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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Diese
Erfindung betrifft den Nachweis von Wechselwirkungen zwischen einem
Liganden und einem Rezeptor durch das Verfolgen von Änderungen
im Brechungsindex. Im Besonderen betrifft sie den Nachweis von derartigen
Wechselwirkungen zwischen relativ kleinen Liganden und relativ großen Rezeptoren.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Der
Brechungsindex ist als Verhältnis
der Geschwindigkeit einer bestimmten Strahlung in einem Vakuum zu
deren Geschwindigkeit in einem gegebenen Medium definiert. Die Richtung
eines Lichtstrahls wird beim Durchgang von einem Medium in ein anderes
mit unterschiedlicher Dichte oder dann verändert (d.h. gebrochen), wenn
er ein Medium durchläuft,
dessen Dichte nicht gleichförmig
ist. Ein Verfahren zum Verfolgen einer derartigen Brechung ist die
Oberflächenplasmonresonanz
(Surface Plasmon Resonance SPR), die auf der Erscheinung einer totalen
internen Reflexion beruht, bei der Licht, das ein Medium mit einem
höheren
Brechungsindex (z.B. Glas) durchläuft, vollständig innen reflektiert wird,
wenn es unter einem ausreichend schrägen Winkel auf ein Medium mit
einem niedrigeren Brechungsindex (z.B. einer Lösung) trifft. Beim SPR-Nachweis
wird die Intensität
des reflektierten Lichts durch das Vorhandensein einer Metalloberfläche gedämpft, die sich
an der Grenzfläche
der beiden Medien befindet. Die Abnahme in der Intensität tritt
bei einem genau festgelegten Winkel auf, der von den Brechungsindizes
der beiden Medien abhängt
und als "Resonanzwinkel" bezeichnet wird.
Da sich Proteine an der Metalloberfläche anlagern, ändert sich
der Brechungsindex der Lösung in
der Nähe
der Grenzfläche,
wodurch jener Winkel verschoben wird, unter dem das reflektierte
Licht gedämpft wird
(d.h. eine Verschiebung des Resonanzwinkels). Der Nachweis der Verschiebung
im Resonanzwinkel stellt die Grundlage eines Geräts dar, das BiacoreTM genannt wird und in dem ein Ligand auf
einer chemisch veränderte
Goldoberfläche
immobilisiert wird, wobei die Assoziation und die Dissoziation eines
löslichen
Liganden zum immobilisierten Liganden als Funktion der Echtzeit
verfolgt werden. Dieser auf optischen Vorgängen beruhende Sensor ermöglicht einen
direkten Nachweis von Proteinen in komplexen Lösungen, beispielsweise in Fermentationsmedien
(H. V. Hsieh, et al., 1998. Vaccine 16, 997–1003). Der Signalausgang des
BiacoreTM wird als Resonanzeinheit (resonance
unit RU) bezeichnet und gibt den Resonanzwinkel wieder. Bei Proteinen
ist im Allgemeinen 1 RU etwa 1 pg/mm2. Andere
Geräte
für eine
Messung der SPR sind bei Bio-Tul (Plasmoon) und Texas Instruments
(Spreeta) erhältlich.
Andere Gesellschaften, die Geräte
entwickeln, die auf Änderungen im
Oberflächenbrechungsindex
beruhen, sind Luna Innovations (Sensoren, die auf einem Long Period
Grating oder LPG beruhen) sowie Affinitätssensoren (IAsys).
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Die
SPR und ähnliche
Verfahren wurden dazu verwendet, um die Bindung von Liganden und
Rezeptoren zu analysieren. Da der Brechungsindex der Lösung in
der Nähe
der Grenzfläche
zwischen dem Feststoff und der Flüssigkeit durch die Masse der
Moleküle
an der Grenzfläche
beeinflusst werden kann, erhöht
die Bindung eines Liganden und eines Rezeptors im Allgemeinen die
Masse und führt
zu einer Erhöhung
des Reflexionswinkels. SPR-Geräte,
beispielsweise der BiacoreTM, verfolgen
den Bindungsvorgang fortlaufend. Mit diesen Verfahren können die
Kinetik und die Affinität
von Bindungen analysiert werden.
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In
letzter Zeit wurde die SPR dazu verwendet, um Konformationsänderungen
in Proteinen zu untersuchen. H. Sota und Y. Hasegawa (1998. Anal.
Chem. 70, 2019–2024)
immobilisierten Dihydrofolat-Reduktase von E. coli und beobachteten
einen Anstieg im SPR-Signal bei einer sauren Denaturierung des Proteins.
S. Boussaad, et al. (2000. Anal. Chem. 72, 222–226) berichten über die
Verwendung einer SPR für
die Verfolgung des elektronischen Zustands von Cytochrome c und
beobachteten eine Abnahme im Resonanzwinkel, wenn das Protein vom
oxidierten in den reduzierten Zustand wechselte, wobei dies eine
zugeordnete Konformationsänderung
anzeigt. Diese Beispiele befassen sich jedoch nicht mit einer Bindung
zwischen Rezeptoren und Liganden.
