DE4341476A1

DE4341476A1 - Mittel zur Untersuchung und Beeinflussung zellulärer Veränderungen auf Lektinbasis

Info

Publication number: DE4341476A1
Application number: DE19934341476
Authority: DE
Inventors: Uwe Dr Pfueller; Fred Prof Dr Niedobitek
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-12-02
Filing date: 1993-12-02
Publication date: 1995-06-08

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Untersuchung und zur Beeinflussung zellulärer Veränderungen auf Lektinbasis, das insbesondere zur Diagnose und zur Therapie von Erkrankungen einsetzbar ist. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die Molekularbiologie.

Lektine sind Proteine, die bestimmte Zuckerreste oder -struk turen z. B. auf Zelloberflächen erkennen und mit entsprechenden Zuckern oder Glykokonjugaten Bindungen eingehen können (Eds.I.Liener, N. Sharon, I.J.Goldstein, Academic Press, Orlando, 1986, pp. 3-32). Auf diese Weise können (markierte) Lektine in der Histochemie und der Zellbiochemie für den Nachweis dieser Kohlenhydratstrukturen eingesetzt werden. Durch die Zugabe des lektintypischen Zuckers im Überschuß kann die Lektin- Kohlenhydratbindung gelöst werden. Diese Eigenschaften macht die Lektine als Reagenzien für die Histochemie (G. L. Nicolson, Intern. Rev. Cytology 39, 89, 1974 und J. Roth, Exp. Pathol. (Suppl. 3), Gustav Fischer, Jena, 1978), die medizinische Diagnostik (J. Artigas, S. Habedank, H. Franz, F. Niedobitek, Pathologe 1991, 12, 152-156; J. Artigas et al. Zentralbl. Pathol. 1992, 38, 278- 283), aber auch für die Therapie von chronischen Erkrankungen interessant (H. Franz in: Advances in Lektin Research, Vol. 4, Springer-Verlag, 1991, S. 33-50).

Das Ziel der Erfindung besteht darin, Reagenzien bzw. Präparate auf Lektinbasis zu entwickeln, mit denen zelluläre Veränderungen nachgewiesen und therapeutische Effekte der Lektine moduliert bzw. neuartige Effekte erzielt werden können.

Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen 1 und 12 realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.

Das erfindungsgemäße Mittel beruht auf dem überraschenden Befund, daß Lektine in Gegenwart ihrer spezifischen Zucker zu weiteren Bindungen an z. B. Zelloberflächen fähig sind, obwohl ihre Zucker-combining-site blockiert sein sollte. Therapeutisch relevante und für die Anwendung in Gegenwart ihrer spezifischen Zucker geeignete Lektine sind die Mistellektine MLI, MLII und MLIII. Sie können auch miteinander kombiniert werden, gleichermaßen können auch die B-Ketten der genannten Mistellektine eingesetzt werden. Das Mittel kann auch andere Lektine enthalten, z. B. Concanavalin A, Phythämagglutinin (PHA), Ricin, Abrin, Weizenkeimagglutinin (WGA), Urtica dioica Agglutinin oder deren Kombinationen. Man kann das erfindungsgemäße Mittel auch herstellen, indem man einen natürlichen Lektinextrakt, z. B. der Mistel, mit den jeweils spezifischen Zuckern versetzt. Als spezifische Zucker werden im Falle der Mistellektine Galaktose oder N-Acetylgalaktose bzw. deren Derivate eingesetzt. Auch andere Monosaccharide mit einer cis-ständigen 3,4- Diolgruppierung wie z. B. Arabinose oder Fucose sind als Modulatoren der Bindungsfähigkeit der Lektine geeignet. Di- und Oligosaccharide bzw. polymere Kohlenhydrate, die einen Anteil der genannten Derivate enthalten, können ebenfalls für das erfindungsgemäße Mittel eingesetzt werden.

Die spezifischen Zucker entfalten auch ihre Wirkung, wenn sie über Spacer an die eingesetzten Lektine kovalent gebunden sind, auch dergestalt, daß bei Lektinen mit 2 combining sites der über Spacer gebundene Zuckerrest nur eine combining site belegen kann. Als Spacer dienen bevorzugt relativ lange Oligosaccharid-, Kohlenwasserstoff-, Polyethylenglykol- oder Polyacrylamid ketten. Das Prinzip der zuckermodulierten Lektinwechselwirkung mit kohlenhydrathaltigen Substanzen wird auch durch Anwendung der Lektine in Systemen mit hohem Kohlenhydratüberschuß (10- 10 000fach) verwirklicht, auch dergestalt, daß Lektin und Kohlenhydrat gemeinsam in Kompartimente eingeschlossen werden. Geeignete Kompartimente sind Tensidassoziate (Mizellen, Mikro emulsionen, flüssig-kristalline Phasen, Liposomen, Vesikel), Mikrosphären und Nanopartikel. Bei der Anwendung von über Spacer gebundenen spezifischen Zuckern genügt ein 2-6facher Überschuß.

Der Einsatz der Lektine in Gegenwart spezifischer Kohlenhydratverbindungen ermöglicht die histochemische Demon stration von Stoffen auf Zelloberflächen und im Gewebe auch für diagnostische Zwecke. Derartige Lektin-Kohlenhydratlösungen sind geeignete Reagenzien in Bioassays sowie zum Nachweis von Zuckerverbindungen, Glykokonjugaten und Rezeptoren.

