WO2023182838A1 - 신규한 hmgb1 유래 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 hmgb1 유래 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2023182838A1
WO2023182838A1 PCT/KR2023/003881 KR2023003881W WO2023182838A1 WO 2023182838 A1 WO2023182838 A1 WO 2023182838A1 KR 2023003881 W KR2023003881 W KR 2023003881W WO 2023182838 A1 WO2023182838 A1 WO 2023182838A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
peptide
present
group
rage
Prior art date
Application number
PCT/KR2023/003881
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
장세복
정미숙
김현진
Original Assignee
부산대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 부산대학교 산학협력단 filed Critical 부산대학교 산학협력단
Publication of WO2023182838A1 publication Critical patent/WO2023182838A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/308—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on cancer prevention

Definitions

  • the present invention relates to a novel HMGB1 (High mobility group box 1) derived peptide and its use.
  • HMGB1 High mobility group box 1
  • Cancer occurs because mutations occur in various genes due to cell DNA damage and, unlike normal cells, continue to proliferate. If cancer growth is not controlled, abnormal growth continues and becomes a malignant neoplasm, which is divided into epithelial tumors and non-epithelial sarcomas. In many cases, cancer cells metastasize to other tissues or organs and proliferate.
  • the living body has a biological defense system that eliminates abnormal cells such as cancer cells, and a representative example is the immune response.
  • cancer cells are induced to become malignant over a long period of time through a mechanism that allows them to evade these biological defense systems.
  • Cancer treatments include local treatments such as surgery, radiation, hyperthermia, and radiofrequency ablation (RFA), and systemic treatments such as chemotherapy. Recently, with the advancement of immunology, immunotherapy has been widely implemented. However, each treatment has many limitations, such as the presence of cells with low sensitivity to each treatment, the possibility of serious side effects, and the ineffectiveness of cancer that has spread beyond the treated area.
  • typical chemotherapy focuses on the different proliferation rates of cancer cells and normal cells.
  • Such chemotherapy causes damage to normal tissue cells that proliferate faster than cancer cells, leading to side effects that affect the entire body.
  • White blood cells are especially susceptible, and eventually a problem arises where the white blood cell-centered biological defense mechanism fails to function.
  • Another problem with radiotherapy is that there are cells and tissues with low sensitivity, and there are many cases where it cannot be applied because it causes organ damage to the radiation irradiated area. Additionally, the high sensitivity of lymphocytes to radiation must be considered.
  • immunotherapy acts only on the body's own defense mechanism, so the effect alone is usually insufficient.
  • the present inventors have made intensive research efforts to develop excellent anti-cancer peptides with biologically effective activity as effective cancer treatments.
  • the present inventors selected HMGB1-derived peptides, and the HMGB1-derived peptide acts as a ligand for RAGE (Receptor for advanced glycation endproducts) and binds to RAGE on the surface of cancer cells, blocking the interaction between them to kill cancer cells.
  • the present invention was completed by confirming that the survival rate of was significantly reduced.
  • one object of the present invention is to provide an anti-cancer peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the anticancer peptide.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing the anti-cancer peptide or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient.
  • another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving cancer, comprising the anti-cancer peptide or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient.
  • another object of the present invention is to provide a health functional food for preventing or improving cancer, comprising the anti-cancer peptide or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a veterinary composition for preventing or treating cancer, comprising the anti-cancer peptide or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient.
  • another object of the present invention is to provide a cancer treatment method, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing the anti-cancer peptide or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient. .
  • the present invention provides an anti-cancer peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the present invention can provide a polynucleotide encoding an anti-cancer peptide according to the present invention.
  • peptide refers to a linear molecule formed by linking amino acid residues to each other through peptide bonds.
  • the peptide may be manufactured according to chemical synthesis methods known in the art, and preferably, may be manufactured according to solid phase synthesis technology, but is not limited thereto.
  • the anti-cancer peptide of the present invention is characterized as being derived from HMGB1 (High mobility group box 1).
  • the anti-cancer peptide contains an acetyl group, a formyl group, a palmitoyl group, A protecting group selected from the group consisting of Myristyl group, Stearyl group, Polyethylene glycol (PEG), Amino group (-NH2), and Azide (-NHNH2) It is characterized by being combined.
  • the peptide of the present invention may additionally include a targeting sequence, a tag, a labeled residue, and an amino acid sequence prepared for the specific purpose of increasing half-life or peptide stability known in the art, as long as the desired effect is achieved. You can.
  • homology refers to the degree of sequence overlap between two amino acids, and is determined by conventionally known methods.
  • the peptides disclosed herein may be artificially synthesized peptides or wild-type peptides identified and isolated from natural sources.
  • functional variants of the peptide of the present invention may also be included.
  • the functional variants include biological equivalents of the peptide sequence described herein (SEQ ID NO: 1).
  • additional changes can be made to the amino acid or polynucleotide sequence of the peptide to further improve the binding affinity and/or other biological properties of the peptide.
  • These modifications include deletions, insertions and/or substitutions of amino acid sequence residues of the peptide and are made based on the relative similarity of amino acid side chain substitutions, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge size, etc.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Therefore, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan, and tyrosine can be said to be biologically equivalent in function.
  • the peptide disclosed herein may be an artificial variant that includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, and/or inserted compared to the peptide of SEQ ID NO: 1.
  • Amino acid changes in the wild-type polypeptide as well as in the artificial variant include conservative amino acid substitutions that do not significantly affect the folding and/or activity of the protein.
  • conservative substitutions include basic amino acids (arginine, lysine, and histidine), acidic amino acids (glutamic acid and aspartic acid), polar amino acids (glutamine and asparagine), hydrophobic amino acids (leucine, isoleucine, valine, and methionine), and aromatic amino acids (phenylalanine, tryptophan and tyrosine) and small amino acids (glycine, alanine, serine, and threonine).
  • Amino acid substitutions that generally do not alter specific activity are known in the art.
  • the most common exchanges are Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu and Asp/Gly and their opposites.
  • anticancer peptide refers to a biocompatible synthetic peptide having anticancer physiological activity of the present invention.
  • the present inventors screened various types of peptides, selected a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and modified (modified) the amino acid sequence of the peptide. ) to identify peptides with confirmed anticancer efficacy.
  • the peptide of the present invention can be obtained by various methods well known in the art. As an example, it can be manufactured using polynucleotide recombination and protein expression systems, in vitro synthesis through chemical synthesis such as peptide synthesis, or cell-free protein synthesis.
  • the peptides are used to obtain better chemical stability, enhanced pharmacological properties (half-life, absorption, potency, potency, etc.), altered specificity (e.g., broad spectrum of biological activity), and reduced antigenicity.
  • the N- or C-terminus can be combined (substituted) with a protecting group (substituent).
  • the protecting group is acetyl group, formyl group, palmitoyl group, myristyl group, stearyl group, polyethylene glycol; It may be a protective group selected from the group consisting of PEG), amino group (-NH2), and azide (-NHNH2), but if it is a component that can improve the modification of the peptide, especially the efficacy or stability of the peptide, it is limited. Can be included without.
