DE19651935A1 - Detektionssystem für den optischen Nachweis von Molekülen - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Sensoren für den optischen Nachweis von Molekülen. Es handelt sich um Festphasensensoren, die selektiv Fluoreszenzfarb­ stoffe an Wellenleiteroberflächen nachweisen und in der Lage sind, mehrere Substan­ zen aus einem Gemisch nachzuweisen.

Der Nachweis von Molekülen, wie Proteine, Nukleinsäure, Pestizide, Toxine, phar­ mazeutische Wirkstoffe, organische und anorganische Substanzen, Mikroorganismen und Ionen kann über eine spezifische Bindung an ein anderes Molekül, das Rezep­ toreigenschaften besitzt, sehr selektiv auch aus einem Gemisch durchgeführt werden. Ein solches Rezeptormolekül kann z. B. ein Antikörpermolekül, oder ein DNS-Mo­ lekül, das zumindest teilweise eine zu der nachzuweisenden DNS-Sequenz kom­ plementäre Struktur aufweist, sein. Diese Rezeptormoleküle werden auf einem opti­ schen Wellenleiter immobilisiert. Dazu sind verschiedene Verfahren bekannt. Als op­ tische Wellenleiter können beispielsweise quader- oder zylinderförmige Substrate aus lichtdurchlässigem Material, wie Glas oder Kunststoff, dienen.

Bei dem Testverfahren bindet das nachzuweisende Molekül, das sich in der Lösung, oder bei gasförmigen Substanzen, das sich im Gasraum über der Oberfläche befindet, an das Rezeptormolekül. Der Nachweis wird mit Hilfe eines weiteren markierten Moleküls in einem kompetitiven oder einem Sandwichtest erreicht. Die Markierung, die mit Fluoreszenzfarbstoffen erfolgt, erlaubt nicht nur den Nachweis der markierten Moleküle, sondern, wenn der Test kompetitiv oder als Sandwich-Test ausgelegt ist, auch den Nachweis nicht markierter Analyte. Für die Anregung der Fluoreszenzfarb­ stoffe können alle Arten von Lichtquellen dienen, die im Absorptionsbereich des Farbstoffs emittieren.

Entscheidend für optische Sensoren auf Basis der Fluoreszenztechnik ist, daß sie zwi­ schen gebundenen und nicht gebundenen farbstoffmarkierten Molekülen unterschei­ den können. Hier wird das besondere Emissionsverhalten von Fluoreszenzfarbstoffen an einer dielektrischen Grenzschicht ausgenutzt.

Photonen, die seitlich auf die Oberfläche eines Wellenleiters treffen, dringen zwar in den Wellenleiter, werden aber bei jeder der folgenden internen Reflexionen das op­ tisch dichtere Medium zum Teil wieder verlassen. Die Intensität nimmt mit zuneh­ mender zurückgelegter Wegstrecke im Innern des Wellenleiters immer mehr ab, bis sie völlig verschwunden ist.

Der Lichtstrahl, der als eine ebene Welle charakterisiert werden kann, ist also nicht in der Lage, seitlich in den Wellenleiter einzukoppeln, d. h. in seinem Innern weiterge­ leitet zu werden.

Ein Fluoreszenzfarbstoffmolekül, das einen elektromagnetischen Strahler darstellt, sendet bei ausreichender Nähe zu einem Medium mit höherem Brechungsindex neben den sich ins Unendliche ausbreitenden ebenen Wellen, zusätzlich sogenannte evanes­ zente Wellen aus. Diese Wellen klingen mit zunehmendem Abstand zum Strahler ex­ ponentiell ab und spielen bei Entfernungen oberhalb einiger Wellenlängen keine Rolle mehr. Die evaneszenten Wellen, die auf das benachbarte Medium mit höherem Brechungsindex treffen, werden darin in ebene Wellen umgewandelt. Die Ausbrei­ tung der ebenen Wellen erfolgt dabei auch in den Winkelbereich, in den ein Licht­ strahl nach dem Snelliusschen Brechungsgesetz nicht gebrochen werden kann. Der größte Anteil der Strahlung dringt dabei mit Raumwinkeln in das optisch dichtere Medium ein, die in der Nähe des Grenzwinkels für Totalreflexion liegen [W. Lukosz, R. E. Kunz, Light emission by magnetic and electric dipoles close to a plane inter­ face. Radiation patterns of dipoles with arbitrary orientation, J. Opt. Soc. Am., 69, 1979, S. 1495-1503]. Handelt es sich bei dem optisch dichteren Medium um einen op­ tischen Wellenleiter, so erfüllen die sich ausbreitenden ebenen Wellen die Bedingung der internen Totalreflexion, sind also in den Wellenleiter eingekoppelt. Dieser Effekt ist als Evaneszenzfeld-Kopplung bekannt [El-Hang Lee, Brenner, R. E. Fenn, J. B. & Change, R. K., Angular distribution of fluorescencefrom liquids and monodispersed sheres by evanescent wave excitation, Appl. Opt. 18 (6), 1979, S. 862-868]. Dieses Fluoreszenzlicht stammt ausschließlich von oberflächennahen Farbstoffmolekülen. Wenn man das Signal an den Seitenflächen des Wellenleiters mit einem lichtemp­ findlichen Detektor auffängt, so erhält man einen selektiven Nachweis für oberflä­ chennahe bzw. gebundene Farbstoffmoleküle.

