DE60301821T2

DE60301821T2 - Küvette für ein Lesegerät zur Bestimmung von Substanzen mittels der Evaneszenzfeldmethode

Info

Publication number: DE60301821T2
Application number: DE60301821T
Authority: DE
Inventors: Manfred Schawaller; Gerald Quapil
Original assignee: Stiftung fur Diagnostische Forschung; Leuze Electronic GmbH and Co KG
Current assignee: Stiftung fur Diagnostische Forschung; Leuze Electronic GmbH and Co KG
Priority date: 2002-06-14
Filing date: 2003-06-12
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2023-06-13
Also published as: EP1371967B1; DK1371967T3; JP2004163402A; NO20032705L; EP1371966A1; JP3668973B2; AU2003204706B2; EP1371967A1; ATE306659T1; ES2250788T3; DE60301821D1; AU2003204706A1; US20040047770A1; NO20032705D0

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Küvette für ein Lesegerät zum Untersuchen von Substanzen unter Verwendung der Evaneszenzfeldmethode, auf ein Verfahren zum Herstellen einer Küvette, die zum Untersuchen von Substanzen bearbeitet ist, und auf ein Verfahren zum Untersuchen von Substanzen unter Verwendung der Küvette.
Medizinische Diagnostik, insbesondere immunologische Diagnostik, basiert weit verbreitet auf ELISA (Enzyme-Linked-Immunoabsorbent Assay). Ein kürzlicher Überblick über Immunversuche bzw. Assays kann in Hage, Anal. Chem. 71 (1999), 294R–304R gefunden werden. Ein ELISA-Test wird verwendet, um die Konzentration von Antigenen oder Antikörpern zu bestimmen. Die untersuchte Substanz (beispielsweise ein Antigen) wird zuerst in Kontakt mit einem festen Substrat angeordnet, mit welchem ein spezifischer Reaktionspartner für die Substanz, die untersucht wird, zuerst gekoppelt wird (beispielsweise ein Antikörper). Durch ein Bonden bzw. Verbinden der Substanz, die untersucht wird, als den zweiten Reaktionspartner an den ersten Reaktionspartner, der an das Substrat gekoppelt ist, wird die untersuchte Substanz auf dem festen Substrat konzentriert. Dann wird ein dritter Reaktionspartner (beispielsweise ein weiterer Antikörper) für die untersuchte Substanz in Kontakt mit dem Substrat angeordnet und dieser dritte Reaktionspartner wird mit einem Enzym markiert, welches eine kolorimetische Detektion ermöglicht. Wenn dieser dritte Reaktionspartner mit der untersuchten Substanz, die an die Oberfläche des Substrats gekoppelt ist, reagiert (d.h. sich daran bindet), wird ein gefärbtes Produkt über eine enzymatische Reaktion erzeugt, welche optisch evaluiert bzw. ausgewertet werden kann. Standardisierte Kunststoffplatten, die häufig aus Polystyrol gefertigt sind, mit 96 Vertiefungen, werden meistens als das feste Substrat verwendet. Die Oberfläche der Kunststoffvertiefungen bindet Proteine in dem Nanogrammbereich durch Absorption in einer Menge, die für eine immunologische Detektion ausreichend ist. Es gibt zahlreiche Wege, den dritten Reaktionspartner, welcher am häufigsten ein Immunoglobulin ist, mit einem Enzym zu markieren. Marker, die gegenwärtig verwendet sind bzw. werden, sind beispielsweise Peroxidase oder alkalische Phosphatase.
ELISAs ergeben gute Ergebnisse in bezug auf Empfindlichkeit und Spezifität, und die Detektionsbegrenzungen, welche erreicht werden können, sind in dem Nanogrammbereich oder darunter. Es gibt eine große Vielzahl von Ausbildungen von Versuchen, welche auf diesem Prinzip basieren. Damit können Antigene oder Antikörper in Abhängigkeit von der Fragestellung detektiert werden.
Jedoch ist ein Hauptnachteil von ELISA die Handhabung des Tests, da unterschiedliche Reagenzien zu den Vertiefungen eines nach dem anderen zugesetzt werden und wiederum entfernt werden müssen. Zehn oder mehr Pipettier-, Wasch- und Inkubationsschritte insgesamt können notwendig sein. Daher sind ELISAs sehr zeitaufwändig und arbeitsintensiv und müssen durch speziell trainiertes Personal mit großer Sorgfalt ausgeführt werden. Ein weiterer Nachteil von ELISA ist die Zeit, die sie für alle Inkubations- und Waschschritte für einen Versuch bzw. Assay oder Test erfordert, was normalerweise eine Stunde oder mehr dauert.
Mit der Evaneszenzfeld-Methode kann die Wechselwirkung von Biomolekülen beispielsweise auf einer Oberfläche direkt beobachtet werden. Hier wird die Wechselwirkung von Reaktanten in Lösung mit einer soliden bzw. festen Matrixoberfläche gemessen. Es ist möglich, das Binden bzw. Bonden der Liganden physikalisch als "Oberflächenplasmonresonanz" in "Echtzeit" zu messen. Die Vorteile verglichen mit ELISA sind die Eliminierung von anderen Pipettierschritten nach dem Zusatz der Reagenzien und die Eliminierung der Warteschritte. In der Vergangenheit waren teure Vorrichtungen bzw. Geräte mit mehrschichtigen bzw. -lagigen Sensorchips mit spezieller Oberflächenchemie für derartige Messungen erforderlich. Diese Nachteile verhindern, daß das Verfahren bzw. die Methode in Routinediagnostiken angewandt wird.
Evaneszenzfeld-Verfahren bzw. -Methoden zum Untersuchen von biochemischen Interaktions- bzw. Wechselwirkungsverfahren bzw. -prozessen auf Reaktionsoberflächen wenden regelmäßig Küvetten an, die Vertiefungen zum Aufnehmen der Lösung, enthaltend die zu analysierenden Substanzen aufweisen. Für zahlreiche diagnostische und analytische Anwendungen würde eine Einweg- oder Wegwerf-Küvette bevorzugt sein, so daß eine signifikante Nachfrage nach billigen Küvetten existiert. Zur selben Zeit müssen jedoch biochemische Analysewerkzeuge immer weiter ansteigenden Erfordernissen betreffend Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit genügen. Daher müssen die Küvetten sowohl strikte Erfordernisse bzw. Vorgaben betreffend Produktionskosten als auch die biochemischen/optischen Eigenschaft erfüllen.
WO 01/14859 beschreibt eine Küvette für eine Lesevorrichtung bzw. ein Lesegerät für Versuche bzw. Assays, wobei die Vorrichtung Merkmale entsprechend der Vorrichtung bzw. des Geräts der Erfindung umfaßt. Jedoch tritt gemäß der Anordnung dieses Geräts des Standes der Technik der Lichtstrahl in dem Basisabschnitt der Küvette auf einer Seite ein und verläßt die Basis an der gegenüberliegenden Seite.
So ist das technische Problem, welches der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, eine billige Küvette für ein Lesegerät zur Untersuchung von Substanzen unter Verwendung der Evaneszenzfeld-Methode zur Verfügung zu stellen, die sowohl exzellente biochemische als auch optische Eigenschaften besitzt, die hoch empfindliche, reproduzierbare und schnelle Untersuchungen bzw. Versuche ermöglichen. Weiters sollte ein Verfahren zum Herstellen bzw. Vorbereiten einer Küvette zur Verfügung gestellt werden, wobei die Küvette so bearbeitet bzw. hergestellt ist, daß sie bereit zur Verwendung in Routinediagnosen ist.
Die Lösung für das obige technische Problem wird durch ein Bereitstellen der in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausbildungen erreicht.
Insbesondere wird eine Küvette für ein Lesegerät für Versuche bzw. Assays unter Verwendung der Evaneszenzfeld-Methode zur Verfügung gestellt, umfassend:

– wenigstens einen Vertiefungsabschnitt, der wenigstens eine Vertiefung zum Aufnehmen einer Lösung aufweist, die zu untersuchende Substanzen enthält; und
– wenigstens einen Basisabschnitt, der Seitenwandglieder des Vertiefungsabschnitts abstützt und eine Erregungs- bzw. Anregungsoberfläche der Vertiefung zur Verfügung stellt; wobei der Basisabschnitt aus einem optisch transparenten Material hergestellt ist und eine Querschnittsform eines gleichschenkeligen Trapezoids bzw. Trapezes in einer Ebene aufweist, die senkrecht die Erregungsoberfläche der Vertiefung schneidet, wobei das Trapezoid erste und zweite Seiten gleicher Länge und parallele Basis- und Oberseiten aufweist; wobei der Basisabschnitt weiters umfaßt
– eine Basisoberfläche, die von der Erregungsoberfläche beabstandet und parallel zu dieser ist, wobei der Querschnitt der Basisoberfläche in der Ebene die Basisseite des Trapezoids ist;
– eine erste Oberfläche zum Aufnehmen eines Erregungs-Lichtstrahls einer externen Erregungslichtquelle, wobei der Querschnitt der ersten Oberfläche in der Ebene die erste Seite des Trapezoids ist; und
– eine zweite Oberfläche gegenüberliegend der ersten Oberfläche, wobei der Querschnitt der zweiten Oberfläche in der Ebene die zweite Seite des Trapezoids ist; und wobei der Basisabschnitt adaptiert ist, um den Erregungslichtstrahl wenigstens teilweise entlang eines optischen runden Pfads bzw. eines optischen Umlaufpfads von einem Auftreff- bzw. Einfallspunkt auf der ersten Oberfläche über Reflexionen auf der Erregungsoberfläche, der zweiten Oberfläche und der Basisoberfläche zurück zu dem Einfallspunkt zu führen.

