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Die
Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur Oberflächenplasmonenresonanzmessung mit
einer wenigstens eine Küvette
umfassenden Küvetteneinheit
und mit einem Transducerprisma, das einander gegenüberliegende
Seitenflächen
für den Eintritt
bzw. den Austritt von Lichtstrahlen sowie eine der Küvetteneinheit
bodenseitig zugeordnete Oberseite mit einer aufgebrachten Schicht
eines Freielektronenmetalls aufweist.
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Eine
derartige Vorrichtung ist aus
WO 95/22754 bekannt.
Dort wird mittels Oberflächenplasmonenresonanz
gemessen, wobei eine Küvette mit
einer Probenaufnahmekammer und ein Prisma mit Seitenflächen vorgesehen
sind, und die Oberseite des Prismas mit einer Freielektronen aufweisenden
Schicht aus Gold belegt ist. Dabei sind jedoch die Küvetteneinheit
und das Prisma einstückig
und becherförmig
mit dem Prisma als Boden der Küvette ausgebildet,
was das Anbringen der Goldschicht erschwert und insbesondere die
Durchführung
von Reihenmessungen mit verschiedenen Proben zeitaufwendig macht.
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In
einem Oberflächenplasmonenresonanzsensor
werden die optischen Eigenschaften in der Nähe einer Oberfläche, an
der Oberflächenplasmonen
angeregt werden können,
beobachtet. Oberflächenplasmonen
sind kollektive Anregungen der freien Elektronen in einer Grenzschicht
von einem Freieelektronenmetall und einem Dielektrikum. Oberflächenplasmonen
können
optisch angeregt werden durch ein evaneszentes Feld, das bei der
Totalreflektion von Licht auftritt. Die Techniken zur Anregung von
Oberflächenplasmonen
und der Einsatz dieses optischen Effektes für Zwecke der Charakterisierung der
optischen Eigenschaften von Schichten in der Nähe der Oberflächenplasmonen
tragenden Oberfläche
sind im Stand der Technik beschrieben [Raether].
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Die
im Stand der Technik [Pharmacia Biosensor AB, Raether, Liedberg]
beschriebenen Transducer verwenden ebene Prismen, oder Zylinderprismen
zur Einkopplung des evaneszenten Feldes in eine Metallschicht, die
sich entweder direkt auf dem Prisma oder aber auf einer Sensorplatte
befindet, die mit Hilfe einer Brechungsindex-anpassenden Flüssigkeit
oder aber mit Hilfe einer Zwischenschicht aus Silikonkautschuk an
das Prisma angekoppelt wird. Dabei wird der Einstrahlwinkel eines
einfallenden Lichtstrahls variiert, oder aber es wird konvergentes Licht
mit einem bestimmten Öffnungswinkel
unter einem bestimmten Winkel in den Transducer eingestrahlt. Die
Oberflächenplasmonenresonanz
tritt bei einem bestimmten Einstrahlwinkel auf. Die Position dieses
Resonanzwinkels hängt
von den optischen Eigenschaften der Schichten ab, die an die Metallschicht
angrenzen.
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Allein
die Verwendung eines Prismas, das fest in den optischen Aufbau des
Sensors integriert ist und an das auswechselbar ein Sensorplättchen mit
Hilfe einer brechungsindexanpassenden Silikonkautschukschicht angekoppelt
ist, hat bisher den Einsatz der SPR in kommerziellen Sensorsystemen,
insbesondere Biosensorsystemen ermöglicht. Den erfolgreichen kommerziellen
Einsatz von Systemen, in denen die optische Ankopplung eines Sensorplättchens
an das gerätefeste
Transducerprisma mit brechungsindexanpassenden Flüssigkeiten
erfolgt, verhindert insbesondere die Verschmutzungsgefahr für das Prisma
durch Verschleppung der brechungsindexanpassenden Flüssigkeit
beim Wechsel des Sensorplättchens
oder die Gefahr der Verschmutzung des Prismas durch Kriechen der
brechungsindexanpassenden Flüssigkeit
während
des Betriebes des Sensors. Ein Wechsel des Trägers der Metallschicht, in
der die Oberflächenplasmonen
erzeugt werden, ist wiederum unabdingbar für die Tauglichkeit von Oberflächenplasmonenresonanzsensoren.