  • the N-terminus of the peptide includes an acetyl group, a formyl group, a palmitoyl group, a myristyl group, a stearyl group, and Any one protecting group selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG) may be bonded; And/or the C-terminus of the peptide may be bound to any one protective group selected from the group consisting of amino group (-NH2) and azide (-NHNH2).
  • the anti-cancer peptide of the present invention is Ac-LKEKYEK-NH 2 , in which an acetyl group is bound to the N-terminus of the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and an amino group is bound to the C-terminus. it means.
  • This modification serves to significantly improve the stability of the peptide of the present invention.
  • stability referred to herein may mean not only “in vivo” stability but also storage stability (eg, room temperature storage stability).
  • modification serves to double the efficacy of the peptide of the present invention in addition to the stability described above.
  • the Ac-LKEKYEK-NH 2 peptide of the present invention may have improved anticancer efficacy or activity compared to the unmodified peptide by modifying the amino acid residues of the peptide.
  • polynucleotide is a polymer in which nucleotides are bonded and serves to transmit genetic information.
  • it encodes the peptide of SEQ ID NO: 1, and each of the polynucleotide sequences encoding said peptide is at least 75%, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, and most preferably at least 95%. It may include sequences having more than one sequence homology.
  • the "homology” is intended to indicate the degree of similarity with the wild-type amino acid sequence or polynucleotide sequence. Comparison of such homologies can be performed using a comparison program widely known in the art, and homology between two or more sequences can be calculated as a percentage (%).
  • the peptide of the present invention has a shorter length of 7 amino acids compared to conventional anti-cancer peptides, so it is easy to deliver to target tissues in vivo, and thus can be very advantageous for development as a medicine or functional food.
  • the peptide of the present invention has a stable structure that specifically binds to RAGE with high affinity, it specifically binds to RAGE (Receptor for advanced glycation endproducts) and inhibits the binding between RAGE's ligand and RAGE, making it an excellent anticancer agent. It is effective.
  • the size of the peptide itself was too large to effectively enter the target tissue or cells, or it had a short half-life, so it disappeared from the body in a short period of time.
  • the present invention demonstrated an effective anticancer effect. It has technical significance in that it was the first to identify a new anticancer peptide consisting of seven amino acids.
  • conventional peptide raw materials have many limitations because they are not homogeneous. For example, when developing conventional natural product-derived peptides into medicines and functional foods, it was very difficult to supply raw materials with consistent quality.
  • the peptide of the present invention can be chemically synthesized, a method is proposed to solve the above-mentioned problems by mass-producing it with the same purity while exhibiting excellent physiological activity.
  • the peptide of the present invention has the advantage of low cytotoxicity and high bioavailability.
  • Anti-cancer peptides according to the present invention include functional equivalents and salts thereof.
  • the "functional equivalent” refers to a peptide having at least 80% or more, preferably 90%, more preferably 95% or more sequence homology (i.e., identity) with the peptide of SEQ ID NO. 1 as a result of addition, substitution or deletion of amino acids. For example, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, It refers to a peptide that has 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, and 100% sequence homology, and exhibits substantially the same physiological activity as the peptide of SEQ ID NO: 1.
  • sequence homology and homology are defined as the percentage of amino acid residues of the candidate sequence relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 after aligning the candidate sequence with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and introducing gaps. When necessary, conservative substitutions are not considered as part of sequence identity to obtain maximum percent sequence identity. N-terminal, C-terminal or internal extensions, deletions or insertions of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are not to be interpreted as sequences affecting sequence identity or homology.
  • sequence identity can be determined by general standard methods used to compare similar portions of the amino acid sequences of two polypeptides.
  • Computer programs such as BLAST or FASTA align two polypeptides to optimally match each amino acid (either along the full length of one or both sequences or along a predicted portion of one or both sequences).
  • the program provides a default opening penalty and a default gap penalty and can be used in conjunction with a computer program called PAM250 (standard scoring matrix; Dayhoff et al., in Atlas of Protein). It provides a scoring matrix such as Sequence and Structure, vol 5, supp. 3, 1978).
  • percent identity can be calculated as follows: multiply the total number of identical matches by 100 and then multiply the length of the longer sequence within the corresponding span by the length of the longer sequence to align the two sequences. Divide by the sum of the number of gaps introduced into the long sequence.
  • substantially homogeneous physiological activity refers to anticancer activity.
  • functional equivalents of the present invention includes derivatives in which some chemical structures of the peptide are modified while maintaining the basic skeleton and anticancer activity of the peptide of SEQ ID NO: 1. For example, this includes structural changes to change the stability, storage, volatility or solubility of the peptide.
  • cancer refers to aggressive characteristics in which cells divide and grow in defiance of normal growth limits, invasive characteristics that infiltrate surrounding tissues, and metastatic characteristics that spread to other parts of the body. ) is a general term for diseases caused by cells with certain characteristics.
  • the cancers include lung cancer, colon cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, breast cancer, liver cancer, blood cancer, and bone cancer.
  • cancer skin cancer, head or neck cancer, cutaneous or intraocular melanoma, uterine sarcoma, ovarian cancer, rectal cancer , anal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, thyroid cancer ), parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue tumor, urethral cancer, prostate cancer, bronchogenic cancer, and bone marrow tumor. ), but is not limited thereto.
  • the anti-cancer peptide not only forms a complex with RAGE but also has a cancer-suppressing effect by blocking the activity of RAGE, and can be used in various fields in the prevention, improvement or treatment of cancer. there is.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the above-described anti-cancer peptide or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient.
  • treatment refers to any action in which symptoms of a wound are improved or beneficially changed by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically effective amount of the peptide of the present invention at any concentration for the desired effect of the present invention, as long as it is a concentration that can expect the desired effective therapeutic effect without cytotoxicity.
  • the term “pharmaceutically effective amount” refers to an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the above-mentioned peptide.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated and used in various forms according to conventional methods.
  • it can be formulated into oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, etc., and can be formulated and used in the form of external preparations, suppositories, and sterile injection solutions.
  • composition of the present invention may contain one or more known active ingredients that have a preventive or therapeutic effect against cancer, along with an anti-cancer peptide.
  • composition of the present invention may further include pharmaceutically acceptable additives, where the pharmaceutically acceptable additives include starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, calcium hydrogen phosphate, and lactose. , mannitol, taffy, gum arabic, pregelatinized starch, corn starch, powdered cellulose, hydroxypropyl cellulose, Opadry, sodium starch glycolate, carnauba lead, synthetic aluminum silicate, stearic acid, magnesium stearate, aluminum stearate, calcium stearate, White sugar, etc. may be used.
  • the pharmaceutically acceptable additive according to the present invention is preferably included in an amount of 0.1 to 90 parts by weight relative to the composition, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention can be administered in various oral or parenteral formulations during actual clinical administration.
  • diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants are used. It can be prepared, and it is preferable to use suitable preparations known in the art that are disclosed in the literature (Remington's Pharmaceutical Science, recently published by Mack Publishing Company, Easton PA).
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations contain at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose, or It is prepared by mixing lactose and gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc are also used.
  • the liquid preparations for oral administration include suspensions, oral solutions, emulsions, syrups, etc., and in addition to the commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc. This may be included.
  • Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • injectable ester such as ethyl oleate.
  • As a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao, laurin, glycerogeratin, etc. can be used.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the formulation method, administration method, administration time, and/or administration route of the pharmaceutical composition, and the type and degree of response to be achieved by administration of the pharmaceutical composition. , various factors including the type, age, weight, general health condition, symptoms or degree of disease, gender, diet, excretion, drugs used simultaneously or simultaneously with the subject, other components of the composition, etc. of the subject to be administered, and It may vary depending on similar factors well known in the pharmaceutical field, and a person skilled in the art can easily determine and prescribe an effective dosage for the desired treatment.
  • the administration route and administration method of the pharmaceutical composition of the present invention may be independent, and are not particularly limited, and any administration route and administration method may be used as long as the pharmaceutical composition can reach the desired area. can be followed.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used alone or in combination with surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy, and methods using biological response regulators for the prevention or treatment of cancer.
  • a cancer treatment method comprising administering to a subject a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing the above-described anti-cancer peptide or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient. do.
  • the present invention provides a food composition for preventing or improving cancer containing the above-described anti-cancer peptide or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient, and a health functional food containing the same.
  • the food composition of the present invention refers to a food that has the effect of preventing or improving cancer and diseases caused by cancer, and must be harmless to the human body when taken over a long period of time.
  • the term “improvement” refers to any action that reduces at least the severity of a parameter related to the condition being treated, such as a symptom.
  • the composition can be used simultaneously or separately with a drug for treatment before or after the onset of the related disease.
  • the food composition of the present invention may include the form of pills, powders, granules, precipitates, tablets, capsules or liquids, and there is no particular limitation on the type of food to which the anti-cancer peptide of the present invention can be added, for example There are various beverages, gum, tea, vitamin complexes, health supplements, etc.
  • ingredients may be added to the food composition, and their types are not particularly limited.
  • it may contain various herbal extracts, foodologically acceptable food additives, or natural carbohydrates as additional ingredients, but is not limited thereto.
  • the term "food supplement” refers to a component that can be added as an auxiliary food additive, and can be appropriately selected and used by a person skilled in the art as it is added to manufacture each type of health functional food.
  • food supplements include various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic and natural flavors, colorants and fillers, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, and protective colloidal thickeners. , pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated drinks, etc., but the types of food supplements of the present invention are not limited to the above examples.
  • natural carbohydrates examples include monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose and sucrose; and polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • Flavoring agents other than those mentioned above include natural flavoring agents (such as thaumatin) and stevia extract (rebaudioside A, glycyrrhizin). hygin, etc.) and synthetic flavors (saccharin, aspartame, etc.) can be used to advantage.
  • health functional food used in this specification refers to food manufactured and processed using raw materials or ingredients with functional properties useful to the human body.
  • 'functionality' means ingestion for the purpose of controlling nutrients for the structure and function of the human body or obtaining useful effects for health purposes such as physiological effects.
  • the food composition includes all types of functional foods, nutritional supplements, health foods, and food additives.
  • the above types can be manufactured in various forms according to conventional methods known in the art.
  • the food composition can be formulated in the same way as the pharmaceutical composition and used as a health functional food, and can be added to various foods.
  • foods to which the above substances can be added include meat, sausages, bread, chocolate, candies, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, etc. These include alcoholic beverages and vitamin complexes, and include all health foods in the conventional sense.
  • the food composition of the present invention may be a food additive.
  • the food additive may be added as is with the anti-cancer peptide, or may be used together with other foods or food ingredients, and may be used appropriately according to conventional methods.
  • the mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health, or therapeutic treatment).
  • the food composition of the present invention may be a health drink composition.
  • the health drink composition may include various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients, like ordinary drinks.
  • the above-mentioned natural carbohydrates may include monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, natural sweeteners such as dextrin and cyclodextrin, and synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame.
  • the proportion of natural carbohydrates is generally about 0.01 to 10 g, preferably about 0.01 to 0.1 g, per 100 ml of the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention contains various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, It may include carbonating agents used in carbonated drinks. Additionally, the composition of the present invention may include pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice beverages, and vegetable beverages. These ingredients can be used independently or in combination. The ratio of these additives is not very important, but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the present invention can provide an anticancer adjuvant composition containing an anticancer peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • anti-cancer adjuvant refers to an agent that can be used as an auxiliary agent to enhance the effect of a cancer treatment agent commonly used in the art.
  • the adjuvant according to the present invention the effect of a cancer treatment or anti-cancer treatment can be improved. It can be promoted.
  • the anti-cancer adjuvant composition of the present invention may be in the form of a pharmaceutical composition or food composition, and more specifically, may be an anti-cancer pharmaceutical adjuvant or an anti-cancer food adjuvant.
  • the present invention provides a veterinary composition for preventing or treating cancer, comprising the above-described anti-cancer peptide of the present invention or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient.
  • the veterinary composition of the present invention contains the above-described peptide of the present invention or the polynucleotide encoding the same as an active ingredient, and not only has an anticancer effect, but is also safe, so when used as a cancer treatment agent in animals, it can prevent, treat or treat cancer. It can contribute to improvement.
  • the veterinary composition of the present invention can be formulated into injections, powders, solutions, granules, or tablets for animals for the purpose of veterinary treatment in a manner that can be easily performed by those skilled in the art. .
  • composition of the present invention uses the peptide of the present invention described above, duplicate content is omitted to avoid excessive complexity of the present specification.
  • HMGB1-derived anti-cancer peptide according to the present invention not only forms a complex with HMGB1, but also has the effect of suppressing cancer by blocking the activity of HMGB1, so it can be used in various fields of cancer prevention and treatment.
  • Figures 1a and 1b show the crystal structure of the complex of HMGB1 and RAGE.
  • Figure 2 shows the results of measuring the affinity of the HMGB1-derived anticancer peptide and the RAGE complex according to the present invention.
  • Figures 3a to 3c show the results of confirming the cancer inhibitory activity of the HMGB1-derived anticancer peptide according to the present invention in NCI-H596 ( Figure 3a), HCT-116 ( Figure 3b), and AsPC-1 ( Figure 3c) cancer cell lines.
  • Figures 4a and 4b show the results confirming the cytotoxicity of the HMGB1-derived anticancer peptide according to the present invention in MRC-5 ( Figure 4a) and CCD-18co ( Figure 4b).
  • the designed anti-cancer peptide was derived from HMGB1, was represented by the amino acid sequence (LKEKYEK) of SEQ ID NO: 1, and was named “HMGB1-derived anti-cancer peptide (hereinafter referred to as anti-cancer peptide).”