Vorzugsweise ist bzw. wird der Einfallswinkel α des Erregungslichtstrahls, der auf die erste Oberfläche einfällt, so gewählt, daß er die Brewster-Kriterien tan α = n₂/n₁ erfüllt, wobei n₂ der Brechungsindex des Basisabschnitts ist und n₁ der Brechungsindex der Umgebung ist, wie beispielsweise Luft (n₁ = 1). Wenn der Erregungslichtstrahl linear in seiner Einfallsebene polarisiert ist, wird keine Reflexion des Erregungslichtstrahls auf der ersten Oberfläche des Basisabschnitts auftreten. Stattdessen wird der Erregungslichtstrahl mit einem Brechungswinkel β in dem Basisabschnitt gebrochen werden.
Nachfolgend wird der Erregungslichtstrahl vorzugsweise durch total durch die Erregungsoberfläche der Vertiefung reflektiert, d.h. die Grenzfläche zwischen dem Basisabschnitt und der die zu untersuchenden Substanzen enthaltenden Lösung. Der Erregungslichtstrahl, der durch die Erregungsoberfläche reflektiert ist bzw. wird, bildet ein elektromagnetisches Evaneszenzfeld, welches in die Vertiefung penetriert bzw. eindringt. Das Evaneszenzfeld sinkt exponentiell in einer normalen Richtung der Erregungsoberfläche in die Vertiefung ab. In einem Bereich benachbart zu der Erregungsoberfläche werden die zu untersuchenden Substanzen optisch durch das Evaneszenzfeld so erregt, daß ein Floureszenzsignal beobachtbar sein kann. Da das Evaneszenzfeld schnell in der Vertiefung absinkt, wird der Erregungsbereich auf einen Raum von nicht mehr als typischerweise 100 nm von der Erregungsoberfläche in der Vertiefung beschränkt. Daher wird keine optische Erregung der Substanzen in dem Volumen der Lösung auftreten.
Nachfolgend wird der reflektierte Lichtstrahl auf der zweiten Oberfläche des Basisabschnitts auftreffen. Wenn die Polarisationsebene des Lichtstrahls unverändert bleibt, (d.h. identisch zu der Polarisationsebene des Erregungslichtstrahls bleibt, der auf der ersten Oberfläche einfällt), wird der gesamte Lichtstrahl auf der zweiten Oberfläche gebrochen und wird den Basisabschnitt verlassen. Jedoch sind zahlreiche Materialien, welche zum Herstellen des Basisabschnitts verwendet werden können, doppelt brechend, so daß die Polarisationsebene des reflektierten Lichtstrahls, der auf der zweiten Oberfläche einfällt, nicht mit der ursprünglichen Polarisationsebene übereinstimmen wird. In diesem Fall wird der Lichtstrahl, der auf der zweiten Oberfläche einfällt, teilweise auf der zweiten Oberfläche reflektiert. Dieser reflektierte Lichtstrahl wird nachfolgend in einer Richtung zu der Basisoberfläche des Basisabschnitts fortschreiten und wird vorzugsweise auf der Basisoberfläche voll bzw. total reflektiert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die trapezoidale Form bzw. Gestalt des Basisabschnitts und der Brechungsindex n₂ des Basisabschnitts so gewählt, daß der Lichtstrahl, der durch die Basisoberfläche reflektiert wird, auf der ersten Oberfläche auf im wesentlichen demselben Auftreff- bzw. Einfallspunkt oder -bereich wie der ursprünglich eintretende Erregungslichtstrahl auftreffen wird. Mit anderen Worten, der Lichtstrahl wird reflektiert und in dem Basisabschnitt in einer derartigen Weise geführt, um einen geschlossen, optischen, runden Pfad bzw. optischen Umlaufpfad auszubilden. Der Lichtstrahl wird durch die Erregungsoberfläche, die zweite Oberfläche und die Basisoberfläche zurück zu der ersten Oberfläche in dieser Reihenfolge reflektiert. Der Lichtstrahl, der durch den Basisabschnitt reflektiert ist, wird teilweise neuerlich durch die Oberfläche reflektiert und wird entlang desselben optischen, runden Pfads wie der Erregungslichtstrahl fortschreiten, der an der ersten Oberfläche gebrochen ist bzw. wird. Der Lichtstrahl, der durch die Basisoberfläche reflektiert ist, wird auch teilweise durch die erste Oberfläche gebrochen, um den Basisabschnitt zu verlassen.
Dieses spezielle optische Design des Basisabschnitts bietet signifikante Vorteile, wenn es mit konventionellen Küvettendesigns verglichen wird. Insbesondere ist die Pfadlänge des Ausbreitungspfads des Erregungslichtstrahls in dem Basisabschnitt relativ kurz verglichen mit Pfadlängen von Erregungslichtstrahlen in konventionellen Küvetten. Da der Basisabschnitt von jeglicher Küvette, insbesondere einer billigen Wegwerf-Küvette aus einem Material, beispielsweise Kunststoff, gefertigt bzw. hergestellt sein wird, welches optische Unreinheiten oder Fehler besitzt, ist eine kurze Pfadlänge des Erregungslichtstrahls in dem Basisabschnitt bevorzugt. Eine große bzw. lange Pfadlänge wird in einer größeren parasitären Lichtintensität von Licht resultieren, das durch optische Verunreinigungen gestreut ist. Dieses parasitäre Licht kann in die Vertiefung eintreten und Substanzen in dem Volumen der Lösung erregen. Dies resultiert in einem parasitären Hintergrundsignal, das das Signal-zu-Rausch-Verhältnis des Fluoreszenzsignals, das zu detektieren ist, reduziert. Ein weiterer Vorteil einer Küvette gemäß der vorliegenden Erfindung liegt in der Tatsache, daß verglichen mit konventionellen Küvetten, die Küvette einen relativ großen Detektionswinkel ermöglicht, d.h. das Fluoreszenzsignal kann über einen großen Winkelbereich detektiert werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausbildung ist die Höhe H des Trapezoids gegeben durch
wobei (90° – γ) der Trapezoidbasiswinkel zwischen der Basisseite und der ersten Seite ist, n₂ der Brechungsindex des Basisabschnitts ist, A die Länge der oberen Seite des Trapezoids ist, und
Die Höhe H des Trapezoids ist der Abstand zwischen der oberen und Basisseite des Trapezoids in einer Richtung senkrecht zu der Basisseite. Die obige Relation bzw. Gleichung gilt für eine Küvette, welche in einer gasförmigen Umgebung zu betätigen bzw. einzusetzen ist, die einen Brechungsindex n₁ = 1 aufweist. Weiter wurde angenommen, daß der Erregungslichtstrahl, der auf der ersten Oberfläche des Basisabschnitts einfällt, so ausgerichtet bzw. orientiert ist, um auf der ersten Oberfläche mit einem Einfallswinkel entsprechend dem Brewster-Winkel α_B = arctan (n₂) einzufallen. γ ist ein Trapezoidneigungswinkel, der den Winkel zwischen einer normalen Richtung der Basisseite und der ersten und zweiten Seite des Trapezoids definiert. β ist der Brechungswinkel des Erregungslichtstrahls, der auf der ersten Oberfläche des Basisabschnitts gebrochen ist.
Wenn der Einfallswinkel α des Erregungslichtstrahls auf der ersten Oberfläche mit dem Brewster-Winkel α_B übereinstimmt bzw. diesem entspricht, ist der Winkel β nur von dem Brechungsindex n₂ des Materials des Basisabschnitts abhängig. Für eine gegebene Länge A der Oberseite und den Trapezoid-Neigungswinkel γ des Trapezoids kann die Höhe H des Trapezoids unter Verwendung der obigen Formel berechnet werden. Es sollte jedoch festgehalten werden, daß der Einfallswinkel α des Erregungslichtstrahls nicht exakt mit dem Brewster-Winkel α_B übereinstimmen muß. Stattdessen sind Winkelabweichungen von α relativ zu dem Brewster-Winkel α_B möglich, werden jedoch in einer abgesenkten bzw. verringerten Effizienz resultieren. Der Einfallswinkel α ist vorzugsweise gewählt, um der Brewster-Winkel α_B zu sein, da in diesem Fall keine Reflexionsverluste auf der ersten Oberfläche auftreten werden, wenn der einfallende Erregungslichtstrahl linear in seiner Einfallsebene polarisiert ist bzw. wird. Wenn beispielsweise der Einfallswinkel α des Erregungslichtstrahls von dem Brewster-Winkel α_B um 10° abweicht, werden die Verluste aufgrund von Reflexionen auf der ersten Oberfläche des Trapezoids in der Größenordnung von 1 % der ursprünglichen bzw. Anfangsintensität I₀ des einfallenden Erregungslichtstrahls sein. Dies entspricht etwa derselben Größenordnung wie der Bereich des Lichts, das durch eine konventionelle Halbleiterlaserdiode emittiert ist, welches nicht linear polarisiert ist. Daher ist es möglich, die obige stringente Bedingung betreffend den Einfallswinkel α ohne Opfern von wesentlicher Effizienz zu lockern.
Gemäß einer bevorzugten Ausbildung der vorliegenden Erfindung ist der Basisseiten-Reflexionswinkel δ = 90° – (β + γ) größer als arcsin(1/n₂), wobei n₂ der Brechungsindex des Basisabschnitts ist und
Entlang des optischen Umlaufpfads des Erregungslichtstrahls in dem Basisabschnitt der Küvette wird der Lichtstrahl vorzugsweise total (intern) auf der Basisoberfläche des Basisabschnitts reflektiert. Zu diesem Zweck hat der Basis seiten-Reflexionswinkel δ (Winkel zwischen einer normalen Richtung der Basisseite und dem Lichtstrahl, der auf der Basisseite einfällt) größer zu sein als arcsin (1/n₂). Der Basisseiten-Reflexionswinkel δ ist eine Funktion des Brechungswinkel β des Lichtstrahls, der auf der ersten Oberfläche reflektiert ist bzw. wird.
Entsprechend einer bevorzugten Ausbildung der Erfindung ist der Erregungsseiten-Reflexionswinkel ε = 90° – (β – γ) größer als arcsin (1/n₂), wobei n₂ der Brechungsindex des Basisabschnitts ist und
In gleicher Weise wie in der oben beschriebenen Ausbildung ist es auch stark bevorzugt, daß der Erregungslichtstrahl vollständig (intern) durch die Erregungsoberfläche des Basisabschnitts reflektiert ist bzw. wird. In diesem Fall wird nur das elektromagnetische Evaneszenzfeld optisch die zu analysierenden Substanzen in einem Raum erregen, der sehr nahe der Erregungsoberfläche liegt. Eine optische Erregung von Substanzen in dem Volumen der Vertiefung wird nicht auftreten. So ist der Erregungsseiten-Reflexionswinkel ε vorzugsweise größer als arcsin (1/n₂). Der Erregungsseiten-Reflexionswinkel ist der Winkel zwischen dem Erregungslichtstrahl, der auf die Erregungsoberfläche einfällt bzw. auf diese auftrifft, und einer normalen Richtung der Erregungsoberfläche.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausbildung der vorliegenden Erfindung ist das Trapezoid vorzugsweise ein Recht eck, das eine Höhe H und eine Breite A aufweist, und A/H n₂. Es sollte verstanden werden, daß die rechteckige bzw. rechtwinkelige Form des Basisabschnitts in einer Querschnittsebene parallel zu der normalen Richtung der Erregungsoberfläche auch kleine Winkelabweichungen (einige wenige Grad) von einer perfekt rechteckigen Form umfassen sollte. Die Relation der Breite A zu der Höhe H des Rechtecks ist in diesem Fall vorzugsweise gewählt, um mit dem Brechungsindex n₂ des Basisabschnitts übereinzustimmen. Diese Relation bzw. Beziehung hält, solange der Einfallswinkel α des einfallenden Erregungslichtstrahls gewählt ist, um dem Brewster-Winkel arctan (n₂) zu entsprechen.