Dieser Effekt wurde schon zur Konstruktion von optischen Sensoren ausgenutzt:
Im sogenannten Fluoreszenz-Kapillar-Gerät wurden Probenlösungen in einer Glaska­ pillaren mit einer Blitzlampe angestrahlt. Als Fluoreszenzfarbstoff diente Fluorescein Isothiocyanat (FITC). In einem kompetitiven Test konnte das menschliche Immuno­ globulin G (hIgG) nachgewiesen werden [R. A. Badley, R. A. L. Drake, I. A. Shanks, F. R. S., A. M. Smith, P. R. Stephenson, Optical biosensors for immunoassays: the fluorescence capillary-fill device, Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 316, 1987, S. 143- 160]. Mit diesem Sensor konnte man mit hIgG nur eine Substanz aus der Lösung nachweisen und mit einer präparierten Kapillare, die hier als optischer Wellenleiter fungierte, konnte nur eine Konzentrationsmessung durchgeführt werden.

In einem anderem Sensor wurde eine optische Faser verwendet, die an ihrem sensiti­ ven Ende in die zu untersuchende Lösung geführt war. Auch hier erfolgte die Anre­ gung von außen und auch hier konnte nur eine Konzentrationsbestimmung von Ter­ butryn (Pestizid) an einem beschichteten Wellenleiter durchgeführt werden. Detek­ tiert wurde nur an einem der Faserenden [F. F. Bier, W. Stöcklein, M. Böcher, U. Bi­ litewski, R. D. Schmid, Use ofafibre optic immunosensor for the detection of pesti­ cides, Sensors and actuators, B, 7, 1992, S. 502-512].

Es sind auch bereits optische Sensoren entwickelt worden, die mehrere Messungen am selben Wellenleiter ermöglichen. Sie beruhen aber auf anderen physikalischen Konzepten, die verschiedene Nachteile beinhalten. Hierbei muß das Anregungslicht durch den Wellenleiter geführt werden, auf dem die Rezeptormoleküle immobilisiert sind. Um den Wellenleiter entsteht dabei ein schmales Anregungsfeld, das für die An­ regung der Fluoreszenzfarbstoffe genutzt wird.

Bei einem der beschriebenen Sensoren wurde eine mit Rezeptormolekülen beschich­ tete Faser durch mehrere Meßzellen geführt. Gepulstes Anregungslicht wurde in eines der Faserenden eingekoppelt. Das den Wellenleiter umgebende, schwache Evanes­ zenzfeld diente zur Anregung der gebundenen Farbstoffmoleküle. Die Fluoreszenz­ antwort wurde am selben Faserende gesammelt. Fluoreszenzphotonen aus den ver­ schiedenen Meßzellen haben unterschiedliche Laufzeiten zum Detektor. Mit zeitauf­ gelöster Registrierung des Photons konnte daher ermittelt werden, in welcher der Meßzellen es ausgesendet worden war. Damit lassen sich mehrere Bindungsvorgänge gleichzeitig beobachten und man erhält einen sogenannten Multiparametertest, d. h. den simultanen Nachweis mehrerer Substanzen [C. A. Browne, D. H. Tarrant, M.S. Olteanu, J. W. Mullens, E. L. Chronister, Intrinsic sol-gel cladfiber-optic sensors with time resolved detection, Anal. Chem, 68, 1996, S. 2289-2295]. Die hier einge­ setzte evaneszente Anregung führt jedoch zu viel geringeren Anregungsfeldstärken im Vergleich zur direkten Bestrahlung des Wellenleiters und deshalb zu einer deutlich reduzierten Empfindlichkeit des Nachweises.