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Ein
Mangel der SPR-Analysen bei Wechselwirkungen zwischen Liganden und
Rezeptoren besteht darin, dass die Massenänderung bei der Bindung groß genug
sein muss, um als Änderung
im Brechungsindex nachgewiesen zu werden. Die SPR wird typischerweise
dazu verwendet, um die Bindung von relativ großen Liganden an immobilisierte
Rezeptoren zu verfolgen (z.B. eine Bindung zwischen Antikörpern und
Antigenen). Diese Bindung wird von einem relativ großen Anstieg
im Signal begleitet, da die signifikante Massenzunahme des Komplexes
zu einer großen Änderung
im Brechungsindex führt.
Obwohl Geräte,
wie beispielsweise der BiacoreTM, ziemlich
empfindlich sind, ist die Bindung von sehr kleinen Liganden an die
Oberfläche
typischerweise nicht nachweisbar, da die Massenzunahme zu klein
ist, um sie als Anstieg im Brechungsindex nachweisen zu können. Ein
Beispiel für
eine Bindungsreaktion, von der erwartet werden kann, dass sie unterhalb
der Nachweisgrenzen von derzeit erhältlichen SPR-Geräten liegt
(die auf der minimalen Massezunahme bei der Bindung basieren), ist
die Bindung von Calcium an Calmodulin (CaM). Aus diesem Grund wurden
andere Analysen, beispielsweise die Fluoreszenz-Analyse, die von T. L. Blair, et al.,
(1994. Anal. Chem. 66, 300–302)
beschrieben wurde und nicht die SPR umfasst, verwendet, um Konformationsänderungen
bei einer Bindung zwischen CaM und Calcium zu untersuchen. Die SPR-Analysen
zur Untersuchung einer CaM-Bindung waren bisher auf Systeme begrenzt,
bei denen Calcium die Bindung von in Lösung stehendem CaM an ein immobilisiertes
Oligopeptid vermittelt, wie dies beispielsweise von T. Ozawa, et
al., (1999. Biochem. Biophys. Acta 1434, 211–220) sowie E. Takano, et al.,
(1994. FEBS Lett. 352, 247–250)
berichtet wird. Bei diesen Systemen kann durch die Verwendung von
CaM (Molekulargewicht ~17000) als Lösungsmolekül die Wechselwirkung mit herkömmlichen
SPR-Verfahren nachgewiesen
werden.
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LPG-Sensoren
mit optischen Fasern wurden für
den Nachweis von biologischen Zielen verwendet, wobei auf die Faseroberfläche Affinitätsbeläge aufgebracht
wurden (M. E. Jones, et al., 2000, NSF Design and Manuf. Research
Conf., Vancouver, Poster Number SBIR-510). Beim LPG wird Licht bei
einer bestimmten Wellenlänge
basierend auf einem Gitterintervall, dem Brechungsindex der Faser
und dem Brechungsindex des umgebenden Mediums gestreut. Da der Affinitätsbelag
das Zielmolekül absorbiert, ändert sich
der Brechungsindex und verursacht eine Verschiebung in der Wellenlänge des
gestreuten Lichts, die das LPG "sieht". Die Autoren berichten über den
Nachweis einer β-Galactosidase-Bindung
an einen auf einem Liganden basierenden Affinitätsbelag (polyklonale Antikörper) als
Verschiebung in der Wellenlänge,
doch verursacht eine derartige Bindung eine relativ große Massenänderung,
wobei dies aber nicht zu einer Konformationsänderung im Rezeptor führt.
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Im
Stand der Technik wurde nicht über
die Verwendung von Verfahren mit einer Oberflächenbrechung berichtet, beispielsweise über Verfahren
für die
Analyse einer Ligandenbindung an allosterische Rezeptoren. Obwohl
eine CaM/Ca-Bindung allosterisch ist, weisen die oben beschriebenen
Untersuchungen über CaM-Bindungen
dies nicht nach, da Calcium an CaM gebunden wird, bevor der Komplex
an das immobilisierte Oligopeptid gebunden wird. Die Bindung des
Komplexes an das Oligopeptid, wobei es sich um jene Bindung handelt,
die nachgewiesen wird, ist nicht allosterisch.
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Bohrmann
B. et al., J. Struct Biol. 2000 Jun; 130(2–3): 232–46, lehrt ein Verfahren zur
Auswahl von synthetischen Molekülen,
um deren Fähigkeit
zu bestimmen, eine Fibrilbildung (durch Selbstorganisation) von Amyloid-β (Aβ) zu verzögern. Das
Verfahren enthält
die Messung von Bindungsaffinitäten
von kleinen Molekülen
an Aβ-Fibril
und eines varianten Aβ42-Momomers unter Verwendung
einer SPR. Das Aβ-Peptid
oder das Aβ-Fibril
werden jedoch bei der Bindung von kleinen Molekülen keiner Konformationsänderung
unterzogen, sondern werden statt dessen an einer weiteren Fibrilbildung
gehindert. Das Verfahren beruht auf der Massenänderung des wachsenden Fibrils
und nicht auf der Änderung
in der Konformation des Peptids (oder Fibrils) für die Lieferung des SPR-Signals.
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US 4,992.385 ist auf Verfahren
für die
Herstellung von Sensoren gerichtet, die darin bestehen, eine geeignete
optische Oberfläche
mit einem Polymer zu beschichten und einen Bindungspartner von einem
Paar von Bindungspartnern mit der polymerbeschichteten optischen
Struktur zu verbinden.
US 4,992.385 schlägt ein Verfahren
für den
Nachweis eines komplexen Aufbaus über optische Änderungen
an der Oberfläche bei der
Bindung der Partner vor.
US 4,992.385 erwähnt den
Nachweis von Zucker. Bei den oben erwähnten, vorgeschlagenen Rezeptoren,
beispielsweise bei Lektinen, handelt es sich jedoch nicht um allosterische
Proteine. Die Lektin/Zucker-Paarbindung
ist der Bildung eines Antikörper/Antigen-Komplexes ähnlich,
womit es sich bei der Bindung um einen Massenänderungsvorgang handelt, der
ohne Konformationsänderung
abläuft.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es
wurde jetzt unerwartet entdeckt, dass Änderungen im Brechungsindex
dazu verwendet werden können,
um die Bindung von Liganden an immobilisierte Rezeptoren nachzuweisen,
wenn der Rezeptor (z.B. ein Bindeprotein) oder der Rezeptoroberflächen-Komplex
bei der Bindung des Liganden eine Konformationsänderung erfährt. Die Konformationsänderung
kann auch dann nachgewiesen werden, wenn der Ligand klein und der
Rezeptor groß ist,
wobei dies nun aufgrund der Massenzunahme bei der Ligandenbindung
nicht vorhersagbar wäre.
Es wurde nicht erwartet, dass die Bindung von derartigen allosterischen
Bindesubstanzen an ihre Liganden negative Abweichungen im optischen
Verhalten bei der SPR hervorrufen kann (d.h. eine Abnahme im Resonanzwinkel).
Obwohl die Verknüpfung
der Arbeitsweise der Erfindung mit einer bestimmten Theorie nicht
erwünscht
ist, nehmen die Anmelder an, dass die Abnahme im Signal bei der
Bindung dadurch erfolgen könnte,
dass sich das Bindeprotein bei seiner Bindung rund um den Liganden "schließt" oder "zusammenbricht". Dies könnte zu
einer Abnahme im hydrodynamischen Volumen führen, die größer als
die Massenzunahme bei der Bindung ist. Im Gegensatz dazu wurde ein
Anstieg in den optischen Messwerten bei der SPR beobachtet, wenn
sich die allosterische Bindesubstanz bei der Bindung des Liganden "öffnet". Diese Reaktion kann zu einer Zunahme
im Molekularvolumen infolge einer Konformationsänderung führen, die signifikanter als
die hinzugefügte
Masse des Liganden ist. Ob die Änderung
im Brechungsindex bei einem gegebenen Paar eines Rezeptors und eines
Liganden positiv oder negativ ist, kann jedoch vom Verfahren und
von den Geräten abhängen, die
für den
Nachweis verwendet werden, da die bei einer LPG beobachteten Änderungen
nicht immer jenen Änderungen
folgen, die bei einer SPR beobachtet werden.
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Die
vorliegende Erfindung liefert daher ein neues optisches Verfahren
für den
Nachweis und die Analyse einer Bindung von allosterischen Rezeptoren
an ihre Liganden. Die Verfahren der Erfindung können besonders bei kleinen
Liganden verwendet werden, von denen nicht erwartet werden kann,
dass sie durch Änderungen
im Oberflächenbrechungsindex
nachgewiesen werden können,
da sie bei der Bindung keine signifikante Masse hinzufügen.
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BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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In
den Zeichnungen zeigt:
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1 die
Ergebnisse bei der Verwendung der Verfahren der Erfindung für die Bindung
von Maltose an MBP, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist;
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2 die
Ergebnisse bei der Verwendung der Verfahren der Erfindung für die Bindung
von Sacchariden an GGBP, wie dies im Beispiel 2 beschrieben ist;
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3 die
Ergebnisse bei der Verwendung der Verfahren der Erfindung für die Bindung
von Calciumionen an Transglutaminase, wie dies im Beispiel 3 beschrieben
ist;
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4 die
Ergebnisse bei der Verwendung der Verfahren der Erfindung für die Bindung
von Calciumionen an CaM, wie dies im Beispiel 4 beschrieben ist;
und
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5 die
Ergebnisse bei der Verwendung der Verfahren der Erfindung für die Bindung
von Glucose an GGBP, wie dies im Beispiel 5 beschrieben ist.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Der
Ausdruck "Rezeptor", wie er im Fachgebiet
typischerweise verwendet wird, bezieht sich auf den größeren der
beiden Bindungspartner und ist allgemein jenes Element des Bindungspaares,
das bei der Bindung eine Konformationsänderung erfährt. Der "Ligand" ist typischerweise kleiner als der
Rezeptor und wird an den Rezeptor gebunden. Im Hinblick auf SPR-Analysen
gemäß der vorliegenden
Erfindung wird bevorzugt, dass der Rezeptor das immobilisierte Molekül und der
Ligand das Molekül
in Lösung
sind. Diese Anordnung steht im Gegensatz zur Empfehlung von Biacore.
Die Verfahren der Erfindung können
dazu verwendet werden, um den Liganden oder die Wechselwirkung zwischen
dem Liganden und dem Rezeptor nachzuweisen oder zu analysieren,
um eine Bindung des Liganden an den Rezeptor zu analysieren, oder
um den Rezeptor zu analysieren. Der Nachweis von Wechselwirkungen
zwischen dem Liganden und dem Rezeptor durch Änderungen im Brechungsindex
hängt typischerweise
vom Molekulargewicht (oder der Masse) des Liganden ab. Je größer der
Ligand ist, umso größer ist
der Anstieg im Signal bei der Bindung. Analysen von kleinen Liganden,
die eine SPR für
die Messung der Änderung
im Brechungsindex verwenden, benötigen
im Allgemeinen ein sehr empfindliches und teures Gerät, beispielsweise
den BiacoreTM 3000 (etwa $250.000,00), oder
eine indirekte Analyse, die ein großes, kompetitives Bindeprotein
verwendet. Es wurde jetzt unerwartet entdeckt, dass es dann, wenn
der Rezeptor bei der Bindung eine Konformationsänderung erfährt (d.h. dann, wenn der Rezeptor
allosterisch ist), möglich
ist, die Bindung auch eines Liganden aus kleinen Molekülen durch Änderungen
im Brechungsindex direkt nachzuweisen. Wenn die Analyse mit einer
SPR erfolgt, kann eine Abnahme im Signal bei der Bindung des Liganden
an einen allosterischen Rezeptor beobachtet werden, anscheinend
deshalb, weil sich der Rezeptor bei der Bindung schlißt oder
zusammenbricht und das hydrodynamische Volumen des Komplexes ungeachtet
der hinzugefügten
Masse des Liganden dadurch abnimmt. Auch bei kleinen Liganden besitzt
die Änderung
im Signal eine Größe, die
mit weniger empfindlichen und damit weniger teuren SPR-Geräten nachgewiesen
werden kann. Damit wird eine Analyse geliefert, die schnell und
billig ist und miniaturisiert werden kann. Dabei handelt es sich
um eine wesentliche Verbesserung, da das BiacoreTM 3000-Gerät darauf
beschränkt
ist, die Bindung von Molekülen
nachzuweisen, die ≥ 180
Da sind, wenn die Massezunahme direkt verfolgt wird. Daher kann
typischerweise die Bindung von kleinen Molekülen, beispielsweise von einem
Calciumion (40 Da), nicht nachgewiesen werden. Wenn man die Verfahren
der vorliegenden Erfindung anwendet, kann irgendeine allosterische
Bindungsreaktion, einschließlich
der Bindung von Calcium an CaM oder an Transglutaminase, unter Verwendung
eines einfacheren und billigeren Geräts nachgewiesen werden.
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Bei
den Verfahren der vorliegenden Erfindung können irgendwelche Vorrichtungen
auf dem Fachgebiet verwendet werden, um Änderungen im Brechungsindex
zu verfolgen. Vorzugsweise verfolgt das ausgewählte Verfahren Änderungen
im Oberflächenbrechungsindex
bei der Bindung zwischen einem Rezeptor und einem Liganden, beispielsweise
Verfahren, die auf einer SPR oder LPG beruhen.
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Die
Rezeptoren der Erfindung sind vorzugsweise allosterisch, d.h., dass
sie ihre Konformation bei der Bindung an den Liganden ändern, sei
es am Ort der Bindung selbst oder anderswo im Molekül. Allosterische Bindungen
sind typischerweise mit einem "Schließen" des Rezeptors rund
um den Liganden verknüpft,
doch verursacht bei einigen allosterischen Rezeptoren die Bindung
des Liganden ein "Öffnen" der Rezeptorkonformation.
Derartige Rezeptoren werden oft als allosterische Rezeptoren oder
allosterische Bindesubstanzen bezeichnet und umfassen Bindeproteine,
die im Fachgebiet bekannt sind. Beispiele von derartigen Bindeproteinen
umfassen das Maltose-Bindeprotein (MBP), das Glucose-Bindeprotein
(GBP) oder Proteine, die kleine Zucker binden, periplasmische Bindeproteine,
CaM und Transglutaminase, wobei jedoch viele andere Bindeproteine
mit den passenden Eigenschaften für eine Verwendung in der Erfindung,
wie sie hier beschrieben wurde, für Fachleute bekannt sind. Zusätzliche
allosterische Rezeptoren, wenn sie nicht bereits als allosterisch
bekannt sind, können
leicht für
eine Verwendung in der Erfindung beurteilt werden, ohne dass nachgeforscht
werden muss, indem der Rezeptor in den Verfahren der Erfindung verwendet
wird, und indem festgestellt wird, ob bei der Bindung an einen kleinen
Liganden eine Änderung
im SPR-Signal beobachtet wird oder nicht. Ein derartiges Auswahlverfahren
liefert schnell eine Information, ob Konformationsänderungen
auftreten, und ob der ausgewählte
Rezeptor und sein Ligand unter Verwendung der Verfahren der Erfindung
analysiert werden können.
Der allosterische Rezeptor kann irgendeine Größe, irgendeine Masse oder irgendein
Molekulargewicht besitzen, doch ist er vorzugsweise relativ zum
ausgewählten
Liganden groß,
so dass die Änderung
im hydrodynamischen Volumen bei der Bindung auch relativ groß ist. Große allosterische
Rezeptoren besitzen typisch ein Moleklargewicht von mehr als etwa
15.000, oft ein Molekulargewicht zwischen etwa 15.000 und etwa 100.000,
doch können
Rezeptoren mit anderen Molekulargewichten bei der Erfindung in Abhängigkeit
von der Größe des ausgewählten Liganden
und der Größe der Konformationsänderung
nützlich
sein. Liganden für
die Verwendung in der Erfindung besitzen vorzugsweise, aber nicht
notwendigerweise, ein Molekulargewicht von weniger als etwa 1500,
besser ein Molekulargewicht etwa 30–400, und umfassen Aminosäuren und
Peptide, Nukleotide und Oligonukleotide, Zucker, Ionen sowie andere
kleine Teilchen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Bevorzugte
Liganden erzeugen bei der Bindung eine relativ große Änderung
in der Konformation des Rezeptors. Es sei darauf hingewiesen, dass
die Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht von den absoluten Relativgrößen des
Liganden und seines Rezeptors abhängen. Wichtiger ist, dass ein
ausgewählter
Ligand relativ klein ist im Vergleich zur Größe der Konformationsänderung
im Rezeptor bei der Bindung. Das bedeutet, dass die Bindung eines
kleinen Liganden an einen relativ kleinen Rezeptor unter Verwendung
der Verfahren der Erfindung nachgewiesen werden kann, wenn die Konformationsänderung
im Rezeptor bei der Bindung groß ist.
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Ohne
den Bereich der Erfindung einschränken zu wollen, nehmen die
Anmelder an, dass die Änderung
im Brechungsindex-Signal, die dann beobachtet wird, wenn ein allosterisches
Bindemittel sich an seinen Liganden bindet, zumindest teilweise
auf der zugeordneten Konformationsänderung im Rezeptor beruht.
Das bedeutet, dass eine Abnahme im hydrodynamischen Volumen des
allosterischen Bindemittels oder des Rezeptors, wenn sich dieser
auf einen Liganden "schließt", größer als
die Massenänderung
sein kann, die durch die Addition des Liganden hervorgerufen wird.
Dies führt
zu einer Nettoabnahme im Volumen des Komplexes sowie zu einer Nettoabnahme
im Brechungsindex. Auf ähnliche
Weise kann ein Anstieg im Brechungsindex, der bei allosterischen
Bindemitteln beobachtet wird, die sich bei der Bindung an ihre Liganden "öffnen", auf einem Anstieg im hydrodynamischen
Volumen beruhen, der größer als
die beigefügte
Masse des Liganden ist. Diese Erscheinung wurde bisher in Untersuchungen
nicht erkannt, die den Brechungsindex verwenden, und es war bisher
nicht ersichtlich oder zu erwarten, dass die Änderung im Brechungsindex,
die einer allosterischen Bindung zugeordnet ist, einen einfachen
Nachweis der Bindung zwischen dem Rezeptor und dem Liganden auch
dann liefert, wenn der Ligand klein ist.
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BEISPIEL 1
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MBP
wurde aus osmotischen Schock-Lysaten hergestellt und mit einem CM5-(Carboxymethyldextran)-Chip
(Biacore) unter Verwendung von EDC/NHS-Standardverfahren gekuppelt,
die mit Reagenzien aus dem Biacore EDC/NHS-Kupplungsset ausgeführt wurden.
Das MBP betrug 10 μM
bei einem pH-Wert 4,5 in 10 mM NaOAc. Hepesgepufferte Saline-EP
(HBS-EP: 0,01 M HEPES, pH-Wert
7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Surfaktant P20; BiacoreTM AB) wurde als Elutionsmittel (O'Shannessy et al.,
1992) verwendet, das mit 5 mM CaCl2 ergänzt wurde.
Ethanolamin (1,0 M, pH 8,0) wurde verwendet, um unreagierte Ester
zu unterdrücken,
wobei entdeckt wurde, dass es beim Entfernen von nichtkonvalent
adsorbiertem Protein von der Chipoberfläche wirksam ist. Maltoselösungen wurden
in dH2O mit den gewünschten Konzentrationen hergestellt. Das
Einspritzen der Maltose betrug 20 μL bei einer Strömungsgeschwindigkeit
von 10 μL/min
(2 Minuten Kontaktzeit). Messpunkte wurden 100 Sekunden nach der
Einspritzung gesammelt. Die Messpunkte von den Einspritzungen über einer
blanke Oberfläche
wurden abgezogen. Datenpunkte wurden für jene Daten ausgeschieden,
die während
offensichtlicher Anomalien gesammelt wurden, wie z.B. bei Luftblasen.
Als Laufpuffer wurde HBS-EP (Biacore) verwendet, der mit 5 mM CaCl2 ergänzt
wurde.
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Gebundene
Maltose wurde durch das Einspritzen von 20 μL von 100 mM Glucose in 10 mM
NaOAc, pH-Wert 4,5 entfernt. Die Glucose wurde einmal von Wasser
als Monohydrat umkristallisiert, um mögliche Maltoseunreinheiten
zu entfernen. Nach der Regenerierung konnte sich die Oberfläche für 300 Sekunden
stabilisieren, bevor ein zusätzlicher
Ligand eingespritzt wurde.
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Das
Einspritzen einer Maltoselösung über die
MBP-Oberfläche
führte
zu einer reproduzierbaren Nettoabnahme in den RU-Einheiten im Gegensatz zu einer positiven Änderung
in den RU-Einheiten,
die für
einen Massenaufbau von Maltose auf dem immobilisierten MBP erwartet
wurde. Eine Oberfläche,
die 2800 RU-Einheiten von MBP trug, wurde für das Einspritzen einer Reihe
von Maltoselösungen
mit verschiedener Konzentration verwendet (1). Die
Messpunkte dieser Lösungen
wurden bestimmt und der Halbwert des Maximums mit 0,3 μM aus der
Kurve bestimmt. Die Dissoziationskonstante (Kd) für die Maltosebindung
an MBP in Lösung
wurde mit etwa 1 μM
berichtet (J. Thomson, et al., 1998. Biophys. Chem. 70, 101–108). Die Ähnlichkeit dieser
Werte deutet auf einen spezifischen Bindungsvorgang zwischen dem
Liganden und dem Rezeptor hin.
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BEISPIEL 2
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Glucose/Galactose-Bindeprotein
(GGBP) wurde aus osmotischen Schock-Lysaten hergestellt und an die
CM5-Chipoberfläche
bei 20 μM
bei pH 4,5 in 10 mM NaOAc unter Verwendung von NHS/EDC-Standardverfahren
gekuppelt. Ethanolamin (1,0 M, pH 8,0) wurde dazu verwendet, um
unreagierte Ester zu unterdrücken,
wobei auch entdeckt wurde, dass es beim Entfernen von nichtkonvalent
adsorbiertem Protein von der Chipoberfläche wirksam ist. Die Pufferströmung wurde über Nacht
beibehalten, um zusätzliches
nichtkonvalent gebundenes GGBP von der Oberfläche zu entfernen, bevor die
Einspritzungen des Liganden vorgenommen wurden. Eine Oberfläche, die
2000 RU-Einheiten von GGBP trug, wurde für die Versuche verwendet. Die Liganden
wurden in dH2O mit den gewünschten
Konzentrationen hergestellt. Die Einspritzungen erfolgten mit 20 μL mit einer
Strömungsgeschwindigkeit
von 10 μL/min
(2 Minuten Kontaktzeit). Die Messpunkte wurden 100 Sekunden nach
dem Einspritzen gesammelt. Die Messpunkte von Einspritzungen über einer
blanke Oberfläche
wurden abgezogen. Typische Einspritzungen über die blanke Kontrolloberfläche ergeben
minimale (< 5 RU)
Signale, wobei sie nichtsdestoweniger abgezogen wurden. Die Einspritzungen
des Liganden wurden dreimal bis fünfmal wiederholt, wobei die
Reihenfolge der Einspritzung periodisch umgekehrt wurde. Datenpunkte wurden
für jene
Daten ausgeschieden, die während
offensichtlicher Anomalien gesammelt wurden, wie z.B. bei Luftblasen.
Die restlichen Daten wurden Q-Tests unterworfen und der Fehler stellt
einzelne Standardabweichungen dar. Eine einzige Reihe von Zuckerlösungen wurde
für das
Einspritzen über
die Kontroll- und Testoberflächen
verwendet. Der laufende Puffer war HBS-EP (Biacore), der mit 5 mM
CaCl2 ergänzt wurde. Gebundene GGBP-Liganden
wurden entweder durch das Einspritzen von 100 mM α-Methylmannosid
in 10 mM NaOAc, pH-Wert 4,5 oder mit 500–1000 Sekunden einer Wäsche mit
dem laufenden Puffer entfernt.
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Eine
Reihe von Sacchariden wurde über
die GGBP-Oberfläche
eingespritzt (2). Nur Glucose ergab einen
signifikant negativen Messwert in relativen RU-Einheiten. Andere
Monosaccharide, Disaccharide und Polysaccharide (z.B. Maltose, Maltotriose,
Maltotetraose und Zyklodextrine) ergaben entweder einen vernachlässigbaren
oder einen schwach positiven Anstieg in relativen RU-Einheiten,
wenn sie über
die GGBP-Oberfläche
eingespritzt wurden. Damit ist das Ansprechen der SPR-Oberfläche konsistent
mit der Spezifität
von GGBP für
Glucose, wie sie in Lösungsstudien
gefunden wurde. Damit ist auch ein Verfahren gegeben, um unspezifische
Bindungsvorgänge
(positive RU-Werte) von spezifischen Bindungsvorgängen (negative RU-Werte) unterscheiden
zu können.
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BEISPIEL 3
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Gewebe-Transglutaminase
(tTG) wurde von Sigma erworben und bei 1,3 mg/mL bei pH 4,5 in 10
mM NaOAc aufbereitet. Eine Oberfläche, die 2500 RU-Einheiten
von tTG trug, wurde unter Verwendung von EDC/NHS-Standardkupplungschemie
hergestellt und für
alle Versuche verwendet. Ethanolamin (1,0 M, pH 8,0) wurde verwendet,
um unregierte Ester zu unterdrücken.
Calciumchlorid wurde in dH2O mit den gewünschten
Konzentrationen hergestellt. Die Einspritzungen erfolgten mit 20 μL bei einer
Strömungsgeschwindigkeit von
10 μL/min
(2 Minuten Kontaktzeit). Die Messpunkte wurden 100 Sekunden nach
der Einspritzung gesammelt. Die Messpunkte von Einspritzungen über einer
blanke Kontrolloberfläche
wurden abgezogen. Typische Einspritzungen über der blanken Kontrolloberfläche ergaben
minimale (< 5 RU)
Signale, die trotzdem abgezogen wurden. Die Einspritzungen wurden
hinsichtlich der Konzentration randomisiert. Datenpunkte wurden
für jene
Daten ausgeschieden, die während
offensichtlicher Anomalien gesammelt wurden, wie z.B. bei Luftblasen.
Der laufende Puffer war HBS-EP (Biacore) ohne einer Ergänzung mit
Calcium. Calcium wurde von der Transglutaminase durch das Einspritzen
von 5 mM EDTA, pH-wert 8,0 entfernt. Nach der EDTA-Einspritzung konnte
sich die Oberfläche
für 300
Sekunden stabilisieren, bevor zusätzliches Calcium eingespritzt
wurde.
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Das
Calcium wurde in einem Bereich von Konzentrationen eingespritzt.
Es ist interessant, dass die Calciumbindung an tTG eine positive Änderung
in den Messwerten bewirkte (3). Der
halbe Maximalwert von tTG war ähnlich
der berichteten Dissoziationskonstanten Kd von Calcium für das Protein
(experimentell bei 0,5 mM; berichteter Wert etwa 1 mM). Die Nachweisgrenze
für die
Liganden am neuesten Biacore-Gerät (BiacoreTM 3000) liegt bei etwa 180 Da. Damit ist
die Calcium-(40
Da)-Bindung für
das Gerät
tatsächlich
unsichtbar. Die positive Änderung
in den Messwerten für
tTG ist jedoch konsistent mit der bekannten Konformationsänderung,
die die Ionenbildung begleitet. Während MBP, GGBP und CaM dafür bekannt
sind, dass sie sich über
ihrem Liganden mit einer Abnahme im hydrodynamischen Radius "schließen", erfährt tTG
eine positive Änderung
im hydrodynamischen Radius bei der Calciumbindung (A. Di Venere,
et al., 2000. J. Biol. Chem. 275, 3915–3921).
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BEISPIEL 4
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Rinderhirn-Calmodulin
(CaM), das von Calbiochem stammte, wurde auf Carboxymethyldextran-Goldoberflächen unter
Verwendung einer Biacore EDC/NHS-Standardkopplungschemie immobilisiert.
Als Eluationsmittel wurde HBS-EP verwendet. CaM wurde bei 0,5 mg/mL
in 10 mM Natriumacetat, pH-Wert 4,0 eingespritzt (54 Minuten Einspritzung).
Dieser Vorgang immobilisierte etwa 480 RU-Einheiten von Calmodulin. Während den
Immobilisierungen betrug die Strömungsgeschwindigkeit
5 μL/min.
Bei einigen Versuchen wurde der BiacoreTM 3000
verwendet. Bei anderen Versuchen fand ein BiacoreTM Upgrad
Verwendung. Im Allgemeinen wurden die Einspritzungen mit einer Strömungsgeschwindigkeit
von 5 oder 10 μL/min
in einem HBP-EP Puffer durchgeführt.
Verschiedene Konzentrationen von CaCl2 in
HBS-EP (3,5–50
mM) wurden auf die CaM-Oberfläche
und auf die blanke Oberfläche
eingespritzt. Eine Abnahme im Signal wurde bei allen Konzentrationen
beobachtet.
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Die
Ergebnisse für
50 mM CaCl2 sind in 4 dargestellt,
die eine Abnahme in den RU-Einheiten bei der Bindung zeigt. Sowohl
für die
CaM-Oberfläche
als auch für
die blanke Oberfläche
ist das Hintergrundsignal groß und
führt zu
einem Anstieg in den RU-Einheiten während der Einspritzung selbst.
Das Signal über
der blanken Oberfläche
(1502 RU) ist jedoch viel größer als
das Signal über
der CaM-Oberfläche
(1350 RU). Für die
verschiedenen Konzentrationen von CaCl2,
die untersucht wurden, stiegen die Messwerte der Kennlinie bei steigenden
Konzentrationen von CaCl2 an, wobei dies
darauf hindeutet, dass diese Analyse dazu verwendet werden kann,
um das Calciumion quantitativ zu bestimmen.
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BEISPIEL 5
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LPG-Fasersensoren
mit einer CMD-(Carboxymethyldextran)-modifizierten Oberfläche stammten von Luna Innovations,
Inc. (Blacksburg, VA). Die Faseroberfläche wurde dadurch aktiviert,
dass der LPG-Sensor für
eine Stunde in einer Lösung
inkubiert wurde, die aus 37 mg/mL EDC und 7,5 mg/mL NHS in 20 mM
MES, pH-Wert 6,8 zusammengesetzt war. Der aktivierte Sensor wurde
mit 20 mM MES, pH-Wert 6,8 und 10 mM NaOAc, pH-Wert 5,0 gewaschen,
dann in eine Lösung
von 20 μM
GGBP in 10 mM NaOAc übertragen
und zwei Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach einer Spülung mit
10 mM NaOAc wurden unreagierte Ester auf der Sensoroberfläche dadurch
deaktiviert, dass sie für
eine Stunde einer 1 M Ethanolaminlösung, pH-Wert 9,0 ausgesetzt
wurden. Daraufhin wurde der Sensor mit einem Basispuffer gespült (10 mM
HEPES, 150 mM NaCl, 0,005% Polysorbat 20, pH-Wert 7,4).
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Die
Verfolgung des LPG-Sensors erfolgte über ein Lunascan-System (Luna Innovations,
Inc.), das aus einem Spektrometer, einem Detektor, einer Steuereinheit,
einem Laptop-Computer mit einem Interface und einer Umschalteinrichtung
bestand, um mehrere LPG-Sensoren abzufragen. Ein Vergleich mit einem
CMD-beschichteten
LPG-Referenzsensor, der nicht dem GGBP ausgesetzt war, zeigte etwa
eine 0,40 nm Wellenlängenverschiebung
des modifizierten Sensors infolge der Immobilisierung des Proteins.
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Nach
einer gründlichen
Spülung
mit dem HEPES-Basispuffer wurden der modifizierte Sensor und der nicht
modifizierte Referenzsensor folgenden Lösungen ausgesetzt (siehe die
Tabelle). Zwischen jeder Lösung wurden
die Sonden mit dem Basispuffer (HEPES) gespült. Die Kurve für den Referenzkanal
wurde vom GGBP-Kanal abgezogen, um Auswirkungen der Lösung auf
den Brechungsindex beim Betrieb der Sensoren zu korrigieren. Diese
Ergebnisse zeigen nachweisbare und reversible Messwerte von Glucosepegeln
von 10 μM und
1 mM (5).
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Die
vorliegende Erfindung liefert Verfahren für den Nachweis von kleinen
Molekülen,
ohne dass Kompetitoren mit hohem Molekulargewicht erforderlich sind.
Es wurde jetzt entdeckt, dass die Bindung von Rezeptoren, die Konformationsänderungen
erfahren, an kleine Liganden direkt durch Änderungen im Oberflächenbrechungsindex
verfolgt werden können.
Derartige Konformationsänderungen
können
dazu verwendet werden, um das Vorhandensein von zu analysierenden
Stoffen mit geringem Molekulargewicht feststellen zu können. Rezeptoren,
die bei der Ligandenbindung das hydrodynamische Volumen verkleinern
(z.B. MBP, GGBP und CaM) erzeugen negative Änderungen im Brechungsindex,
wenn sie mit der SPR analysiert werden. Rezeptoren, die bei der
Ligandenbindung das hydrodynamische Volumen vergrößern (z.B.
tTG), erzeugen eine positive Änderung
im Brechungsindex, wenn sie mit der SPR analysiert werden. Ob die
bei der Bindung eines kleinen Liganden gefundenen Messwerte positiv
oder negativ sind, kann sich je nach dem Verfahren ändern, das
für die
Messung des Oberflächenbrechungsindex
ausgewählt
wurde. Beispielsweise erzeugte die LPG-Analyse einer GGBP-Bindung
an Glucose eher einen positiven Wert als den negativen Wert, der
bei der SPR beobachtet wurde.
