JPH03501294A

JPH03501294A - 分析方法及びキット

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Publication number: JPH03501294A
Application number: JP1503799A
Authority: JP
Inventors: フラナガン，マイケル　トーマス; アシュワァース，ロバート　ヘドル
Original assignee: アプライド　リサーチ　システムス　エー　アール　エス　ホールディング　エヌ　ヴイ
Priority date: 1988-03-29
Filing date: 1989-03-28
Publication date: 1991-03-22
Anticipated expiration: 2012-01-16
Also published as: EP0359807A1; NO176293B; DE68919395T2; GB8807488D0; NO176293C; JP2571971B2; CA1332206C; NO894744L; ATE114192T1; AU3361889A; WO1989009408A1; NO894744D0; AU632477B2; DE68919395D1; EP0359807B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】分析方法本発明は分析技術及び該技術を実行するための手段に関する。

特に、より優れた信号対雑音比及び感度を提供する分析技術の改良に関する。

螢光分析、例えば分析の一つの構成要素が導波管のインターフェースに固定された螢光免疫分析では、表面（要求される信号）に結合された、ラベル付けされた別の分析試液から螢光放射と、好ましくない雑音信号を与える溶液内に依然存在する上記側の試液からの螢光放射とを識別するという問題を生起させる。

これら結合及び非結合試液の２つの個体間の差が大きい程分析の信号対雑音比及び感度が向上する。

以下に述べる本発明は固定された検出試液Ｙ′例えば抗体の上或いは近くの試液Ｘに結合された発蛍光団と、場合によっては導波管上、導波管内、或いは固定されたフィルム支持体内に固定された染料との間の共鳴エネルギ移動工程（ＦｏｒｓｔｅｒＥｎｅｒｇｙ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ；Ｔｈ、Ｆｏｒｓｔｅｒ、八ｎｎ、Ｐｈｙｓ、２．５５−７５　（１９５８）を参照されたい）と組合せた光学導波管の消失性フィールド特性を利用するものである。

エネルギの移動により達成される型の均質分析における結合及び自由試液間の差が分子の大きさと交差して効果的に生じるだけであり、従って複合体の形成にしか見られないであろう。

公知となっている消失性導波管の分析は、消失性波の浸透が分子の大きさを越える無視できるものであり、従って、複合体のラベルを励起するだけであるという推測に基づいたものである。しかし、実際にはこの推測は簡略化し過ぎたものであり、かかる分析の感度は期待したものよりも低い。

本発明の一つの側面によれば、（Ａ）　以下の要素（ａ）〜（ｅ）を同時に、或いは所望の順序で温間する工程と；（ａ）　サンプル；（５）第１エネルギ受容体にラベル付けされた試液Ｘ；（Ｃ）　光学導波管の表面に直接或いは間接的に固定された試液Ｙ；（ｄ）　光学導波管の表面に直接或いは間接的に（望むのであれば試液Ｙを介して）固定された、或いは前記導波管内に固定された第２エネルギ受容体；（ｅ）　望むのであれば、前記第１或いは第２受容体と同じ或いは異なり、光学導波管の表面上或いは内部に直接或いは間接的に固定された少なくとも１つの別のエネルギ受容体；前記試液Ｘ及びＹの一方が前記配位子に対して特定の結合パートナを有し、また他方が配位子アナログ或いは配位子ノ特定の結合パートナを有し、前記第１及び第２エルギ受容体の一方は、他方の電子吸収スペクトルと重複した電子放射スペクトルの発螢光団（供与体発蛍光団）を有し；（Ｂ）　前記供与体発蛍光団を励起するのに適した波長の電子放射をもって前記光学導波管を放射する工程と；（Ｃ）　第１及び第２エネルギ受容体間或いは第２及び第１エネルギ受容体間のそれぞれで共鳴エネルギの移動が直接或いは間接的に起こるのかどうか、また望むのであればその程度或いはその確率またはその両方を検知する工程と；よりなり、前記放射工程（Ｂ）は導波管に沿った電磁放射伝播により消失性フィールドを用いて生じ、及び／或いは前記検知工程（Ｃ）は第１エネルギ受容体の螢光或いはもしあれば第２エネルギ受容体の螢光の導波管に結合する消失性フィールドを利用してなる、サンプルにおける配位子の分析方法が提供される。

