혈암 세포주 유래 AMF의 항암효과
1) HL-60 CM의 암세포 증식 억제효과
HL-60 CM의 암세포 증식 억제효과를 확인하기 위해 백혈암을 제외한 다양한 암세포에 HL-60 CM을 처리하여, MTT 분석을 실시하였다. 결과는 HL-60 CM을 처리하지 않은 대조군에 대한 HL-60 CM 처리군의 세포 증식 억제율을 각각의 세포별로 나타냈다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 백혈암 유래 세포인 HL-60 CM을 처리한 유방암(MCF-7), 전립선암(DU145), 대장암(HT-29), 뇌암(U-87 MG), 후두암(Hep 2), 방광암(253J) 세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였으나, 기타 암세포의 활성에는 영향이 나타나지 않았다. 이를 통해 HL-60 CM은 유방암(MCF-7), 전립선암(DU145), 대장암(HT-29), 뇌암(U-87 MG), 후두암(Hep 2), 방광암(253J) 세포의 증식을 특이적으로 억제하는 것을 확인하였다.
2) HL-60 분비 단백질의 분석
HL-60 CM에 포함된 암세포 증식 억제효과를 나타내는 단백질을 분석하기 위해 단백질을 정제하고 동정하였다. DEAE 세파로오스(sepharose) 분획물 및 DEAE 세파로오스(sepharose) 분획물 중 생리활성을 나타내는 분획물을 Sephacryl S-200이 충진된 칼럼을 이용하여 재분획하고, 상기 재분획물 중 우수한 생리활성을 가지는 분획을 확인하였다. 생리활성은 분획물을 HT-29 세포에 처리하여 암세포의 증식을 억제하는 것을 통해 확인하였다.
우수한 생리활성을 나타내는 분획을 말디토프를 이용하여 질량 분석한 결과, 암세포의 이동성 및 증식과 관련되어 있는 단백질인 AMF를 확인하였으며, 이후 AMF를 이용하여 실험을 진행하였다.
3) HL-60 유래 AMF 유전자 구조 분석
HL-60 RNA를 이용한 역전사 및 PCR을 통하여 HL-60 AMF cDNA를 증폭시킨 후 pCold DNA1 벡터에 클로닝하여 pHL-60-AMF를 구축하였다. 그 결과, 서열번호 9와 같이 DNA 서열이 분석되었으며, 예측되는 재조합 AMF의 아미노산 서열을 분석한 결과, 도 8에서 나타난 바와 같이 GPI 동형단백질(Genbank accession number: BC004982.1)과 89%의 상동성을 나타내며, 몇 가지 돌연변이가 나타나는 것을 확인하였다.
4) HL-60 유래 재조합 AMF에 의한 세포 증식 억제 효과
상기 재조합된 AMF를 정제한 후 암세포에 처리하여 세포 증식에 미치는 효과를 확인하였다. 그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 다양한 농도(2, 10 및 50ng/㎖)의 재조합 AMF를 3일 동안 처리하였을 경우 무처리 대조군(control, 100%)에 비하여 농도의존적으로 유방암(MCF-7), 전립선암(DU145), 대장암(HT-29), 뇌암(U-87 MG), 후두암(Hep 2) 및 방광암(253J) 세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 4. 위암 세포주 유래 AMF의 항암효과
1) SNU484 CM의 암세포 증식 억제효과
SNU484 CM의 암세포 증식 억제효과를 확인하기 위해 위암을 제외한 다양한 암세포에 SNU484 CM을 처리하여, MTT 분석을 실시하였다. 결과는 SNU484 CM을 처리하지 않은 대조군에 대한 SNU484 CM 처리군의 세포 증식 억제율을 각각의 세포별로 나타냈다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 위암 유래 세포인 SNU484 CM을 처리한 뇌암(U-87 MG) 및 대장암(HT-29) 세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였으나, 기타 암세포의 증식에는 영향이 나타나지 않았다. 이를 통해 SNU484 CM은 뇌암(U-87 MG) 및 대장암(HT-29) 세포의 활성을 특이적으로 억제하는 것을 확인하였다.
2) SNU484 분비 단백질의 분석
SNU484 CM에 포함된 암세포 증식 억제효과를 나타내는 단백질을 분석하기 위해 단백질을 정제하고 동정하였다. DEAE 세파로오스(sepharose) 분획물 및 DEAE 세파로오스(sepharose) 분획물 중 생리활성을 나타내는 분획물을 Sephacryl S-200이 충진된 칼럼을 이용하여 재분획하고, 상기 재분획물 중 우수한 생리활성을 가지는 분획을 확인하였다. 생리활성은 분획물을 U-87 MG 세포에 처리하여 암세포의 증식을 억제하는 것을 통해 확인하였다.
우수한 생리활성을 나타내는 분획을 말디토프를 이용하여 질량 분석한 결과, 암세포의 이동성 및 증식과 관련되어 있는 단백질인 AMF를 확인하였으며, 이후 AMF를 이용하여 실험을 진행하였다.
3) SNU484 유래 AMF 유전자 구조 분석
SNU484 RNA를 이용한 역전사 및 PCR을 통하여 SNU484 AMF cDNA를 증폭시킨 후 pCold DNA1 벡터에 클로닝하여 pSNU484-AMF를 구축하였다. 그 결과, 서열번호 10과 같이 DNA 서열이 분석되었으며, 예측되는 재조합 AMF의 아미노산 서열을 분석한 결과, 도 11에서 나타난 바와 같이 GPI 동형단백질(Genbank accession number: BC004982.1)과 99%의 상동성을 나타내며, 몇 가지 돌연변이가 나타나는 것을 확인하였다.
4) SNU484 유래 재조합 AMF에 의한 세포 증식 억제 효과
상기 재조합된 AMF를 정제한 후 암세포에 처리하여 세포 증식에 미치는 효과를 확인하였다. 그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 다양한 농도(2, 10 및 50ng/㎖)의 재조합 AMF를 3일 동안 처리하였을 경우 무처리 대조군(control, 100%)에 비하여 농도의존적으로 뇌암(U-87 MG) 및 대장암(HT-29) 세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였다.

Claims (7)

  1. 암 세포주 유래 AMF(autocrine motility factor)를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 암 세포주 유래 AMF는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항암용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항암은 백혈암, 대장암, 후두암, 유방암, 전립선암, 뇌암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 암종에 대한 항암인 것을 특징으로 하는 항암용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 암 세포주 유래 AMF는 암세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 항암용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 암 세포주 유래 AMF는 암세포의 세포사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 항암용 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 제형으로 제조하는 것을 특징으로 하는 항암용 약학 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항암용 약학 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암세포의 증식억제 또는 세포사멸 증진방법.
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