  • the anti-cancer peptide was produced using Fomc solid-phase peptide synthesis (SPPS) and purified by liquid-phase high-altitude liquid chromatography (RP-HPLC) with a purity of over 95%. Purified anticancer peptides were identified using liquid chromatography/mass spectrometry (LC-MS).
  • Glutamine (Q) or glutamic acid (E) located at the N-terminus may be denatured into a Pyroglutamate structure during synthesis and storage. To prevent this, it can be replaced with another amino acid or the N-terminus can be acetylated. Likewise, C-terminal amylation was also performed to prevent modification.
  • the present inventors modified the N-terminus of the selected peptide with an acetyl group and the C-terminus with an amino group and used them in the examples below.
  • the present inventors used the ZDOCK three-dimensional protein structure site to model the three-dimensional RAGE and HMGB1 complex.
  • the protein structures used were RAGE (PDB ID: 4OI7) and HMGB1 (PDB ID: 2YRQ).
  • ZDOCK three-dimensional protein structure site is a service that predicts the structure of a complex between two proteins based on independently crystallized structures, and performs a full rigid-body search for the binding direction between the two proteins.
  • the anti-cancer peptide of the present invention forms a complex with RAGE.
  • the conjugate structure is expressed as a ribbon, with orange indicating HMGB1 and green indicating RAGE.
  • the present inventors conducted an automatic isothermal titration calorimetric experiment to confirm whether the HMGB1-derived anticancer peptide (SEQ ID NO: 1) of the present invention selectively prepared in Example 1 binds to RAGE.
  • the binding affinity (KD) between the peptide and RAGE protein was measured.
  • RAGE concentration and HMGB1-derived anticancer peptide concentration were diluted in buffer [50mM Tris-HCl (pH7.5), 200mM NaCl2, 1mM DTT] to be 0.1mM and 1.0mM, respectively.
  • buffer 50mM Tris-HCl (pH7.5), 200mM NaCl2, 1mM DTT
  • 1.0mM HMGB1-derived anticancer peptide was injected into an automatic isothermal titration calorimeter a total of 20 times for 200 seconds, reacted with 0.1mM RAGE protein of the immobilized ligand, and then the HMGB1-derived anticancer peptide and RAGE protein were mixed. Binding affinity was measured.
  • the present inventors evaluated the cancer inhibitory activity of the anticancer peptide of the present invention using lung cancer, colon cancer, and pancreatic cancer cell lines.
  • the lung cancer cell line NCI-H596 was seeded with 35x10 3 cells
  • the colon cancer cell line HCT-116 was seeded with 30x10 3 cells
  • the pancreatic cancer cell line AsPC-1 was seeded with 60x10 3 cells.
  • the seeded cells were cultured for 24 hours to attach, and the medium was changed.
  • the cells were treated with anti-cancer peptides at various concentrations (100 ⁇ M, 200 ⁇ M, and 300 ⁇ M) and cultured for 24 hours. After completion of culture, cells were treated with MTT tetrazolium, and the optical density (OD) of each well at 540 nm was measured using a microplate reader.
  • control in which the cancer cell line was not treated with anything and a negative control (no peptide) in which only 1% DMSO was treated and no anticancer peptide were used were used as comparative controls.
  • the present inventors evaluated the cytotoxicity of the anticancer peptide of the present invention using normal lung and colon cell lines.
  • MRC-5 a normal lung cell line
  • CCD-18co a normal colon cell line
  • the seeded cells were cultured for 24 hours to attach, and the medium was changed.
  • the cells were treated with anti-cancer peptides at various concentrations (100 ⁇ M, 200 ⁇ M, and 300 ⁇ M) and cultured for 24 hours.
  • MTT thiazolyl blue tetrazolium bromide
  • OD optical density
  • control in which the cell line was not treated with anything and a negative control (no peptide) in which only 1% DMSO was treated and no anticancer peptide were used were used as comparative controls.
  • the present inventors developed an HMGB1-derived anti-cancer peptide based on the interaction between RAGE and HMGB1, and the HMGB1-derived anti-cancer peptide not only acts as a ligand that specifically binds to RAGE to form a complex, but also acts as a ligand for RAGE activity. It was confirmed that the survival rate of cancer cells was reduced by blocking it. This demonstrates that the HMGB1-derived anti-cancer peptide of the present invention exerts anti-cancer effects, and can be utilized in various fields of cancer prevention and treatment.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 신규한 HMGB1 유래 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 HMGB1 유래 펩타이드는 RAGE의 활성 차단을 통해 암을 억제하는 효과를 가지고 있어, 암 예방 및 치료 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.

Description

신규한 HMGB1 유래 펩타이드 및 이의 용도
본 발명은 신규한 HMGB1 (High mobility group box 1) 유래 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
암은 세포의 DNA 손상으로 인하여 여러 유전자에서 변이가 생기면서, 정상세포와 달리 계속 증식하기 때문에 생긴다. 암의 증식이 제어되지 않을 경우 이상 증식이 계속되어 악성 신생물이 되는데, 상피에 생긴 종양과 비 상피성 육종으로 구분된다. 많은 경우 암세포는 다른 조직이나 장기로 전이되어 증식하게 된다. 생체에는 암세포와 같은 이상 세포를 제거하는 생체 방어시스템이 존재하는데, 면역 반응 등이 대표적이다. 그러나 암세포는 장기간에 걸쳐, 이들 생체 방어시스템을 회피할 수 있는 기전을 통해 악성으로 유도된다. 암 치료법에는 외과적 수술, 방사선 조사, 온열 요법(hyperthermia), 라디오파 요법 (RFA: radiofrequency ablation) 등 국소적 치료법과 화학 요법 등 전신 치료법이 있다. 최근에는 면역학의 발전으로 면역요법도 폭넓게 시행되고 있다. 그러나, 각 치료법에 대해 감수성이 낮은 세포가 존재하고, 심각한 부작용이 생길 수 있으며, 처치한 국소 이외에 전이된 암 등에 효과가 없는 등 각 치료법 마다 많은 한계를 갖고 있다.
예를 들면 전형적인 화학요법은 암세포와 정상세포가 증식 속도가 다른 것에 초점을 맞춘 것이다. 이러한 화학 요법은 암세포보다 빨리 증식하는 정상 조직세포에 손상을 일으켜, 전신에 영향을 미치는 부작용을 유도하게 된다. 특히 백혈구가 영향을 받기 쉬우며, 결국 백혈구 중심의 생체방어기구가 기능을 하지 못하는 문제가 생긴다. 또 방사선 요법은 감수성이 낮은 세포와 조직이 있는 것이 문제이며, 방사선 조사 부위에 장기 손상을 일으켜 적용할 수 없는 경우도 많다. 또한 림프구가 방사선에 감수성이 높은 것도 고려해야 한다. 한편 면역요법은 생체 각각의 방어 기구에만 작용하므로, 통상 단독으로는 효과가 불충분하다.