ここで用いられる「配位子アナログ」という用語は分析下での配位子と同じ特定の結合パートナの同じ結合位置と複合できる種類を意味し、！堡、分析中の配位子の公知となっている分量はその範囲内に含まれる。

ここで用いられている「エネルギ受容体」という用語は例えば染料或いは発螢光団等の電子エネルギを吸収できる化合物を示す、典型的なエネルギ受容体としては例えば、コマリン、フルオレセイン、ルシファーイエロー、ローダミン科、フィコビリプロティン及びニドプシンが含まれ、またエネルギ受容体の特定の例としてはフルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１２３、Ｒ−フルオレセイン、Ｃ−フィコシアニン、アロフィコシアニン、フルオレスカミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ　）　、ルシファーイエローＶＳ及びルフファーイエローＣＨが含まれる。上述のように、第１及び第２エネルギ受容体の一方は供与体発蛍光団である。また他方は受容体発螢光団或いは受容体染料であっても良い、適切な波長のｔ磁放射による供与体発蛍光団の励起及び試液Ｘ及びＹ間の直接或いは間接的な複合体がエネルギ受容体間の直接或いは間接的な共鳴エネルギの移動を促進するように、エネルギ受容体は選択される。従って、第１及び第２エネルギ受容体がそれぞれ供与体発蛍光団と受容体染料或いは受容体染料と供与体発蛍光団を有するとき、供与体発蛍光団の螢光は消光し、また第１及び第２エネルギ受容体がそれぞれ供与体発蛍光団と受容体発蛍光団、或いは受容体発蛍光団と供与体発蛍光団を有する時、供与体発蛍光団は消光し、受容体発蛍光団は螢光する（しかし、受容体発蛍光団の螢光には非常に低い効果しかない。

例示することだけを目的として、本発明における供与体発蛍光団及び受容体発蛍光団として用いるのに適した一対の代表的な化合物を下の表１に列挙する。

フルオレセイン　イソチオシアネート　ローダミ　ンＢＲ−フィコエリトリン　アロフィコシアニンフルオレセイン　イソチオシアネート　Ｒ−フィ　コニ　リ　ト　リ　ンロータミンＢ　アロフィコシアニンフルオレスカミン　ルシファーイエロー■ＳＣ−フィコシアニン　Ｒ−フィコエリトリン少なくとも１つの新たなエネルギ受容体が構成要素（ｅ）として存在すれば、２つ以上の共鳴エネルギ移動工程が生じるかも知れない、従って、例えば第１エネルギ受容体が受容体染料であり、第２エネルギ受容体が供与体発蛍光団であり、そして受容体発蛍光団が化合物（ｅ）として存在すれば、試液Ｘ及びＹ間の複合体の形成は供与体発蛍光団及び受容体染料間の共鳴エネルギ移動を促進して、受容体染料は構成要素（ｅ）として存在する供与体発蛍光団及び受容体発螢光体の両方から放射される螢光を消光する。

第１及び第２エネルギ受容体間或いはそのｔ−１共鳴エネルギ移動が生じているかどうかを検知することで、供与体発蛍光団の螢光及び／或いはもしあれば受容体発蛍光団の螢光が消光するかまたはその両方を検知することが可能であろう、１つ或いはそれ以上の新たなエネルギ受容体が化合物（ｅ）として存在すれば、１つ或いはそれ以上の化合物の消光或いは螢光、またはその両方が検知されるかも知れない、従って、例えば第１エネルギ受容体が受容体染料であり、第２エネルギ受容体が供与体発蛍光団であり、また受容体発蛍光団が化合物（ｅ）として存在すれば、供与体或いは受容体発蛍光団またはその両方の螢光の消光が検知できるであろう。

試液χ及びＹの一方が配位子アナログを有し、また他方が配位子に対して特定の結合パートナを有していれば、試液Ｘ及びＹ間の複合体形成は直接起こる０代わりに、試液Ｘ及びＹの両方が配位子に対して特定の結合パートナを有していれば、試液Ｘ及びＹ間の複合物形成は配位子（サンプル内にある場合）を介して間接的に起こる。