Das neue Mittel eröffnet die Möglichkeit, durch Variation von eingesetzten Lektinen und den jeweils spezifischen Zuckern sowie durch Variation der Mengenverhältnisse

- eine bessere Differenzierung zuckertragender Zell- oder Gewebeoberflächen zu erreichen und
- die therapeutische Wirksamkeit von Lektinpräparaten zu modulieren.

Die Erfindung soll nachfolgend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiel

Leberschnitte werden nach üblicher Fixierung und Einbettung mit einer Mistellektinlösung (10-1000 µg/ml) in Abwesenheit und in Gegenwart spezifischer Zucker (für Mono- und Disaccharide gelten Konzentrationsbereiche zwischen 1 und 100 mM Zucker, für Oligosaccharide, Glykokonjugate und Polysaccharide können 1-100 µMolare Konzentrationen ausreichend sein) inkubiert und gewaschen. Anschließend wird mit einem polyklonalen oder monoklonalen Anti-Mistellektin-Antikörper inkubiert, der nach einem Waschschritt mit einem markierten Antikörper nachgewiesen wird. Je nach Markierung des Detektionsantikörpers werden am Schnitt im Lichtmikroskop (visueller Bereich, Fluoreszenz) oder Elektronenmikroskop (nach Abscheidung elektronendichter Verbindungen) selektiv gefärbte zellulare Strukturen sichtbar.

Resultate einer Lektinbehandlung von Lebergewebsschnitten
Lektinbehandlung
Demonstrierte Strukturen
MLI
Paraplastische Substanzen (Fasersysteme) von Blutgefäßen, Kupffersche Sternzellen, granuläres Material in Hepatozyten
MLI+ 50mM Galaktose	Glykokalyx der Hepatozyten und Kupffersche Sternzellen

2. Wie unter 1. beschrieben, aber mit Gewebsschnitten aus dem Zentralnervensystem von HIV-Patienten

Resultate einer Lektinbehandlung von ZNS-Gewebsschnitten
Lektinbehandlung
Demonstrierte Strukuren
MLI
Mikrogliazellen, Perzyten, Makrophagen
MLI+ 50 mM Galaktose	Paraplastische Substanzen (Fasersysteme)
MLI+ 50 mM N-Acetylgalaktose	Paraplastische Substanzen (Fasersysteme)

3. Titerplatten mit 96 wells werden mit Polysacchariden oder wasserlöslichen, an Träger gebundenen Mono-, Di- oder Oligosacchariden (z. B. Galaktosylpolyacrylamid) oder Glykokonjugaten (Glykoproteine, Glykolipide, Neoglykoproteine bzw. -lipide) beschichtet und dann die Bindung von Lektinen in An- bzw. Abwesenheit spezifischer Saccharide untersucht. Von besonderem Interesse ist die Beschichtung der Platten mit physiologisch oder therapeutisch relevanten zellulären Rezeptoren oder deren kohlenhydrathaltigen Teilen. Nach Waschschritten wird z. B. mit üblichen ELISA-Tests die Menge des gebundenen Lektins bestimmt.

Resultate:

Claims

1. Mittel zur Untersuchung und Beeinflussung zellulärer Veränderungen auf Lektinbasis, dadurch gekennzeichnet, daß es ein oder mehrere Lektine bzw. deren zuckerbindende Untereinheiten und einen oder mehrere der für sie spezifischen Zucker enthält.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die Mistellektine MLI und/oder MLII und/oder MLIII enthält.

3. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die B- Kette der Mistellektine MLI, MLII oder MLIII enthält.

4. Mittel nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß es die Zucker Galaktose und/oder N-Acetylgalaktose und/oder ihre Derivate enthält.

5. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es Glycokonjugate, Oligomere oder Polymere der für sie spezifischen Zucker, im Falle der Mistellektine von Galaktose oder N- Actylgalaktose, enthält.

6. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es Oligomere oder Polymere mit einem Anteil der für sie spezifischen Zucker, im Falle der Mistellektine von Galaktose oder N-Acetylgalaktose, enthält.

7. Mittel nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß der oder die spezifischen Zucker am eingesetzten Lektin über Spacer chemisch gebunden sind.

8. Mittel nach Anspruch 1-3 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß der oder die spezifischen Zucker an einer der combining sites des eingesetzten Lektins kovalent oder nicht kovalent gebunden sind.

9. Mittel nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß es den spezifischen Zucker im Überschuß enthält.

10. Mittel nach Anspruch 1-6 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß es den spezifischen Zucker in 10-10000-fachem Überschuß ent hält.

11. Mittel nach Anspruch 1-3 und 7-9, dadurch gekennzeichnet, daß es den spezifischen Zucker in 2-6-fachem Überschuß enthält.

12. Verfahren zur Anwendung des Mittels nach Anspruch 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß es dem zu untersuchenden Gewebe bzw. biologischem Material zugesetzt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß dem zu untersuchenden Gewebe bzw. biologischen Material die Bestandteile des Mittels nacheinander zugesetzt werden.