Die Küvette der vorliegenden Erfindung ist aus einem optisch transparenten Material gefertigt bzw. hergestellt, vorzugsweise in dem Wellenlängenbereich von 600 bis 700 nm, wie Glas, Quarz, Silikone oder transparente Polymere oder jegliche Kombinationen dieser Materialien. Die Küvette enthält insbesondere vorzugsweise einen Kunststoff, wie Polystyrol, ein Polyolefin, wie Polypropylen, Polyethylen, Polyethylenterephtalat, ein Polycycloolefin, Polyacrynitril, Polymethylmethacrylat, Polycarbonat, SAN, Cyclocopolymerolefin (COC; vertrieben beispielsweise unter dem Handelsnamen TOPAS oder ZEONEX) und/oder Mischungen oder Verschnitte dieser Kunststoffe. Im Prinzip ist jeder Kunststoff oder jedes Harz geeignet, welches grundsätzlich bzw. im wesentlichen kein Licht in dem speziellen Bereich von Interesse (beispielsweise dem sichtbaren Bereich) absorbiert und vorzugsweise die Anwendung einer geeigneten Beschichtung für ein insbesondere fluoreszierendes Material ermöglicht. Das Material kann Additive bzw. Zusätze enthalten, um beispielsweise die Bearbeitungscharakteristika, insbesondere für ein Spritzgießen zu verbessern. Da die Dispersionsbeziehungen der obigen Materialien bekannt sind, können jegliche notwendige Einstellungen der Größenabmessungen der Vertiefung und Basisabschnitte durch Berechnungen ausgeführt werden. In einer Form einer Ausbildung kann der Kunststoff auch gefärbt sein, beispielsweise hellblau, um eine Emission herauszufiltern, die durch gestreutes Licht bewirkt wird. Bei den Wellenlängen von Interesse ist der Basisabschnitt vorzugsweise optisch transparent, während der Vertiefungsabschnitt aus einem Licht absorbierenden oder opaken Material gefertigt sein kann. Kunststoffküvetten können billig bzw. kostengünstig durch Spritzgießen erhalten werden und haben vorzugsweise ein Reaktionsvolumen von 1 bis 400 μl, und insbesondere bevorzugt 5 bis 200 μl. Vorzugsweise ist die Küvette der vorliegenden Erfindung in einem Stück gefertigt. Es kann auch ein Vorteil sein, wenn das Innere und/oder die Emissionsoberfläche, d.h. die Oberfläche, von welcher der emittierte Strahl aus der Küvette austritt, auf eine Oberflächerauheit von vorzugsweise 10 nm Maximum poliert ist/sind.
Vorzugsweise sind der Vertiefungsabschnitt und der Basisabschnitt einstückig ausgebildet. Beispielsweise können die Vertiefungs- und Basisabschnitte durch ein Spritzgießen geformt sein. Alternativ ist es auch möglich, gesondert den Vertiefungsabschnitt und den Basisabschnitt auszubilden und diese Abschnitte unter Verwendung von beispielsweise eines Klebers zusammenzubauen, der einen Brechungsindex aufweist, der mit dem Brechungsindex des Basisabschnitts übereinstimmt bzw. abgestimmt ist. Vorzugsweise sind der Vertiefungs- und Basisabschnitt aus einem Material gebildet, umfassend Polymere, wie sie oben aufgelistet sind. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausbildung der vorliegenden Erfindung umfaßt die Küvette eine Mehrzahl von Vertiefungs abschnitten. Beispielsweise können die Vertiefungsabschnitte linear in einer stabförmigen Küvette so angeordnet sein, daß eine Mehrzahl von Versuchen mit einer einzigen Küvette ausgeführt werden kann. Vorzugsweise ist nur ein einziger Basisabschnitt für die Mehrzahl von Vertiefungsabschnitten vorgesehen bzw. zur Verfügung gestellt.
Die vorliegende Erfindung wird nun mittels eines Beispiels im Zusammenhang mit den beiliegenden Zeichnungen beschrieben. In den Figuren ist:
1(a) eine Draufsicht auf eine bevorzugte Ausbildung einer Küvette gemäß der vorliegenden Erfindung;
1(b) eine Querschnittsansicht der Küvette entlang der Linie A-A in 1(a);
1(c) eine Seitenansicht der unteren Endseite der Küvette, die in 1(a) gezeigt ist;
1(d) eine Querschnittsansicht entlang der Linie B-B von 1(a);
1(e) eine Querschnittsansicht der Küvette entlang der Linie C-C von 1(a);
1(f) eine perspektivische Ansicht der Küvette, die in 1(a) gezeigt ist;
2 eine schematische Zeichnung eines Basisabschnitts einer Küvette gemäß einer anderen bevorzugten Ausbildung der vorliegenden Erfindung, wobei der optische Pfad des Lichtstrahls schematisch angedeutet bzw. dargestellt ist;
3 eine schematische Ansicht einer Ausbildung des Verfahrens zum Untersuchen von Substanzen unter Verwendung der Küvette der vorliegenden Erfindung;
4 eine Kinetik einer Biotin-HRP-Bindung an einer Streptavidin-Oberfläche;
5 eine Maus IgG Titration in ELISA (A) und Fluoreszenzversuch bzw. -assay (B); und
6 eine Titration von Maus IgG in unterschiedlichen Matrizen.
In 1(a) ist eine bevorzugte Ausbildung der Küvette gemäß der vorliegenden Erfindung gezeigt. Die Küvette 10 ist im wesentlichen stangen- bzw. stabförmig und hat einen Handhabungsabschnitt 12 zum Handhaben und Montieren der Küvette 10 in einen Leser bzw. ein Lesegerät. Wie dies in 1(b) gezeigt ist, hat der Handhabungsabschnitt 12 eine Aussparung bzw. Ausnehmung 14, die darin ausgebildet ist. Gegenüberliegend dem Handhabungsabschnitt 12 der Küvette 10 ist ein Analysierabschnitt 16 ausgebildet. Der Analysierabschnitt 16 hat eine Mehrzahl von Vertiefungsabschnitten 18, die Vertiefungen 20 zum Aufnehmen einer Lösung aufweisen, die zu analysierende Substanzen enthalten. Die Seitenwände 22 der Vertiefungen 20 sind durch einen Basisabschnitt 24 abgestützt bzw. getragen, welcher sich über den gesamten Analysierabschnitt 16 erstreckt. In der in 1 gezeigten, bevorzugten Ausbildung ist der Basisabschnitt 24 integral bzw. einstückig mit dem Vertiefungsabschnitt 18 ausgebildet. Vorzugsweise ist die Küvette spritzgegossen und besteht beispielsweise aus Polystyrol 158 K.
In 1(d) ist eine Querschnittsansicht der Küvette entlang einer Linie B-B von 1(a) dargestellt bzw. gezeigt. Der Querschnitt wird in einer Ebene genommen, die eine Anregungs- bzw. Erregungsoberfläche 30 einer Vertiefung 20 des Vertiefungsabschnitts 18 unter rechten Winkeln schneidet, d.h. die Querschnittsebene ist parallel zu der normalen Richtung der Erregungsoberfläche 30. Der Basisabschnitt 24 der Küvette 10 hat eine erste Oberfläche 26, um einen Anregungs- bzw. Erregungslichtstrahl einer externen Erregungslichtquelle (nicht dargestellt) zu empfangen. Eine zweite Oberfläche ist gegenüberliegend der ersten Oberfläche 26 angeordnet. Der Boden des Basisabschnitts 24 ist durch eine Basisoberfläche 32 ausgebildet, welche beabstandet von und parallel zu der Erregungsoberfläche 30 ist. In dem Querschnitt, der in 1(d) gezeigt ist, weist der Basisabschnitt 24 der Küvette 10 die Form bzw. Gestalt eines gleichschenkeligen Trapezoids bzw. Trapezes aus. Bezugnehmend auch auf 1(d) und 2 ist die obere Seite 30S des Trapezoids durch die Erregungsoberfläche 30 gebildet, die sich über die Seitenwandglieder 22 des Vertiefungsabschnitts 18 erstreckt. Die Basisseite 32S des Trapezoids ist durch die Basisoberfläche 32 gebildet. Die erste Seite 26S und die zweite Seite 28S von gleicher Länge des Trapezoids sind durch die erste Oberfläche 26 bzw. die zweite Oberfläche 28 gebildet. Bezugszeichen 26, 28, 30 und 32 werden verwendet, wenn auf die Oberflächen Bezug genommen wird, und Bezugszeichen 265, 285, 30S und 32S werden verwendet für die Seiten oder Schenkel des Trapezoids.
Die erste und zweite Seite 26S, 28S des Trapezoids sind um einen Winkel γ von 2° in bezug auf eine normale bzw. Normalenrichtung der Oberseite 30S oder der Basisseite 32S geneigt. Diese kleine Neigung der ersten und zweiten Oberfläche 26 und 28 des Basisabschnitts 24 hilft, die Küvette aus der Spritzgußform nach einem Formen bzw. Gießen zu entfernen.
2 zeigt eine schematische Querschnittsansicht eines Basisabschnitts 24 einer Küvette gemäß einer anderen bevorzugten Ausbildung der vorliegenden Erfindung. In 2 ist der optische Pfad eines Erregungslichtstrahls 34 einer ex ternen Erregungslichtquelle, vorzugsweise einer Halbleiterlaserdiode, dargestellt. Der Erregungslichtstrahl 34 wird durch die erste Oberfläche 26 des Basisabschnitts 24 empfangen. Vorzugsweise entspricht der Einfallswinkel α des einfallenden Erregungslichtstrahls 34 dem Brewster-Winkel α_B = arctan (n₂/n₁), wobei n₁ der Brechungsindex des Basisabschnitts 24 ist und n₁ der Brechungsindex der näheren Umgebung ist, typischerweise Luft. In diesem Fall ist n₁ = 1.
Über der Erregungsoberfläche 30 (oberen bzw. Oberseite 30S) ist eine Vertiefung 20 zum Aufnehmen einer Lösung, enthaltend Substanzen, die zu untersuchen sind, ausgebildet. Der Vertiefungsabschnitt 18 ist der Einfachheit halber nicht in 2 gezeigt. Es sollte jedoch verstanden werden, daß im Betrieb die Erregungsoberfläche 30 die Zwischen- bzw. Grenzfläche zwischen dem Basisabschnitt 24, der den Brechungsindex n₂ aufweist, und der Lösung sein wird, die einen Brechungsindex n₃ in der Vertiefung 20 aufweist.
Die Erregungslichtstrahl 34 wird auf der ersten Oberfläche 26 (ersten Seite 26S in 2) des Trapezoids gebrochen. Der gebrochene Lichtstrahl trifft nachfolgend auf die Erregungsoberfläche 30 (obere Seite 30S in 2) auf, wo er intern total reflektiert wird, um in der Richtung der zweiten Oberfläche 28 fortzuschreiten bzw. sich fortzupflanzen. Wenn der einfallende Erregungslichtstrahl 34 perfekt linear in seiner Einfallsebene polarisiert ist, werden keinerlei Reflexionen des eintretenden Erregungslichtstrahls 34 auf der ersten Oberfläche 26 auftreten. Weiters wird unter idealen optischen Bedingungen (Material des Basisabschnitts 24 ist nicht doppelt brechend) der Erregungslichtstrahl 34 den Basisabschnitt 24 verlassen, indem er auf der zweiten Oberfläche 28 gebrochen ist bzw. wird. Jedoch sind typische Materialien des Basisabschnitts 24 doppelt brechend, so daß die Polarisationsebene des Erregungslichtstrahls gestört werden wird. Daher treten teilweise Reflexionen des Lichtstrahls 34 auf der zweiten Oberfläche 28 auf. Der reflektierte Lichtstrahl wandert bzw. schreitet in der Richtung der Basisoberfläche 32 (Basisseite 32S) fort, wo er vorzugsweise vollständig bzw. total reflektiert wird.
Der Basisabschnitt 24 ist derart ausgebildet, daß der Lichtstrahl, der durch die Basisoberfläche 32 reflektiert wird bzw. ist, auf die erste Oberfläche 26 an im wesentlichen demselben Punkt oder dem Bereich auftrifft, wo der einlangende bzw. ankommende Erregungslichtstrahl 34 ursprünglich die erste Oberfläche 26 trifft. Mit anderen Worten ist die Kopplungshöhe h, die der Abstand zwischen der Erregungsoberfläche 30 (oberen Seite 30S) und dem Einfallspunkt des ankommenden Erregungslichtstrahls 34 in einer normalen Richtung der Oberseite 30S ist, dieselbe Höhe, unter welcher der Lichtstrahl, der durch die Basisoberfläche 32 reflektiert ist, auf die erste Oberfläche 26 auftrifft. Somit ist der Basisabschnitt 24 der Küvette 10 derart ausgebildet bzw. konstruiert, daß ein auffallender Erregungslichtstrahl 34 in den Basisabschnitt 24 entlang eines (geschlossenen) optischen, runden Pfads bzw. Umlaufpfads geführt ist, der identische Start- und Endpunkte/bereiche aufweist. Es sollte verstanden werden, daß der Erregungslichtstrahl 24, der in 2 gezeigt ist, in dem Ausmaß vereinfacht ist, daß ein tatsächlicher Erregungslichtstrahl eine finite bzw. endliche Strahlbreite aufweisen wird. Die Strahlbreite ist vorzugsweise so eingestellt, um einen vorbestimmten Bereich der Erregungsoberfläche 30 zu erregen. Auch für einen Erregungslichtstrahl 34 aus parallelem Licht, der eine finite Strahlbreite aufweist, halten bzw. gelten die obigen Kriterien des Umlaufpfads.