試液Ｙは光学導波管の表面に直接的にでもまた間接的にでも固定できることを理解されたい。例えば、試液Ｙが抗体であれば、間接的な固定はそれ自体が光学導波管の表面に結合された試液Ｙに対する抗種類抗体により達成される。

このように光学導波管の表面への固定は抗体−抗原或いは抗体−パブチン内の免疫学的結合、或いは蛋白質及び配位子間、例えばアビディン及びビオチン間等の非免疫学的結合により生じる。

光学的導波管に適した材料として例えばガラス（例えばバルブロック（ｐｅｒｍａｂｌｏｃ）ガラス或いはクラウンガラス）、合成樹脂（例えばアクリル或いはポリスチレン）、シリカ及び石英が挙げられるが、原則として少なくとも分析に含まれる波長の放射を透き通す適切な屈折率の材料を使用して良い。

放射工程（Ｂ）及び検知工程（Ｃ）の両方共消失性フィールド結合を用いるのが好ましい。

共鳴エネルギ移動及び消失性結合の２つの技術を組合せることにより幾つかの利点が得られる。

１、消失性波の指数の減少を伴う共鳴移動の距離に依存するインバースシックススパワー（ｉｎｖｅｒｓｅ　５ｉｘｔｈ　ｐｏｗｅｒ）の渦巻きが導波管に近い励起範囲の局部化を抑制する。

２、励起する電磁放射及び放射された光間のストークス・シフトの頻度は供与対発螢光団またもしあれば受容対発螢光団を適切に選択することにより増加し、これにより信号を更に効果的に濾過する。

３、信号対雑音比は向上する。受容対発螢光団が存在すると、導波管の表面に受容体を固定することにより供与対の背景に直面する受容対発螢光団信号の測定が促進される。移動通路の数は導波管上或いは内に新たな供与対或いは受容対を固定することにより増やすことができる。

４、ストークス・シフトは別の発螢光団の種類を協働固定してより長い波長で放出することで更に増やすことができ、これにより移動工程のチェーンが生じる。

このような移動工程のチェーン及び移動通路の数の増加は従来の均質分析には効果的に組込むことはできない。

５、固定された発螢光団を適切に配列すれば、発螢光団のチェーンに沿った移動は更に効果的なものになろう。そのような配列は発螢光団の固定と組合せた液体水晶及びラングムイアープロジＪ、７ト（Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ）　ｌ！の沈澱物により達成される。

上述した光学導波管は「導波管センサ」という名称の、本願と同じ出願臼を有する同時係属出願（英国比１ＢＮｏ、８８０７４８６．９に対応）に記載されているような格子状の配列に選択的に盛り込んでも良い、上記移動技術にかかる格子状配列を組合せて用いることにより導波管センサ装置自体の内に放出されて励起している放射の分離及び濾過を行うことができ、外部のモノクロメータ或いは濾過機が不要となる。

欧州特願公開第１７１１４８号公報に記載され請求されている型の装置は分析される試験サンプルを本発明の方法に持ち込むのに優れているかも知れない。

放出された放射は例えば１つ或いはそれ以上の光電子増倍管等の従来の手段により検知される前に、望むのであれば濾過或いは規準またはその両方を行っても良い。

本発明の別の側面によれば、上記試液Ｘ　（ｉ）と；表面に上記試液Ｙが（直接或いは間接的に）固定されると共に、上部或いは内部に少なくとももう１つの上記エネルギ受容体が（直接或いは間接的に、また望むのであれば試液Ｙを介して）固定された導波管（ｉｉ）と；よりなる、上記分析方法を実行するためのキッドが提供される。

本発明の更に別の側面によれば、表面中に分析中の配位子用の特定の結合パートナ−或いは、配位子のアナログのいずれか一方（直接或いは間接的に）固定されると共に、内部には発螢光団或いは染料が固定された、光学導波管よりなる上述の分析方法に使用される装置が提供される。

配位子としての抗原について、試液Ｘ及びＹのそれぞれが抗体、即ち、サンドインチ型免疫分析よりなるという状況で本発明を以下に詳述する。しかし、本発明は例えば試液Ｘ及びＹの一方が抗体よりなり、他方が配位子アナログよりなるコンペティション型の免疫分析にも適用できる。

