ES2257373T3 - Deteccion de ligandos por metodos refractivos de superficie. - Google Patents
Deteccion de ligandos por metodos refractivos de superficie.Info
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Abstract
Un método para detectar o analizar la formación de un complejo entre un ligando y un receptor alostérico para el ligando en ausencia de competidores de peso molecular elevado, que comprende las etapas de: inmovilizar un receptor alostérico que experimenta un cambio conformacional tras la unión del ligando; unir el ligando a dicho receptor alostérico inmovilizado en ausencia de competidores de peso molecular elevado del ligando para formar el complejo; y detectar la presencia del complejo midiendo un cambio en el índice de refracción superficial, dicho cambio en el índice de refracción superficial debido a la masa del ligando siendo menor que un cambio en el índice de refracción superficial debido al cambio conformacional del receptor alostérico inmovilizado tras la unión del ligando.
Description
Detección de ligandos por métodos refractivos de
superficie.
La presente invención se refiere a la detección
de interacciones ligando-receptor controlando los
cambios en el índice de refracción y, en particular, a detectar
dichas interacciones entre ligandos relativamente pequeños y
receptores relativamente grandes.
El índice de refracción se define como la
relación de la velocidad de una radiación específica en el vacío a
su velocidad en un medio dado. La dirección de un rayo de luz es
cambiada (es decir, refractada) tras pasar desde un medio hasta
otro de diferente densidad o cuando atraviesa un medio cuya
densidad no es uniforme. Un método para controlar dicha refracción
es la Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) que está basado en
el fenómeno de la reflexión interna total, en el que la luz que se
desplaza a través de un medio de índice de refracción superior
(por ejemplo, vidrio) es totalmente reflejada internamente tras
encontrar un medio de índice de refracción inferior (por ejemplo,
solución) a un ángulo suficientemente oblicuo. En la detección
SPR, la intensidad de la luz reflejada es amortiguada por la
presencia de una superficie metálica en la intercara de los dos
medios. La disminución de la intensidad se produce a un ángulo bien
definido, que depende de los índices de refracción de los dos
medios, denominado "ángulo de resonancia". Cuando las
proteínas se absorben en la superficie metálica, el índice de
refracción de la solución cerca de la intercara cambia, variando el
ángulo al que la luz reflejada es amortiguada (es decir, variando
el ángulo de resonancia). La detección de la variación del ángulo
de resonancia es la base de un aparato denominado Biacore®, en el
que un ligando es inmovilizado sobre una superficie de oro
químicamente modificada, y la asociación y disociación de un
ligando soluble al ligando inmovilizado es controlada como una
función del tiempo real. Este sensor ópticamente basado permite
dirigir la detección de proteínas en soluciones complejas, como
medios de fermentación (H. V. Hsieh et al., 1998. Vaccine
16, 997-1003). La salida de la señal del Biacore® se
denomina unidad de resonancia (RU) y refleja el ángulo de
resonancia. En general para proteínas, 1 RU es aproximadamente 1
pg/mm^{2}. Otros instrumentos para medir la SPR están disponibles
en las empresas Bio-Tul (Plasmooon) y Texas
Instruments (Spreeta). Otras empresas que desarrollan instrumentos
basados en los cambios del índice de refracción superficial
incluyen Luna Innovations (sensosres basados en retículos de
períodos largos, o LPG) y sensores de afinidad (IAsys).
La SPR y técnicas similares han sido usadas para
analizar la unión de ligandos y receptores. Como el índice de
refracción de la solución cerca de la intercara
sólido-líquido puede verse afectado por la masa de
las moléculas en la intercara, en general la unión de un ligando y
un receptor aumenta la masa y da lugar a un aumento del ángulo de
reflexión. Los instrumentos de SPR como el Biacore® controlan el
acontecimiento de unión continuamente. Usando estas técnicas,
pueden ser analizadas la cinética y la afinidad de unión.
Más recientemente, la SPR ha sido usada para
estudiar cambios conformacionales en proteínas. H. Sota y Y.
Hasegawa (1998. Anal. Chem. 70, 2019-2024)
inmovilizaron dihidrofolato reductasa de E. coli y
observaron un aumento de la señal de SPR con desnaturalización
ácida de la proteína. S. Boussaad et al. (2000. Anal. Chem.