상술한 종래 암 치료제의 부작용을 극복하는 문제와 관련지어 합성 펩타이드에서 그 활성을 찾으려는 연구들이 활발히 진행되고 있으나, 현재까지 다양한 암 질환을 상대로 뛰어난 안전성과 항암 효능을 갖는 예방 및 치료용 물질로서 정확한 서열을 갖는 합성 펩타이드에 대한 효능 보고 및 적용에 대해서는 전무한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 효과적인 암 치료제로서 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 우수한 항암 펩타이드를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 HMGB1 유래 펩타이드를 선별하였고, 상기 HMGB1 유래 펩타이드가 RAGE (Receptor for advanced glycation endproducts)의 리간드로 작용하여, 암 세포 표면의 RAGE와 결합함에 따라, 이들간의 상호작용을 차단하여 암세포의 생존율을 현저하게 감소시켰음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 항암 펩타이드를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 항암 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항암 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항암 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항암 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항암 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 수의학적 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항암 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 본 명세서에서 특별한 표시가 없는 한, 아미노산 및 보호기의 지정에 사용되는 약어는 IUPAC-IUB의 생화학 용어 위원회(Commission of Biochemical Nomenclature)에서 권장하는 용어에 기초한다(Biochemistry, 11:1726-1732(1972)).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항암 펩타이드를 제공한다.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 항암 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 상기 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성방법에 따라 제조될 수 있으며, 바람직하게는 고체상 합성기술에 따라 제조될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 항암 펩타이드는 HMGB1 (High mobility group box 1) 유래인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항암 펩타이드는, 상기 항암 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 아세틸기(Acetyl group), 포르밀기(Formyl group), 팔미토일기(Palmitoyl group), 미리스틸기(Myristyl group), 스테아릴기(Stearyl group), 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol; PEG), 아미노기(Amino group, -NH2) 및 아자이드(Azide, -NHNH2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 보호기가 결합되어 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 목적 효과를 달성하는 한, 당업계에 공지된 표적화 서열, 태그(Tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "상동성(Homology)"은 2 개의 아미노산 사이에서 서열의 오버랩 정도를 나타내며, 종래에 알려진 방법들로 결정된다.
본 명세서에 개시된 펩타이드는 인공적으로 합성된 펩타이드거나, 자연 그대로의 공급원으로부터 동정 및 분리된 야생형 펩타이드일 수 있다.
또한, 본 발명의 펩타이드에 대한 기능성 변이체도 포함할 수 있다. 상기 기능성 변이체는 본 명세서에 기재된 펩타이드 서열(서열번호 1)의 생물학적 균등물들을 포함한다. 예를 들면, 펩타이드의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 개선시키기 위하여 펩타이드의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 펩타이드의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함하며, 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적인 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 리신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 리신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 티로신 등은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
즉, 본 명세서에 개시된 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드와 비교하여 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 인공 변이체일 수 있다. 인공 변이체에서 뿐만 아니라 야생형 폴리펩타이드에서의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩(Folding) 및/또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다.
상기 보존성 치환의 예들은 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(류신, 이소류신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신) 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)의 군의 범위 내에 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 그리고 이들과 반대인 것들이다.
본 명세서에서 용어 "항암 펩타이드"는 본 발명의 항암 생리학적 활성을 갖는 생체적합 합성 펩타이드를 의미한다.
본 발명자들은 생물학적으로 유효한 항암 활성을 갖는 펩타이드를 개발하고자 예의 노력한 결과, 다양한 종류의 펩타이드를 스크리닝하고, 그 중 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 선정하고, 상기 펩타이드의 아미노산 서열을 변형(개질)시켜 항암 효능이 확인된 펩타이드를 규명하였다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 당해 분야에서 널리 공지된 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 일례로서, 폴리뉴클레오티드 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 펩타이드 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법, 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다.
당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(Solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술(US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.
또한, 상기 펩타이드는 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 상기 펩타이드의 N- 또는 C-말단을 보호기(치환기)로 결합(치환)할 수 있다.
바람직하게, 상기 보호기는 아세틸기(Acetyl group), 포르밀기(Formyl group), 팔미토일기(Palmitoyl group), 미리스틸기(Myristyl group), 스테아릴기(Stearyl group), 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol; PEG), 아미노기(Amino group, -NH2) 및 아자이드(Azide, -NHNH2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 보호기일 수 있으나, 펩타이드의 개질, 특히 펩타이드의 효능 또는 안정성을 증진시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 펩타이드의 N-말단은, 아세틸기(Acetyl group), 포르밀기(Formyl group), 팔미토일기(Palmitoyl group), 미리스틸기(Myristyl group), 스테아릴기(Stearyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기가 결합될 수 있고; 및/또는 상기 펩타이드의 C-말단은, 아미노기(Amino group, -NH2), 및 아자이드(Azide, -NHNH2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기가 결합될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항암 펩타이드는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N-말단에 아세틸기(Acetyl group)가 결합되고, C-말단은 아미노기가 결합된 Ac-LKEKYEK-NH2를 의미한다.
이러한 개질은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 언급되는 용어 "안정성"은 "인 비보" 안정성 뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미하는 것일 수 있다.
또한, 개질은 상술한 안정성 외에도 본 발명의 펩타이드의 효능을 배가시키는 작용을 한다.
즉, 본 발명의 Ac-LKEKYEK-NH2 펩타이드는 펩타이드의 아미노산 잔기를 변형시킴으로써, 개질시키지 않은 펩타이드보다 개선된 항암 효능 또는 활성을 가질 수 있다.
본 발명에서, "폴리뉴클레오티드(Polynucleotide)"는 뉴클레오티드가 결합된 중합체로서, 유전 정보를 전달하는 역할을 한다. 본 발명의 목적상, 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하며, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 각각 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 서열 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. 상기 "상동성"은 야생형 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 이러한 상동성의 비교는 당업계에서 널리 알려진 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있으며, 2개 이상의 서열간 상동성을 백분율 (%)로 계산할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 종래의 항암 펩타이드와 비교하여 아미노산 7개의 짧은 길이로 이루어져 있어, 생체 내 타겟으로 하는 조직 등에 운반(Delivery)하기 용이하며, 이에 의약 또는 기능성 식품으로 개발하는 데 매우 유리할 수 있다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 높은 친화력으로 RAGE에 특이적으로 결합하는 안정된 구조를 가지기 때문에, RAGE (Receptor for advanced glycation endproducts)에 특이적으로 결합하여 RAGE의 리간드와 RAGE 사이의 결합을 저해하므로 탁월한 항암 효과를 발휘한다.
즉, 펩타이드 치료제에 대한 다양한 연구에도 불구하고, 펩타이드 자체 크기가 너무 커서 표적 조직 또는 세포에 효과적으로 유입되지 못하거나 반감기가 짧아 단기간에 체내에서 소멸되는 단점을 드러내었는 바, 본 발명은 유효한 항암 효과를 가짐과 동시에 7개의 아미노산으로 이루어진, 신규 항암 펩타이드를 최초로 규명하였다는 점에 기술적 의의가 있다.