更に、本発明は抗体或いは抗原の分析に限定されるものではない。本発明の方法により分析できる配位子の例は、各ケースごとにおける適切な特定の結合パートナ−の表示と共に下の第２表に示されている。

紅配位子　特　の結合パートナ− 抗原　特定の抗体抗体　抗原ホルモン　ホルモン受容体ホルモン受容体　ホルモンポリヌクレオチド　補足ポリヌクレオチドストライド　ストライドアビディン　ビオチンビオチン　アビディンプロティンＡ　免疫グロブリン免疫グロブリン　フロティアＡ酵素　酵素共同因子（基質）或いは反応抑制剤酵素共同因子（基質）　酵素或いは反応抑制剤レクチン　特定の炭水化物レクチンの特定の　レクチン炭水化物本発明方法には非常に広く応用性があるが、特に、ペプチドホルモン（例えば甲状！刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、人体絨毛膜生殖腺刺激ホルモン（ｈｃｃ）、小胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インシュリン及びプロラクチン）を含むホルモン、或いはノンペプチドホルモン（例えばコーチソン、エストラジオール、プロゲステロン及びテストステロン、或いは甲状腺ホルモンチロキシン（Ｔ４）及びトリイオドチロニン（ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）等の甲状腺ホルモン）、プロティン（例えば癌胎児抗原（ＣＥＡ）及びアルファフェトプロティン（ａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）　（Ａ　Ｆ　Ｐ　）　）　、薬剤（例えばジゴキシン）、垢、毒素、ビタミン、インフルエンザ等のウィルス、バラインフルエンザ、アデノ、肝炎、呼吸器官の及びエイズウィルス或いは微生物を文勢するのに使用できる。

ここで用いられている「抗体Ｊという用語はその範囲に以下の点を含むものと理解されたい：（ａ）　例えば羊、うさぎ、やぎ或いはねずみ等の従来から使用されている動物から得られる例えばＩｇＧ、ＬｇＭ等の免疫グロブリンの種々のクラス或いはサブクラスの全て、（ｂ）　モノクロナル抗体（Ｃ）　抗体の完全な微粒子或いは「断片」、モノクロナル或いはポリクロナル（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）　、前記断片とは抗体の結合領域、即ちＦｃ部（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’　、Ｆ　（ａｂ’　）ｔのない断片、或いは完全な抗体内の重量％ェーンの構成要素を連結するデイスルフイデボンズ（ｄｉｓｕ］ｐｈｉｄｅ　ｂｏｎｄｓ）の減少した分裂により得られるいわゆる「半−微粒子」断片を有するものである。抗体の断片の作成方法は本技術分野で良く知られているのでここでは説明しない。

ここで使用されている「抗原」という用語は永久的な抗原種類（例えばプロティン、バクテリア、バクテリア断片、細胞、細胞断片及びウィルス）、及び適切な条件下で抗原にされるハブチンの両方を含むものと理解されたい。

本発明をより理解するために、添付図面を参照されたい。第１〜１０図は本発明による種々の分析形式を示し、第１１図は本発明方法を実行するのに通した装置の構成を示している。

図示されている実施例において、フォースター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）のエネルギ移動は励起された「供与体」発螢光団（Ｄ）から「受容体ｊ発螢光団（Ａ）に向って行われる。供与体発蛍光団は分析複合体が固定されている導波管内に案内される光の消失性フィールドにより励起されるか或いは導波管の上または下からの光により直接励起される。

螢光の放出は供与体発蛍光団及び受容体発蛍光団の両方またはどちらか一方により集められる。螢光放出は導波管モードに結合されるか、または（供与体発蛍光団が光の消失性フィールドにより励起された時）検出前に導波管を横切って移動される。

第１図は上に抗体４（試液Ｙ）が固定された光学導波管の表面２を示しており、該抗体は受容体発蛍光団とラベル付けされている。供与体発蛍光団（Ｄ）とラベル付けされている第２抗体６は試液Ｘとして存在する。