72, 222-226) expusieron el uso de SRP para controlar
el estado electrónico del citocromo c y observaron una disminución
del ángulo de resonancia a medida que la proteína pasaba desde el
estado oxidado al reducido, indicando un cambio conformacional
asociado. Sin embargo, estos ejemplos no suponen una unión
ligando-receptor.
Un inconveniente del análisis SPR de
interacciones ligando/receptor es que el cambio de masa tras la
unión debe ser suficientemente grande para ser detectado como un
cambio del índice de refracción. La SPR es normalmente usada para
controlar la unión de ligandos relativamente grandes a receptores
inmovilizados (por ejemplo, unión de anticuerpo/antígeno). Esta
unión va acompañada de un aumento relativamente grande de la señal
porque el aumento significativo de masa del complejo da lugar a un
cambio grande del índice de refracción. Aunque los instrumentos
como el Bioacore® son bastante sensibles, la unión de ligandos muy
pequeños a la superficie normalmente no es detectable porque el
aumento de masa es demasiado pequeño para ser detectado como un
aumento del índice de refracción. Un ejemplo de una reacción de
unión que se esperaría que estuviera por debajo de los límites de
detección de los instrumentos SPR actualmente disponibles (basado
en el aumento mínimo de masa tras la unión) es la unión de calcio a
calmodulina (CaM). Por esta razón, son descritos ensayos
alternativos como el ensayo de fluorescencia descrito por T. L.
Blair et al. (1994, Anal. Chem. 66, 300-302)
que no involucran SPR han sido usados para estudiar los cambios
conformacionales tras la unión de CaM/calcio. Los ensayos SPR para
el análisis de la unión de CaM se han limitado hasta ahora a
sistemas en los que el calcio media la unión de CaM en solución a
un oligopéptido inmovilizado, como se describe por T. Ozawa et
al. (1999. Biochim Biophys. Acta 1434, 211-220)
y E. Takano et al. (1994. FEBS Lett. 352,
247-250). En estos sistemas el uso de CaM (peso
molecular \sim 17000) como la molécula en solución hace que sea
detectable la interacción por métodos SPR convencionales.
Los sensores de retículos de períodos largos
(LPG) por fibra óptica han sido usados para la detección de dianas
biológicas aplicando revestimientos de afinidad a la superficie de
las fibras (M. E. Jones et al., NSF Design and Manuf.
Research Conf., Vancouver, Poster Numbers SBIR-510).
El LPG dispersa la luz a una longitud de onda particular basada en
el período del retículo, el índice de refracción de la fibra y el
índice de refracción del medio circundante. A medida que el
revestimiento de afinidad absorbe la molécula diana, el índice de
refracción cambia y provoca una variación de la longitud de onda de
la luz dispersada "observada" por el LPG. Los autores exponen
la detección de \beta-galactosidasa enlazada a un
revestimiento de afinidad basado en ligandos (anticuerpos
policlonales) como una variación de la longitud de onda, sin
embargo, esta unión produce un cambio relativamente grande de la
masa pero no da lugar a un cambio conformacional del receptor.
La técnica anterior no ha descrito el uso de
métodos de refracción superficial como éstos para el análisis de
la unión de ligandos a receptores alostéricos. Aunque la unión
CaM/Ca es alostérica, los estudios de unión de CaM anteriormente
descritos no la detectan porque el calcio se une a CaM antes de la
unión del complejo al oligopéptido inmovilizado. La unión del
complejo al oligopéptido, que es la unión que está siendo
detectada, no es alostérica.
Bohrman B. et al., J Struct Biol. 2000
junio; 130(2-3): 232-46
expone un método de selección de moléculas sintéticas para
determinar la capacidad de retrasar la formación de fibrillas (por
auto-organización) de
amiloide-\beta (A\beta). El método comprende
medir las afinidades de unión de moléculas pequeñas a fibrillas
A\beta y monómero A\beta42 variante usando SPR. Sin embargo,
el péptido A\beta o la fibrilla A\beta, tras la unión de las
moléculas pequeñas, no experimenta un cambio conformacional sino
que en lugar de ello queda impedido para la formación de más
fibrillas. El método se basa en el cambio de masa de la fibrilla en
crecimiento, no en el cambio de conformación del péptido (o
fibrilla) para proporcionar la señal de SPR.