Ein weiterer Fasersensor, mit dem ein Multiparametertest durchgeführt werden kann, basiert auf der unterschiedlichen Fluoreszenzlebensdauer verschiedener Farbstoffe. Mit gepulster Fluoreszenzanregung und zeitaufgelöster Messung der Fluoreszenz­ photonen können die Farbstoffe durch ihre unterschiedlichen Abklingzeiten unter­ schieden werden. Auch hier erfolgte die Anregung durch den Wellenleiter [K. Galla, J. Arden-Jacob, G. Deltau, K. H. Drexhage, M, Martin, M. Sauer, J. Wolfrum, S. See­ ger, Simultaneous antigen detection using multiplex dyes, Journal of Fluorescence, Vol. 4, No. 1, 1994, S. 111-115].

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige optische Sensoren, mit denen an einem mit Rezeptormolekülen beschichteten Wellenleiter mehrere vollkommen voneinander unabhängige Messungen durchgeführt werden können. Dabei wird die evaneszente Einkopplung oberflächennaher Farbstoffe ausgenutzt und der Wellenleiter nacheinan­ der an mehreren Stellen von außen bestrahlt. Dabei muß nur die Intensität des Fluo­ reszenz gemessen werden braucht dabei nur die Intensität des Fluoreszenzlichts. Der gepulste Betrieb der Anregungsquelle wird nicht benötigt, wenn nur ein Fluoreszenz­ farbstoff eingesetzt werden soll. Es sind aber auch zeitaufgelöste Messungen möglich, wenn über das Abklingverhalten der Fluoreszenzstrahlung unterschiedliche Farbstoffe nachgewiesen werden sollen.

Wie in Abb. 1 dargestellt, sind an einem beschichteten Wellenleiter (3) mehrere Meßzellen (6) nebeneinander angebracht (nicht maßstabsgerecht). Die Anzahl der möglichen Messungen entspricht hier der Anzahl der Zellen und ist theoretisch unbe­ grenzt. Die Zellen sind jeweils mit Zu- und Abflußleitungen (7) versehen, so daß sie unabhängig voneinander mit Probenvolumen gefüllt werden können. Die Anregung der Wellenleiteroberfläche mit einer oder mehrerer Lichtquellen (1) erfolgt von au­ ßen, d. h. durch die Probe (4) hindurch. Dazu sind die Meßzellen mit optischen Fen­ stern (5) versehen. Mit Hilfe von Linsen (10) und Filtern (2) kann die Anregungsfeld­ stärke an der Oberfläche optimiert und unerwünschte Streueffekte eliminiert werden. Die Bestrahlung der einzelnen Wellenleiterabschnitte muß nacheinander bzw. ab­ wechselnd erfolgen, die resultierenden Fluoreszenzsignale stehen mit der Konzentra­ tion der nachzuweisenden Substanz in der jeweiligen Zelle in Verbindung. Der ge­ naue Aufbau des Sensors muß in Abhängigkeit der Geometrie des verwendeten Wel­ lenleiters gewählt werden.

Bei einem Fasersensor ist der verwendete Wellenleiter eine optische Faser, die vor der Immobilisierung der Rezeptormoleküle von Schutzschicht und Mantel befreit wird, so daß der Faserkern im sensitiven Bereich frei liegt. Die Art der Faser ist dabei nicht auf die gewöhnlichen Fasern mit kreisförmiger Querschnittsfläche beschränkt. Es eignen sich auch Fasern mit ellipsenförmigem oder rechteckigem Querschnitt. Im hier vorgeschlagenen Fasersensor wird der beschichtete Faserkern mittels Faserkopplun­ gen (8) und zusätzlichen Fasern (9), auf beiden Seiten hin zum Detektor (11) verlän­ gert. Die Bestrahlung der Faserkernoberfläche erfolgt von außen durch das Proben­ volumen; die Lichtquelle kann mit konstanter Intensität betrieben werden. Der in Abb. 1 gezeigte schematische Aufbau beschreibt den ersten Fasersensor bei dem die Sammlung von Fluoreszenzlicht an beiden Faserenden durchgeführt wird.

Die Erfindung ist nicht nur auf optische Fasern beschränkt, sondern betrifft auch die­ lektrische Filme, Streifen oder Platten (13), an denen ebenfalls mehrere Meßzellen angebracht werden (vgl. Abb. 2). Das zu detektierende Fluoreszenzlicht tritt aus den Seitenflächen des Wellenleiters und kann mit Hilfe von Spiegeln, Linsen und/oder weiteren Wellenleitern zum Detektor geleitet werden.