分析の間、サンプル中の抗原（即ち、配位子）はＡとラベル付けされた抗体４及びＤとラベル付けされた抗体６の両方の結合位置に結合され、これにより「サンドインチ複合体」を形成する。供与体発蛍光団は付随的な放射の吸収により電子的に励起される。そしてフォースターエネルギ移動１０は供与体発蛍光団り及び受容体発螢光団Ａ間で生じ、これにより受容体発蛍光団が電子的に励起され、供与体発蛍光団は不活性されてその螢光能力を失う。分析の間、両発螢光団のいずれかまたは両方からの螢光を測定しても良い。

第２図に示される本発明の別の実施例において、固定された試液Ｙは抗体のＦａｂ断片１２である。かかる断片を使用することで供与体及び受容体発蛍光団間の距離が短縮され、従ってエネルギ移動がより効果的になる。

この実施例では、受容体発蛍光団１４は光学導波管の表面に固定される。

第３図は第１図に示されている状態の逆を示している０固定された抗体２２（試液Ｙ）は供与体発蛍光団（Ｄ）とラベル付けされ、試液χは受容体発蛍光団（Ａ）とラベル付けされた第２抗体２４よりなる。

受容体発蛍光団の螢光の分量収率が非常に低い場合、螢光受容体からの放出のゼロ強さからの増加を検出するよりも供与体発蛍光団の放出の消失を検出するのが好ましい、受容体染料は受容体発蛍光団の制限されたケースを提供するのでその螢光分量収率は無視できる程低い。

第４図は受容体発蛍光団（Ａ）及びそれと同じ種類にラベル付けされた抗体３４が固定された導波管の表面を示している。

この構成は、供与体及び受容体間の距離を短縮すること及び移動通路の数を増やすことにより共用体発螢光団（Ｄ）からのエネルギ移動の効率を高める。

第５図は、第４図に示されている受容体発蛍光団とラベル付けされた固定された抗体４０及び固定された受容体発蛍光団に加え、重合体層４２も導波管の表面に固定れれている。この重合体層も受容体発蛍光団とラベル付けしても良く、またこれは供与体及び受容体発螢光団間の平均的な距離を短縮する役目を果たす。重合体を適切に選択すれば導波管の表面に対する抗体４６とラベル付けされた供与体発螢光団の非特定結合を減少する。かかる非特定結合は望ましくない雑音信号を発生する。

代わりに、第６図に示されるように受容体発蛍光団を導波管の表面内に吸収しても良い。これは上部導波管インターフェースを通る移動行為の螢光放出の損失を回避する。

第７図は供与体及び受容体発蛍光団の位置が逆になっている点を除き第６図と同様の実施例を示している。

第８図は受容体発蛍光団を加えると共にそれらを整列させる固定された分子マトリックスを示している。これは規準及び検出機構により集められた効果を向上させるために受容体発蛍光団の側面の角度を変える役目を果たす。供与体及び受容体の効果的な励起は第９図に示されるように整列される。

第１０図に示される本発明の更に別の実施例では、例えば染料（Ａ２）を螢光しないエネルギ受容体とラベル付けされた抗体５２の結合は供与体発螢光団（Ｄ）から受容体発蛍光団（Ａ１）へのエネルギ移動を減少させる。これはＡ１の消滅とエネルギ移動行程により導入された改良されたストークスシフトとを組合せる。

第４〜１０図に示される各実施例は、重合体の上或いは整列マトリックス内の導波管の表面での２つ以上の供与体或いは受容体種類を共同固定することにより、励起及び放出波長間の向上したストークスシフトが達成される。整列マトリックス自体が螢光体であっても良い。一つの螢光体種類から他の蛍光体種類へ連続して移動することにより高揚される。