El documento US 4.992.385 se dirige a métodos
para producir sensores que comprenden revestir con polímero una
superficie óptica adecuada y asociarla un par de elementos asociados
a la estructura óptica revestida con polímero. El documento US
4.992.385 sugiere un método para la detección de la formación de
complejos a través de cambios ópticos en la superficie tras la
unión de los elementos asociados. El documento US 4.992.385
menciona la detección de azúcar. Sin embargo, los receptores
sugeridos mencionados, por ejemplo, lecitinas, no son proteínas
alostéricas. La unión del par lecitina-azúcar es
análoga a la de la formación de un complejo
anticuerpo-antígeno y, por lo tanto, la unión es un
acontecimiento de cambio de masa que se produce sin cambio
conformacional.
Se ha encontrado ahora inesperadamente que los
cambios del índice de refracción pueden ser usados para detectar
la unión de ligandos a receptores inmovilizados cuando el receptor
(por ejemplo, una proteína de unión) o el complejo
receptor-superficie experimenta un cambio
conformacional tras unirse al ligando. El cambio conformacional es
detectable incluso cuando el ligando es pequeño y el receptor
grande, lo que no sería predecible basándose en el aumento de masa
tras la unión del ligando. Inesperadamente, la unión de estos
agentes de unión alostéricos a sus ligandos puede producir
desviaciones negativos en la respuesta óptica en SPR (es decir,
una disminución del ángulo de resonancia). Aunque no se desean
vinculaciones a ninguna teoría particular del modo en que funciona
la invención, los solicitantes creen que la reducción de la señal
tras la unión puede ser debida al "cierre" o
"agrupamiento" de la proteína de unión alrededor del ligando
cuando éste se une. Esto podría dar lugar a una disminución del
volumen hidrodinámico que es mayor que el aumento de masa tras la
unión. Contrariamente, ha sido observado un aumento de la respuesta
óptica tras la SPR cuando el agente de unión alostérico se
"abre" tras la unión del ligando. Esta respuesta puede dar
lugar a un aumento del volumen molecular debido a un cambio
conformacional que es más significativo que la masa añadida del
ligando. Sin embargo, el que el cambio del índice de refracción sea
positivo o negativo para cualquier par
ligando-receptor dado depende del método y la
instrumentación usados para hacer la determinación, ya que los
cambios observados en el LPG no siempre siguen los observados en la
SPR.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
un nuevo método óptico para detectar y analizar la unión de
receptores alostéricos a sus ligandos. Los métodos de la invención
son particularmente útiles para ligandos pequeños que no se
esperaría que fueran detectables por los cambios del índice de
refracción superficial porque no añaden una masa significativa tras
la unión.
La Fig. 1 ilustra los resultados usando los
métodos de la invención para la unión de maltosa a MBP, como se
describe en el Ejemplo 1.
La Fig. 2 ilustra los resultados usando los
métodos de la invención para la unión de sacáridos a GGPB, como se
describe en el Ejemplo 2.
La Fig. 3 ilustra los resultados usando los
métodos de la invención para la unión de iones de calcio a
transglutaminasa, como se describe en el Ejemplo 3.
La Fig. 4 ilustra los resultados usando los
métodos de la invención para la unión de iones de calcio a CaM,
como se describe en el Ejemplo 4.
La Fig. 5 ilustra los resultados usando los
métodos de la invención para la unión de glucosa a GGBP, como se
describe en el Ejemplo 5.
El término "receptor", como se usa en el
estado de la técnica, se refiere normalmente al mayor de los dos
elementos asociados de unión, y generalmente es el miembro del par
de unión que experimenta un cambio conformacional tras la unión.
El "ligando" es normalmente más pequeño que el receptor y está
unido por el receptor. Con respecto a los ensayos SPR según la
invención, es preferido que el receptor sea la molécula
inmovilizada y que el ligando sea la molécula en solución. Esta
configuración es opuesta a la que recomienda Biacore. Los métodos
de la invención pueden ser usados para detectar o analizar el
ligando o la interacción ligando-receptor, para
analizar la unión del ligando al receptor, o para analizar el
receptor. Normalmente, la detección de interacciones
ligando-receptor mediante cambios en el índice de
refracción depende del peso (o masa) molecular del ligando. Cuanto
mayor sea el ligando, mayor es el aumento de la señal tras la
unión. Los ensayos de ligandos pequeños que usan SPR para medir el
cambio del índice de refracción requieren generalmente un
instrumento muy sensible y caro como el Bioacore® 3000 (de
aproximadamente 250.000,00 dólares) o un ensayo indirecto que use
una proteína de unión competitiva grande. Sin embargo, se ha
encontrado ahora sorprendentemente que cuando el receptor
experimenta un cambio conformacional tras la unión (es decir,
cuando el receptor es alostérico), es posible detectar directamente
la unión incluso de un ligando de molécula pequeña mediante
cambios en el índice de refracción. Cuando se analiza por SPR, puede
ser observada una disminución de la señal tras la unión del
ligando a un receptor alostérico, aparentemente porque el receptor
se cierra o se bloquea tras la unión y así el volumen hidrodinámico
del complejo disminuye a pesar de la masa añadida de ligando.
Incluso para ligandos pequeños, el cambio de señal es de una
magnitud que puede ser detectada por instrumentos SPR menos
sensibles y por lo tanto menos caros y, por lo tanto, proporciona un
ensayo que es rápido, barato y que puede ser miniaturizado. Esto
es una mejora importante porque el instrumento Bioacore® 3000 está
limitado a detectar la unión de moléculas que son de \geq 180 Da
cuando se controla directamente el aumento de masa. Por lo tanto,
normalmente no puede ser detectada la unión de moléculas pequeñas
como un ion de calcio (40 Da). Usando los métodos de la presente
invención, cualquier reacción de unión alostérica, incluida la
unión de calcio a CaM o a transglutaminasa, puede ser detectada
usando una instrumentación más sencilla y menos
cara.
cara.
Cualquier medio conocido en la técnica para
controlar cambios en el índice de refracción puede ser usado en
los métodos de la presente invención. Preferentemente, el método
seleccionado controla los cambios del índice de refracción
superficial tras la unión de receptor-ligando, como
métodos basados en SPR o LPG.
Los receptores de la invención son
preferentemente alostéricos, es decir, cambian la conformación tras
la unión al ligando, ya sea en el propio sitio de unión o en
cualquier otro lugar en la molécula. Normalmente la unión
alostérica incluye el "cierre" del receptor alrededor del
ligando, pero para algunos receptores alostéricos, la unión del
ligando provoca la "apertura" de la conformación del receptor.
Los receptores de este tipo son denominados a menudo receptores
alostéricos o agentes de unión alostéricos e incluyen proteínas de
unión, como es bien conocido en la técnica. Ejemplos de estas
proteínas de unión incluyen la proteína de unión a maltosa (MBP),
proteína de unión a glucosa (GBP), otras proteínas que se unen a
azúcares pequeños, proteínas de unión periplasmática, CaM y
transglutaminasa, sin embargo, muchas otras proteínas de unión con
las propiedades apropiadas para ser usadas en la invención, como se
describe en la presente memoria descriptiva, son conocidas por los
expertos en la técnica. Los receptores alostéricos adicionales, si
no se conoce ya que son alostéricos, pueden ser fácilmente
evaluados para ser usados en la invención sin el ejercicio de una
actividad inventiva usando el receptor en los métodos de la
invención y determinando si se observa o no un cambio en la señal
de SPR tras la unión a un ligando pequeño. Esta técnica de selección
proporcionará rápidamente información acerca de si los cambios
conformacionales se están produciendo y sobre si el receptor
seleccionado y su ligando pueden ser analizados usando los métodos
de la invención. El receptor alostérico puede ser de cualquier
tamaño, masa o peso molecular, pero es preferentemente grande con
relación al ligando seleccionado, de forma que el cambio en el
volumen hidrodinámico tras la unión es también relativamente
grande. Los receptores alostéricos grandes son normalmente mayores
que un peso molecular de aproximadamente 15.000, a menudo entre un
peso molecular de aproximadamente 15.000 y un peso molecular de
aproximadamente 100.000, pero pueden ser útiles en la invención
receptores de otros pesos moleculares, dependiendo del tamaño del
ligando seleccionado y el alcance del cambio conformacional. Los
ligandos para ser usados en la invención son preferentemente, pero
no necesariamente, menores que un peso molecular de aproximadamente
1500, más preferentemente un peso molecular de aproximadamente
30-400, e incluyen aminoácidos y péptidos,
nucleótidos y oligonucleótidos, azúcares, iones y otros restos
pequeños conocidos en la técnica. Los ligandos preferidos producen
un cambio relativamente grande en la conformación del receptor
tras la unión. Debe apreciarse que los métodos de la presente
invención no dependen de los tamaños relativos absolutos del
ligando y su receptor. De más importancia es que un ligando
seleccionado es pequeño con relación a la magnitud del cambio
conformacional en el receptor tras la unión. Es decir, la unión de
un ligando pequeño a un receptor relativamente pequeño puede ser
detectada usando los métodos de la invención si el cambio
conformacional en el receptor tras la unión es
grande.
grande.
Sin limitar el alcance de la invención, los
solicitantes suponen que el cambio de la señal del índice de
refracción observado cuando un agente de unión alostérico se une a
su ligando puede ser debido al menos parcialmente al cambio
conformacional asociado en el receptor. Es decir, una disminución
del volumen hidrodinámico del agente de unión alostérico o receptor
cuando se "cierra" en un ligando puede ser mayor que el cambio
de masa provocado por la adición del ligando. Esto da lugar a una
disminución neta del volumen del complejo y una disminución neta
del índice de refracción. Análogamente, un aumento del índice de
refracción observado para los agentes de unión alostéricos que se
"abren" tras la unión a sus ligandos puede ser debida a un
aumento del volumen hidrodinámico que es mayor que la masa añadida
del ligando. Este fenómeno no ha sido previamente reconocido en
estudios que usan el índice de refracción y no fue previamente
apreciado o esperado que el cambio del índice de refracción
asociado con la unión alostérica proporcionara una detección
sencilla de la unión de receptor/ligando incluso cuando el ligando
es
pequeño.
pequeño.
Se preparó MBP a partir de lisados de choques
osmóticos y se acopló a un chip (Biacore) CM5
(carboximetil-dextrano) usando procedimientos
estándar EDC/NHS realizados con reactivos del estuche de ensayo de
acoplamiento EDC/NHS. La MBP era 10 \muM a pH 4,5 en NaOAc 10 mM.
Se usó Solución salina tamponada con Hepes-PE
(HBS-EP: HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3
mM, 0,005% de tensioactivo P20; Biacore® AB) fue usado como
eluyente (O'Shannessy et al., 1992) complementado con
CaCl_{2} 5 mM. Se usó etanolamina (1,0 M, pH 8,0) para inactivar
los ésteres sin reaccionar y se encontró también que era eficaz
para separar la proteína adsorbida de forma no covalente de la
superficie del chip. Se prepararon soluciones de maltosa en
dH_{2}O a las concentraciones deseadas. Las inyecciones de
maltosa fueron de 20 \mul a un caudal de 10 \mul/minuto (tiempo
de contacto de 2 minutos). Se recogieron puntos de información a
100 segundos después de la inyección. Se restaron los puntos de
información de las inyecciones sobre una superficie en blanco.
Fueron desechados los puntos de datos para los datos recogidos
durante anomalías obvias, como burbujas de aire. El tampón utilizado
fue HBS-EP (Biacore) complementado con CaCl_{2}
5 mM.
La maltosa unida fue separada por medio de una
inyección de 20 \mul de glucosa 100 mM en NaOAc 10 mM a pH 4,5.
La glucosa fue recristalizada una vez en agua en forma del
monohidrato para separar posibles impurezas de maltosa. Después de
la regeneración, se dejó que la superficie se estabilizara durante
300 segundos antes las inyecciones adicionales de ligando.
La inyección de una solución de maltosa sobre la
superficie de MBP dio lugar a una disminución neta reproducible de
RUs, en contraste con el cambio positivo de RUs que habría que
esperar para la constitución de masa de maltosa sobre la MBP
inmovilizada. Se usó una superficie que portaba 2800 RUs de MBP
para la inyección de una serie de soluciones de maltosa de
concentraciones variables (Fig. 1). Se midió la respuesta a estas
soluciones y se determinó una respuesta máxima media aparente de
0,3 \muM. La constante de disociación (Kd) para la unión de
maltosa a MBP en solución se informó que era de aproximadamente 1
\muM (J. Thomson et al., 1998, Biophys. Chem. 70,
101-108). La analogía de estos valores sugiere un
acontecimiento específico de unión de ligando-
receptor.
receptor.
Se preparó proteína de unión de glucosa/galactosa
(GGBP) a partir de lisados de choque osmótico y se acopló a la
superficie del chip CM5 a 20 \muM y pH 4,5 en NaOAc 10 mM usando
procedimientos estándar NHS/EDC. Se usó etanolamina (1,0 M, pH 8,0)
para inactivar los ésteres sin reaccionar y se encontró también que
era eficaz para separar la proteína adsorbida de forma no covalente
de la superficie del chip. Se mantuvo el flujo de tampón durante
una noche para separar GGBP unida de forma no covalente adicional
de la superficie antes de que se realizaran las inyecciones de
ligando. Se uso una superficie que portaba 2000 RU de GGBP para los
experimentos. Se prepararon ligandos en dH_{2}O a las
concentraciones deseadas. Las inyecciones fueron de 20 \mul a un
caudal de 10 \mul/minuto (tiempo de contacto de 2 minutos). Se
sustrajeron los puntos de información a partir de inyecciones sobre
una superficie en blanco. Las inyecciones típicas sobre la
superficie testigo en blanco proporcionaron señales mínimas (<
50 RU), pero fueron no obstante sustraídas. Las inyecciones de
ligando se repitieron 3-5 veces y el orden de
inyección fue invertido periódicamente. Fueron desechados los
puntos de datos para los datos recogidos durante anomalías obvias,
como burbujas de aire. Los datos restantes fueron sometidos a
ensayos Q y el error representa las desviaciones típicas sencillas.
Se usó un único conjunto de soluciones de azúcar para la inyección
sobre las superficies testigos y del ensayo. El tampón utilizado
fue HBP-EP (Biacore) complementado con CaCl_{2} 5
mM. Los ligandos de GGBP unidos fueron separados mediante
inyección de a-metil-manósido 10 mM
en NaOAc 10 mM, pH 4,5, o mediante un lavado con tampón habitual de
500-1000 segundos.
Una serie de sacáridos fue inyectada sobre la
superficie de GGBP (Fig. 2). Solamente la glucosa proporcionó una
respuesta negativa significativa en RU relativa. Otros
monosacáridos, disacáridos y polisacáridos (por ejemplo, maltosa,
maltotriosa, maltotetraosa y ciclodextrinas) proporcionaron un
aumento despreciable o ligeramente positivo en RU relativas cuando
fueron inyectados sobre la superficie de GGBP. Por tanto, la
respuesta de la superficie de SPR es congruente con la
especificidad de GGBP para la glucosa encontrada en estudios de
soluciones. Esto demuestra también un método para distinguir
acontecimientos de unión no específica (respuesta de RU positiva)
a partir de acontecimientos de unión específica (respuesta de RU
negativa).
Se obtuvo transglutaminasa de tejidos (tTG) de la
empresa Sigma y se preparó a 1,3 mg/ml a pH 4,5 en NaOAc 10 mM. Se
preparó una superficie que portaba 2500 RU de tTG usando una
química estándar de acoplamiento EDC/NHS y se usó para todos los
experimentos. Se usó etanolamina (1,0 M, pH 8,0) para inactivar los
ésteres sin reaccionar. Se preparó cloruro de calcio en dH_{2}O a
las concentraciones deseadas. Las inyecciones fueron de 20 \mul
a un caudal de 10 \mul/minuto (tiempo de contacto de 2 minutos).
Los puntos de información fueron recogidos 100 segundos después de
la inyección. Fueron sustraídos los puntos de información de las
inyecciones sobre una superficie en blanco. Las inyecciones
normales sobre la superficie testigo en blanco proporcionaron
señales mínimas (< 5 RU), pero no obstante fueron sustraídas. Las
inyecciones fueron al azar con relación a la concentración. Los
puntos de datos fueron desechados para los datos recogidos durante
anomalías obvias, como burbujas de aire. El tampón utilizado fue
HBS-EP (Biacore) sin complemento de calcio. El
calcio fue separado de las transglutaminas mediante la inyección de
EDTA 5 mM, pH 8,0. Después de la inyección de EDTA, se dejó que se
estabilizara la superficie durante 300 segundos antes de las
inyecciones adicionales de calcio.