Besonders hierfür geeignet ist ein Aufbau, der in Abb. 3 vorgestellt wird und ebenfalls einen Teil der Erfindung darstellt. Das Fluoreszenzlicht eines planaren Wellenleiters wird hier mit sehr hoher Effizienz zum Detektor geleitet. Es handelt sich um einen flaschenförmigen Wellenleiter (14), an dessen Hals das Fluoreszenzsi­ gnal austritt und von den detektierenden Bauteilen aufgefangen wird. Die evaneszente Kopplung der Fluoreszenzphotonen erfolgt auf der gegenüberliegenden Seite, wo der Wellenleiter an der Kontaktfläche zum beschichteten Substrat abgeflacht ist. Um die beiden Lichtleiter, die einen ähnlichen Brechungsindex besitzen sollten, optimal zu verbinden, kann ein optisches Kontaktmittel verwendet werden. Mit diesem neuarti­ gen Aufbau eines Sensors wird erreicht, daß praktisch das gesamte in den ebenen Wellenleiter eingekoppelte Fluoreszenzlicht zum Detektor geführt wird.

Ein weiterer Sensoraufbau ist in Abb. 4 dargestellt. Hier wird die besondere Abstrahlungscharakteristik der oberflächennahen Farbstoffe ausgenutzt, die ein aus­ geprägtes Maximum in Richtung des Grenzwinkels aufweist. In einer Ebene befinden sich kegelförmige Wellenleiter (15), deren Spitzen abgeflacht und mit verschiedenen Rezeptormolekülen beschichtet sind (12). Das Anregungslicht, das wieder durch die Probe eingestrahlt wird, trifft hier gleichzeitig auf die verschieden Meßpunkte. Das emittierte Fluoreszenzlicht koppelt wieder zu einem Großteil in den Wellenleiter ein. Nur die starke, grenzwinkelnahe Strahlung wird dabei an der kegelförmigen Grenz­ fläche zu der umgebenden Luft (18) so totalreflektiert, daß sie an der Unterseite des Wellenleiters wieder austritt. Dort wird das Signal der verschiedenen Zellen simultan von einem ortsauflösenden Detektor (16), wie z. B. einer CCD-Kamera, gemessen. Um den Detektor vor Anregungslicht zu schützen sind lichtundurchlässige Schichten (17) am Wellenleiter aufgebracht. Dieser Aufbau ermöglicht einen hochempfindli­ chen, simultanen Nachweis mehrerer Stoffe aus einem Gemisch der mit konstanter Anregungsintensität und nur einem Fluoreszenzfarbstoff auskommt.

Mit den vorgestellten Sensoraufbauten, die eine abwechselnde Bestrahlung der ein­ zelnen Meßpunkte erfordern, ist ebenfalls ein Multiparametertest durchführbar. Für den vorgeschlagenen Nachweis von mehreren Substanzen mit einem Wellenleiter ge­ nügt ebenfalls eine konstanter Anregungsintensität und nur ein Fluoreszenzfarbstoff. Auf der Wellenleiteroberfläche an den Meßstellen jeweils andere Rezeptormoleküle immobilisiert, die eine der nachzuweisenden Molekülsorten binden sollen. Das zu analysierende Volumen und die verschiedenen mit Farbstoff markierten Molekülsor­ ten werden zusammen oder nacheinander in die Meßzelle gegeben. Mit Beginn der Einwirkzeit der markierten Moleküle werden mit einer oder mehrerer Anregungs­ quellen abwechselnd die Wellenleiteroberflächen in den Meßzellen bestrahlt. Das Lichtsignal, das dabei jeweils mit dem Detektor gemessen wird, steht mit dem Bin­ dungsverhalten einer der nachzuweisenden Substanzen in direktem Zusammenhang und ermöglicht die quantitative Bestimmung der Konzentration. Wenn die Bestrah­ lung in einem im Vergleich zum Bindungsverhalten schnellen Wechsel erfolgt, lassen sich die Bindungsabläufe an der Oberfläche quasi simultan beobachten. Die abwech­ selnde Bestrahlung kann z. B. erreicht werden durch die bewegliche Lagerung der Lichtquelle und/oder des Wellenleiters, durch Einsatz von beweglichen Spiegeln, oder durch eine Schaltung mit mehreren Lichtquellen.

Beispiel 1

Ein Beispiel für die Umsetzung der Erfindung ist der Faserimmunosensor mit Evanes­ zenzfeld-Kopplung und mehreren Meßzellen nach Abb. 1. Auf der Faser werden dazu Antikörper nach bekannten Verfahren immobilisiert [A. Hartmann, S. Seeger, Direct immobilization of antibodies on phthalocyaninato-polysiloxane photopoly­ mers, Thin Solid Films, 245, 1994, S. 206-210]. Antikörper, die gegen dasselbe Anti­ gen gerichtet sind werden an Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelt. Das Antigen wird an die Oberfläche des Wellenleiters gebunden und durch ein ansteigendes Fluoreszenzsi­ gnal nachgewiesen.