第１１図は本発明による分析を実行するのに適した実験用の装置を示す０分析に適した波長の放射が光源６２から発生され、従来の機構のレンズにより規準した後、前記放射はスリット６３及びフィルタ６４を通過する。そこで生じた放射ビーム６５はチョッパ６６により接断され、その後ビームスリッタ６７により細長く切り開かれ、ビームの反射された部分（レフエレンスビーム）は中性濃度フィルタ６９を介して光電子増倍管６８内に入り、ビームの移動した部分は半開筒状のプリズム７０を介して透明で指標が合致した液体或いは接着剤によりプリズムに固着された導波管７１に入る。この例では、サンプル液は例えば毛細管充填装置（例えば欧州特願公開第１７１１４８号公報を参照されたい）に見られるような、導波管７１及び上部板７２間の毛細管の穴の中に流れる。プリズム７０からの光は２つ以上の適切なフィルタ７４を通過した後２つ以上の光電子増倍管７３により検出される。光電子増倍管６８，７３及びチョッパ６６はロックインアンプ７５により統合されている。光電子増倍管からの信号は所望する通り処理及び出力しても良い。

限定しない以下の例は本発明を説明するものである。

■上間の１°　膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の＼析この分析では、螢光によりラベル付けされた抗体はアナライ）　（ａｎａｌｙｔｅ　）配位子（ｈＣＧ）と、螢光とラベル付けされ導波管に連結された第２抗体とのサンドインチ複合体の形成結果として結合体となる。

初りｌ七追礼！（ｉ）アビディンによ　被イした導２管の製゛告１０　Ｘ　２０　Ｘ　１．１　ｍｍのガラス導波管は標準的なガラススクライビング技術を用いてパーマブロックガラス（Ｔ’ｉｌｋｉｎｇｔｏｎ　ＧｌａｓｓＬｔｄ、、　Ｈｅ１ｅｎｓ、英国）から切り離された。ガラスは洗剤及び超音波振動によって完全に洗浄された後、シラン（８％３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン）　（Ｆｌｕｋａ、　に１ｉｓｓｏｐ＋　英国））と共にＰ　Ｈ３，５で２時間活性化された。

その後ガラスは洗浄され、標準的な技術を用いてアビディンをガラスの表面に結合（例えばビシクラ外によるＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＩａＩｍｕｎｏａｓｓａｙ　↓５２０９−２３７　（１９８３）を参照されたい）するために適切なりロス −リンキング薬剤（例えば、Ｓ？ＩＣＣ，コハクアミディル（ｓｕｃｃｉｎｉｎｄｙｌ　４　（Ｎ−マレイミドメチル（Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）シクロヘサンー１−カルボキシレート（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｌｕｔｏｎ＋英国）或いはグルタミルアルデヒド）が使用された。その後ガラススライドは１０％のサッカローズ溶液と０．１％のカゼインで回転被覆され、使用するまで４°Ｃの乾燥状態で保管された。

（ｉｉ）ビオチン／Ｒ−フィコエリトリン　ｒｈＣＧ抗体の調モノクロナル抗ｈｃＧ抗体はＮａｔｕｒｅ２５６．４９５　４９７（１９７５）のＭｉｌｓｔｅｉｎ及びＭｏｈｌｅｒの方法によりねずみの腹水から得られた。個々の腫細胞の輪郭は抗原決定基を区別するために抗体を生み出すものを識別すべく仕切られた。

ｈＣＧに対する最も高い類似性を有する抗体は分析に使用するために選択された。１．４８ｅｇのＲ−フイコエリトリンは標準的な方法（Ｇｕｅｓｄｏｎ　ｅｔａｌ、　Ｊ　！ｌｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ　２７．　１１３１　（１９７９）を参照されたい）を有して０．３４　ｍｇのＮ−ヒドロキシーサクシニミド（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）ビオチンエステル（Ｓｉｇ＋ｎａ、　Ｐｏｏｌｅ。

英国）と混ぜられた。そこで得られたフィコエリトリンとビオチンの結合体はｐ　Ｈ０，９のソジウム重炭酸塩パフ１０．２　Ｍを使ったＰｈａｒｍａｃｉａ　ＰＤＩＯコラムを用いて浄化された。抗体Ａは２−イミノチオレン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）により活性化され、そしてフィコエリトリンとビオチンとの結合体を同量混ぜられ、４°Ｃで一装置かれた。、前記結合体はＮａＣ１（０，１Ｍ）　、ＭｇＣ１ｔ　（１０−”Ｍ）　、ＺｎＣ１ｚ　（１０−３Ｍ）及び１％のＮＡＮ、を含むトリエタノールアミンバファ　（０，１Ｍ、ｐＨ７，３）と溶離されたＴＳＫ３０００　ＳＷＧコラム上で浄化され、最も高い分子の重さの部分が集められる。