또한, 종래의 펩타이드 원료들은 균질하지 못하기 때문에 많은 한계를 가지고 있다. 예를 들어, 종래의 천연물 유래 펩타이드는 의약 및 기능성 식품으로 개발하는 데 있어서 일정한 품질을 가지는 원료를 공급하는 것이 매우 어려웠다.
그러나, 본 발명의 펩타이드는 화학적으로 합성이 가능하므로, 탁월한 생리학적 활성을 나타내면서도 동일한 순도로 대량 생산하여 상술한 문제점을 해결할 수 있는 방안을 제시한다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 세포독성이 낮아 생체 내 이용 가능성이 높다는 장점을 가진다.
본 발명에 따른 항암 펩타이드는 기능적 동등물 및 그들의 염을 포함한다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 서열번호 1의 펩타이드와 적어도 80％ 이상의, 바람직하게는 90％, 더욱 바람직하게는 95％이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 것으로 예를 들면, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 것을 포함하며, 서열번호 1의 펩타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 말한다. 본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 서열번호 1의 아미노산 서열과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 서열번호 1의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다.
또한 상기 서열 동질성은 두개의 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두개의 폴리펩타이드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭(matching) 되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 패널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp. 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다: 일치하는 서열(indentical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(machted span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.
상기에서 "실질적으로 동질의 생리활성"이란 항암 활성을 말한다. 본 발명의 "기능적 동등물"의 범위에는 서열번호 1의 펩타이드의 기본골격과 항암 활성을 유지하면서 펩타이드의 일부 화학 구조가 변형된 유도체가 포함된다. 예를 들어 펩타이드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.
본 발명에 있어서, "암"은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성, 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다. 상기 암은 폐암(lung cancer), 대장암(colon cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 위암(gastric cancer), 유방암(breast cancer), 간암(liver cancer), 혈액암(blood cancer), 뼈암(bone cancer), 피부암(skin cancer), 머리 또는 목암(head or neck cancer), 피부 또는 안구 흑색종(cutaneous or intraocular melanoma), 자궁육종(uterine sarcoma), 난소암(ovarian cancer), 직장암(rectal cancer), 항문암(anal cancer), 난관암(fallopian tube carcinoma), 자궁내막암(endometrial carcinoma), 자궁경부암(cervical cancer), 소장암(small intestine cancer), 내분비암(endocrine cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 부갑상선암(parathyroid cancer), 신장암(adrenal cancer), 연조직종양(soft tissue tumor), 요도암(urethral cancer), 전립선암(prostate cancer), 기관지암(bronchogenic cancer) 및 골수암(bone marrow tumor) 으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 상기 항암 펩타이드는 RAGE와 복합체를 형성할 뿐만 아니라 RAGE의 활성 차단을 통해, 암을 억제하는 효과를 가지고 있는바, 암의 예방, 개선 또는 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 항암 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 상처에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 목적 효과를 위하여 약학적 유효량의 본 발명의 펩타이드를, 세포 독성없이 목적으로 하는 유효한 치료 효과를 기대할 수 있는 농도라면, 임의의 농도로 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "약학적 유효량"은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 이용되는 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 항암 펩타이드와 함께 암에 대하여 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1 종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부로 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 실제 임상투여 시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 이용하는 것이 바람직하다.
상기 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 또한, 상기 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 상기 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 상기 약학적 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 그 방식에 있어 특별히 제한되지 아니하며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상술한 항암 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 항암 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 이를 함유하는 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 이용되는 경우, 본 발명의 식품 조성물은 암 및 암으로 인해 발병하는 질병의 예방 또는 개선 효과를 가지는 식품을 의미하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해해야 한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 이때, 상기 조성물은, 관련 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 항암 펩타이드를 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 본 발명의 항암 펩타이드 이외에도 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "건강기능식품"은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미한다. 여기서, '기능성'이란 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
상기 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형들은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
상기 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 건강기능식품으로 이용될 수 있으며, 각종 식품에 첨가될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 실시예에서, 본 발명의 식품 조성물은 식품 첨가물일 수 있다. 상기 식품 첨가물은 상기 항암 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 본 발명의 식품 조성물은 건강음료 조성물일 수 있다. 상기 건강음료 조성물은 항암 펩타이드 외에 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 항암 펩타이드를 포함하는 항암 보조제 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, "항암보조제"는 당업계에서 일반적으로 사용되는 암치료제의 효과를 증진시키기 위하여 보조적으로 사용될 수 있는 제제를 말하며, 본 발명에 의한 보조제를 사용함으로써 암 치료제 또는 항암치료의 효과를 증진시킬 수 있다.
본 발명의 항암보조제 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물의 형태일 수 있으며, 보다 구체적으로는 항암 약학적 보조제 또는 항암 식품 보조제일 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항암 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 수의학적 조성물은 상술한 본 발명의 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하고 있어, 항암 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 안전하므로, 이를 동물의 암 치료제로 사용할 경우 암 예방, 치료 또는 개선에 기여할 수 있다.
한편 본 발명의 수의학적 조성물은 해당 기술분야에 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법으로 수의학적 치료를 목적으로 하는 동물용 주사제, 산제, 액제 또는 과립제, 정제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 펩타이드를 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에 따른 HMGB1 유래 항암 펩타이드는 HMGB1와 복합체를 형성할 뿐만 아니라 HMGB1의 활성 차단을 통해 암을 억제하는 효과를 가지고 있어, 암 예방 및 치료 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.
도 1a 및 1b는 HMGB1와 RAGE의 복합체 결정구조를 보여준다.
도 2는 본 발명에 따른 HMGB1 유래 항암 펩타이드와 RAGE 복합체의 친화력을 측정한 결과를 보여준다.
도 3a 내지 3c는 본 발명에 따른 HMGB1 유래 항암 펩타이드의 NCI-H596(도 3a), HCT-116(도 3b), AsPC-1(도 3c) 암 세포주에서의 암 억제 활성을 확인한 결과를 보여준다.
도 4a 및 4b는 본 발명에 따른 HMGB1 유래 항암 펩타이드의 MRC-5(도 4a) 및 CCD-18co(도 4b)에서의 세포 독성을 확인한 결과를 보여준다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 항암 펩타이드 설계 및 제작
본 발명자들은, 종래 RAGE V 도메인과 HMGB1 150-183 아미노산 잔기가 결합하는 사실을 기초로 하여, RAGE와 HMGB1의 결합 잔기를 예측하고(도 1a), 항암 펩타이드를 설계하였고, 상기 펩타이드는 Solid Phase Peptide Synthesis 방법을 이용하여 C-terminal부터 합성을 시작하였다.
그 결과, 상기 설계된 항암 펩타이드는 HMGB1로부터 유래한 것으로, 서열번호 1의 아미노산 서열(LKEKYEK)로 표시되며 "HMGB1 유래 항암 펩타이드(이하, 항암 펩타이드)"로 명명하였다. 상기 항암 펩타이드는 Fomc 고상 펩타이드 합성(SPPS)를 사용하여 생산되었으며 순도가 95% 이상인 액상 고소 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)로 정제하였다. 정제된 항암 펩타이드는 액체 크로마토그래피/질량분석기(LC-MS)를 사용하여 동정하였다.