Es lassen sich ebenfalls DNA-Sequenzen nachweisen. Die optische Faser wird mit dem Protein Streptavidin nach bekannten Verfahren beschichtet. Biotin, das soge­ nannte Vitamin H, geht mit Streptavidin eine sehr starke und spezifische Bindung ein. Biotinylierte Oligonukleotide sind kommerziell erhältlich und werden auf der Ober­ fläche des Wellenleiters immobilisiert. DNA-Analytmoleküle können wieder in ei­ nem Sandwichtest mit Fluoreszenzfarbstoffmarkierten Oligonukleotiden nachgewie­ sen werden.

Beispiel 2

Mit einem leicht modifizierten Aufbau läßt sich eine konkrete Anwendung des Multi­ parametertests angeben. Die optische Faser wird mit dem Protein Streptavidin be­ schichtet. Verschiedene biotinylierte Antikörper werden an den Meßpunkten der Fa­ ser immobilisiert. Die Meßzelle, die an diesen Stellen für Anregungslicht durchlässig ist, wird auf der Faser angebracht. Die zu untersuchende Analytlösung, z. B. Blut wird durch die Meßzelle geleitet. Passende Antigene werden dabei an die jeweiligen Faser­ abschnitte gebunden. Danach werden farbstoffmarkierte Antikörper in die Zelle gege­ ben, die im Sandwich ebenfalls an die Oberfläche gebunden werden. Das System der Durchflußzellen ist beweglich gelagert, so daß ein Laser abwechselnd die relevanten Meßabschnitte bestrahlt. Das Fluoreszenzsignal wird wie in Abb. 1 an beiden Faserenden gesammelt und zu einem Photomultiplier geführt. Die Steuerung des ge­ samten Systems sowie die Aufnahme der Meßwerte der verschiedenen Zellen kann über einen PC erfolgen.

Claims (7)

1. Optischer Sensor auf Basis der evaneszenten Kopplung von Fluoreszenzlicht in Wellenleiter, der mehrere Messungen nacheinander an einem mit Rezeptormo­ lekülen beschichteten Wellenleiter ermöglicht, wobei der Wellenleiter nachein­ ander an verschiedenen Meßpunkten durch die umgebende Probenlösung mit Anregungslicht bestrahlt wird, bestehend aus

• a) einem optischen Wellenleiter, auf dem Repeztormoleküle immo­ bilisiert sind
• b) einer oder mehreren Anregungslichtquellen
• c) einem Detektor
• d) einer oder mehreren Linsen und oder Filtern
• e) einem Fluoreszenzfarbstoff, der an andere Moleküle gebunden ist und mit dem Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzphoto­ nen angeregt werden kann
• f) einem oder mehreren Probenbehältnissen, die auf dem Wellenleiter angebracht sind und die für Anregungslicht durchlässig sind
• g) weiteren optischen Wellenleitern, die das Fluoreszenzlicht zum Detektor transportieren

2. Optischer Sensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Anre­ gungslicht durch die Probe auf die Wellenleiteroberfläche trifft und die dort ge­ bundenen Farbstoffe zur Emission von Fluoreszenzphotonen angeregt werden.

3. Optischer Sensor nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der be­ schichtete Wellenleiter nacheinander oder abwechselnd an den unterschiedli­ chen Meßpunkten vom Anregungslicht bestrahlt wird.

4. Optischer Sensor nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluo­ reszenzlicht an beiden Faserenden gesammelt und zum Detektor geleitet wird. Dazu ist die beschichtete Faser mittels Faserkopplungen und zwei zusätzlichen Fasern an beiden Enden zum Detektor hin verlängert.

5. Optischer Sensor nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Wechsel in der Bestrahlung der Meßpunkte im Vergleich zur Bindungskinetik schnell erfolgt und damit mehrere Bindungsvorgänge simultan beobachtbar werden.

6. Optischer Sensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei einem planaren mit Rezeptormolekülen beschichteten Wellenleiter, die Sammlung des Fluoreszenzlichts durch einem flaschenförmigen Wellenleiter erfolgt und somit das eingekoppelte Fluoreszenzlicht fast vollständig zu den detektierenden Bau­ teilen geführt werden kann.

7. Optischer Sensor nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Wel­ lenleiter mit einer speziellen Geometrie in Form von abgeflachten Kegeln für die Beschichtung der Rezeptormoleküle verwendet wird, so daß die gleichzeiti­ ge Anregung aller Meßpunkte und eine ortsaufgelöste Detektion und eine si­ multane Auswertung aller Bindungsvorgänge erlaubt.