１１上１ヱ！ユコＪフミ最低鮭旦助バ玉Ｐ囮■刀に代ｈｃ以痕生■璽斐抗体Ｂ（異なる抗原の決定基に対して特定の、ｈＣＧに対する第２モノクロナル抗体）は５ｔｒｙｅｒ　ｅｔ　ａｌによる米国特許４゜５４２．１０４　（１９８５）に略述べられている方法の後にアロフィコチアンと結合された。

（ｉｖ　ｈＣＧ標１ｆｆｉｊ　の請負最初の国際参照標本（７５−５３７）に対して基準化されたｈＣＧのフリーズドライ標本はＢｉｏｄａｔａ　ＳｐＡ、Ｍｉｌａｎイタリアから得られた。このサンプルは馬の血清（Ｓｅｒｏｎｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｗｏｋｉｎｇ＋英国）の中で所望の濃度に薄められた。

友ヱ煎叉定装置本発明によれる分析を行うに通した光学装置は添付の第１１図に示される。光源６２は１５０Ｗのキセノンアークランプであり、励起フィルタ６４は４８５ｎｍ　（６０ｎｍのバンド幅）の中心波長を有し、検出フィルタは５８０ｎｍ　（７０ｎｍのバンド幅）の中心波長を有する。これらのフィルタはＲ−フイコエリトリンが関係する分析に適している。アロフイコチアニンのためのロングバスコレクタは６４５ｎｍのカットオンを有している＊　Ｈａｋｕｔ。

ｔｏＲ９２Ｂ光学電子　増倍管（Ｈａｋｕｔｏ、Ｗａｌｔｈａｍ　Ｃｒｏｓｓ　英国）はフォトディテクタ６８．７３として使用され、またＥＧ及びＧ　５２０７　（ＰＡＲ，Ｐｒｅｃｔｏｎ米国）ロックイン増幅器７５が使用される。ガラス導波管７１はサンプルが毛細運動により導波管の表面にわたって流れるように充分に小さな寸法の細胞に取付けても良い。

分析処理上記初期材料及び装置を使用してサンドインチ分析を以下のように行うニアビディンにより被覆された導波管はビオチン／Ｒ−フイコエリトリン／抗ｈＣＧ抗体の溶液に共に温間される。供与体発蛍光団とラベル付けされた抗体Ａはアビデン及びビオチンの相互の高い親和力の結果として導波管の表面に固定される。導波管はその後分析中の抗原（ｈＣＧ）及び決まった量のアロフイコチアニン（受容体発螢光団）とラベル付けされた抗体Ｂを含むサンプルと温間される。導波管は供与体螢光団を励起するのに適した波長、即ち、Ｒ−フイコエリトリン用の４８５ｎｍぐらいの放射により照らされる。この照明は平衡が達成された後、或いは平衡が達成される過程のいずれかで行われる。供与体発蛍光団から放射される光の強さはＲ−フィコエリトリン用５８０ｎｍぐらいで測定される。サンドインチ複合体を形成した結果、５８０ｎｍの螢光強さはｈＣＧの集中機能として減少する。

ゼロ或いはｈＣＧの公知の量を含む最終的なサンプル溶液と比較して目盛り付けが行われる。

上述のように、コンペティション型の分析も本発明方法により実行できる。それらの場合の処理は同様である。

ｈＣＧのコンペティションノ＼供与体発蛍光団（Ｒ−フイコエリトリン）とラベル付けされた抗体は上述した方法によりアビディン及びビオチンの相互作用を用いて導波管の表面に固定される。受容体発螢光団（アロフィコチアン）はｈＣＧ分子と結合される。導波管はその後ｈＣＧ及び決められた公知の量のアロフィコチアンとｈＣＧとの結合体を含む液体サンプルと共に温間される。供与体発蛍光団は適切な波長の光を与えることにより励起され、供与体発蛍光団の螢光の衰弱が測定される。供与体発蛍光団による螢光はサンプル中のｈＣＧの量を減らすことで減少する。