Der optische, runde Pfad bzw. Umlaufpfad in dem Basisabschnitt 24 der Küvette 10 hat zahlreiche Vorteile verglichen mit konventionellen Küvetten. Beispielsweise ist die Pfadlänge des optisch runden Pfads (2l + 2k für einen runden Weg bzw. Umlauf, siehe 2) bemerkenswert kürzer als die Pfadlänge in konventionellen Küvetten. Ein Reduzieren der Pfadlänge des optischen Pfads in der Küvette impliziert eine Reduktion der Intensität des Lichts, das an Verunreinigungen gestreut wird, welche in unvermeidbarer Weise in dem Basisabschnitt 24 vorhanden sind. Weiters erlaubt das Design des Basisabschnitts 24 einen größeren Betrachtungs- bzw. Sicht- oder Detektionswinkel für ein Sammeln/Detektieren des Fluoreszenzlichts. Während in den konventionellen Küvettendesigns die Fluoreszenz nur in einem relativ kleinen Winkelbereich detektiert werden kann, kann der Detektionswinkel einer Küvette 10 gemäß der Erfindung größer sein bzw. werden, was in einem verbesserten Fluoreszenzsignal resultiert. Weiters ist die trapeziodale Form des Basisabschnitts 24 relativ leicht unter Verwendung von Spritzgußtechniken herzustellen, die in der Technik bekannt sind. Insbesondere erfordern die erste und zweite Oberfläche 26 und 28 des Basisabschnitts 24 nicht notwendiger Weise, daß sie optisch poliert sind bzw. werden, da die Genauigkeit der Spritzgußtechnik regelmäßig für eine optisch ebene bzw. flache Oberfläche ausreichend sein wird.
Im Folgenden wird unter Bezugnahme auf 2 ein bevorzugtes Designverfahren einer bevorzugten Ausbildung der vorliegenden Erfindung beschrieben werden:
Um vollständige innere bzw. interne Reflexionen des Erregungslichtstrahls 34 durch die Erregungs- und Basisoberflächen 30, 32 des Basisabschnitts 24 zu erreichen bzw. zu erhalten, müssen der Erregungsoberflächenwinkel ε und der Basisoberflächenwinkel δ größer als die entsprechenden kritischen Winkel für Totalreflexionen sein. Daher ε(β,γ) > εmin δ(β,γ) > δmin wobei ε(β,γ) = 90° – (β – γ) δ(β,γ) = 90° – (β + γ); und δ(β,γ) = 90° – (β + γ).
Die kritischen Winkel für eine Totalreflexion sind δmin = arcsin (n1/n2); und εmin = arcsin (n3/n2).
Wie zuvor ausgeführt, ist ein geschlossener, optischer Pfad (optischer, runder Pfad) des Erregungslichtstrahls 34 in dem Basisabschnitt 24 stark bevorzugt, wenn doppelt brechende Materialien (beispielsweise Kunststoffmaterialien) für zum Herstellen des Basisabschnitts 24 verwendet werden. Um einen geschlossenen, optischen Pfad innerhalb des Basisabschnitts 24 zu besitzen, müssen die folgenden Bedingungen erfüllt sein: A/2 + h tan (γ) = l cos (β – γ), h = l sin (β – γ), A/2 + h tan (γ) = k cos (β + γ), wobei l die optische Pfadlänge zwischen dem Auftreff- bzw. Einfallspunkt auf die erste Oberfläche 26 zu dem Einfalls- bzw. Auftreffpunkt auf die Erregungsoberfläche 30 ist und k die optische Pfadlänge zwischen den Einfallspunkten auf die erste und Basisoberfläche 26 und 32 für einen symmetrisch optischen, runden Pfad bzw. Umlaufpfad in dem Basisabschnitt 24 sind. A ist die Länge der Oberseite 30, die die erste und zweite Seite 26S, 28S verbindet.
Es kann gezeigt werden, daß die obigen Bedingungen den folgenden Ausdruck für die Höhe H des Trapezoids ergeben:
Die koppelnde bzw. Kopplungshöhe h eines einfallenden Erregungslichtstrahls 34, der einen symmetrischen, optischen, runden Pfad in dem Basisabschnitt 24 aufweist, d.h. einen runden Pfad bzw. Umlaufpfad, wobei die Reflexionen an der oberen und Basisseite 30S, 32S des Trapezoids im Zentrum der entsprechenden Seiten liegen, ist gegeben durch
Die Kopplungshöhe h sollte vorzugsweise in Übereinstimmung mit der Strahlbreite des Erregungslichtstrahls 34 sein.
Für den speziellen Fall, wo das Trapeziod ein Rechteck ist und der einfallende Erregungslichtstrahl 34 unter dem Brewster-Winkel α_B = arctan (n₂/n₁) einfällt, kann eine einfache Relation bzw. Beziehung für die Relation A/H berechnet werden. Für ein Rechteck (γ = 0)
Wenn α dem Brewster-Winkel α_B entspricht, ist der Winkel zwischen dem Lichtstrahl, der an der ersten Oberfläche 26 reflektiert und gebrochen wird, 90°, so daß
Daher
In einer bevorzugten Ausbildung der vorliegenden Erfindung ist die Erregungsoberfläche 30 der Küvette vorzugsweise hydrophil. Eine im wesentlichen hydrophile Erregungsoberfläche 30 kann beispielsweise durch ein wenigstens teilweises Beschichten der Oberfläche mit einer hydrophilen Verbindung erhalten werden. Jedoch sind viele Verbindungssysteme, welche für ein Bereitstellen einer hydrophilen Erregungsoberfläche 30 verwendet werden können, beispielsweise Dextranderivate, wie Allyldextran, welche kovalent an die Erregungsoberfläche, die beispielsweise aus einem Polystyrol hergestellt ist, nach einer Röntgenbestrahlung bzw. -behandlung der Erregungsoberfläche gekoppelt sind, um Radikale zu generieren. Insbesondere ist ein Beispiel zum Herstellen bzw. Vorbereiten einer hydrophilen Erregungsoberfläche 30 unter Verwendung von Allyldextran wie folgt: ein Polystyrolchip als Küvette (γ bestrahlt mit 26 kGray, ⁶⁰Co) wird zur Verfügung gestellt, und 50 μl einer Lösung von Allyldextran, das ein Molekulargewicht von etwa 150 kD aufweist (100 μg/μl in Wasser) wird hinzugefügt und für 16 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wird angesaugt und der Polystyrolchip bzw. das Polystyrolstück wird drei Mal mit Wasser gewaschen. Nach einer Inkubation mit 50 μl einer Lösung aus Natrium(meta)periodat (30mM in Wasser) für 1 h bei Raumtemperatur, wird die Lösung angesaugt und der Polystyrolchip wird drei Mal mit PBS gewaschen. Dann werden 50 μl einer Lösung von Neutravidin (40 μg/μl in 0,1 M NaHCO₃, pH 9,3) hinzugefügt und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt durch einen Zusatz von 0,5 μl einer Lösung aus Natrium-Cyanborhydrid (5 M) und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur, und nachfolgend durch ein Hinzufügen und Inkubieren mit 25 μl einer wäßrigen Lösung aus Ethanolamin (300 mM) für 15 min bei Raumtemperatur. Die Lösungen werden angesaugt und der Polystyrolchip wird drei Mal mit PBS gewaschen. Die überschüssigen reaktiven Stellen des Polystyrolchips werden durch ein Inkubieren in einer 100 μl Blockierlösung (z.B. PBS, 1 % BSA, 0,25 % Tween 20) für 1 h bei Raumtemperatur blockiert.
Alternativ kann ein hydrophiles Verbindungssystem, welches für ein Bereitstellen einer hydrophilen Erregungsoberfläche 30 verwendet werden kann, das Poly-L-Lysin/Glutardialdehyd-System sein. Insbesondere ist ein Beispiel dafür wie folgt: ein Polystyrolchip bzw. -stück als Küvette (γ bestrahlt mit 26 kGray, ⁶⁰Co) wird zur Verfügung gestellt und 50 μl einer Lösung von Poly-L-Lysin (10μg/μl in PBSplus (100 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄, 100 mM NaCl pH 7,5) wird hinzugefügt und für 16 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wird an- bzw. abgesaugt und der Polystyrolchip wird drei Mal mit PBS ge waschen. Nach einer Inkubation mit 50 μl einer Lösung aus Glutardialdehyd (1 % in PBSplus) für 1 h bei Raumtemperatur, wird die Lösung angesaugt und der Polystyrolchip wird drei Mal mit PBS gewaschen. Dann werden 50 μl einer Lösung aus Neutravidin (40 μg/μl in 0,1 M NaHCO₃, pH 9,3) hinzugefügt und für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt durch ein Hinzufügen von 0,5 μl einer Lösung aus Natrium-Cyanborhydrid (5 M) und Inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur, und nachfolgend durch ein Hinzufügen und Inkubieren von 25 μl einer wäßrigen Lösung aus Ethanolamin (300 mM) für 15 min bei Raumtemperatur. Die Lösungen werden angesaugt und der Polystyrolchip wird drei Mal mit PBS gewaschen. Die überschüssigen, reaktiven Stellen des Polystyrolchips werden durch ein Inkubieren mit 100 μl Blockierlösung (z.B. PBS, 1 % BSA, 0,25 % Tween 20) für 1 h bei Raumtemperatur blockiert.
Das Beschichten der oben erwähnten hydrophilen Verbindungen auf der Erregungsoberfläche kann beispielsweise sogenannte "Inselstrukturen" oder Monoschichten ausbilden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausbildung der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung als ein Reaktionspartner R1 auf der Erregungsoberfläche 30 der Küvette immobilisiert (z.B. gebondet), wobei die Erregungsoberfläche mit hydrophilen Verbindungen, wie oben ausgeführt, beschichtet sein kann. Der Ausdruck "immobilisiert" bedeutet vorzugsweise, daß der Reaktionspartner R1 an der Erregungsoberfläche 30 durch Absorption angehaftet ist ("direkte Absorption"). Jedoch kann der Reaktionspartner R1 auch an der Erregungsoberfläche 30 über eine Verankerungsverbindung immobilisiert sein, beispielsweise ein Protein, wie einen Antikörper, ein Antigen, Streptavidin, Avidin, Neutravidin, oder Verbindungen wie Biotin. Der Reaktionspartner R1 kann auch an der Erregungsoberfläche R1 (30) über (eine) kovalente Bindung(en) immobilisiert sein. Dies kann beispielsweise durch eine Konversion bzw. Umwandlung mit einem Carbodiimid einer acrylathaltigen Erregungsoberfläche zur Verfügung gestellt sein.
Allgemein bedeuten die Ausdrücke "immobilisiert" und "gebondet bzw. verbunden" in dem Sinn der vorliegenden Erfindung eine Adhäsion eines Reaktionspartners oder einer Verbindung, wie einer Verankerungsverbindung oder einer Fluorophor enthaltenden Verbindung an einer Oberfläche, wie der Erregungsoberfläche 30, oder an einem anderen Reaktionspartner und/oder einer Verbindung, und umfassen bzw. beinhalten sowohl kovalente als auch nicht-kovalente Wechselwirkungen, wie Wechselwirkungen, die auf ionischen, polaren oder nicht-polaren Wechselwirkungen basieren.
Der Reaktionspartner R1 der verankernden bzw. Verankerungsverbindung kann an der Erregungsoberfläche durch ein übliches Verfahren angeordnet sein. Beispielsweise kann ein Protein, das als Reaktionspartner R1 oder eine Verankerungsverbindung dient, auf bzw. an der Erregungsoberfläche beschichtet sein. Reaktionspartner R1 oder die Verankerungsverbindung kann vorzugsweise an die Oberfläche durch Absorption oder kovalente Verbindung(en) verankert bzw. gebunden werden. Nach diesem Schritt wird die Erregungsoberfläche vorzugsweise mit einer weiteren Lösung, enthaltend blockierende bzw. Blockierverbindungen, behandelt, und Flächen bzw. Bereiche auf der Erregungsoberfläche, die keinen Reaktionspartner R1 oder keine Verankerungsverbindung enthalten, sind bzw. werden beispielsweise durch ein weiteres Protein als einer Blockierungs verbindung blockiert oder werden blockiert werden, welches) grundsätzlich nicht mit den Verbindungen in den Lösungen reagiert, die für ein Ausführen des Versuchs bzw. Assays verwendet werden.
In bevorzugten Ausbildungen der vorliegenden Erfindung liegen der Reaktionspartner R1 oder die Verankerungsverbindung in lyophilisierter Form vor.
In noch einer anderen bevorzugten Ausbildung der vorliegenden Erfindung ist der lyophilisierte Reaktionspartner R1 oder die lyophilisierte Verankerungsverbindung durch eine lyophilisierte Abstandhalterschicht abgedeckt. Die Bestandteile der Abstandhalterschicht sind vorzugsweise aus der Gruppe gewählt, bestehend aus einer oder mehreren Pufferverbindung(en), wie HEPES, einer oder mehreren Proteinhaltigen Verbindung(en), wie BSA, einem oder mehreren hydrophilen Polymer(en), wie Dextran, einem oder mehreren Komplexieragentien/Antikoagulantien, wie EDTA, und gegebenenfalls bakteriostatische Verbindungen, wie Trimethoprim und/oder Sulfamethoxazol, und einer Mischung enthaltend einen oder mehrere dieser Bestandteile. Weiters kann die Abstandhalterschicht auch den Reaktionspartner R3 enthalten.
In weiters bevorzugten Ausbildungen der vorliegenden Erfindung enthält die Küvette neben dem lyophilisierten Reaktionspartner R1 oder der Verankerungsverbindung und der Abstandhalterschicht ein Lyophilisat, welches die lyophilisierte Abstandhalterschicht abdeckt. Dieses Lyophilisat umfaßt entweder