또한, N-말단에 위치한 Glutamine (Q) 또는 glutamic acid (E)는 합성 및 보관과정에서 Pyroglu- tamate 구조로 변성될 수 있다. 이를 방지하기 위하여 다른 아미노산으로 대체하거나 N-말단을 아세틸화(Acetylation)할 수 있다. 마찬가지로 C-말단 아밀화도 변형 방지를 위해 실시하였다.
이에, 본 발명자들은 상기 선별된 펩타이드의 N-말단을 아세틸기로, C-말단을 아미노기로 개질시켜 이하 실시예에 이용하였다.
실시예 2. RAGE-HMGB1 단백질 결합체 모델링
본 발명자들은 삼차원 RAGE와 HMGB1 결합체 모델링을 위해 ZDOCK 삼차원 단백질 구조 사이트를 이용하였다. 사용된 단백질 구조는 RAGE(PDB ID:4OI7), HMGB1(PDB ID:2YRQ)를 사용하였다.
간략하게는 다음과 같다: ZDOCK 삼차원 단백질 구조 사이트는 독립적으로 결정화된 구조를 기반으로 두 단백질 간의 복합체 구조 예측하는 서비스로, 두 단백질 간의 결합 방향에 대한 전체 rigid-body 검색을 수행하였다.
그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항암 펩타이드는 RAGE와 복합체를 형성하는 것을 확인하였다. 결합체 구조는 리본으로 표현하였으며 주황색은 HMGB1, 초록색은 RAGE를 가르킨다.
또한 도 1b에 나타낸 바와 같이, HMGB1 106번 잔기가 RAGE 131,132 아미노산과 결합하고, MGB1 158번 잔기가 RAGE 208번 잔기와 결합한다는 예측 모델을 얻었다.
실시예 3. 항암 펩타이드 및 RAGE 단백질의 결합 친화력 측정
본 발명자들은, 상기 실시예 1에서 선별제조된 본 발명의 HMGB1 유래 항암 펩타이드(서열번호 1)가 RAGE에 결합하는지 확인하기 위해, 자동 등온 적정 열량 시험(Auto isothermal titration calorimetric experiment)을 통해 HMGB1 유래 항암 펩타이드와 RAGE 단백질 간의 결합 친화력(KD)을 측정하였다.
간략하게는 다음과 같다: RAGE 농도 및 HMGB1 유래 항암 펩타이드 농도가 각각 0.1 mM 및 1.0 mM이 되도록 완충액 [50mM Tris-HCl (pH7.5), 200mM NaCl2, 1mM DTT]에 희석하였다. 실온에서 결합 친화력을 측정하기 위해, 자동 등온 적정 열량계에 1.0mM HMGB1 유래 항암 펩타이드를 200초 간 총 20회 주입한 후 고정된 리간드의 0.1 mM RAGE 단백질과 반응시킨 후 HMGB1 유래 항암 펩타이드 및 RAGE 단백질의 결합 친화력을 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, HMGB1 유래 항암 펩타이드는 RAGE 단백질에 높은 결합 친화력으로 결합하는 것을 확인하였다.
실시예 4. 암 세포주에서 항암 펩타이드의 암 억제 활성 확인
본 발명자들은 폐암, 대장암, 췌장암 세포주를 사용하여, 본 발명의 항암 펩타이드의 암 억제 활성을 평가하였다.
간략하게는 다음과 같다: 각 웰당, 폐암 세포주인 NCI-H596는 35x103 세포로, 대장암 세포주인 HCT-116는 30x103 세포로, 췌장암 세포주인 AsPC-1는 60x103 세포를 각각 시딩하였다. 시딩된 세포를 24시간 동안 배양하여 부착시켰으며, 배지를 교환하였다. 상기 세포에 다양한 농도(100μM, 200μM 및 300μM)로 항암 펩타이드를 처리한 후 24시간 배양하였다. 배양 종료 후 MTT tetrazolium을 세포에 처리하여 마이크로플레이트 리더를 사용하여 540nm에서의 각 웰의 흡광도(OD)를 측정하였다.
이때, 암세포주에 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군(control) 및 1% DMSO만을 처리하고 항암 펩타이드를 처리하지 않은 음성 대조군(no peptide)을 비교 대조군으로 이용하였다.
그 결과, 도 3a 내지 3c에 나타낸 바와 같이, 암세포주들 모두 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 생존율이 감소하였으며, 항암 펩타이드의 IC50값은 NCI-H596(도 3a), HCT-116(도 3b), AsPC-1(도 3c) 세포주에 대하여, 각각 89.02μM, 90.16μM 및 186.9μM임을 확인하였다. 이는 본 발명의 항암 펩타이드가 저농도로 처리시에도 우수한 항암 활성을 나타낸다는 것을 의미한다.
실시예 5. 정상 세포주에서 항암 펩타이드의 세포 독성 확인
본 발명자들은 정상 폐 및 대장 세포주를 사용하여, 본 발명의 항암 펩타이드의 세포 독성 여부를 평가하였다.
간략하게는 다음과 같다: 각 웰당 정상 폐 세포주인 MRC-5는 35x103 세포로, 정상 대장 세포주인 CCD-18co는 60x103 세포를 각각 시딩하였다. 시딩된 세포를 24시간 동안 배양하여 부착시켰으며, 배지를 교환하였다. 상기 세포에 다양한 농도(100μM, 200μM 및 300μM)로 항암 펩타이드를 처리한 후 24시간 배양하였다. 배양 종료 후 Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT)을 세포에 처리하여 마이크로플레이트 리더를 사용하여 540nm에서의 각 웰의 흡광도(OD)를 측정하였다.
이때, 세포주에 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군(control) 및 1% DMSO만을 처리하고 항암 펩타이드를 처리하지 않은 음성 대조군(no peptide)을 비교 대조군으로 이용하였다.
그 결과, 도 4a 및 4b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 항암 펩타이드를 처리하였을때, MRC-5(도 4a) 및 CCD-18co(도 4b)에 대하여 세포 독성이 없음을 확인 하였다.