ＦＩＧ、７゜ＦＩＧ３．３゜ＦＩＧ、５゜ＦＩＧ、　６゜ＦＩＧ、　７ＦＩＧ、８゜ＦＩＧ、９゜国際調査報告１ｍｏｒ＋ｖ＋ｎ−＾ｅｅ＋曇ｃ−＋曜・−１＋＋ＩＩＰＣＴ／ＧＢ８９１００３２０Ｓ＾　２７８１１

Claims

【特許請求の範囲】

１．（Ａ）以下の要素（ａ）〜（ｅ）を同時に、或いは所望の順序で装置する工程と；（ａ）サンプル；（ｂ）第１エネルギ受容体にラベル付けされた試液Ｘ；（ｃ）光学導波管の表面に直接或いは間接的に固定された試液Ｙ；（６）前記光学導波管の表面に直接或いは間接的に（望むものであれば試液Ｙを介して）固定された、或いは前記導波管内に固定された第２エネルギ受容体；（ｅ）望むのであれば、前記第１或いは第２受容体と同じ或いは異なり、光学導波管の表面上或いは内部に直接或いは間接的に固定された少なくとも１つの別のエネルギ受容体；前記試液Ｘ及びＹの一方が前記配位子に対して特定の結合パートナを有し、また他方が配位子アナログ或いは配位子の特定の結合パートナを有し、前記第１及び第２エネルギ受容体の一方は、他方の電子放出スペクトルと重複した電子発光スペクトルの発螢光団（供与体発螢光団）を有し、（Ｂ）前記供与体発螢光団を励起するのに適した波長の電子放射をもって前記光学導波管を放射する工程と、（Ｃ）前記第１及び第２エネルギ受容体間或いは第２及び第１エネルギ受容体間のそれぞれで共鳴エネルギの移動が直接或いは間接的に起こるのかどうか、また望むのであればその程度或いはその確率またはその両方を検知する工程と、よりなり前記放射工程（Ｂ）は導波管に沿った電磁放射伝播により生じる消失性フィールドによるものであり、及び／或いは検知工程（Ｃ）は前記第１エネルギ受容体の螢光或いはもしあれば第２エネルギ受容体の螢光導波管に結合する消失性フィールドを利用してなる、サンプルにおける配位子の分祈方法。
２．前記第１エネルギ受容体は供与体発螢光団よりなり、前記第２エネルギ受容体は受容体染料或いは受容体発螢光団よりなる、請求の範囲第１項記載の方法。
３．前記第１エネルギ受容体は受容体染料或いは受容体発螢光団よりなり、前記第２エネルギ受容体は供与体発螢光団よりなる、請求の範囲第１項記載の方法。
４．受容体発螢光団が構成要素（ｅ）として存在してなる、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の方法。
５．前記放射工程（Ｂ）は光学的導波管に沿って伝播する電磁放射と共同した消失性フィールドを利用してなる、請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。
６．前記エネルギ受容体の１つは受容体発螢光団よりなり、前記検出工程（Ｃ）は前記受容体発螢光団により前記導波管に放出される螢光と結合する消失性フィールドを利用してなる、請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の方法。
７．前記エネルギ発螢光団はフィコビリプロテイン、コマリン、フルオレセイン、ローダミン、ルツファーイエロー、エリトロシンまたはそれらの誘導体よりなるグループから選択される、請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の方法。
８．前記光学導波管はガラス或いはシリカ製である、請求の範囲第１項に記載の方法。
９．第１エネルギ受容体とラベル付けされた試液Ｘ（ｉ）と、表面に試液Ｙが（直接或いは間接的に）固定されると共に、上部或いは内部に少なくとももう１つのエネルギ受容体が（直接或いは間接的に、また望むのであれば試液Ｙを介して）固定された光学導波管（ｉｉ）とよりなり、前記試液Ｘ，Ｙ及び前記エネルギ受容体は請求の範囲第１項に限定されているものである、請求の範囲第１項記載の方法に使用するためのキッド。
１０．分析中の前記配位子のための特定の結合パートナ或いは配位子アナログに（直接或いは間接的に）固定されると共に、内部に発螢光団或いは染料が固定された表面に設けられた光学導波管よりなる、請求の範囲第１項記載の方法に使用されるための装置。