El calcio fue inyectado en una gama de
concentraciones. De forma interesante, la unión de calcio a tGT
indujo un cambio positivo en la respuesta (Fig. 3). La respuesta
máxima media de tTG fue similar a la Kd informada de calcio para
la proteína (experimental a 0,5 mM; valor informado de
aproximadamente 1 mM). El límite de detección para los ligandos del
instrumento Biacore más reciente (Biacore® 3000) es de
aproximadamente 180 Da. Por lo tanto, la unión de calcio (40 Da) es
efectivamente invisible para el instrumento. Sin embargo, el
cambio positivo de respuesta para tTG es congruente con el cambio
conformacional conocido que acompaña a la unión de iones. Mientras
que MBP, GGBP y CaM se conoce que se "cierran" sobre su
ligando con una disminución del radio hidrodinámico, la tTG
experimenta un cambio positivo del radio hidrodinámico tras la
unión de calcio (A. Di Venere et al., 2000. J. Biol. Chem.
275, 3915-3921).
Se obtuvo calmodulina de cerebro bovino (CaM) de
la empresa Calbiochem y se inmovilizó en superficies doradas de
carboximetil-dextrano usando una química estándar de
acoplamiento EDC/NHS de Biacore. Se usó HBS-EP
como eluyente. Se inyectó CaM a 0,5 mg/ml en acetato de sodio 10 mM,
pH 4,0 (inyección de 54 minutos). Este procedimiento inmovilizó
aproximadamente 480 RU de calmodulina. Durante las
inmovilizaciones, el caudal fue de 5 \mul/minuto. Para algunos
experimentos, se usó el Biacore® 3000. Para otros, se usó una
mejora de Biacore®. En general, las inyecciones se realizaron a un
caudal de 5 ó 10 \mul/minuto, en tampón HBP-EP.
Se inyectaron concentraciones variables de CaCl_{2} en
HBS-EP (3,5-50 mM) en las
superficies de CaM y en blando. Se observó una reducción de la
señal para todas las concentraciones.
Los resultados para CaCl_{2} 50 mM se ilustran
en la Fig. 4, mostrando una disminución de RU tras la unión. Para
superficies tanto de CaM como el blanco, la señal de fondo es
elevada y conduce a un aumento de RU durante la propia inyección.
Sin embargo, la señal sobre la superficie en blanco (1502 RU) es
mucho mayor que la señal sobre la superficie de CaM (1350 RU). Para
las diversas concentraciones de CaCl_{2} ensayadas, la magnitud
de la respuesta aumentó con la concentración creciente de
CaCl_{2}, sugiriendo que este ensayo puede ser usado para
cuantificar el ion de calcio.
Se obtuvieron sensores de fibras LPG con una
superficie modificada de CMD
(carboximetil-dextrano) de la empresa Luna
Innovations, Inc. (Blacksburb, VA). La superficie de la fibra fue
activada mediante inoculación de detector de LPG durante una hora
con una solución compuesta por 37 mg/ml de EDC y 7,5 ml/ml de NHS
en MES 20 mM, pH 6,8. El sensor activado fue lavado con MES 20 mM,
pH 6,8, y NaOAc 10 mM, pH 5,0, seguidamente fue transferido a una
solución de GGBP 20 \muM en NaOAc 10 mM y fue incubado durante
dos horas a temperatura ambiente. Después de aclarar con NaOAc 10
mM, los ésteres sin reaccionar en la superficie del sensor fueron
inactivados mediante exposición a solución de etanolamina 1 M, pH
9,0, durante una hora. Posteriormente, el sensor fue aclarado con
tampón de base (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Polisorbato 20 al 0,005%,
pH 7,4).
El control del sensor LPG se realizó a través de
un sistema Lunascan (Luna Innovations, Inc.), que consiste en un
espectrómetro, detector, controlador, ordenador portátil con
interfaz y mecanismo de interruptor para la interrogación de
múltiples sensores LPG. La comparación con un sensor LPG revestido
con CMD de referencia no expuesto a GGBP indicó un desplazamiento
de longitud de onda de aproximadamente 0,40 nm del sensor
modificado, debido a la inmovilización de la proteína.
Después de aclarar a fondo con el tampón de base
de HEPES, el sensor modificado y un sensor de referencia sin
modificar fueron expuestos a las siguientes soluciones (véase la
Tabla). Entre cada solución, las sondas fueron aclaradas con
tampón de base (HEPES). El trazado del canal de referencia fue
sustraído del canal de GGBP para corregir los efectos del índice de
refracción sobre el rendimiento del sensor. Los resultados indican
una respuesta detectable y reversible a los niveles de glucosa de 10
\muM y 1 mM (Fig. 5).
| Solución de reactivos | Tiempo (segundos) |
| \begin{minipage}[t]{70mm} HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, 0,005% de Polisorbato 20 (v/v), 7,4 \end{minipage} | 0 |
| Glucosa 10 \muM | 950 |
| Tampón de regeneración (\alpha-metil-manósido) | 1265 |
| Tampón HEPES | 1700 |
| Glucosa 1 mM | 1850 |
| Tampón de regeneración | 2100 |
| Tampón HEPES | 2290 |
La presente invención proporciona métodos para la
detección de moléculas pequeñas sin necesidad de competidores de
peso molecular elevado. Se ha encontrado ahora que la unión de
receptores que experimentan cambios conformacionales a un ligando
pequeño puede ser controlada directamente por los cambios en el
índice de refracción superficial. Estos cambios conformacionales
pueden ser usados para informar sobre la presencia de analitos de
peso molecular bajo. Los receptores que disminuyen el volumen
hidrodinámico tras la unión al ligando (por ejemplo, MBP, GGBP y
CaM) producen cambios negativos en el índice de refracción cuando
son analizados por SPR. Los receptores que aumentan el volumen
hidrodinámico tras la unión al ligando (por ejemplo, tTG) producen
un cambio positivo en el índice de refracción cuando son analizados
por SPR. El carácter positivo o negativo de la respuesta detectada
tras la unión a ligandos pequeños puede variar dependiendo del
método seleccionado para verificar el índice de refracción
superficial. Por ejemplo, el análisis por LPG de la unión de GGBP a
glucosa produjo una respuesta positiva en lugar de la respuesta
negativa observada sobre SPR.
Claims (7)
1. Un método para detectar o analizar la
formación de un complejo entre un ligando y un receptor alostérico
para el ligando en ausencia de competidores de peso molecular
elevado, que comprende las etapas de:
inmovilizar un receptor alostérico que
experimenta un cambio conformacional tras la unión del ligando;
unir el ligando a dicho receptor alostérico
inmovilizado en ausencia de competidores de peso molecular elevado
del ligando para formar el complejo; y
detectar la presencia del complejo midiendo un
cambio en el índice de refracción superficial, dicho cambio en el
índice de refracción superficial debido a la masa del ligando siendo
menor que un cambio en el índice de refracción superficial debido
al cambio conformacional del receptor alostérico inmovilizado tras
la unión del ligando.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el
receptor es una proteína de unión.
3. El método de la reivindicación 1, en el que la
presencia del complejo es detectada por un cambio en el ángulo de
resonancia sobre la resonancia de plasmón superficial o mediante un
cambio en una longitud de onda de luz dispersada.
4. El método de la reivindicación 1, en el que la
masa de ligando es menor que la masa de receptor.
5. El método de la reivindicación 1, en el que el
ligando se selecciona entre el grupo que consiste en aminoácidos,
péptidos, nucleótidos, oligonucleótidos, azúcares e iones.
6. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la formación de un complejo entre
el ligando y el receptor alostérico es indicativa de la unión del
ligando al receptor alostérico.
7. Un método para evaluar si un receptor es un
receptor alostérico, que comprende las etapas de:
inmovilizar el receptor que va a ser
evaluado;
unir el ligando a dicho receptor inmovilizado en
ausencia de competidores de peso molecular elevado del ligando,
teniendo dicho ligando una masa que no provoca un cambio en el
índice de refracción superficial tras unirse al receptor; y
determinar si el receptor es alostérico midiendo
un cambio en el índice de refracción superficial, dicho cambio en
el índice de refracción superficial siendo debido a un cambio
conformacional del receptor inmovilizado tras la unión del
ligando.
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