종합적으로, 본 발명자들은 RAGE와 HMGB1 간 상호작용을 기반으로 HMGB1 유래 항암 펩타이드를 개발하였고, 상기 HMGB1 유래 항암 펩타이드가 RAGE에 특이적으로 결합하는 리간드로 작용하여 복합체를 형성할 뿐만 아니라, RAGE의 활성을 차단하여 암세포의 생존율을 감소시키는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 HMGB1 유래 항암 펩타이드가 항암 효과를 발휘함을 입증하는 바, 암 예방 및 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항암 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항암 펩타이드는 HMGB1 (High mobility group box 1) 유래인 것을 특징으로 하는, 항암 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항암 펩타이드는, 상기 항암 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 아세틸기(Acetyl group), 포르밀기(Formyl group), 팔미토일기(Palmitoyl group), 미리스틸기(Myristyl group), 스테아릴기(Stearyl group), 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol; PEG), 아미노기(Amino group, -NH2) 및 아자이드(Azide, -NHNH2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 보호기가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 항암 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항암 펩타이드는 RAGE (Receptor for advanced glycation endproducts)에 특이적으로 결합하여 RAGE의 리간드와 RAGE 사이의 결합을 저해하는 것을 특징으로 하는, 항암 펩타이드.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 암은 폐암(lung cancer), 대장암(colon cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 위암(gastric cancer), 유방암(breast cancer), 간암(liver cancer), 혈액암(blood cancer), 뼈암(bone cancer), 피부암(skin cancer), 머리 또는 목암(head or neck cancer), 피부 또는 안구 흑색종(cutaneous or intraocular melanoma), 자궁육종(uterine sarcoma), 난소암(ovarian cancer), 직장암(rectal cancer), 항문암(anal cancer), 난관암(fallopian tube carcinoma), 자궁내막암(endometrial carcinoma), 자궁경부암(cervical cancer), 소장암(small intestine cancer), 내분비암(endocrine cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 부갑상선암(parathyroid cancer), 신장암(adrenal cancer), 연조직종양(soft tissue tumor), 요도암(urethral cancer), 전립선암(prostate cancer), 기관지암(bronchogenic cancer) 및 골수암(bone marrow tumor)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 항암 펩타이드.
  6. 제1항의 항암 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  7. 제1항의 항암 펩타이드 또는 제6항의 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제1항의 항암 펩타이드 또는 제6항의 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  9. 제1항의 항암 펩타이드 또는 제6항의 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품.
  10. 제1항의 항암 펩타이드 또는 제6항의 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 수의학적 조성물.
  11. 제1항의 항암 펩타이드 또는 제6항의 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법.
PCT/KR2023/003881 2022-03-25 2023-03-23 신규한 hmgb1 유래 펩타이드 및 이의 용도 WO2023182838A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2022-0037547 2022-03-25
KR1020220037547A KR20230139195A (ko) 2022-03-25 2022-03-25 신규한 hmgb1 유래 펩타이드 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023182838A1 true WO2023182838A1 (ko) 2023-09-28

Family

ID=88101893

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2023/003881 WO2023182838A1 (ko) 2022-03-25 2023-03-23 신규한 hmgb1 유래 펩타이드 및 이의 용도

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20230139195A (ko)
WO (1) WO2023182838A1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110217292A1 (en) * 2003-09-11 2011-09-08 Walter Newman Monoclonal antibodies against hmgb1
US20110236406A1 (en) * 2004-06-17 2011-09-29 Medimmune, Llc Immunogenic compositions comprising hmgb1 polypeptides
US20110268738A1 (en) * 2005-06-16 2011-11-03 Davorka Messmer Antibodies Against Hmgb1 and Fragments Thereof
WO2016184795A1 (en) * 2015-05-15 2016-11-24 Hmgbiotech S.R.L. Novel peptides

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101477130B1 (ko) 2012-01-11 2015-01-06 연세대학교 산학협력단 용해성 rage를 유효성분으로 포함하는 심근염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110217292A1 (en) * 2003-09-11 2011-09-08 Walter Newman Monoclonal antibodies against hmgb1
US20110236406A1 (en) * 2004-06-17 2011-09-29 Medimmune, Llc Immunogenic compositions comprising hmgb1 polypeptides
US20110268738A1 (en) * 2005-06-16 2011-11-03 Davorka Messmer Antibodies Against Hmgb1 and Fragments Thereof
WO2016184795A1 (en) * 2015-05-15 2016-11-24 Hmgbiotech S.R.L. Novel peptides

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NOJIRI SHUNSUKE, TSUCHIYA ATSUNORI, NATSUI KAZUKI, TAKEUCHI SUGURU, WATANABE TAKAYUKI, KOJIMA YUICHI, WATANABE YUSUKE, KAMIMURA HI: "Synthesized HMGB1 peptide attenuates liver inflammation and suppresses fibrosis in mice", INFLAMMATION AND REGENERATION, vol. 41, no. 1, 1 December 2021 (2021-12-01), pages 28, XP093054687, DOI: 10.1186/s41232-021-00177-4 *
STARKOVA TATIANA, POLYANICHKO ALEXANDER, ARTAMONOVA TATIANA, TSIMOKHA ANNA, TOMILIN ALEXEY, CHIKHIRZHINA ELENA: "Structural Characteristics of High-Mobility Group Proteins HMGB1 and HMGB2 and Their Interaction with DNA", LABORATORY OF MOLECULAR BIOLOGY OF STEM CELLS, INSTITUTE OF CYTOLOGY OF THE RUSSIAN ACADEMY OF SCIENCES, TIKHORETSKY AV. 4, 194064 ST. PETERSBURG, RUSSIA, vol. 24, no. 4, pages 3577, XP093095803, DOI: 10.3390/ijms24043577 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230139195A (ko) 2023-10-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2051995B1 (en) Selective glucagon-like-peptide-2 (glp-2) analogues
US9580487B2 (en) Method of treating stomach or bowel-related disorders by administering glucagon-like-peptide-2 (GLP-2) analogues
EP2694095B1 (en) Compositions comprising glucagon analogs and methods of making and using the same
TWI519541B (zh) 包含調酸素與免疫球蛋白片段之複合物及其用途
WO2020204359A1 (ko) H-rev107 유래 펩타이드의 신규한 용도
EP3130345A1 (en) Peptide having fibrosis inhibitory activity and composition containing same
WO2018194309A1 (ko) 인디루빈 유도체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물
KR102607901B1 (ko) 신규한 올리고펩티드 및 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2022131791A1 (ko) 다중구리 산화효소 펩타이드를 포함하는 구리대사 관련 신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2023182838A1 (ko) 신규한 hmgb1 유래 펩타이드 및 이의 용도
LV13462B (en) Tetrapeptide regulating blood glucose level in diabetes mellitus
KR20210146218A (ko) 신규 펩티드 및 이의 뇌신경계 질환 치료 용도
EP1409518B1 (en) Use of fragments of oxytocin for the preparation of a pharmaceutical composition in order to create eustasis
US20210236597A1 (en) Methods and compositions for treating and diagnosing polycystic ovary syndrome
WO2022114919A2 (ko) 인테그린 결합성 펩타이드 및 이를 포함하는 약학적 조성물
WO2023113349A1 (ko) 성게 유래 펩타이드 및 이의 용도
US20190330295A1 (en) Glucagon-like-peptide-2 (glp-2) analogues
CN100535003C (zh) Exendin 4的类似物
WO2023204329A1 (ko) 신규 펩타이드 기반 면역항암제
WO2023008683A1 (ko) 양친매성 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도
WO2023014070A1 (ko) Stc-1 또는 그 유도체를 포함하는 간질환 예방 또는 치료용 조성물
US7803768B2 (en) Method for treatment of hyperglycemia in a subject in need thereof
WO2020130519A1 (ko) 암 세포주 유래 amf를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23775333

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1