Dies gilt insbesondere für
Biosensorsysteme, in denen die Metalloberfläche entweder direkt oder mittelbar über eine angekoppelte
erste Schicht durch feste Ankopplung von spezifischen Bindungspartnern
für das
zu analysierende Biomolekül
funktionalisiert wird. Die Austauschbarkeit der Oberflächenplasmonen
tragenden Metallschicht bzw. des Trägers dieser Metallschicht ist
essentielle Voraussetzung für die
Anwendbarkeit des Systems. Da in einem Biosensorsystem insbesondere
dann, wenn es für
den Einsatz in der Erforschung von biologischen Systemen und nicht
allein für
die Bewältigung
von Routine-Meßaufgaben
verwendet wird, viele verschiedene Fragen beantwortet werden sollen,
ist die Auswechselbarkeit nur dann gegeben, wenn die Kosten des
auszuwechselnden Teiles genügend
niedrig sind. In diesem Zusammenhang sind bisher kommerzielle Transducerprismen, die
direkt mit der Freieelektronenmetall-Schicht versehen sind, keine
konkurrenzfähige
Alternative zu Systemen, in denen ein Sensorplättchen auswechselbar an ein
fest im optischen Aufbau integriertes Prisma angekoppelt wird.
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Aus
Thiel, A. J.: „In
Situ surface Plasmon Rsonance Imaging Detection of DANN Hybridization to
Oligonucleotide Arrays of Gold Surfaces", Analytical Chemistry, Vol 69, 1997,
S. 4948–4956
ist bereit eine zweiteilige Messvorrichtung zur Oberflächenplasmonenresonanzmessung
bekannt, die ein Transducerprisma mit glatter oberseitiger Goldbeschichtung
aufweist, auf die ein Aufsatzteil mit unterseitigem umlaufenden
Dichtungsring aufgesetzt ist. Dieses Aufsatzteil ist blockförmig mit
zwei von seiner Oberseite zur Unterseite durchgehenden Kanälen ausgebildet,
die an der Blockunterseite durch eine nutförmige Aussparung in der Blockunterseite
miteinander verbunden sind. Das Aufsatzteil ist also nicht wie eine
Küvette
ein Gefäß zur Aufnahme
einer zu untersuchenden einzelnen Probe, es dient vielmehr zur Bildung
eines Durchflußsystems
mit einer Strömung über die
Goldschicht. Bei solchen Durchflußsystemen ist die erforderliche
exakte Temperaturkontrolle wesentlich unproblematischer und einfacher
als bei der Verwendung von offenen Küvettensystemen. Auch sind bei
Küvettensystemen
mit der üblichen Probenzugabe
mittels einer Pipette ganz andere technische Probleme zu lösen als
beim Durchflußsystem.
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das Küvettensystem gemäß der eingangs
beschriebenen Vorrichtung so auszubilden, dass es bei einfacher
und preiswerter Herstellbarkeit vielseitig und mit hoher Leistung
einsetzbar sowie auch leicht zu reinigen ist.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch
gelöst,
dass die Küvetteneinheit
und das Transducerprisma als separate austauschbare Bauteile ausgebildet
sind, dass die bzw. jede Küvette rohrförmig ausgebildet
ist und am unteren Rohrende einen umlaufenden Dichtrand zur Anlage
an der Oberseite des Trasducerprismas aufweist und dass eine Halteanordnung
zur Aufnahme des Trasducerprismas und der Küvetteneinheit in ihrer gegeneinander
abgedichteten Betriebsstellung vorgesehen ist.
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Zweckmäßige Ausgestaltungen
und Weiterbildungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
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Ein
solcher Transducer vereinigt die Aufgabe der Einkopplung des SPR-anregenden
Lichtes, der Erzeugung der Oberflächenplasmonen, gegebenenfalls
der Bereitstellung einer Schicht zur Verhinderung unspezifischer
Adsorption und Ankopplung von spezifisch bindenden Bindungspartnern
für den
zu untersuchenden Analyten.