(A) eine Fluorophor enthaltende Verbindung oder eine Verbindung als Reaktionspartner R3 oder eine Mischung davon, unter der Voraussetzung, daß der Reaktionspartner R1 auf der Erregungsoberfläche 30 immobilisiert ist; oder
(B) Reaktionspartner R1 oder eine Fluorophor enthaltende Verbindung oder eine Verbindung als Reaktionspartner R3 oder eine Mischung davon, enthaltend zwei oder drei dieser Bestandteile, unter der Voraussetzung, daß die Verankerungsverbindung auf der Erregungsoberfläche 30 immobilisiert ist;

In bevorzugten Ausbildungen der vorliegenden Erfindung beinhalten die Ausdrücke ""Verankerungsverbindung", ""Reaktionspartner R1", ""Reaktionspartner R2" und ""Reaktionspartner R3" allgemein jeweils einen Teil eines liganden-Verbindungssystems, wie monoklonale oder polyklonale Antikörper, Proteine, die als Antigene funktionieren bzw. fungieren, Proteine, die eine Affinität für spezifische Verbindungen besitzen, wie Streptavidin, Avidin etc., und Verbindungen, die eine Affinität für beispielsweise spezifische Proteine, wie Biotin besitzen. Beispielsweise ist die Verankerungsverbindung, die auf der Erregungsoberfläche immobilisiert ist, Streptavidin; der Reaktionspartner R1 ist ein monoklonaler Antikörper, der gegen den Reaktions partner R2 gerichtet ist, der ein Biotin daran konjugiert aufweist, um eine Immobilisierung an der Erregungsoberfläche über das Streptavidin/Biotin-System zu ermöglichen; der Reaktionspartner R2, welcher die Substanz ist, die untersucht wird, funktioniert bzw. fungiert als ein Antigen; und Reaktionspartner R3 ist ein monoklonaler Antikörper, der gegen den Reaktionspartner R2 gerichtet ist, der eine Fluorophor enthaltende Verbindung daran konjugiert aufweist, um Fluoreszenzmessungen zu ermöglichen (siehe auch 3).
Weiters wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Küvette, die wie oben definiert ist, zur Verfügung gestellt, umfassend die Schritte:

(a) Immobilisieren von Reaktionspartner R1 oder der Verankerungsverbindung auf der Erregungsoberfläche 30 der Küvette.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann weiters die Schritte umfassen:

(b) Anwenden einer frierbaren (vorzugsweise wäßrigen) Lösung I, welche eine oder mehrere Pufferverbindung(en), wie HEPES eine oder mehrere Proteinartige Verbindung(en), wie BSA, einen oder mehrere Cryoprotektanten, wie Poly(ethylenglycol), einen oder mehrere Lyoprotektanten, wie Saccharose, ein oder mehrere Detergens (-tien), wie n-Octyl-β-D-glucopyranosid, ein oder mehrere Antioxidans (-tien), wie Ascorbinsäure, eine oder mehrere hydrophile Verbindung(en), wie Dextran, ein oder mehrere Komplexieragens (-tien)/Antikoagulans (-tien), wie EDTA, und gegebenenfalls bakteriostatische Verbindungen, wie Trimethoprim und/oder Sulfamaethoxazol und Mischung, enthaltend einen oder mehreren dieser Bestandteile, auf dem immobilisierten Reaktionspartner R1 oder der immobilisierten Verankerungsverbindung enthalten kann; und
(c) Frieren dieser Lösung I, um eine gefrorene Abstandhalterschicht zu erhalten.

Nach Schritt (c) des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann der gefrorene Inhalt der Küvette lyophilisiert werden, um eine Küvette zu erhalten, welche bereit zur Verwendung zum Untersuchen von Substanzen ist.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann weiters die Schritte umfassen:

(d) Anwenden einer frierbaren (vorzugsweise wäßrigen) Lösung II, welche eine oder mehrere Pufferverbindung(en), wie HEPES, eine oder mehrere Proteinartige Verbindung(en), wie BSA, eine oder mehrere hydrophile Verbindung(en), wie Dextran, einen oder mehrere Kryoprotektanten, wie Poly(ethylenglycol), einen oder mehrere Lyoprotektanten, wie Saccharose, ein oder mehrere Detergens (-tien), wie n-Octyl-β-D-glucopyranosid, ein oder mehrere Antioxidans (-tien), wie Ascorbinsäure, eine oder mehrere ionische und/oder nicht-ionische oberflächenaktive Substanz(en), wie Tween 20 oder Brij35 T, ein oder mehrere Salz(e), wie NaCl, einen oder mehrere Füllstoff(e), wie Glycin, und gegebenenfalls bakteriostatische Verbindungen, wie Trimethoprim und/oder Sulfamethoxazol, einen oder mehrere Farbstoff(e), wie Lissamin Grün B, Indigokarmin, Brilliant Schwarz oder Cu-Chlorophyll, und eine Mischung enthaltend einen oder mehrere dieser Bestandteile enthalten kann, enthaltend entweder (A) eine Fluorophor enthaltende Verbindung oder eine Verbindung als Reaktionspartner R3 oder eine Mischung davon, unter der Voraussetzung, daß der Reaktionspartner R1 auf der Erregungsoberfläche 30 immobilisiert ist, oder (B) Reaktionspartner R1 oder die Fluorophor enthaltende Verbindung oder eine Verbindung, wie Reaktionspartner R3 oder eine Mischung davon, enthaltend zwei oder drei dieser Bestandteile, unter der Voraussetzung, daß die Verankerungsverbindung auf der Erregungsoberfläche 30 auf der gefrorenen Abstandhalterschicht immobilisiert ist;
(e) Frieren von Lösung II, um eine gefrorene Lösung II auf der gefrorenen Lösung I zu erhalten; und
(f) Lyophilisieren des gefrorenen Inhalts in der Küvette, um ein Lyophilisat zu erhalten, welches bereit ist, um für ein Untersuchen von Substanzen verwendet zu werden.

Die Abstandhalterschicht sollte vollständig die Oberfläche abdecken und ist vor einem Lyophilisieren ein gefrorener Feststoff, bevor der nächste Reaktionspartner, wie Reaktionspartner R3 hinzugefügt wird. Dieser Zusatz schmilzt üblicherweise die gefrorene Abstandhalterschicht nicht, sondern, falls überhaupt, wird nur die Oberseite der Abstandshalterschicht schmelzen. Es ist wesentlich für die Funktionalität des Versuchs, damit ausgeführt zu werden, damit der Reaktionspartner nicht in direktem Kontakt mit Reaktionspartner R1 oder der Verankerungsverbindung zu irgendeiner Zeit während des Verfahrens ist.
In dem Sinn der vorliegenden Erfindung entspricht der Ausdruck "zu untersuchende Substanz" dem Ausdruck "Reaktionspartner R2", wie dies bereits oben erwähnt wurde.
Die Küvette der vorliegenden Erfindung kann in Verfahren für medizinische oder veterinärmedizinische Diagnostik, Nahrungsmittelanalyse, Umwelt- bzw. Umgebungsanalyse, chemische oder biologische Analyse, oder Analyse von Fermentationsverfahren, vorzugsweise für die qualitative und/oder quantitative Bestimmung von Substanzen über immunologische Reaktionen verwendet werden.
Das Verfahren, das die Küvette gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, beinhaltet die Schritte:

– Anordnen in Kontakt mit dem immobilisierten Reaktionspartner R1 oder mit der immobilisierten Verankerungsverbindung oder mit der lyophilisierten Abstandshalterschicht einer Lösung, welche die Substanz enthält, die zu untersuchen ist, als Reaktionspartner R2 oder (A) eine Fluorophor enthaltende Verbindung oder eine Verbindung als Reaktionspartner R3 oder eine Mischung davon, unter der Voraussetzung, daß der Reaktionspartner R1 auf der Erregungsoberfläche 30 immobilisiert ist, oder (B) Reaktionspartner R1 oder eine Fluorophor enthaltende Verbindung oder eine Verbindung als Reaktionspartner R3 oder eine Mischung davon, enthaltend zwei oder drei der Bestandteile, unter der Voraussetzung, daß die Veran kerungsverbindung auf der Erregungsoberfläche 30 immobilisiert ist bzw. wird, wobei ein Komplex sich auf dem immobilisierten Reaktionspartner R1 oder auf der immobilisierten Verankerungsverbindung ausbildet, wobei der Komplex entweder enthält (i) Reaktionspartner R1 und Reaktionspartner R2, welcher einen Fluorophor enthaltenden Rest oder eine Fluorophor enthaltende Verbindung enthält, die damit konjugiert ist; oder (ii) Reaktionspartner R1, Reaktionspartner R2 und Reaktionspartner R3, welcher einen Fluorophor enthaltenden Rest oder eine Fluorophor enthaltende Verbindung enthält, die damit konjugiert ist; oder (iii) Reaktionspartner R1, Reaktionspartner R2, Reaktionspartner R3 und eine Fluorophor enthaltende Verbindung; oder (iv) die Verankerungsverbindung, Reaktionspartner R1 und Reaktionspartner R2, welcher einen Fluorophor enthaltenden Rest oder eine Fluorophor enthaltende Verbindung umfaßt, die damit konjugiert ist; oder (v) die Verankerungsverbindung, Reaktionspartner R1, Reaktionspartner R2 und Reaktionspartner R3, welcher einen Fluorophor enthaltenden Rest oder eine Fluorophor enthaltende Verbindung enthält, die damit konjugiert ist; oder (vi) die Verankerungsverbindung, Reaktionspartner R1, Reaktionspartner R2, Reaktionspartner R3 und eine Fluorophor enthaltende Verbindung; und
– Erregen des Fluorophors, das an die Erregungsoberfläche 30 gebunden wird, über den Komplex durch das Evaneszenzfeld einer Lichtquelle (d.h. durch das Evaneszenzfeld, das innerhalb der Küvette (oder dem Basisabschnitt) erzeugt bzw. generiert wird, wenn ein Erregungslichtstrahl einer externen Erregungslichtquelle angelegt wird), und Messen der erzeugten Fluoreszenz.

In einer bevorzugteren Ausbildung der vorliegenden Erfindung verwendet das Verfahren die Küvette, enthaltend den lyophilisierten Reaktionspartner R1 oder die Verankerungsverbindung, die lyophilisierte Abstandhalterschicht und entweder (A) eine Fluorophor enthaltende Verbindung oder eine Verbindung als Reaktionspartner R3 oder eine Mischung davon, unter der Voraussetzung, daß Reaktionspartner R1 auf der Erregungsoberfläche 30 immobilisiert wird, oder (B) Reaktionspartner R1 oder eine Fluorophor enthaltende Verbindung oder eine Verbindung als Reaktionspartner R3 oder eine Mischung davon, enthaltend zwei oder drei dieser Bestandteile, unter der Voraussetzung, daß die Verankerungsverbindung auf der Erregungsoberfläche 30 immobilisiert wird, wobei das Verfahren die Schritte beinhaltet:

– Anordnen in Kontakt mit dem lyophilisierten Inhalt in der Küvette einer Lösung, welche die Substanz, die zu untersuchen ist, als Reaktionspartner R2 enthält, wobei ein Komplex sich auf dem immobilisierten Reaktionspartner R1 oder auf der immobilisierten Verankerungsverbindung, wie dies oben beschrieben ist, ausbildet; und
– Erregen des Fluorophors, das an die Erregungsoberfläche 30 über den Komplex gebunden ist, durch das Evanseszenzfeld einer Lichtquelle und Messen der ausgebildeten Fluoreszenz.

In bevorzugten Ausbildungen der vorliegenden Erfindung basiert, das in der Küvette zu verwenden ist, auf einem ELISA unter Verwendung eines Fluorophors statt einem farbbildenden System.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Ausdrücke "Komplex" und ""Konjugat" zu verstehen, daß sie ein molekulares Koppeln oder Bonden zwischen zwei oder mehr, vorzugsweise chemischen oder biochemischen Substanzen ausbilden. Der Komplex oder das Konjugat ist vorzugsweise mittels selektiver und/oder spezifischer Reaktionen, insbesondere bevorzugt durch Antigen-Antikörper-Reaktionen ausgebildet.
Gemäß der Erfindung beinhaltet der Ausdruck "Reaktionen" sowohl kovalente als auch nicht-kovalente Wechselwirkungen von zwei oder mehreren Reaktionspartnern, wobei beide Arten von Wechselwirkung eine nach der anderen innerhalb eines Komplexes stattfinden können. Nicht-kovalente Wechselwirkung kann beispielsweise Van der Waals'sche Wechselwirkung, polare und/oder ionische Wechselwirkung von Reaktionspartnern bedeuten. Der Ausdruck "Reaktionspartner" bedeutet allgemein eine Verbindung mit einer Affinität für eine andere Substanz in der vorliegenden Erfindung.
In einer bevorzugten Ausbildung des Verfahrens in der vorliegenden Erfindung kann die Substanz, die als Reaktionspartner R2 untersucht wird, selbst eine Affinität für Reaktionspartner R1 besitzen, der auf der Oberfläche immobilisiert ist, und kann sich daher direkt mit diesem Reaktionspartner R1 verbinden. Wenn die Substanz, die zu untersuchen ist, beispielsweise ein Antikörper ist, kann ein Antigen, das für diesen Antikörper spezifisch ist, auf der Oberfläche angeordnet sein oder umgekehrt.
In einer anderen bevorzugten Ausbildung hat die Substanz, d.h. Reaktionspartner R2, die untersucht wird, selbst (grundsätzlich) keine Affinität oder nur eine sehr kleine Affinität für eine Verankerungsverbindung auf der Oberfläche. In diesem Fall enthält die Lösung, die in Kontakt mit der Oberfläche anzuordnen ist, beispielsweise eine andere Verbindung, welche Reaktionspartner R1 und eine Bindungsstelle für die Substanz enthält, die zu untersucht wird. Der Reaktionspartner R1 kann sich an die Verankerungsverbindung auf der Oberfläche binden und fixiert somit die Substanz, die untersucht wird, indirekt an der Oberfläche. Diese andere Verbindung dient als ein Brückenelement zwischen der Substanz, die untersucht wird, und der Verankerungsverbindung auf der Oberfläche. Beispielsweise kann Avidin als die Verankerungsverbindung auf der Oberfläche vorhanden sein. Die andere Verbindung (d.h. Reaktionspartner R1) enthält neben einer Bindungsstelle für die Substanz, die untersucht wird, beispielsweise Biotin, welches sich an das Avidin binden kann, das an der Oberflächen immobilisiert ist. Diese Ausbildung hat den Vorteil, daß eine Oberfläche, die mit Avidin (oder Streptavidin) beschichtet ist, anders als zahlreiche andere Antikörper oder Antigene, besser lyophilisiert werden kann und sehr stabil in getrockneter oder lyophilisierter Form ist. Zusätzlich hat das Avidin- (oder Streptavidin-)/Biotin-System eine sehr hohe Dissoziationskonstante KD. Es ist auch möglich, daß eine Serie von unterschiedlichen Versuchen auf einer Oberfläche ausgeführt wird, die mit Avidin (oder Streptavidin) beschichtet ist und auch nur die andere Verbindung, welche in Kontakt mit der Oberfläche mit der Lösung ange ordnet ist, auf der zu untersuchenden Substanz zu untersuchen.
3 zeigt diese Ausbildung des Verfahrens, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, schematisch. In der Lösung, die in Kontakt mit der Erregungsoberfläche 30 angeordnet ist, sind nacheinander die Substanz 40 (d.h. Reaktionspartner R2), die untersucht wird, ein Reaktionspartner R3 44, umfassend einen Fluorophor enthaltenden Rest oder eine Verbindung, und Reaktionspartner R1 46 angeordnet, der eine Affinität für die Verankerungsverbindung 48 aufweist. Die Verankerungsverbindung 48 ist an die Erregungsoberfläche gebunden bzw. an dieser festgelegt. Der Reaktionspartner R3 und der Reaktionspartner R1 sind auf der zu untersuchenden Substanz (Konjugat 50) absorbiert, und das Konjugat 50 ist über Reaktionspartner R1 auf der Verankerungsverbindung 48 auf der Oberfläche festgelegt bzw. gebondet, um einen Komplex 52 auszubilden. Somit wird der Komplex 52, welcher den Reaktionspartner R3, enthaltend ein Fluorophor, an die Erregungsoberfläche 30 gebondet und kann durch ein Messen der Fluoreszenz in dem Evaneszenzfeld 54 untersucht werden.
Für diese Ausbildung des Verfahrens in der vorliegenden Erfindung sind neben dem Avidin (oder Streptavidin)/Biotin-System, alle Liganden oder Ligandenbindungssysteme geeignet, in welchen Proteine beispielsweise selektive und/oder spezifische Bindungsstellen für einen oder mehrere Liganden besitzen, beispielsweise für Histidin, Histidin-Tags, Lectin und/oder Digoxigenin, und selbstverständlich Antigen/Antikörpersysteme, wie dies bereits ausgeführt wurde.
Gemäß der vorliegenden Erfindung zeigen die Ausdrücke ""Fluorophor", ""Fluorophor enthaltende Verbindung" und ""Fluorophor enthaltender Rest" keine speziellen Beschränkungen, solange sie fluoreszierend sind, und beinhalten beispielsweise eine fluoreszierende Verbindung, wie Phycobilisome, Phycobiliproteine, fluoreszierende, chemische Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, oder Quantum-Dots. Gemäß der vorliegenden Erfindung können Phycobiliproteine, wie Allophycocyanin (APC), Cryptofluor-Crimson oder Cryptofluor-Rot als fluoreszierende Proteine verwendet werden. Cy5 oder BODIPY (Fluorophore, die 4,4-Diluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indanzen enthalten) können als Beispiele von fluoreszierenden Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht genannt werden. Fluoreszierende Farbstoffe mit einer effizienten Absorption im Wellenlängenbereich von 600 bis 700 nm sind bevorzugt.
Statt einem Fluorophor kann eine Fluorophorverläuferverbindung verwendet werden, aus welcher das Fluorophor vor dem Meßverfahren beispielsweise durch Verändern des pH-Werts oder durch Abspalten einer Schutzgruppe freigesetzt wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung beinhalten die Ausdrücke ""Fluorophor" und ""Fluorophor enthaltende Verbindung" und ""Fluorophor enthaltender Rest" auch phosphoreszierende Verbindungen. Wenn eine phosphoreszierende Verbindung als ein Fluorophor verwendet wird, wird die abgestrahlte Phosphoreszenz, welche in der Zeit von der Erregung gestaffelt bzw. gestapelt wird, bestimmt. Es ist somit möglich, die Strahlungszeit von der Meßzeit zu trennen.
Diese Verbindung, welche ein Fluorophor enthält, kann auch eine Bindungsstelle für die untersuchende Substanz besitzen. Beispielsweise kann das Fluorophor an einen Antikörper als Reaktionspartner R3 gebunden sein bzw. werden. Dieser Antikörper, enthaltend ein Fluorophor, kann vorzugsweise in einer Antigen-Antikörper-Reaktion mit der zu untersuchenden Substanz als ein Antigen, beispielsweise ein Protein, reagieren.
In einer anderen Ausbildung kommt bzw. erscheint die Substanz, die untersucht wird (d.h. Reaktionspartner R2) selbst als eine Verbindung, enthaltend ein Fluorophor. In dieser Ausbildung werden kompetitive Versuche ausgeführt, welche insbesondere durch ein niedriges Detektionslimit gekennzeichnet sind.
Mit dem Verfahren in der vorliegenden Erfindung kann eine große Vielzahl von Substanzen detektiert werden. Das Verfahren ist insbesondere zum Untersuchen von biologisch aktiven Substanzen, wie Hormonen, wie Protein-artigen oder nicht Protein-artigen Hormonen, Proteinen, wie Antigenen, Antikörpern oder Haptenen, Nukleinsäuren, wie DNS, Oligonukletiden oder RNA, Pharmazeutika, Viren, Bakterien usw. geeignet. Jedoch kann das Verfahren auch zum Detektieren von Umwelt- bzw. Umgebungsgiften, Toxinen, Mißbrauch von Drogen, therapeutischen Drogen usw. verwendet werden. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung beinhaltet auch Doppel-Antigen-Antikörper-Versuche zur Detektion von z.B. Immunoglobinen, wie HIV-, HBC- oder HCV-Antikörpern in menschlichen Körperfluiden, z.B. Blut.
Es ist insbesondere bevorzugt für die zu untersuchenden Substanzen, daß sie durch immunologische Reaktionen detektiert werden.
Wenn das an die Oberfläche gebundene Fluorophor mit einem Evaneszenzfeld erregt wird, wird ein Lichtstrahl auf den Boden der Oberfläche unter einem Winkel gerichtet, so daß eine Totalreflexion an der Küvetten/Lösung-Phasengrenze auftritt. Dies bildet ein Evaneszenzfeld über der Oberfläche in der Lösung, welches bis zu mehreren hundert Nanometer in das Fluid penetrieren bzw. eindringen kann. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Einfallswinkel von wenigstens 60° bis 90° bevorzugt, so daß das Evaneszenzfeld bis zu einer Höhe von bis zu 400 nm, vorzugsweise 200 nm, und insbesondere bevorzugt 50 bis 150 nm über der Oberfläche ausgebildet wird. Innerhalb dieses Evaneszenzfeld kann das gestrahlte Licht geeignete Fluorophore erregen. Das emittierte Fluoreszenzlicht wird beispielsweise mit einem Photovervielfacher detektiert und ausgewertet.
Da nur das Fluorophor, das an die Oberfläche gebondet ist, im Evaneszenzfeld ist, wird nur dieses gebondete Fluorophor optimal erregt und emittiert Photonen. Eine Verbindung, welche Fluorophor enthält und nicht in der Lösung gebunden ist, ist nicht in dem Bereich des Evaneszenzfelds und ist daher grundsätzlich nicht erregt und emittiert auch grundsätzlich keine Photonen. Diese Anordnung ermöglicht somit eine quantitative Bestimmung von Fluoropor, das an die Oberfläche gebunden ist, in der Anwesenheit von Fluorophor in der überstehenden Lösung ohne einen vorherigen Abtrennungs- und/oder Waschschritt.
Monochromatisches Licht kann als die Lichtquelle verwendet werden. Licht sollte verwendet werden, das eine Wellenlänge aufweist, welche vorzugsweise nicht mit der Emission des Fluorophors wechselwirkt bzw. diese beeinflußt. Ein Laser ist insbesondere als eine Lichtquelle bevorzugt, dessen Licht eine Wellenlänge von wenigstens 635 nm emittiert. Insbesondere wenn die überstehende Lösung ein Serum ist, sind Laser bevorzugt, welche Wellenlängen von 600 bis 700 nm emittieren, da die inhärente Fluoreszenz von Serum grob bei 580 nm liegt.
In einer Ausbildung der Erfindung kann der Zusatz des Fluorophors, das an die Oberfläche gebunden ist, direkt (in Echtzeit) mit einer mit der Zeit fortschreitenden Reaktion gemessen werden. Da die Menge eines Fluorophors, das an die Oberfläche gebunden bzw. gebondet ist, direkt proportional zu der ursprünglichen Menge an Verbindung ist, die Fluorophor enthält, macht es das Verfahren in der Erfindung möglich, eine quantitative Bestimmung von Reaktanten, die in der Lösung gefunden werden, in Echtzeit ohne irgendwelche zusätzliche Wasch- und/oder ohne Pipetierschritte auszuführen.
Da die Absorptionskoeffizienten und die Emissionseigenschaften von Fluorophoren sehr gut sind, sind die Detektionsgrenzen klein. Nach nur wenigen Minuten können Reaktionen qualitativ und/oder quantitativ verfolgt bzw. beurteilt werden.
Jedoch stellt die Streuung des Lichtstrahls in der Küvette, welche nicht ideal ist, ein Problem dar, selbst wenn physikalische Maßnahmen getroffen werden, um das Streulicht zu reduzieren. Aufgrund der Streuung gelangt Licht auch in das Volumen in der Küvette ein und bewirkt hier eine Hintergrundfluoreszenz. Der Ausdruck "Volumen" wird in der vorliegenden Erfindung so verstanden, daß es die Flüssigkeit außerhalb des Evaneszenzfelds ist, welches nicht gebundene Verbindungen, enthaltend Fluorophor enthält. Die Polarisation des Lichtstrahls kann auch sowohl in Kunststoff- als auch Glasküvetten gedreht werden. Dies führt insbesondere zu Reflexionen des Erregungslichts während eines Entkoppelns, bildet sogenanntes Vagabundenlicht, welches gemeinsam mit Volums- und Oberflächenstreuungseffekten in einer Erregung des Volumens resultieren kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Erregung des Fluorophors in dem Volumen weiter unterdrückt werden, wenn die in Kontakt mit der Oberfläche anzuordnende Lösung wenigstens einen Farbstoff dazu zugesetzt hat, welcher eine Absorption in dem Absorptions- und/oder Emissionsbereich des Fluorophors besitzt.
Die Absorption des Farbstoffs, der zu dem Volumen hinzugefügt ist, wird mit dem Absorptions- und/oder Emissionsbereich des Fluorophors in der Erfindung koordiniert. Eine individuelle Farbe bzw. ein individueller Farbstoff oder eine Mischung von Farbstoffen kann verwendet werden. Der Absorptionsbereich des Fluorophors korreliert allgemein mit der Wellenlänge der verwendeten Lichtquelle. