ES2250788T3 - Cubeta para un dispositivo lector para someter a ensayo sustancias utilizando el metodo de campo evanescente. - Google Patents
Cubeta para un dispositivo lector para someter a ensayo sustancias utilizando el metodo de campo evanescente.Info
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Abstract
Cubeta (10) para un dispositivo lector para ensayos que utiliza el método de campo evanescente que comprende: - al menos una parte (18) de pocillos que tiene al menos un pocillo (20) para alojar una disolución que contiene sustancias que van a someterse a ensayo; y - al menos una parte (24) de base que soporta elementos (22) de pared lateral de la parte (18) de pocillo y que proporciona una superficie (30) de excitación del pocillo (20); en la que la parte (24) de base se fabrica de un material ópticamente transparente y tiene una forma en sección transversal de un trapezoide isósceles en un plano (B-B) que corta perpendicularmente la superficie (30) de excitación del pocillo (20), teniendo el trapezoide lados (26S, 28S) primero y segundo de igual longitud y base paralela y lados (32S, 30S) superiores.
Description
Cubeta para un dispositivo lector para someter a
ensayo sustancias utilizando el método de campo evanescente.
La presente invención se refiere a una cubeta
para un dispositivo lector para someter a ensayo sustancias
utilizando el método de campo evanescente, a un método para preparar
una cubeta tratada para someter a ensayo sustancias y a un método
para someter a ensayo sustancias que utiliza dicha cubeta.
Los diagnósticos médicos, especialmente los
diagnósticos inmunológicos, se basan principalmente en el ELISA
(ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas). Puede encontrarse una
revisión reciente de ensayos inmunitarios en Hage, Anal. Chem. 71
(1999), 249R-304R. Se utiliza una prueba ELISA para
determinar la concentración de antígenos o anticuerpos. La sustancia
que se está estudiando (por ejemplo, un antígeno) se pone en primer
lugar en contacto con un sustrato sólido al que se acopla en primer
lugar un componente de reacción específico para la sustancia que se
está estudiando (por ejemplo, un anticuerpo). Uniendo la sustancia
que se está estudiando como el segundo componente de reacción al
primer componente de reacción acoplado al sustrato, se concentra la
sustancia que se está estudiando sobre el sustrato sólido. Luego, se
pone en contacto con el sustrato un tercer componente de reacción
(por ejemplo, otro anticuerpo) para la sustancia que se está
estudiando, y este tercer componente de reacción se marca con una
enzima, lo que permite la detección colorimétrica. Cuando este
tercer componente de reacción reacciona con (es decir, se une a) la
sustancia que se está estudiando acoplada a la superficie del
sustrato, se produce un producto coloreado a través de una reacción
enzimática que puede evaluarse ópticamente. Las placas de plástico
normalizadas, frecuentemente compuestas por poliestireno, con 96
pocillos se utilizan principalmente como el sustrato sólido. La
superficie de los pocillos de plástico une proteínas en el intervalo
de los nanogramos mediante absorción en una cantidad suficiente para
la detección inmunológica. Existen varias maneras de marcar el
tercer componente de reacción, que es principalmente una
inmunoglobulina, con una enzima. Los marcadores utilizados
comúnmente son, por ejemplo, peroxidasa o fosfatasa alcalina.
Los ELISA dan buenos resultados en cuanto a
sensibilidad y especificidad, y los límites de detección que pueden
alcanzarse están en el intervalo de los nanogramos o inferior a él.
Existe una amplia variedad de realizaciones de ensayos que se basan
en este principio. Con él, pueden detectarse antígenos o
anticuerpos, dependiendo de que cuestión sea.
Sin embargo, una desventaja importante del ELISA
es manejar la prueba, ya que se añaden diferentes reactivos a los
pocillos uno detrás de otro y deben retirarse de nuevo. Pueden ser
necesarias en conjunto diez o más etapas de pipeteado, lavado e
incubación. Por tanto, los ELISA llevan mucho tiempo y requieren
mucho trabajo y deben realizarse por personal especialmente
cualificado con gran cuidado. Otra desventaja del ELISA es el tiempo
que llevan todas las etapas de incubación y lavado para un ensayo o
prueba, lo que normalmente dura una hora o más.
Con el método de campo evanescente, puede
observarse directamente, por ejemplo, la interacción de biomoléculas
sobre una superficie. Aquí, la interacción de reactivos en
disolución se mide con una superficie de matriz sólida. Es posible
medir la unión de los ligandos físicamente como "resonancia de
plasmón superficial" en "tiempo real". Las ventajas
comparado con un ELISA son la eliminación de otras etapas de
pipeteado tras la adición de los reactivos y la eliminación de las
etapas de espera. En el pasado, se necesitaban aparatos caros y
chips detectores de múltiples capas con una química superficial
especial para tales mediciones. Estas desventajas evitan que el
método se utilice en diagnósticos de rutina.
Los métodos de campo evanescente para someter a
ensayo procesos de interacción bioquímica sobre superficies de
reacción emplea regularmente cubetas que tienen pocillos para alojar
la disolución que contiene las sustancias que van a analizarse. Para
numerosas aplicaciones diagnósticas y analíticas, sería preferible
una cubeta unidireccional o desechable, de modo que existe una
demanda significativa de cubetas de bajo coste. Sin embargo, al
mismo tiempo, las herramientas de análisis bioquímico deben ser
suficientes para requisitos crecientes concernientes a la
sensibilidad y la reproducibilidad. Por tanto, las cubetas deben
cumplir tanto prerrequisitos estrictos con respecto a los costes de
producción como las propiedades bioquímicas / ópticas.
El documento WO 01/14859 describe una cubeta para
un dispositivo lector para ensayos, dispositivo que comprende
características correspondientes al aparato de la invención. Sin
embargo, según la disposición de este dispositivo de la técnica
anterior, el haz luminoso entra en la parte de base de la cubeta por
un lado y sale de la base por el lado opuesto.
Por tanto, el problema técnico que subyace a la
presente invención es proporcionar una cubeta barata para un
dispositivo lector para someter a ensayo sustancias utilizando el
método de campo evanescente que tiene excelentes propiedades tanto
bioquímicas como ópticas, permitiendo ensayos sumamente sensibles,
reproducibles y rápidos. Además, debe proporcionarse un método para
preparar una cubeta, tratándose dicha cubeta de modo que esté lista
para utilizarla en diagnósticos de rutina.
La solución al anterior problema técnico se
consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las
reivindicaciones.
\newpage
En particular, se proporciona una cubeta para un
dispositivo lector para ensayos utilizando el método de campo
evanescente, que comprende:
- -
- al menos una parte de pocillo que tiene al menos un pocillo para alojar una disolución que contiene sustancias que van a someterse a ensayo; y
- -
- al menos una parte de base que soporta elementos de pared lateral de la parte de pocillo y que proporciona una superficie de excitación del pocillo;
en la que la parte de base se
fabrica de un material ópticamente transparente y tiene una forma en
sección transversal de un trapezoide isósceles en un plano que corta
perpendicularmente la superficie de excitación del pocillo, teniendo
el trapezoide lados primero y segundo de igual longitud y lados de
base y superior
paralelos;
en la que la parte de base comprende además
- -
- una superficie de base que está separada de y es paralela a la superficie de excitación, siendo la sección transversal de la superficie de base en dicho plano el lado de base del trapezoide;
- -
- una primera superficie para recibir un haz luminoso de excitación de una fuente luminosa de excitación externa, siendo la sección transversal de la primera superficie en dicho plano el primer lado del trapezoide; y
- -
- una segunda superficie opuesta a la primera, siendo la sección transversal de la segunda superficie en dicho plano el segundo lado del trapezoide;
y en la que la parte de base se
adapta para guiar el haz luminoso de excitación al menos
parcialmente a lo largo de una trayectoria óptica circular desde un
punto de incidencia sobre la primera superficie a través de
reflexiones sobre la superficie de excitación, la segunda superficie
y la superficie de base de vuelta hasta el punto de
incidencia.
Preferiblemente, el ángulo \alpha de incidencia
del haz luminoso de excitación incidente sobre la primera superficie
se elige de modo que cumpla los criterios de Brewster tan \alpha =
n_{2} / n_{1}, en el que n_{2} es el índice de refracción de
la parte de base y n_{1} es el índice de refracción del entorno,
por ejemplo aire (n_{1} = 1). Si el haz luminoso de excitación se
polariza linealmente en su plano de incidencia, no se producirá
ninguna reflexión del haz luminoso de excitación sobre la primera
superficie de la parte de base. En su lugar, el haz luminoso de
excitación se refractará con un ángulo \beta de refracción en la
parte de base.
Posteriormente, el haz luminoso de excitación se
refleja preferiblemente en su totalidad por la superficie de
excitación del pocillo, es decir, la interfase entre la parte de
base y la disolución que contiene las sustancias que van a someterse
a ensayo. El haz luminoso de excitación reflejado por la superficie
de excitación produce un campo evanescente electromagnético que
penetra en el pocillo. El campo evanescente decae exponencialmente
en una dirección normal a la superficie de excitación en el pocillo.
En una región adyacente a la superficie de excitación, las
sustancias que van a someterse a ensayo se excitarán ópticamente
mediante el campo evanescente de modo que puede observarse una señal
de fluorescencia. Como el campo evanescente decae rápidamente en el
pocillo, la región de excitación se restringe a un espacio de no más
de normalmente 100 nm desde la superficie de excitación en el
pocillo. Por tanto, no se producirá la excitación óptica de las
sustancias en el volumen de la disolución.
Posteriormente, el haz luminoso reflejado chocará
contra la segunda superficie de la parte de base. Si el plano de
polarización del haz luminoso permanece inalterado (es decir,
permanece idéntico al plano de polarización del haz luminoso de
excitación incidente sobre la primera superficie), el haz luminoso
completo se refractará sobre la segunda superficie y abandonará la
parte de base. Sin embargo, muchos materiales que pueden utilizarse
para fabricar la parte de base son birrefringentes, de modo que el
plano de polarización del haz luminoso reflejado incidente sobre la
segunda superficie no corresponderá a plano de polarización inicial.
En este caso, el haz luminoso incidente sobre la segunda superficie
se reflejará parcialmente sobre la segunda superficie. Este haz
luminoso reflejado se propagará posteriormente en una dirección
hacia la superficie de base de la parte de base y preferiblemente se
reflejará en su totalidad sobre la superficie de base.
Según la presente invención, la forma trapezoidal
de la parte de base y el índice de refracción n_{2} de la parte de
base se seleccionan de modo que el haz luminoso reflejado por la
superficie de base choque contra la primera superficie
sustancialmente en el mismo punto o zona de incidencia que el haz
luminoso de excitación de entrada inicial. En otras palabras, el haz
luminoso se refleja y guía en la parte de base de tal manera que se
produzca una trayectoria óptica circular cerrada. El haz luminoso se
reflejará por la superficie de excitación, la segunda superficie y
la superficie de base de vuelta a la primera superficie, en este
orden. El haz luminoso reflejado por la parte de base se reflejará
parcialmente de nuevo por la primera superficie y se propagará a lo
largo de la misma trayectoria óptica circular que el haz luminoso de
excitación refractado en la primera superficie. El haz luminoso
reflejado por la superficie de base también se refractará
parcialmente por la primera superficie de modo que abandone la parte
de base.
Este diseño óptico especial de la parte de base
ofrece ventajas significativas en comparación con los diseños de
cubeta convencionales. En particular, la longitud de trayectoria de
la trayectoria de propagación del haz luminoso de excitación en la
parte de base es relativamente corta, en comparación con las
longitudes de trayectoria de los haces luminosos de excitación en
cubetas convencionales. Ya que la parte de base de cualquier cubeta,
especialmente una cubeta desechable de bajo coste, se fabricará de
un material, por ejemplo plástico, que tiene impurezas o defectos
ópticos, es preferible una longitud de trayectoria corta del haz
luminoso de excitación en la parte de base. Una longitud de
trayectoria larga dará como resultado una intensidad luminosa
parásita mayor de luz dispersada por las impurezas ópticas. Esta luz
parásita puede entrar en el pocillo y excitar sustancias en el
volumen de la disolución. Esto produce una señal de fondo parásita
que reduce la razón señal-ruido de la señal de
fluorescencia que va a detectarse. Otra ventaja de la cubeta según
la presente invención reside en el hecho de que, en comparación con
cubetas convencionales, la cubeta permite un ángulo de detección
relativamente grande, es decir la señal de fluorescencia puede
detectarse en un intervalo angular mayor.
Según una realización preferida, la altura H del
trapezoide viene dada por
H =
\frac{Asen(\beta - \gamma)}{2(- \ cos(\beta - \gamma) + sen(\beta -
\gamma) \
tan(\gamma))}
- \left(-
\frac{A}{2} + \frac{Asen(\beta - \gamma) tan(\gamma)}{2(- \
cos(\beta - \gamma) + sen \ (\beta - \gamma) \ tan(\gamma))}\right)
\ tan(\beta +
\gamma),
en la que (90º - \gamma) es el
ángulo de la base del trapezoide entre el lado de base y el primer
lado, n_{2} es el índice de refracción de la parte de base, A es
la longitud del lado superior del trapezoide
y
\beta \approx
arcsen
\left(\frac{sen(arctan(n_{2}))}{n_{2}}\right).
La altura H del trapezoide es la distancia entre
los lados superior y de base del trapezoide en una dirección
perpendicular al lado de base. La relación anterior se mantiene para
una cubeta que va a hacerse funcionar en un entorno gaseoso que
tiene un índice de refracción n_{1} = 1. Además, se supuso que el
haz luminoso de excitación incidente sobre la primera superficie de
la parte de base está orientado de modo que choque contra la primera
superficie con un ángulo de incidencia correspondiente al ángulo de
Brewster \alpha_{B} = arctan (n_{2}). \gamma es un ángulo de
inclinación del trapezoide que define el ángulo entre una dirección
normal al lado de base y los lados primero y segundo del trapezoide.
\beta es el ángulo de refracción del haz luminoso de excitación
refractado sobre la primera superficie de la parte de base.
Si el ángulo \alpha de incidencia del haz
luminoso de excitación sobre la primera superficie corresponde al
ángulo \alpha_{B} de Brewster, el ángulo \beta sólo depende
del índice de refracción n_{2} del material de la parte de base.
Para una longitud A del lado superior y un ángulo \gamma de
inclinación del trapezoide dados del trapezoide, puede calcularse la
altura H del trapezoide utilizando la fórmula anterior. Sin embargo,
debe observarse que el ángulo \alpha de incidencia del haz
luminoso de excitación no es necesario que se corresponda
exactamente con el ángulo \alpha_{B} de Brewster. En su lugar,
son posibles desviaciones angulares de \alpha con respecto al
ángulo \alpha_{B} de Brewster, pero darán como resultado una
disminución de la eficacia. El ángulo \alpha de incidencia se
elige preferiblemente para que sea el ángulo \alpha_{B} de
Brewster, ya que en este caso no se producirán pérdidas de reflexión
sobre la primera superficie si el haz luminoso de excitación se
polariza linealmente en su plano de incidencia. Si, por ejemplo, el
ángulo \alpha de incidencia del haz luminoso de excitación se
desvía del ángulo \alpha_{B} de Brewster en 10º, las pérdidas
debidas a reflexiones sobre la primera superficie del trapezoide
serán de orden del 1% de la intensidad inicial I_{0} del haz
luminoso de excitación incidente. Esto corresponde a aproximadamente
el mismo orden de magnitud que la parte de luz emitida por un diodo
láser semiconductor convencional que no se polariza linealmente. Por
tanto, es posible relajar la condición rigurosa anterior sobre el
ángulo \alpha de incidencia sin sacrificar una eficacia
sustancial.
Según una realización preferida de la presente
invención, el ángulo de reflexión del lado de base \delta = 90º -
(\beta + \gamma) es mayor que el arcsen (1 / n_{2}), siendo
n_{2} el índice de refracción de la parte de base y
\beta \approx
arcsen
\left(\frac{sen(arctan(n_{2}))}{n_{2}}\right).
A lo largo de la trayectoria óptica circular del
haz luminoso de excitación en la parte de base de la cubeta, el haz
luminoso se refleja preferiblemente en su totalidad (internamente)
sobre la superficie de base de la parte de base. Para este fin, el
ángulo \delta de reflexión del lado de base (ángulo entre una
dirección normal al lado de base y el haz luminoso incidente sobre
el lado de base) tiene que ser mayor que el arcsen (1 / n_{2}). El
ángulo \delta de reflexión del lado de base es una función del
ángulo \beta de refracción del haz luminoso reflejado sobre la
primera superficie.
Según una realización preferida de la presente
invención, el ángulo de reflexión del lado de excitación
\varepsilon = 90º - (\beta - \gamma) es mayor que el arcsen (1
/ n_{2}), siendo n_{2} el índice de refracción de la parte de
base y
\newpage
\beta \approx
arcsen
\left(\frac{sen(arctan(n_{2}))}{n_{2}}\right).
De manera similar a la realización descrita
anteriormente, también se prefiere enormemente que el haz luminoso
de excitación se refleje en su totalidad (internamente) por la
superficie de excitación de la parte de base. En este caso, sólo el
campo evanescente electromagnético excitará ópticamente las
sustancias que van a analizarse en un espacio muy próximo a la
superficie de excitación. No se producirá una excitación de
sustancias en el volumen del pocillo. Por tanto, es preferible que
el ángulo \varepsilon de reflexión del lado de excitación sea
mayor que el arcsen (1 / n_{2}). El ángulo de reflexión del lado
de excitación es el ángulo entre el haz luminoso de excitación que
choca contra la superficie de excitación y una dirección normal a la
superficie de excitación.
Según otra realización preferida de la presente
invención, el trapezoide es sustancialmente un rectángulo que tiene
una altura H y una anchura A y A / H \approx n_{2}. Debe
entenderse que la forma rectangular de la parte de base en un plano
en sección transversal paralelo a la dirección normal a la
superficie de excitación también debe englobar pequeñas desviaciones
angulares (unos cuantos grados) desde una forma rectangular
perfecta. La relación de la anchura A y la altura H del rectángulo
se elige en este caso preferiblemente para que corresponda al índice
de refracción n_{2} de la parte de base. Esta relación se mantiene
siempre que el ángulo \alpha de incidencia del haz luminoso de
excitación incidente se elija para que corresponda al ángulo de
Brewster arctan (n_{2}).
La cubeta de la presente invención se fabrica de
un material ópticamente transparente, preferiblemente en el
intervalo de longitud de onda de desde 600 hasta 700 nm, tal como
vidrio, cuarzo, siliconas o polímeros transparentes o cualquier
combinación de estos materiales. La cubeta contiene especial y
preferiblemente un plástico, tal como poliestireno, una poliolefina
tal como polipropileno, polietileno, poli(tereftalato de
etileno), una policicloolefina, poliacrilonitrilo,
poli(metacrilato de metilo), policarbonato, SAN, copolímero
de olefina cíclica (COC; distribuido como ejemplo bajo los nombres
de marca TOPAS o ZEONEX) y/o mezclas o combinaciones de estos
plásticos. En principio, es adecuado cualquier plástico o resina que
básicamente no absorba luz en el intervalo espectral de interés (por
ejemplo, el intervalo visible) y preferiblemente permita la
aplicación de un recubrimiento adecuado para, en particular, la
unión de moléculas fluorescentes. El material puede contener
aditivos para mejorar las características de procesamiento, en
particular, para el moldeo por inyección. Ya que se conocen las
relaciones de dispersión de los materiales anteriores, puede
realizarse mediante cálculos cualquier ajuste necesario de las
dimensiones de tamaño del pocillo y las partes de base. En una forma
de realización, el plástico también puede teñirse, por ejemplo azul
claro, con el fin de filtrar cualquier emisión producida por la luz
dispersada. En las longitudes de onda de interés, preferiblemente la
parte de base es ópticamente transparente mientras que la parte de
pocillo puede fabricarse de un material opaco o que absorbe luz. Las
cubetas de plástico pueden obtenerse de manera barata mediante
moldeo por inyección y preferiblemente tienen un volumen de reacción
de 1 a 400 \mul, y se prefiere especialmente de 5 a 200 \mul.
Preferiblemente, la cubeta de la presente invención se fabrica de
una pieza. También puede ser una ventaja que la superficie interna
y/o de emisión, es decir la superficie desde la que sale el haz
emitido de la cubeta, se pula(n) hasta una rugosidad
superficial de preferiblemente 10 nm como máximo.
Preferiblemente, la parte de pocillo y la parte
de base se forman unitariamente. Por ejemplo, las partes de pocillo
y de base pueden formarse mediante moldeo por inyección.
Alternativamente, también es posible formar por separado la parte de
pocillo y la parte de base y ensamblar estas partes utilizando, por
ejemplo, un adhesivo que tiene un índice de refracción que coincide
con el índice de refracción de la parte de base. Preferiblemente,
las partes de pocillo y de base se forman de un material que
comprende polímeros tales como los enumerados anteriormente. Según
otra realización preferida de la presente invención, la cubeta
comprende una pluralidad de partes de pocillo. Por ejemplo, las
partes de pocillo pueden disponerse linealmente en una cubeta con
forma de barra, de modo que puede realizarse una pluralidad de
ensayos con una única cubeta. Preferiblemente, se proporciona una
única parte de base para la pluralidad de partes de pocillo.
Ahora se describirá la presente invención a modo
de ejemplo junto con los dibujos adjuntos. En las figuras:
Figura 1(a) una vista desde arriba de una
realización preferida de una cubeta según la invención;
Figura 1(b) una vista en sección
transversal de la cubeta a lo largo de la línea A-A
en la figura 1(a);
Figura 1(c) una vista lateral del lado del
extremo inferior de la cubeta mostrada en la figura 1(a);
Figura 1(d) una vista en sección
transversal a lo largo de la línea B-B de la figura
1(a);
Figura 1(e) una vista en sección
transversal de la cubeta a lo largo de la línea C-C
de la figura 1(a);
Figura 1(f) vistas en perspectiva de la
cubeta mostrada en la figura 1(a);
Figura 2 un dibujo esquemático de una parte de
base de una cubeta según otra realización preferida de la presente
invención, en la que la trayectoria óptica del haz luminoso se
representa esquemáticamente;
\newpage
Figura 3 una vista esquemática de una realización
del método para someter a ensayo sustancias utilizando la cubeta de
la presente invención;
Figura 4 cinética de la unión de
biotina-HRP a una superficie de estreptavidina;
Figura 5 una valoración de IgG de ratón en un
ensayo ELISA (A) y de fluorescencia (B); y
Figura 6 una valoración de IgG de ratón en
diferentes matrices.
En la figura 1(a), se muestra una
realización preferida de la cubeta según la presente invención. La
cubeta 10 tiene sustancialmente forma de barra y tiene una parte 12
de mango para manejar y montar la cubeta 10 en un lector. Tal como
se muestra en la figura 1(b), la parte 12 de mango tiene una
cavidad 14 formada en ella. Opuesta a la parte 12 de mango de la
cubeta 10, se forma una parte 16 de análisis. La parte 16 de
análisis tiene una pluralidad de partes 18 de pocillo que tienen
pocillos 20 para alojar una disolución que contiene sustancias que
van a analizarse. Las paredes 22 laterales de los pocillos 20 se
soportan por una parte 24 de base que se extiende por toda la parte
16 de análisis. En la realización preferida mostrada en la figura 1,
la parte 24 de base se forma de manera integral con la parte 18 de
pocillo. Preferiblemente, la cubeta se moldea por inyección y
consiste en, por ejemplo, Polystyrene 158 K.
En la figura 1(d), se representa una vista
en sección transversal de la cubeta a lo largo de la línea
B-B de la figura 1(a). La sección transversal
se toma en un plano que corta una superficie 30 de excitación de un
pocillo 20 de la parte 18 de pocillo en ángulos rectos, es decir, el
plano de la sección transversal es paralelo a la dirección normal a
la superficie 30 de excitación. La parte 24 de base de la cubeta 10
tiene una primera superficie 26 para recibir un haz luminoso de
excitación de una fuente luminosa de excitación externa (no
representada). Se dispone una segunda superficie opuesta a la
primera superficie 26. La parte inferior de la parte 24 de base está
formada por una superficie 32 de base que está separada de y es
paralela a la superficie 30 de excitación. En la sección transversal
mostrada en la figura 1(d), la parte 24 de base de la cubeta
10 tiene la forma de un trapezoide isósceles. Haciendo referencia
también a la figura 1(d) y la figura 2, el lado 30S superior
del trapezoide está formado por la superficie 30 de excitación
extendida a lo largo de los elementos 22 de pared lateral de la
parte 18 de pocillo. El lado 32S de base del trapezoide está formado
por la superficie 32 de base. El primer lado 26S y el segundo lado
28S de igual longitud del trapezoide están formados por la primera
superficie 26 y la segunda superficie 28, respectivamente. Se
utilizarán los números de referencia 26, 28, 30 y 32 cuando se hace
referencia a las superficies y se utilizarán los números de
referencia 26S, 28S, 30S y 32S para los lados o patas del
trapezoide.
Los lados 26S, 28S primero y segundo del
trapezoide están inclinados en un ángulo \gamma de 2º con respecto
a una dirección normal al lado 30S superior o el lado 32S de base.
Esta pequeña inclinación de las superficies 26 y 28 primera y
segunda de la parte 24 de base ayuda a extraer la cubeta del molde
de inyección tras el moldeo.
La figura 2 muestra una vista esquemática en
sección transversal de una parte 24 de base de una cubeta según otra
realización preferida de la presente invención. En la figura 2, se
representa la trayectoria óptica de un haz 34 luminoso de excitación
de una fuente luminosa de excitación externa, preferiblemente un
diodo láser semiconductor. La primera superficie 26 de la parte 24
de base recibe el haz 34 luminoso de excitación. Preferiblemente, el
ángulo \alpha de incidencia del haz 34 luminoso de excitación
incidente corresponde al ángulo de Brewster \alpha_{B} = arctan
(n_{2} / n_{1}), en el que n_{2} es el índice de refracción
de la parte 24 de base y n_{1} es el índice de refracción del
entorno circundante, normalmente aire. En este caso n_{1} = 1.
Sobre la superficie 30 de excitación (lado 30S
superior) se forma un pocillo 20 para alojar una disolución que
contiene sustancias que van a someterse a ensayo. La parte 18 de
pocillo no se muestra, con el fin de simplicidad, en la figura 2.
Sin embargo, debe entenderse que la superficie 30 de excitación será
funcionalmente la interfase entre la parte 24 de base que tiene el
índice de refracción n_{2} y la disolución que tiene un índice de
refracción n_{3} en el pocillo 20.
El haz 34 luminoso de excitación se refracta
sobre la primera superficie 26 (primer lado 26S en la figura 2) del
trapezoide. El haz luminoso refractado choca posteriormente contra
la superficie 30 de excitación (lado 30S superior en la figura 2),
donde se refleja internamente en su totalidad de modo que se
propague en la dirección de la segunda superficie 28. Si el haz 34
luminoso de excitación incidente se polariza linealmente de manera
perfecta en su plano de incidencia, no se producirán reflexiones en
el haz 34 luminoso de excitación de entrada sobre la primera
superficie 26. Además, en condiciones ópticas ideales (el material
de la parte 24 de base no es birrefringente), el haz 34 luminoso de
excitación abandonará la parte 24 de base refractándose sobre la
segunda superficie 28. Sin embargo, los materiales habituales para
la parte 24 de base son birrefringentes, de modo que se alterará el
plano de polarización del haz luminoso de excitación. Por tanto, se
producen reflexiones parciales del haz 34 luminoso sobre la segunda
superficie 28. El haz luminoso reflejado se propaga en la dirección
de la superficie 32 de base (lado 32S de base), donde se refleja
preferiblemente en su totalidad.
La parte 24 de base se diseña de tal manera que
el haz luminoso reflejado por la superficie 32 de base choca contra
la primera superficie 26 sustancialmente en el mismo punto o zona en
el que inicialmente choca el haz 34 luminoso de excitación de
entrada contra la primera superficie 26. En otras palabras, la
altura h de acoplamiento que es la distancia entre la superficie 30
de excitación (lado 30S superior) y el punto de incidencia del haz
34 luminoso de excitación de entrada en una dirección normal al lado
30S superior, es la misma altura bajo la que el haz luminoso
reflejado por la superficie 32 de base choca contra la primera
superficie 26. Por tanto, la parte 24 de base de la cubeta 10 se
diseña de tal manera que un haz 34 luminoso de excitación incidente
se guía en la parte 24 de base a lo largo de una trayectoria óptica
circular (cerrada) que tiene idénticos puntos / zonas de inicio y
finalización. Debe entenderse que el haz 24 luminoso de excitación
mostrado en la figura 2 se simplifica hasta el grado de que el haz
luminoso de excitación real tendrá una anchura de haz finita. La
anchura del haz se ajusta preferiblemente de modo que excite una
zona predeterminada de la superficie 30 de excitación. También para
un haz 34 luminoso de excitación de luz paralela que tiene una
anchura de haz finita, se mantienen los criterios de la trayectoria
óptica circular anterior.
La trayectoria óptica circular en la parte 24 de
base de la cubeta 10 tiene numerosas ventajas en comparación con las
cubetas convencionales. Por ejemplo, la longitud de trayectoria de
la trayectoria óptica circular (2l + 2k para un recorrido circular,
véase la figura 2) es considerablemente más corta que la longitud de
trayectoria en cubetas convencionales. Reducir la longitud de
trayectoria de la trayectoria óptica en la cubeta supone una
reducción de la intensidad de la luz dispersada en las impurezas que
están presentes inevitablemente en la parte 24 de base. Además, el
diseño de la parte 24 de base permite una mayor visualización o
ángulo de detección para recoger / detectar la luz de fluorescencia.
Mientras que en los diseños de las cubetas convencionales, la
fluorescencia sólo puede detectarse en un intervalo angular
relativamente pequeño, el ángulo de detección de una cubeta 10 según
la invención puede ser mayor, dando como resultado una señal de
fluorescencia mejorada. Además, la forma trapezoidal de la parte 24
de base es relativamente fácil de fabricar utilizando técnicas de
moldeo por inyección conocidas en la técnica. En particular, las
superficies 26 y 28 primera y segunda de la parte 24 de base no
necesitan pulirse necesariamente de manera óptica ya que la
precisión de la técnica de moldeo por inyección será suficiente con
regularidad para una superficie ópticamente plana.
A continuación, haciendo referencia a la figura
2, se describirá un procedimiento de diseño preferido de una
realización preferida de la presente invención:
Con el fin de obtener reflexiones internas
totales del haz 34 luminoso de excitación por las superficies 30, 32
de excitación y de base de la parte 24 de base, el ángulo
\varepsilon de la superficie de excitación y el ángulo \delta de
la superficie de base deben ser mayores que los respectivos ángulos
críticos para las reflexiones totales. Por tanto,
\varepsilon
(\beta, \gamma) \ > \ \varepsilon
_{min}
\delta (\beta,
\gamma) \ > \ \delta
_{min'}
en las
que
\varepsilon
(\beta, \ \gamma) = 90 ^{o} \ - \ (\beta \ - \
\gamma);
\delta (\beta,
\ \gamma) = 90 ^{o} \ - \ (\beta \ + \
\gamma);
y
\delta (\beta,
\ \gamma) = 90 ^{o} \ - \ (\beta \ + \
\gamma).
Los ángulos críticos para las reflexiones totales
son
\delta _{min}
= \ arcsen \ (n_{1} \ /
n_{2});
y
\varepsilon
_{min} = \ arcsen \ (n_{3} \ /
n_{2}).
Tal como se estableció anteriormente, se prefiere
enormemente una trayectoria óptica cerrada (una trayectoria óptica
circular) del haz 34 luminoso de excitación en la parte 24 de base,
si se utilizan materiales birrefringentes (por ejemplo, materiales
de plástico) para fabricar la parte 24 de base. Con el fin de tener
una trayectoria óptica cerrada dentro de la parte 24 de base, deben
cumplirse las siguientes condiciones:
A/2 + h \
tan(\gamma) = I \ cos \ (\beta \ - \
\gamma),
h = I \ sen \
(\beta \ - \
\gamma),
A/2 + h \ tan
\ (\gamma) = k \ cos \ (\beta \ + \
\gamma),
en las que I es la longitud de la
trayectoria óptica entre el punto de incidencia sobre la primera
superficie 26 hasta el punto de incidencia sobre la superficie 30 de
excitación y k es la longitud de la trayectoria óptica entre el
punto de incidencia sobre las superficies 26 y 32 primera y de base
para una trayectoria óptica circular simétrica en la parte 24 de
base. A es la longitud del lado 30 superior que conecta los lados
26S, 28S primero y
segundo.
Puede demostrarse que las condiciones anteriores
producen la siguiente expresión para la altura H del trapezoide:
H =
\frac{Asen(\beta - \gamma)}{2(- \ cos(\beta \ - \ \gamma) +
sen(\beta \ - \ \gamma) \
tan(\gamma))}
- \left(-
\frac{A}{2} \ + \ \frac{Asen(\beta \ - \ \gamma) \ tan(\gamma)}{2(-
\ cos(\beta - \gamma) \ + \ sen \ (\beta \ - \ \gamma)
tan(\gamma))}\right) \ tan(\beta \ + \
\gamma),
La altura h de acoplamiento de un haz 34 luminoso
de excitación incidente que tiene una trayectoria óptica circular
simétrica en la parte 24 de base, es decir una trayectoria circular
en la que las reflexiones sobre los lados 30S, 32S superior y de
base del trapezoide están en el centro de los lados respectivos
viene dada por
h =
\frac{Asen(\beta \ - \ \gamma)}{2(- \ cos(\beta \ - \ \gamma) \ + \
sen(\beta \ - \ \gamma) \
tan(\gamma))}
La altura h de acoplamiento debe estar
preferiblemente de acuerdo con la anchura de haz del haz 34 luminoso
de excitación.
Para el caso especial en el que el trapezoide es
un rectángulo y el haz 34 luminoso de excitación incidente es
incidente bajo el ángulo de Brewster \alpha_{B} = arctan
(n_{2} / n_{1}), puede calcularse una relación sencilla para la
relación de A/H. Para un rectángulo (\gamma = 0),
tan \ (\beta)
\ = \
\frac{H/2}{A/2},
Si \alpha corresponde al ángulo \alpha_{B}
de Brewster, el ángulo entre el haz luminoso reflejado y refractado
en la primera superficie 26 es de 90º, de modo que
tan \ (\beta)
\ = \ tan(90 ^{o} \ - \ \alpha) \ = \
\frac{1}{tan(\alpha)},
Por tanto,
tan \ (\alpha)
\ = \ \frac{n_{2}}{n_{1}} \ = \
\frac{A}{H},
En una realización preferida de la presente
invención, la superficie 30 de excitación de la cubeta es
preferiblemente hidrófila. Puede obtenerse una superficie 30 de
excitación sustancialmente hidrófila, por ejemplo, mediante el
recubrimiento al menos parcialmente de la superficie con un
compuesto hidrófilo. Los sistemas de compuestos hidrófilos que
pueden utilizarse para proporcionar una superficie 30 de excitación
hidrófila son, por ejemplo, derivados de dextrano, tales como
alildextrano, que se acoplan covalentemente a la superficie de
excitación compuesta por, por ejemplo, un poliestireno, con el
tratamiento mediante rayos X de la superficie de excitación para
generar radicales. En particular, un ejemplo para preparar una
superficie 30 de excitación hidrófila utilizando alildextrano es tal
como sigue: se proporciona una pastilla de poliestireno como cubeta
(irradiada con radiación \gamma con 26 kGray, ^{60}Co) y se
añaden 50 \mul de una disolución de alildextrano que tiene un peso
molecular de aproximadamente 150 kD (100 \mug/\mul en agua) y se
incuba durante 16 h a temperatura ambiente. Se aspira la disolución
y se lava la pastilla de poliestireno tres veces con agua. Tras la
incubación con 50 \mul de una disolución de (meta)peryodato
de sodio (30 mM en agua) durante 1 h a temperatura ambiente, se
aspira la disolución y se lava la pastilla de poliestireno tres
veces con PBS. Luego, se añaden 50 \mul de una disolución de
neutravidina (40 \mug/\mul en NaHCO_{3} 0,1 M, pH 9,3) y se
incuba durante 2 h a temperatura ambiente, seguido por la adición de
0,5 \mul de una disolución de cianoborohidruro de sodio (5 M) y la
incubación durante 15 min. a temperatura ambiente, y posteriormente
añadiendo e incubando con 25 \mul de una disolución acuosa de
etanolamina (300 mM) durante 15 min. a temperatura ambiente. Se
aspiran las disoluciones y se lava la pastilla de poliestireno tres
veces con PBS. Los sitios reactivos en exceso de la pastilla de
poliestireno se bloquean mediante incubación en 100 \mul de una
disolución de bloqueo (por ejemplo, PBS, BSA al 1%, Tween 20 al
0,25%) durante 1 h a temperatura ambiente.
Alternativamente, un sistema de compuesto
hidrófilo que puede utilizarse para proporcionar una superficie 30
de excitación hidrófila es el sistema de
poli-L-lisina / glutardialdehído. En
particular, un ejemplo es por tanto tal como sigue: se proporciona
una pastilla de poliestireno como cubeta (irradiada con radiación
\gamma con 26 kGray, ^{60}Co) y se añaden 50 \mul de una
disolución de poli-L-lisina (10
\mug/\mul en PBSplus (K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 100 mM,
NaCl 100 mM, pH 7,5)) y se incuba durante 16 h a temperatura
ambiente. Se aspira la disolución y se lava la pastilla de
poliestireno tres veces con PBS. Tras la incubación con 50 \mul de
una disolución de glutardialdehído (al 1% en PBSplus) durante 1 h a
temperatura ambiente, se aspira la disolución y se lava la pastilla
de poliestireno tres veces con PBS. Luego, se añaden 50 \mul de
una disolución de neutravidina (40 \mug/\mul en NaHCO_{3} 0,1
M, pH 9,3) y se incuba durante 2 h a temperatura ambiente, seguido
por una adición de 0,5 \mul de una disolución de cianoborohidruro
de sodio (5 M) y la incubación durante 15 min. a temperatura
ambiente, y posteriormente añadiendo e incubando con 25 \mul de
una disolución acuosa de etanolamina (300 mM) durante 15 min. a
temperatura ambiente. Se aspiran las disoluciones y se lava la
pastilla de poliestireno tres veces con PBS. Los sitios reactivos en
exceso de la pastilla de poliestireno se bloquean mediante
incubación en 100 \mul de una disolución de bloqueo (por ejemplo,
PBS, BSA al 1%, Tween 20 al 0,25%) durante 1 h a temperatura
ambiente.
El recubrimiento de los compuestos hidrófilos
mencionados anteriormente sobre la superficie de excitación puede
formar, por ejemplo, las denominadas "estructuras de islas" o
monocapas.
Según una realización preferida adicional de la
presente invención, se inmoviliza (es decir, se une) un compuesto
como componente R1 de reacción sobre la superficie 30 de excitación
de la cubeta, en la que la superficie de excitación puede recubrirse
con compuestos hidrófilos, tal como se expuso anteriormente. El
término "inmovilizado" significa preferiblemente que el
componente R1 de reacción se adhiere a la superficie 30 de
excitación mediante absorción ("absorción directa"). Sin
embargo, el componente R1 de reacción también puede inmovilizarse en
la superficie 30 de excitación a través de un compuesto de anclaje,
por ejemplo, una proteína tal como un anticuerpo, un antígeno,
estreptavidina, avidina, neutravidina o compuestos tales como
biotina. El componente R1 de reacción también puede inmovilizarse
sobre la superficie (30) de excitación a través de enlace(s)
covalente(s). Esto puede proporcionarse, por ejemplo,
mediante la conversión con una carbodiimida de una superficie de
excitación que contiene acrilato.
En general, los términos "inmovilizado" y
"unido" en el sentido de la presente invención significan
adhesión de un componente de reacción o un compuesto tal como un
compuesto de anclaje o un compuesto que contiene un fluoróforo, a
una superficie tal como la superficie 30 de excitación, o a otro
componente de reacción y/o compuesto, e incluyen tanto interacciones
covalentes cono no covalentes, tales como las interacciones basadas
en interacciones iónicas, polares o apolares.
El componente R1 de reacción o el compuesto de
anclaje pueden situarse sobre la superficie de excitación mediante
un método común. Por ejemplo, puede recubrirse una proteína que
sirve como componente R1 de reacción o un compuesto de anclaje sobre
la superficie de excitación. El componente R1 de reacción o el
compuesto de anclaje pueden unirse preferiblemente a la superficie
mediante absorción o mediante enlace(s) covalente(s).
Después de esta etapa, la superficie de excitación se trata
preferiblemente con otra disolución que contiene compuestos de
bloqueo y se bloquean o se bloquearán zonas sobre la superficie de
excitación que no contienen el componente R1 de reacción o el
compuesto de anclaje, por ejemplo mediante otra proteína como un
compuesto de bloqueo que básicamente no reacciona con los
componentes en las disoluciones utilizadas para realizar el
ensayo.
En realizaciones preferidas de la presente
invención, el componente R1 de reacción o el compuesto de anclaje
están presentes en forma liofilizada.
Aún en otra realización preferida de la presente
invención, el componente R1 de reacción liofilizado o el compuesto
de anclaje liofilizado se cubre mediante una capa de separación
liofilizada. Los constituyentes de la capa de separación se
seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en uno o más
compuestos tampón tales como HEPES, uno o más compuestos proteicos
tales como BSA, uno o más polímeros hidrófilos tales como dextrano,
uno o más agentes complejantes / anticoagulantes tales como EDTA y
opcionalmente compuestos bacteriostáticos tales como trimetoprima
y/o sulfametoxazol, y una mezcla que contiene uno o más de estos
constituyentes. Además, la capa de separación también puede contener
el componente R3 de reacción.
En realizaciones preferidas adicionales de la
presente invención, la cubeta contiene, además del componente R1 de
reacción o el compuesto de anclaje y la capa de separación
liofilizados, un liofilizado que cubre la capa de separación
liofilizada. El liofilizado comprende, o bien
- (A)
- un compuesto que contiene un fluoróforo o un compuesto como componente R3 de reacción o una mezcla de los mismos, siempre que el componente R1 de reacción esté inmovilizado sobre la superficie 30 de excitación; o bien
- (B)
- un componente R1 de reacción o un compuesto que contiene un fluoróforo o un compuesto como componente R3 de reacción o una mezcla de los mismos que contiene dos o tres de dichos constituyentes, siempre que el compuesto de anclaje esté inmovilizado sobre la superficie 30 de excitación;
teniendo dicho componente R3 de
reacción afinidad por la sustancia que se está sometiendo a ensayo
como componente R2 de reacción, en el que dicho componente R3 de
reacción comprende opcionalmente un resto que contiene un
fluoróforo, y teniendo dicho compuesto que contiene un fluoróforo
afinidad por el componente R2 de reacción o R3 de
reacción.
En realizaciones preferidas de la presente
invención, los términos "compuesto de anclaje", "componente
R1 de reacción", "componente R2 de reacción" y "componente
R3 de reacción", en general, incluyen cada uno parte de un
sistema de unión de ligandos tal como anticuerpos monoclonales o
policlonales, proteínas que funcionan como antígenos, proteínas que
tienen afinidad por compuestos específicos, tales como
estreptavidina, avidina, etc., y compuestos que tienen afinidad, por
ejemplo, por proteínas específicas, tales como biotina. Por ejemplo,
el compuesto de anclaje inmovilizado sobre la superficie de
excitación, es estreptavidina; el componente R1 de reacción es un
anticuerpo monoclonal dirigido contra el componente R2 de reacción,
que tiene biotina conjugada al mismo con el fin de permitir la
inmovilización sobre la superficie de excitación a través del
sistema de estreptavidina / biotina; el componente R2 de reacción,
que es la sustancia que se está sometiendo a ensayo, funciona como
un antígeno; y el componente R3 de reacción es un anticuerpo
monoclonal dirigido contra el componente R2 de reacción, que tiene
un compuesto que contiene un fluoróforo conjugado al mismo con el
fin de permitir mediciones de fluorescencia (véase también la
\hbox{figura 3).}
Además, según la presente invención se
proporciona un procedimiento para la preparación de una cubeta tal
como se definió anteriormente, que comprende las etapas de:
(a) inmovilizar el componente R1 de reacción o el
compuesto de anclaje sobre la superficie 30 de excitación de la
cubeta.
El procedimiento de la presente invención puede
comprender adicionalmente las etapas de:
(b) aplicar una disolución I congelable
(preferiblemente, acuosa) que puede contener uno o más compuestos
tampón tales como HEPES, uno o más compuestos proteicos tales como
BSA, uno o más crioprotectores tales como poli(etilenglicol),
uno o más lioprotectores tales como sacarosa, uno o más detergentes
tales como
n-octil-\beta-D-glucopiranósido,
uno o más antioxidantes tales como ácido ascórbico, uno o más
compuestos hidrófilos tales como dextrano, uno o más agentes
complejantes / anticoagulantes tales como EDTA y opcionalmente
compuestos bacteriostáticos tales como trimetoprima y/o
sulfametoxazol y una mezcla que contiene uno o más de estos
constituyentes, sobre dicho componente R1 de reacción inmovilizado o
el compuesto de anclaje inmovilizado; y
(c) congelar dicha disolución I para obtener una
capa de separación congelada.
Tras la etapa (c) del procedimiento de la
presente invención, el contenido congelado de la cubeta puede
liofilizarse para obtener una cubeta que está lista para su uso para
someter a ensayo sustancias.
El procedimiento de la presente invención puede
comprender adicionalmente las etapas de:
(d) aplicar una disolución II congelable
(preferiblemente, acuosa) que puede contener uno o más compuestos
tampón tales como HEPES, uno o más compuestos proteicos tales como
BSA, uno o más compuestos hidrófilos tales como dextrano, uno o más
crioprotectores tales como poli(etilenglicol), uno o más
lioprotectores tales como sacarosa, uno o más detergentes tales como
n-octil-\beta-D-glucopiranósido,
uno o más antioxidantes tales como ácido ascórbico, uno o más
tensioactivos iónicos y/o no iónicos tales como Tween 20 o Brij35 T,
una o más sales tales como NaCl, una o más cargas tales como glicina
y opcionalmente compuestos bacteriostáticos tales como trimetoprima
y/o sulfametoxazol, uno o más colorantes tales como Lissamine Green
B, carmín de índigo, Brilliant Black o clorofila-Cu
y una mezcla que contiene uno o más de estos constituyentes, que
contiene o bien (A) un compuesto que contiene un fluoróforo o un
compuesto como componente R3 de reacción o una mezcla de los mismos,
siempre que el componente R1 de reacción esté inmovilizado sobre la
superficie 30 de excitación, o bien (B) el componente R1 de reacción
o el compuesto que contiene un fluoróforo o un compuesto como
componente R3 de reacción o una mezcla de los mismos que contiene
dos o tres de dichos constituyentes, siempre que el compuesto de
anclaje esté inmovilizado sobre la superficie 30 de excitación,
sobre dicha capa de separación congelada;
(e) congelar dicha disolución II para obtener una
disolución II congelada; y
(f) liofilizar el contenido congelado en la
cubeta para obtener un liofilizado que está listo para utilizarse
para someter a ensayo sustancias.
La capa de separación debe cubrir por completo la
superficie y, antes de la liofilización, es un sólido congelado,
antes de que se añada el siguiente componente de reacción, tal como
el componente R3 de reacción. Esta adición normalmente no funde la
capa de separación congelada, pero si lo hace, sólo se fundirá la
parte superior de la capa de separación. Es esencial para la
funcionalidad del ensayo con que va a llevarse a cabo que el
siguiente componente de reacción no esté en contacto directo con el
componente R1 de reacción o el compuesto de anclaje en ningún
momento durante el procedimiento.
En el sentido de la presente invención, el
término "sustancia que se está sometiendo a ensayo" corresponde
al término "componente R2 de reacción", tal como ya se ha
mencionado anteriormente.
La cubeta de la presente invención puede
utilizarse en métodos para diagnósticos médicos o médicos
veterinarios, análisis de alimentos, análisis medioambientales,
análisis químicos o biológicos, o análisis de procesos de
fermentación, preferiblemente para la determinación cualitativa y/o
cuantitativa de sustancias a través de reacciones inmunológicas.
El método que utiliza la cubeta según la presente
invención incluye las etapas de:
- -
- poner en contacto con el componente R1 de reacción inmovilizado o con el compuesto de anclaje inmovilizado o con la capa de separación liofilizada una disolución que contiene la sustancia que se está sometiendo a ensayo como componente R2 de reacción y o bien (A) un compuesto que contiene un fluoróforo o un compuesto como componente R3 de reacción o una mezcla de los mismos, siempre que el componente R1 de reacción esté inmovilizado sobre la superficie 30 de excitación, o bien (B) el componente R1 de reacción o un compuesto que contiene un fluoróforo o un compuesto como componente R3 de reacción o una mezcla de los mismos que contiene dos o tres de dichos constituyentes, siempre que dicho compuesto de anclaje esté inmovilizado sobre la superficie 30 de excitación, en el que se forma un complejo sobre el componente R1 de reacción inmovilizado o sobre el compuesto de anclaje inmovilizado, conteniendo dicho complejo o bien
- (i)
- un componente R1 de reacción y un componente R2 de reacción que comprende un resto que contiene un fluoróforo o un compuesto que contiene un fluoróforo conjugado al mismo; o bien
- (ii)
- un componente R1 de reacción, un componente R2 de reacción y un componente R3 de reacción que comprende un resto que contiene un fluoróforo o un compuesto que contiene un fluoróforo conjugado al mismo; o bien
- (iii)
- un componente R1 de reacción, un componente R2 de reacción, un componente R3 de reacción y un compuesto que contiene un fluoróforo; o bien
- (iv)
- el compuesto de anclaje, un componente R1 de reacción y un componente R2 de reacción que comprende un resto que contiene un fluoróforo o un compuesto que contiene un fluoróforo conjugado al mismo; o bien
- (v)
- el compuesto de anclaje, un componente R1 de reacción, un componente R2 de reacción y un componente R3 de reacción que comprende un resto que contiene un fluoróforo o un compuesto que contiene un fluoróforo conjugado al mismo; o bien
- (vi)
- el compuesto de anclaje, un componente R1 de reacción, un componente R2 de reacción, un componente R3 de reacción y un compuesto que contiene un fluoróforo; y
- -
- excitar el fluoróforo unido a la superficie 30 de excitación a través de dicho complejo mediante el campo evanescente de una fuente luminosa (es decir, mediante el campo evanescente generado dentro de la cubeta (o parte de base) cuando se aplica un haz luminoso de excitación de una fuente luminosa de excitación externa) y medir la fluorescencia producida.
En una realización más preferida de la presente
invención, el método utiliza la cubeta que contiene el componente R1
de reacción o el compuesto de anclaje liofilizado, la capa de
separación liofilizada, y o bien (A) un compuesto que contiene un
fluoróforo o un compuesto como componente R3 de reacción o una
mezcla de los mismos, siempre que el componente R1 de reacción esté
inmovilizado sobre la superficie 30 de excitación, o bien (B) el
componente R1 de reacción o un compuesto que contiene un fluoróforo
o un compuesto como componente R3 de reacción o una mezcla de los
mismos que contiene dos o tres de dichos constituyentes, siempre que
dicho compuesto de anclaje esté inmovilizado sobre la superficie 30
de excitación, incluyendo dicho método las etapas de:
- -
- poner en contacto con el contenido liofilizado de la cubeta una disolución que contiene la sustancia que se está sometiendo a ensayo como componente R2 de reacción, en el que se forma un complejo sobre el componente R1 de reacción inmovilizado o sobre el compuesto de anclaje inmovilizado tal como se expone anteriormente; y
- -
- excitar el fluoróforo unido a la superficie 30 de excitación a través de dicho complejo mediante el campo evanescente de una fuente luminosa y medir la fluorescencia producida.
En realizaciones preferidas de la presente
invención, el método que va a utilizarse en la cubeta se basa en un
ELISA que utiliza un fluoróforo en lugar de un sistema de formación
de color.
Según la presente invención, los términos
"complejo" y "conjugado" se entienden que son un
acoplamiento o unión molecular entre dos o más sustancias
preferiblemente químicas o bioquímicas. El complejo o conjugado se
forma preferiblemente por medio de reacciones selectivas y/o
específicas, especialmente preferido mediante reacciones
antígeno-anticuerpo.
Según la invención, el término "reacciones"
incluye tanto interacciones covalentes como no covalentes de dos o
más componentes de reacción, en las que pueden tener lugar ambos
tipos de interacción una tras otra dentro de un complejo. La
interacción no covalente puede significar, por ejemplo, interacción
de Van der Waals, interacción polar y/o iónica de componentes de
reacción. El término "componente de reacción" significa en
general un compuesto con afinidad por otra sustancia en la presente
invención.
En una realización preferida del método en la
presente invención, la sustancia que se está sometiendo a ensayo
como componente R2 de reacción puede tener ella misma afinidad por
el componente R1 de reacción inmovilizado sobre la superficie y, por
tanto puede unirse directamente a ese componente R1 de reacción.
Cuando la sustancia que se está sometiendo a ensayo es un
anticuerpo, por ejemplo, puede situarse sobre la superficie un
antígeno específico para ese anticuerpo, o viceversa.
En otra realización preferida, la sustancia, es
decir el componente R2 de reacción, que se está sometiendo a ensayo
no tiene afinidad ella misma (básicamente) o sólo una pequeña
afinidad por un compuesto de anclaje sobre la superficie. En este
caso, la disolución que se va a poner en contacto con la superficie
contiene, por ejemplo, otro compuesto que contiene el componente R1
de reacción y un sitio de unión para la sustancia que se está
sometiendo a ensayo. El componente R1 de reacción puede unirse al
compuesto de anclaje sobre la superficie y por tanto fija la
sustancia que se está sometiendo a ensayo indirectamente a la
superficie. Esta otra conexión sirve como elemento de puente entre
la sustancia que se está sometiendo a ensayo y el compuesto de
anclaje sobre la superficie. Por ejemplo, puede estar presente
avidina como compuesto de anclaje sobre la superficie. Entonces, el
otro compuesto (es decir, el componente R1 de reacción) contiene,
además de un sitio de unión para la sustancia que se está sometiendo
a ensayo, por ejemplo biotina, que puede unirse a la avidina
inmovilizada sobre la superficie. Esta realización tiene la ventaja
de que una superficie recubierta con avidina (o estreptavidina), al
contrario que muchos anticuerpos y antígenos, puede liofilizarse
mejor y son muy estables en forma seca o liofilizada. Además, el
sistema avidina (o estreptavidina) / biotina tiene una constante de
disociación KD muy elevada. También es posible realizar una serie de
ensayos diferentes sobre una superficie recubierta con avidina (o
estreptavidina) y someter a ensayo sólo el otro compuesto, que se
pone en contacto con la superficie con la disolución, sobre la
sustancia que se está sometiendo a ensayo.
La figura 3 muestra de manera esquemática esta
realización del método utilizado en la presente invención. En la
disolución puesta en contacto con la superficie 30 de excitación
están, uno junto a otro, la sustancia 40 (es decir, componente R2 de
reacción) que se está sometiendo a ensayo, un componente 44 R3 de
reacción que comprende un resto o compuesto que contiene un
fluoróforo, y componente 46 R1 de reacción que tiene afinidad por el
compuesto 48 de anclaje. El compuesto 48 de anclaje se une a la
superficie de excitación. El componente R3 de reacción y el
componente R1 de reacción se absorben sobre la sustancia que se está
sometiendo a ensayo (conjugado 50), y el conjugado 50 se une a
través del componente R1 de reacción al compuesto 48 de anclaje para
formar el complejo 52. Por tanto, el complejo 52, que incluye el
componente R3 de reacción que contiene un fluoróforo, se une a la
superficie 30 de excitación y puede someterse a ensayo mediante la
medición de la fluorescencia en el campo 54 de
evanescencia.
evanescencia.
Para esta realización del método de la presente
invención, además del sistema avidina (o estreptavidina) / biotina,
todos los sistemas de ligandos o de unión a ligandos son adecuados
en los que las proteínas, por ejemplo, tienen sitios de unión
selectivos y/o específicos para uno o más ligandos, como por ejemplo
histidina, marcas de histidina, lectina y/o digoxigenina, y sistemas
antígeno / anticuerpo naturales, tal como lo ya expuesto
anteriormente.
Según la presente invención, los términos
"fluoróforo", "compuesto que contiene un fluoróforo" y
"resto que contiene un fluoróforo", no muestran limitaciones
particulares siempre que sean fluorescentes e incluyan, por ejemplo,
un compuesto fluorescente, tal como ficobilisomas,
ficobiliproteínas, compuestos químicos fluorescentes de bajo peso
molecular o puntos cuánticos. Según la presente invención, pueden
utilizarse ficobiliproteínas, tales como aloficocianina (APC),
Cryptofluor Crimson o Cryptofluor Red como proteínas fluorescentes.
Pueden citarse Cy5 o BODIPY (fluoróforos que tienen
4,4-difluor-4-boro-3a,
4a-diaza-s-indaceno)
como ejemplos de compuestos fluorescentes de bajo peso molecular. Se
prefieren colorantes fluorescentes con una absorción eficaz en el
intervalo de longitudes de onda de desde 600 hasta 700 nm.
En lugar de un fluoróforo, puede utilizarse un
compuesto precursor de fluoróforo, a partir del cual se libera un
fluoróforo antes del procedimiento de medición, por ejemplo,
mediante el cambio del valor de pH o mediante la separación de un
grupo protector.
Según la presente invención, los términos
"fluoróforo" y "compuesto que contiene un fluoróforo" y
"resto que contiene un fluoróforo" también incluyen compuestos
fosforescentes. Si se utiliza un compuesto fosforescente como
fluoróforo, se determina la fosforescencia irradiada, que se
desplaza en el tiempo de la excitación. Por tanto, es posible
separar el tiempo de radiación del tiempo de medición.
Este compuesto que contiene un fluoróforo también
puede tener un sitio de unión para la sustancia que se está
sometiendo a ensayo. Por ejemplo, el fluoróforo puede venir unido a
un anticuerpo como componente R3 de reacción. Este anticuerpo que
contiene un fluoróforo puede reaccionar preferiblemente en una
reacción antígeno-anticuerpo con la sustancia que se
está sometiendo a ensayo como antígeno, por ejemplo una
proteína.
En otra realización, la sustancia (es decir,
componente R2 de reacción) que se está sometiendo a ensayo viene
ella misma como compuesto que contiene un fluoróforo. En esta
realización, se realizan ensayos competitivos, que se caracterizan
especialmente por un bajo límite de detección.
Con el método de la presente invención, puede
detectarse una amplia variedad de sustancias. El método es
especialmente adecuado para someter a ensayo sustancias
biológicamente activas, como hormonas, tales como hormonas proteicas
o no proteicas, proteínas como antígenos, anticuerpos o haptenos,
ácidos nucleicos tales como DNS, oligonucleotidos o ARN, productos
farmacéuticos, virus, bacterias, etc. El método también puede
utilizarse para detectar venenos medioambientales, toxinas, abuso de
sustancias, fármacos terapéuticos, etc. El método de la presente
invención también incluye ensayos dobles de antígeno anticuerpo para
la detección, por ejemplo, de inmunoglobulinas tales como
anticuerpos frente a HIV, HBC o HCV en fluidos corporales humanos,
por ejemplo sangre.
Se prefiere especialmente detectar las sustancias
que se están sometiendo a ensayo mediante reacciones
inmunológicas.
Cuando se excita el fluoróforo unido a la
superficie con un campo evanescente, se apunta un haz de luz a la
base de la superficie con un ángulo tal que se produce reflexión
total al límite de la fase cubeta / disolución. Esto forma un campo
evanescente sobre la superficie de la disolución, que puede penetrar
hasta varios cientos de nanómetros dentro del fluido. Según la
presente invención, se prefiere un ángulo de incidencia al menos de
60º a 90º, de modo que se forma un campo evanescente a una altura de
hasta 400 nm, preferiblemente 200 nm, y especialmente preferido de
50 a 150 nm, sobre la superficie. Dentro de este campo evanescente,
la luz emitida puede excitar fluoróforos adecuados. Se detecta la
luz fluorescente emitida, por ejemplo con un fotomultiplicador, y se
evalúa.
Ya que sólo el fluoróforo unido a la superficie
está en el campo evanescente, sólo este fluoróforo unido se excita
de manera óptima y emite fotones. Un compuesto que contiene
fluoróforo y no está unido en la disolución no está en la zona del
campo evanescente, y por tanto básicamente no se excita y tampoco
emite básicamente ningún fotón. Esta disposición permite así una
determinación cuantitativa del fluoróforo unido a la superficie en
presencia de fluoróforo en la disolución sobrenadante sin una etapa
de separación y/o lavado previa.
Puede utilizarse luz monocromática como fuente
luminosa. Debe utilizarse luz que tiene una longitud de onda que
preferiblemente no interfiere con la emisión del fluoróforo. Se
prefiere especialmente un láser como fuente luminosa, cuya luz emite
una longitud de onda de al menos 635 nm. En particular, si la
disolución sobrenadante es un suero, se prefieren los láser que
emiten longitudes de onda de desde 600 hasta 700 nm, ya que la
fluorescencia inherente al suero es de aproximadamente 580 nm.
En una realización de la invención, la adición
del fluoróforo unido a la superficie puede medirse directamente (en
tiempo real) con una reacción que progresa con el tiempo. Ya que la
cantidad de fluoróforo unido a la superficie es directamente
proporcional a la cantidad original de compuesto que contiene
fluoróforo, el método de la invención hace posible realizar una
determinación cuantitativa de reactivos encontrados en la
disolución, en tiempo real, sin otras etapas adicionales de lavado
y/o pipeteado.
Ya que los coeficientes de absorción y las
propiedades de emisión de fluoróforos son muy buenos, los límites de
detección son pequeños. Tras tan sólo unos minutos, pueden evaluarse
las reacciones cualitativa y/o cuantitativamente.
Sin embargo, la dispersión del haz luminoso en la
cubeta, que no es ideal, plantea un problema, incluso si se toman
medidas físicas para reducir la luz dispersada. Debido a esta
dispersión, la luz también llega al volumen de la cubeta y causa
fluorescencia de fondo. El término "volumen" se entiende en la
presente invención que es el líquido fuera del campo evanescente,
que contiene compuestos no unidos que contienen fluoróforo. La
polarización del haz luminoso también puede girarse en cubetas tanto
de plástico como de vidrio. Esto conduce, en particular, a
reflexiones de la luz de excitación durante el desacoplamiento,
creando la denominada luz errante, que, junto con los efectos de
dispersión de volumen y superficie, puede dar como resultado la
excitación del volumen.
Según la presente invención, la excitación del
fluoróforo en el volumen puede suprimirse adicionalmente si la
disolución que va a ponerse en contacto con la superficie tiene al
menos un colorante añadido que tiene una absorción en el intervalo
de absorción y/o emisiones del fluoróforo.
La absorción del colorante añadido al volumen se
coordina con el intervalo de absorción y/o emisión del fluoróforo de
la invención. Puede utilizarse un colorante individual o una mezcla
de colorantes. El intervalo de absorción del fluoróforo se
correlaciona normalmente con la longitud de onda de la fuente
luminosa utilizada. No es necesario que el colorante tenga un máximo
de absorción en este intervalo espectral; un hombro en el espectro
de absorción puede ser suficiente. Por ejemplo, si se utilizan
fluoróforos como APC o Cy5, el colorante utilizado puede tener una
absorción de entre 600 nm y 700 nm, como por ejemplo Brilliant Blue
FCF. La concentración de colorante añadido depende de la frecuencia
de la luz irradiada. La concentración de colorante puede ajustarse,
dependiendo del colorante, de modo que la luz penetrante puede
observarse básicamente en 1 mm sobre la superficie. Para determinar
la concentración óptima de colorante, en primer lugar se miden la
fluorescencia y la fluorescencia de volumen en el campo evanescente,
por ejemplo la fluorescencia de superficie, para diversas
concentraciones de colorante. Luego, se traza la razón de
fluorescencia de superficie - fluorescencia de volumen frente a la
concentración de colorante. El máximo de esta razón representa la
concentración óptima de colorante. Según la presente invención,
"razón señal - ruido" es la razón de fluorescencia de
superficie (señal) - fluorescencia de volumen ("ruido").
"Básicamente absorbido" puede significar una cancelación de
intensidad del 70%, preferiblemente del 80% y especialmente
preferido de al menos el 90%.
Por ejemplo, cuando se utiliza Brilliant Blue FCF
como colorante, una concentración de 0,04 mM es suficiente para
suprimir mucho más del 95% de la fluorescencia de volumen. Por
ejemplo, la concentración de Brilliant Blue FCF es preferiblemente
de al menos 0,001 mM.
La pequeña dimensión y bajo precio hacen que la
cubeta de la presente invención sea factible para diagnósticos y
análisis de rutina. En aplicación práctica, este tipo de cubeta
puede prepararse previamente y venderse comercialmente cerrada con
una etiqueta especial. Tal como ya se ha expuesto anteriormente, la
preparación previa incluye el recubrimiento de la superficie de la
cubeta con el primer componente R1 de reacción y, si es necesario,
luego bloquear los sitios no recubiertos. Se prefiere especialmente
si la cubeta recubierta se presenta liofilizada o secada. Dotar a la
cubeta de un número de serie hace posible tener una atribución clara
al lote de fabricación, la reacción de detección y la muestra en
cualquier momento.
Ejemplos de aplicaciones específicas que pueden
citarse son una amplia variedad de ensayos que se basan en el
principio de ELISA. Una prueba ELISA puede utilizarse para
determinar la concentración de antígenos o anticuerpos. Ejemplos de
antígenos específicos son proteína S de HBV, HCG, proteínas
marcadoras cardíacas, y hormonas tales como hormonas esteroides,
hormonas peptídicas, hormonas tiroides. Pueden citarse ensayos de
anticuerpos, indicativos de una infección previa o indicativos de un
síntoma de enfermedad específico, tales como un ensayo de
anticuerpos frente a HIV, ensayo de anticuerpos frente a hepatitis S
o la trombocitopenia inducida por heparina mediada por anticuerpos.
También es posible la detección de productos de protección de
plantas, tales como atrazina, en agua potable utilizando la cubeta
de la presente invención.
También pueden realizarse ensayos no inmunitarios
utilizando la cubeta de la presente invención, cuando puede marcarse
un reactivo de detección y este reactivo es un ligando específico
para un receptor. Por tanto, se une una molécula de receptor a la
superficie de la cubeta y el ligando u hormona, etc. marcado puede
unirse específicamente al receptor. Receptores de hormonas pueden
ser receptores naturales o moléculas de receptor recombinantes. Éste
puede ser un ensayo competitivo para fármacos en el que se
derivatiza fluorescentemente el fármaco y la proteína receptora se
inmoviliza sobre la superficie de la cubeta. Alternativamente, se
inmoviliza el fármaco sobre la superficie del receptor y se une el
receptor marcado fluorescente. La aplicación también puede
utilizarse para fármacos recreativos.
También se puede realizar la detección de ARN o
ADN con la cubeta de la presente invención. Una cadena
complementaria inmovilizada sobre la superficie de la cubeta puede
capturar un oligonucleotido marcado. El oligonucleotido puede
marcarse por ejemplo con APC.
Cuando se utiliza la cubeta según la presente
invención, los métodos anteriormente definidos para someter
sustancias a ensayo dan sorprendentemente como resultado una
sensibilidad analítica de al menos 10 veces mejor que los ELISA
comunes y un tiempo de análisis de al menos 10 veces menos que en
los ELISA comunes.
La presente invención se explicará adicionalmente
a continuación utilizando ejemplos que, por supuesto, no limitan el
alcance de la protección conferida por las reivindicaciones.
En los siguientes ejemplos se midieron los
fotones cada segundo durante un tiempo de 10 min (= 600 s).
Normalmente, se midieron los fotones contados al comienzo a 0 min y
tras 10 min y se calculó la diferencia. Esta diferencia es positiva
y directamente proporcional al antígeno medido en el ensayo. Si se
observa un cierto número de acontecimientos estadísticos, por
ejemplo 10.000 fotones (n), el error estadístico se calcula como
tres veces la raíz cuadrada de n. En este ejemplo, 3 x raíz cuadrada
de 10.000 = 3 x 100 = 300 fotones.
En el experimento, no sólo se miden estos dos
puntos en el tiempo, sino durante estos 10 min, 600 puntos en el
tiempo. Estos puntos se ajustan en una línea recta. Si no, se genera
una función de tendencia con una función de regresión lineal y se
calcula una curva lineal, el error total para un intervalo de
confianza del 99,99% se reduce a aproximadamente 30 fotones. Esto
significa una décima parte del error de 300 fotones obtenido
mediante el cálculo de 2 puntos. Por tanto, esta regresión lineal
mejora el límite de detección analítica por un factor de 10.
Ejemplo
1
Se recubrió una microplaca maxisorp de Nunc con
una disolución de neutravidina (10 \mug/ml en NaHCO_{3} 0,1 M)
durante la noche a temperatura ambiente. Luego se lavó 3 veces con
TBST (Tris 10 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,1%). Se añadió
una disolución de peroxidasa de rábano biotinilada ("HRP",
disponible comercialmente de Pierce) (10 ng/ml en TBST) a los
pocillos y se incubó durante varios tiempos desde 1 minuto hasta 6
horas. Se lavaron los pocillos 6 veces con TBST y 3 veces con TBS
(Tris 10 mM pH 7,5, NaCl 150 mM). Se reveló HRP unida mediante TMB
(disponible comercialmente de KPL) y se midió la densidad óptica a
630 nm tras 10 minutos de incubación a temperatura ambiente. Los
resultados se muestran en la figura 4.
La figura 4 es una gráfica de DO_{630} como
función de tiempo de unión de HRP biotinilada a la microplaca. Tras
10 minutos, se observa una DO de aproximadamente 0,75. La DO máxima
tras 6 horas de tiempo de reacción es de 2,10. Tras 10 minutos se
muestra una señal de aproximadamente el 30% del valor máximo para
HRP mediante un ensayo basado en la difusión y así es posible medir
un resultado significativo. Si, por ejemplo, está disponible un
sistema de detección por fluorescencia, se puede compensar la marca
menos unida y todavía tener un ensayo rápido y sensible.
Ejemplo
2
Se recubrió una microplaca de pocillos maxisorp
de Nunc con una disolución de estreptavidina (10 \mug/\mul en
PBSplus (K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 100 mM, NaCl 100 mM, pH
7,5)) durante la noche a temperatura ambiente. Luego se aspiró la
disolución y se lavaron los pocillos 4 veces con PBS
(K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 10 mM, NaCl 137 mM, pH 7,5). Para
bloquear los sitios reactivos restantes, se añadió una disolución de
BSA al 1% en PBSplus al pocillo y se dejó durante 1 h.
Se realizó un procedimiento ELISA de una etapa y
de tres etapas. El ensayo es un sándwich ELISA que detecta IgG de
ratón.
El ELISA de una etapa se llevó a cabo mediante la
incubación de una disolución de IgG de cabra antiratón biotinilado
(disponible comercialmente de Jackson) a 1 \mug/ml, HRP de cabra
antiratón (disponible comercialmente de Jackson) a 8 \mug/ml y
diversas cantidades de IgG de ratón (disponible comercialmente de
Jackson) en BSA al 1% en PBSplus que contiene Tween 20 al 0,025%
durante 0,5 h a temperatura ambiente.
El ELISA de tres etapas se llevó mediante una
incubación de 1 h con el IgG de cabra antiratón biotinilado a 1
\mug/ml en BSA al 1% en PBSplus que contiene Tween 20 al 0,025%
seguido de tres lavados con PBS. Luego una incubación con diversas
cantidades de IgG de ratón en el mismo tampón seguido de tres
lavados con PBS, seguido de una incubación de 1 h con HRP de cabra
antiratón a 8 \mug/ml en el mismo tampón.
Tras estas etapas de incubación, el procedimiento
era idéntico para ambos métodos ELISA y consistió en 5 lavados con
PBS seguidos de la adición de TMB para el desarrollo de la
coloración durante 10 minutos y lectura de la DO a 630 nm. Los
resultados se muestran en la figura 5 (A).
La figura 5 (A) muestra una gráfica de la
DO_{630} como una función de la concentración de IgG de ratón en
la muestra. Los límites de detección de IgG de ratón son
aproximadamente de 3 ng/ml para el ELISA de una etapa tras 40
minutos o de 1 ng/ml para el ELISA de tres etapas tras 3 horas.
Ejemplo
2
Una pastilla fluorescente como ejemplo de la
cubeta de la presente invención, fabricada mediante moldeado por
inyección a partir de poliestireno, se irradió con radiación
\gamma con una fuente de cobalto-60. La superficie
de poliestireno resultante está activada para la absorción de
proteínas. Se recubrieron los pocillos mediante la absorción de
estreptavidina a 10 \mug/ml en PBSplus (KPO_{4} 100 mM, NaCl 100
mM, pH 7,5) durante la noche a temperatura ambiente. Se aspiró la
disolución y se lavaron los pocillos 4 veces con PBS
(K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 10 mM, NaCl 137 mM, pH 7,4). Para
bloquear los sitios reactivos restantes, se añadió una disolución de
Tween 20 al 0,25% en PBSplus al pocillo y se dejó durante 1
hora.
Se realizó un inmunoensayo de una etapa que
detecta IgG de ratón y se midió la fluorescencia unida mediante
excitación evanescente.
Se añadió una mezcla IgG de cabra antiratón
biotinilado a 1 \mug/ml, APC de cabra antiratón conjugado
realizado según el procedimiento aportado por el proveedor de APC
activado (disponible comercialmente de Intergen) a 10 \mug/ml y
diversas cantidades de IgG de ratón en BSA al 1% en PBSplus que
contiene Tween 20 al 0,05% a la pastilla fluorescente de
poliestireno. Luego se situó la pastilla inmediatamente en el lector
y se monitorizó la emisión de fotones fluorescentes con el tiempo y
se registró. A medida que avanza la reacción, las moléculas
fluorescentes se unen a la superficie y la fluorescencia medida
aumenta con el tiempo. La medición de las unidades de cuenta de
fotones en los momentos 0 y 10 minutos y el cálculo de la diferencia
proporciona un número de unidades de cuenta de fotones debidos a la
reacción bioquímica en la superficie excitada por el campo
evanescente. Este aumento de fotones depende de la concentración de
antígeno en la muestra. Hay una variación menor en el fondo de una
pastilla a otra. Esta variación de una pastilla a otra no cambia
durante el tiempo de medición de 10 minutos y por tanto no aparece
en el resultado. La cantidad de IgG de ratón se valoró durante un
intervalo de 0,1 hasta 10.000 ng/ml. Los resultados se muestran en
la figura 5 (B).
La figura 5 (B) muestra los fotones fluorescentes
expresados como unidades de cuenta medidas en intervalos de 10
segundos como función de la concentración de IgG de ratón en la
muestra.
El límite de detección viene dado por la
variación estadística de los fotones medidos, que corresponde a 3
veces la raíz cuadrada de la emisión de fondo de fotones en el
aparato. La fluorescencia de fondo en este ejemplo es de 500.000, lo
que da una variación estadística de 3 x 707 = 2121 unidades de
cuenta.
La muestra que contiene 0,1 ng/ml de IgG de ratón
dio como resultado una señal de 5.000 fotones, muy por encima del
límite de detección del dispositivo. Por tanto, el sistema es diez
veces más sensible que un ELISA comparable descrito en el ejemplo 2
(A).
Ejemplo
3
Las condiciones experimentales y los reactivos
son los mismos que los mostrados en el ejemplo 2 (B). El ensayo de
sándwich utiliza una mezcla de IgG de cabra antiratón biotinilado a
1 \mug/ml, APC de cabra antiratón conjugado realizado según el
procedimiento aportado por el proveedor de APC activado a 10
\mug/ml y diversas cantidades de IgG de ratón(disponible
comercialmente de Jackson). Las mediciones se realizaron en dos
matrices diferentes: (a) en BSA al 1% en PBSplus que contiene Tween
20 al 0,05%; y (b) en plasma humano con EDTA. Los resultados se
muestran en la figura 6.
La figura 6 muestra los fotones fluorescentes
expresados como unidades de cuenta medidas en intervalos de 1
segundo como función de la concentración de IgG de ratón en la
muestra.
Los resultados son comparables en ambos sistemas
tampón, que utilizan o bien la mezcla sintética de BSA, PBS, Tween
20 o bien una matriz natural tal como plasma humano. El plasma no
parece generar autofluorescencia detectable.
Ejemplo
4
Se proporcionó una pastilla de poliestireno como
ejemplo de la cubeta de la presente invención y se preparó una capa
de avidina mediante absorción sobre el poliestireno.
Alternativamente, se utilizó uno de los métodos mencionados
anteriormente (poli-L-lisina o
alildextrano). El término "avidina" en el contexto general
engloba avidina o estreptavidina o neutravidina o cualquier otra
molécula que se une a biotina. Se añadieron 50 \mul/pocillo de una
disolución I (por ejemplo, Hepes 20 mM pH 7,5, BSA al 1%, Dextrano
T70 al 1%, EDTA 10 mM y opcionalmente 32 mg/ml de trimetoprima y 160
mg/ml de sulfametoxazol) y se congeló durante 4 h a -20ºC. La
disolución I forma la capa de separación. Luego se añadieron 10
\mul/pocillo de disolución II (por ejemplo, Hepes 20 mM pH 7,5,
BSA al 1%, Dextrano T70 al 1%, glicina al 2%, Brij al 1%, Tween 20
al 0,5%, NaCl 100 mM y opcionalmente 32 mg/ml de trimetoprima y 160
mg/ml de sulfametoxazol y un colorante tal como Lissamine Green B,
carmín de índigo, Brilliant Black BN o
clorofilina-Cu) sobre la parte superior de la capa
de separación congelada y se congeló durante 4 h a -20ºC. La
disolución II contiene las inmunoglobulinas reactivas, por ejemplo
IgG-XL-APC de cabra antiratón a 50
\mug/ml o IgG de cabra antiratón a 5 \mug/ml. Finalmente, se
liofilizó dando la cubeta lista para ser usada.
- 10
- cubeta
- 12
- parte de mango
- 14
- cavidad
- 16
- parte de análisis
- 18
- parte de pocillos
- 20
- pocillo
- 22
- elementos de pared lateral de pocillos
- 24
- parte de base
- 26
- primera superficie
- 28
- segunda superficie
- 30
- superficie de excitación
- 32
- superficie de base
- 26S
- primer lado del trapezoide
- 28S
- segundo lado del trapezoide
- 30S
- lado superior del trapezoide
- 32S
- lado de base del trapezoide
- 40
- componente R2 de reacción
- 44
- componente R3 de reacción
- 46
- componente R1 de reacción
- 48
- compuesto de anclaje
- 50
- conjugado
- 52
- complejo
- 54
- campo evanescente.
Claims (23)
1. Cubeta (10) para un dispositivo lector para
ensayos que utiliza el método de campo evanescente que
comprende:
- -
- al menos una parte (18) de pocillos que tiene al menos un pocillo (20) para alojar una disolución que contiene sustancias que van a someterse a ensayo; y
- -
- al menos una parte (24) de base que soporta elementos (22) de pared lateral de la parte (18) de pocillo y que proporciona una superficie (30) de excitación del pocillo (20);
en la que la parte (24) de base se
fabrica de un material ópticamente transparente y tiene una forma en
sección transversal de un trapezoide isósceles en un plano
(B-B) que corta perpendicularmente la superficie
(30) de excitación del pocillo (20), teniendo el trapezoide lados
(26S, 28S) primero y segundo de igual longitud y base paralela y
lados (32S, 30S)
superiores;
en la que la parte (24) de base comprende
además
- -
- una superficie (32) de base que está separada de y es paralela a la superficie (30) de excitación, siendo la sección transversal de la superficie (32) de base en dicho plano (B-B) el lado (32S) de base del trapezoide;
- -
- una primera superficie (26) para recibir un haz (34) luminoso de excitación de una fuente luminosa de excitación externa, siendo la sección transversal de la primera superficie (26) en dicho plano (B-B) el primer lado (26S) del trapezoide; y
- -
- una segunda superficie (28) opuesta a la primera superficie (26), siendo la sección transversal de la segunda superficie (28) en dicho plano (B-B) el segundo lado (28S) del trapezoide;
y en la que la parte (24) de base
se adapta para guiar el haz (24) luminoso de excitación al menos
parcialmente a lo largo de una trayectoria óptica circular desde un
punto de incidencia sobre la primera superficie (26) a través de
reflexiones sobre la superficie (30) de excitación, la segunda
superficie (28) y la superficie (32) de base de vuelta hasta el
punto de
incidencia.
2. Cubeta (10) según la reivindicación 1, en la
que la altura H del trapezoide viene dada por
H =
\frac{Asen(\beta - \gamma)}{2(- \ cos(\beta - \gamma) + sen(\beta -
\gamma) \
tan(\gamma))}
- \left(-
\frac{A}{2} + \frac{Asen(\beta - \gamma) \ tan(\gamma)}{2(- \
cos(\beta - \gamma) + sen (\beta - \gamma) \ tan(\gamma))}\right) \
tan(\beta +
\gamma),
en la que (90º - \gamma) es el
ángulo de la base del trapezoide entre el lado (32S) de base y el
primer lado (26S), n_{2} es el índice de refracción de la parte
(24) de base, A es la longitud del lado (30S) superior del
trapezoide
y
\beta \approx
\ arcsen
\left(\frac{sen(arctan(n_{2}))}{n_{2}}\right).
3. Cubeta (10) según la reivindicación 1 ó 2, en
la que el ángulo de reflexión del lado de base \delta = 90º -
(\beta + \gamma) es mayor que el arcsen (1 / n_{2}), siendo
n_{2} el índice de refracción de la parte (24) de base y
\beta \approx
\ arcsen
\left(\frac{sen(arctan(n_{2}))}{n_{2}}\right).
4. Cubeta (10) según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el ángulo de reflexión del
lado de excitación \varepsilon = 90º - (\beta - \gamma) es
mayor que el arcsen (1 / n_{2}), siendo n_{2} el índice de
refracción de la parte (24) de base y
\beta \approx
\ arcsen
\left(\frac{sen(arctan(n_{2}))}{n_{2}}\right).
5. Cubeta (10) según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el trapezoide es
sustancialmente un rectángulo que tiene una altura H y una anchura A
y A / H \approx n_{2}.
6. Cubeta (10) según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la parte (18) de pocillos y
la parte (24) de base se forman unitariamente de un material de
resina, que comprende preferiblemente PMMA, poliestireno,
policarbonato, SAN, copolímero de olefina cíclica o poliolefina.
7. Cubeta (10) según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la cubeta (10) comprende una
pluralidad de pocillos (20).
8. Cubeta según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en la que la superficie (30) de excitación
es hidrófila.
9. Cubeta según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en la que la superficie (30) de excitación
se recubre al menos parcialmente con un compuesto hidrófilo.
10. Cubeta según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en la que se inmoviliza un compuesto como
componente R1 de reacción sobre la superficie (30) de excitación
opcionalmente recubierta, teniendo dicho componente R1 de reacción
una afinidad por la sustancia que se está sometiendo a ensayo como
componente R2 de reacción.
11. Cubeta según la reivindicación 10, en la que
dicho componente R2 de reacción comprende un resto que contiene un
fluoróforo.
12. Cubeta según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en la que se inmoviliza un compuesto de
anclaje para un compuesto como componente R1 de reacción sobre la
superficie (30) de excitación opcionalmente recubierta, teniendo
dicho componente R1 de reacción una afinidad por la sustancia que se
está sometiendo a ensayo como componente R2 de reacción.
13. Cubeta según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12, en la que dicho componente R1 de reacción
o dicho compuesto de anclaje están presentes en forma
liofilizada.
14. Cubeta según la reivindicación 13, en la que
dicho componente R1 de reacción liofilizado o dicho compuesto de
anclaje liofilizado está recubierto por una capa de separación
liofilizada que contiene uno o más compuestos tampón, uno o más
compuestos proteicos, uno o más compuestos hidrófilos o uno o más
agentes complejantes / anticoagulantes y opcionalmente compuestos
bacteriostáticos, o una mezcla que contiene uno o más de estos
constituyentes.
15. Cubeta según la reivindicación 14, en la que
dicha capa de separación liofilizada está cubierta por un
liofilizado que comprende o bien
(A) un compuesto que contiene un fluoróforo o un
compuesto como componente R3 de reacción o una mezcla de los mismos,
siempre que el componente R1 de reacción esté inmovilizado sobre la
superficie (30) de excitación; o
(B) un componente R1 de reacción o un compuesto
que contiene un fluoróforo o un compuesto como componente R3 de
reacción o una mezcla de los mismos que contiene dos o tres de
ellos, siempre que el compuesto de anclaje esté inmovilizado sobre
la superficie (30) de excitación;
teniendo dicho componente R3 de reacción afinidad
por la sustancia que se está sometiendo a ensayo como componente R2
de reacción, en el que dicho componente R3 de reacción comprende
opcionalmente un resto que contiene un fluoróforo, y teniendo dicho
compuesto que contiene un fluoróforo afinidad por el componente R2
de reacción o por el componente R3 de reacción.
16. Procedimiento para la preparación de una
cubeta según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, que
comprende la etapa de:
(a) inmovilizar el componente R1 de reacción o
dicho compuesto de anclaje sobre la superficie (30) de excitación de
la cubeta definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
9.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, que
comprende además las etapas de:
(b) aplicar una disolución I congelable que
contiene uno o más compuestos tampón, uno o más compuestos
proteicos, uno o más compuestos hidrófilos o uno o más agentes
complejantes / anticoagulantes y opcionalmente compuestos
bacteriostáticos, o una mezcla que contiene uno o más de estos
constituyentes, sobre dicho componente R1 de reacción inmovilizado o
dicho compuesto de anclaje inmovilizado; y
(c) congelar dicha disolución I para obtener una
capa de separación congelada.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en
el que se liofiliza la disolución I congelada tras la etapa (c).
19. Procedimiento según la reivindicación 17, que
comprende además las etapas de:
(d) aplicar una disolución II congelable que
contiene o bien (A) un compuesto que contiene un fluoróforo o un
compuesto como componente R3 de reacción o una mezcla de los mismos,
siempre que el componente R1 de reacción esté inmovilizado sobre la
superficie (30) de excitación, o bien (B) el componente R1 de
reacción o el compuesto que contiene un fluoróforo o un compuesto
como componente R3 de reacción o una mezcla de los mismos que
contiene dos o tres de ellos, siempre que el compuesto de anclaje
esté inmovilizado sobre la superficie (30) de excitación, sobre
dicha capa de separación congelada;
(e) congelar dicha disolución II para obtener una
disolución II congelada sobre la disolución I congelada; y
(f) liofilizar el contenido congelado en la
cubeta para obtener un liofilizado.
20. Uso de la cubeta según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15 en diagnósticos médicos o médico
veterinarios, análisis de alimentos, análisis medioambientales,
análisis químicos o biológicos, o análisis de procesos de
fermentación.
21. Uso de la cubeta según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15 para una determinación cualitativa y/o
cuantitativa de sustancias a través de reacciones inmunológicas.
22. Uso de una cubeta según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13 para la determinación cualitativa y/o
cuantitativa de sustancias a través de reacciones inmunológicas, que
incluye las etapas de:
- poner en contacto con el componente R1 de
reacción inmovilizado o con el compuesto de anclaje inmovilizado o
con la capa de separación liofilizada una disolución que contiene la
sustancia que se está sometiendo a ensayo como componente R2 de
reacción y o bien (A) un compuesto que contiene un fluoróforo o un
compuesto como componente R3 de reacción o una mezcla de los mismos,
siempre que el componente R1 de reacción esté inmovilizado sobre la
superficie (30) de excitación, o bien (B) el componente R1 de
reacción o un compuesto que contiene un fluoróforo o un compuesto
como componente R3 de reacción o una mezcla de los mismos que
contiene dos o tres de ellos, siempre que dicho compuesto de anclaje
esté inmovilizado sobre la superficie (30) de excitación, en el que
se forma un complejo sobre el componente R1 de reacción inmovilizado
o sobre el compuesto de anclaje inmovilizado, conteniendo dicho
complejo o bien
- (i)
- un componente R1 de reacción y un componente R2 de reacción que comprende un resto que contiene un fluoróforo o un compuesto que contiene un fluoróforo conjugado al mismo; o
- (ii)
- un componente R1 de reacción, un componente R2 de reacción y un componente R3 de reacción que comprende un resto que contiene un fluoróforo o un compuesto que contiene un fluoróforo conjugado al mismo; o
- (iii)
- un componente R1 de reacción, un componente R2 de reacción, un componente R3 de reacción y un compuesto que contiene un fluoróforo; o
- (iv)
- el compuesto de anclaje, un componente R1 de reacción y un componente R2 de reacción que comprende un resto que contiene un fluoróforo o un compuesto que contiene un fluoróforo conjugado al mismo; o
- (v)
- el compuesto de anclaje, un componente R1 de reacción, un componente R2 de reacción y un componente R3 de reacción que comprende un resto que contiene un fluoróforo o un compuesto que contiene un fluoróforo conjugado al mismo; o bien
- (vi)
- el compuesto de anclaje, un componente R1 de reacción, un componente R2 de reacción, un componente R3 de reacción y un compuesto que contiene un fluoróforo; y
- excitar el fluoróforo unido a la superficie
(30) de excitación a través de dicho complejo mediante el campo
evanescente de una fuente luminosa y medir la fluorescencia
producida.
23. Uso de una cubeta según la reivindicación 15
para una determinación cualitativa y/o cuantitativa de sustancias a
través de reacciones inmunológicas, que incluye las etapas de:
- poner en contacto con el contenido liofilizado
de la cubeta, una disolución que contiene la sustancia que se está
sometiendo a ensayo como componente R2 de reacción, en el que se
forma un complejo sobre el componente R1 de reacción inmovilizado o
sobre el compuesto de respuesta inmovilizado, conteniendo dicho
complejo o bien
- (i)
- un componente R1 de reacción y un componente R2 de reacción que comprende un resto que contiene un fluoróforo o un compuesto que contiene un fluoróforo conjugado al mismo; o bien
- (ii)
- un componente R1 de reacción, un componente R2 de reacción y un componente R3 de reacción que comprende un resto que contiene un fluoróforo o un compuesto que contiene un fluoróforo conjugado al mismo; o
- (iii)
- un componente R1 de reacción, un componente R2 de reacción, un componente R3 de reacción y un compuesto que contiene un fluoróforo; o
- (iv)
- el compuesto de anclaje, un componente R1 de reacción y un componente R2 de reacción que comprende un resto que contiene un fluoróforo o un compuesto que contiene un fluoróforo conjugado al mismo; o
- (v)
- el compuesto de anclaje, un componente R1 de reacción, un componente R2 de reacción y un componente R3 de reacción que comprende un resto que contiene un fluoróforo o un compuesto que contiene un fluoróforo conjugado al mismo; o
el compuesto de anclaje, un
componente R1 de reacción, un componente R2 de reacción, un
componente R3 de reacción y un compuesto que contiene un fluoróforo;
y
- excitar el fluoróforo unido a la superficie
(30) de excitación a través de dicho complejo mediante el campo
evanescente de una fuente luminosa y medir la fluorescencia
producida.
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