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Außerdem wird
ein System beschrieben, das den eigentlichen, auswechselbaren Transducer
an ein Küvettensystem
ankoppelt. Dabei ist das Küvettensystem
selbst wieder unabhängig
vom Transducer austauschbar. Die Transducer/Küvetteneinheit wird im Sensorsystem
plaziert.
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Ein
austauschbarer SPR-Transducer erfüllt insbesondere alle physikalischen
Randbedingungen, die zur Einkopplung des SPR-anregenden Lichtes notwendig sind. Seine
Abmaße
sind an das Sensorproblem angepaßt. Gleichzeitig sind seine
Abmaße derart
angepaßt,
daß seine
Kosten genügend
niedrig sind, um den Austausch zu ermöglichen. Dazu wird das Volumen,
insbesondere die Dicke des Transducers und die Größe der Flächen, durch
die das plasmonenanregende Licht eingekoppelt bzw. ausgekoppelt
wird, minimiert. Die Minimierung des Volumens des Transducers führt zu Kostenersparnissen
im Bereich Materialpreis, und senkt die Kosten insbesondere für die Arbeitsschritte
Aufbringen einer Schicht des Freieelektronenmetalls, Aufbringen
der speziellen Biosensorschichten und Handhabung. Die Minimierung
der Dicke gestattet z. B. die Verwendung von Floatglas. Die Minimierung
der optischen Flächen
verringert die Kosten für
die Bearbeitung (Polieren) dieser Flächen.
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Sofern
die Winkelabhängigkeit
der Position der Oberflächenplasmonenresonanz
beobachtet wird, überdeckt
das Licht, das in einen Oberflächenplasmonenresonanztransducer
eingeleitet wird, einen bestimmten Winkelbereich. Dementsprechend wird
das Transducerprisma, das die Einkopplung von Licht dieses Winkelbereiches
optimal gestattet, ausgebildet.
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Im
folgenden wird anhand von Beispielen und der Zeichnung die Erfindung
näher erläutert. Es zeigen:
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1a)
bis 1c) eine Ansicht von unten, eine Seitenansicht
und eine Vorderansicht eines Ausführungsbeispiels eines Transducers
aus BK7-Glas für
die Verwendung in Biosensorgeräten,
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2a)
bis e) Ansichten einer erfindungsgemäßen Ausführungsform einer Transducer-Küvetteneinheit,
und
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3 eine
vergrößerte Schnittansicht
eines Teils der in 2b gezeigten Anordnung (spiegelverkehrt).
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In 1a)
bis 1c) ist ein Transducer in drei Ansichten gezeigt, der eine Länge L, eine
Breite W und eine Höhe
H aufweist. Das Transducerprisma besteht aus BK7-Glas. Wie insbesondere
aus der 1c) hervorgeht, hat das Prisma
im Querschnitt die Form einer stumpfen Pyramide. Die Basisfläche des
Prismas ist mindestens teilweise, vorzugsweise im Meßfleckbereich,
auf dem eine zu untersuchende Probe mit dem Transducer in Berührung kommt,
mit einer Gold-Beschichtung 12 versehen. An die Goldoberfläche wird
in dem gezeigten Beispiel ein Hydrogel aufgebracht, und eine Schicht
zur spezifischen Adsorption von bestimmten zu untersuchenden Analyten.
Die schrägen
Seitenflächen
des Transducers sind in einem vorzugsweise mittleren Bereich als
Fläche 14 mit
optischer Qualität
ausgeführt.
Bei einer Messung wird durch eine der Flächen 14 das SPR-anregende
Licht eingekoppelt und auf der gegenüberliegenden Fläche 14 ausgekoppelt. 1c) zeigt
somit die Einfallsebene des Lichts.
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In
einem Biosensorsystem sollen im wesentlichen wäßrige Lösungen von Analyten untersucht werden.
Die Analyte sind meist Proteine, die beispielsweise an andere Proteine
binden, die über
eine ca. 100 nm dicke Schicht eines Hydrogels fest an eine Goldoberfläche gekoppelt
sind. Dabei hat reines Wasser einen Brechungsindex von ca. 1,33,
ein typisches Protein einen Brechungsindex von ca. 1,44, das Hydrogel
einen entsprechenden mittleren Brechungsindex, der sich aus den
Anteilen Wasser/Protein und enventueller Substanzen, wie Salze,
die dem Wasser zugegeben wurden, ergibt. Der Brechungsindex von
BK7-Glas beträgt
ca. 1,51. In einem solchen System variiert der Resonanzwinkel ca.
zwischen 66° und
80°, wenn
zur Beobachtung der Resonanz Licht mit einer Wellenlänge von
ca. 780 nm eingestrahlt wird und die Dicke der aufgedampften Goldschicht
ca. 50 nm beträgt.
Für entsprechende
Systeme, die als Grundmaterial Gläser mit anderen Brechungsindizes
verwenden (z. B SF 10-Glas, n ca. 1,72), ändert sich der Variationsbereich
des Resonanzwinkels entsprechend. Die Höhe H des Prismas 10 (siehe 1c)
richtet sich nach diesem Winkelbereich und der Ausdehnung der Breite
W der Prismengrundfläche
parallel zur Einfallsebene des Lichtes. Dabei liegt der Reflektionspunkt
des einfallenden Lichtes auf der Mittelachse des Transducers senkrecht
zur Einfallsebene des Lichtes. Ebenfalls berücksichtigt wird der Basiswinkel α: die Breite
W des Prismas 10 (siehe 1a) ergibt
sich im wesentlichen aus der Ausdehung des Reflektionspunktes, der
noch handhabbaren Küvettengröße und besonders
wesentlich aus der aufgrund der Bearbeitungstechnik minimal möglichen
Höhe h2,
an der der Strahl mit dem flachsten Einfallswinkel auf die Einfallsfläche des
Prismas trifft. Diese Höhe
h2 (siehe 1b) beträgt aufgrund des Vorhandenseins
von Kantenausbrüchen
ca. 0,2 mm. Damit ergibt sich eine Breite W des Transducerprismas
von ca. 10 mm als Optimum. Die Eintrittshöhe h1 + h2 bei der der Strahl
mit dem steilsten Einfallswinkel auf die Eintrittsfläche trifft
ergibt sich entsprechend. Aus dieser Höhe und dem Randbereich ergibt
sich die optimale Höhe
des Prismas. Der optimale Basiswinkel α des Prismas ist unter Berücksichtigung
der Gleichförmigkeit
der Reflektionseigenschaften der Ein- und Austrittsflächen der Mittenwinkel
des Einstrahlwinkelbereiches. Er kann allerdings unter Bearbeitungsgesichtspunkten
sogar bis 90° variieren.
Die Eintrittsflächen
weisen optische Qualität
auf. Im beschriebenen System ist das Prisma damit ca. 10 mm breit
und ca. 2 mm hoch und besitzt einen Basiswinkel von ca. 73°. Die Länge L des Prismas
ergibt sich aus der Größe des Bereiches,
der für
die Applikation von Probe zur Verfügung gestellt werden muß. Dieser
ergibt sich insbesondere fertigungstechnisch aus den Abmassen des
Flüssigkeitshandlingsystems,
mit dem Proben auf die Meßoberfläche appliziert
werden und der gewünschten
Anzahl der verwendeten Meßflecken.
Beispielsweise ergibt sich L zu ca. 20–25 mm, wenn die Proben in Küvetten mit
einer Ausdehnung von ca. 2,5 mm (inkl. Wandungen) und 8 Küvetten auf
den Transducerchip gebracht werden.
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Die 2a)
bis e) zeigen eine bevorzugte Ausführungsform einer Transducer-Küvetteneinheit. Eine
Halteanordnung 20 weist im vorderen Bereich eine untere
Andruckplatte 22 auf (siehe 2a). An der
Oberseite ist ein um eine Achse 25 verschwenkbarer Andruckhebel 26 angeordnet.
Am freien Ende des Andruckhebels 26 ist ein sich dazu quer
erstreckender Halteteil 27 angeordnet, der klinkenartig
in eine Rastverbindung mit einer gegenüberliegenden Wand 28 in
Eingriff bringbar ist, wobei der Eingriff durch Verschwenken des
Halteteils 27 wieder lösbar ist
(vgl. 2b). Der Andruckhebel 26 weist
eine längliche Öffnung 29 auf,
durch die die im vorderen Teil angeordnete Küvetteneinheit 30 zugänglich ist. Dabei
hält der
Andruckhebel 26 in der eingerasteten Stellung die Küvetteneinheit 30 und
drückt
die Küvetteneinheit
gegen das im Innern darunter angeordnete Transducerprisma (nicht
dargestellt).
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3 zeigt
eine vergrößerte Schnittansicht des
vorderen Teils der Ausführungsform
von 2. Der Andruckhebel 26 ist
in durchgezogener Linie noch geöffnet
gezeigt und in gestrichelter Linie in der eingerasteten Stellung
gezeigt. Auf der Andruckplatte 22 ist in einer Ausnehmung
ein Transducerprisma angeordnet, das vorzugsweise die unter Bezugnahme
auf die 1a) bis c) beschriebene Ausführungsform
ist. Dabei ist das Prisma 10 im Längsschnitt gezeigt, d. h. entlang
der Mittellinie zwischen den Flächen 14 mit
optischer Qualität.
Die Gold-Beschichtung 12 weist in der Figur nach oben und
trägt eine Schicht
zur spezifischen Bindung für
zu untersuchende Analyten. An dieser Seite ist die Küvetteneinheit 30 angeordnet,
die im gezeigten Beispiel acht in einer Reihe angeordnete Küvetten 32 aufweist.
Die Küvetten 32 sind
rohrförmige
Hohlräume,
wobei die Oberseite des Transducers 10 jeweils den Boden
der einzelnen Küvette 32 bildet.
An der Unterseite jeder Küvette 32 ist
ein umlaufender Dichtrand 34 vorgesehen, der die Seitenwand
jeder Küvette
gegen die Oberseite des Transducers abdichtet, wenn mittels des
Andruckhebels 26 die Küvetteneinheit 30 in
der Zeichnung nach unten gedrückt
wird. Die einzelnen Küvetten
werden über
die nach oben gerichtete Öffnung
durch die im Andruckhebel 26 vorhandene Längsöffnung 29 befüllt. Die
Befüllung
mit Probenlösung
erfolgt vorzugsweise mit einem Pipettiersystem, wobei dieses Pipettiersystem
Teil eines Biosensorgerätes
ist, in das die Halteanordnung mit dem vorbereiteten Transducer
und der vorbereiteten Küvetteneinheit
eingeführt
wird.
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Innerhalb
des Biosensorgerätes
sind mindestens eine Lichtquelle, eine optische Einrichtung und
eine Detektoranordnung vorgesehen. Beim Einführen der Halteanordnung in
das Gerät
wird das Transducerprisma in die gewünschte Lage gebracht. Vorzugsweise
wird für
die relative Ausrichtung in der x-Richtung die Vorderfläche des
Transducerprismas als Referenz verwendet. Bevorzugt wird für die relative
Ausrichtung in der y-z-Ebene (Richtung entlang der Projektion des
Lichtweges auf die reflektierende Fläche, Höhe) die Oberkante des Transducerprismas entlang
der Seitenkante(n) verwendet. Die Referenzpunkte an dem Transducerprisma
sind über
zugehörige
Aussparungen in der Halteanordnung zugänglich.
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Die
in den 2 und 3 gezeigte
Halteanordnung 20 besteht vorzugsweise aus Kunststoff und
wird im Spritzgußverfahren
hergestellt. In gleicher Weise wird die Küvetteneinheit 30 vorzugsweise aus
Kunststoff im Spritzgußverfahren
hergestellt. Besonders bevorzugt wird Polypropylen als Kunststoffmaterial.
Die erfindungsgemäße Transducer-Küvetteneinheit
ist einfach und preiswert herstellbar. Modifikationen sind ohne
weiteres möglich,
wobei insbesondere einzelne oder mehrere Teile der vorstehend beschriebenen
Anordnung ausgetauscht oder verändert
werden können.
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Literaturliste
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- 1. H. Raether, Surface Plasmons an Smooth and Rough
Surfaces and an Gratings, Springer Tracts in Moden Physics, 111,
Springer-Verlag, Berlin, 1988
- 2. Pharmacia Biosensor AB, EP 444 921 A1 , EP 442 922 A1
- 3. B. Liedberg, C. Nijlander, L. Lundström, Sensors and Actuators 4
(1983), S. 169 ff.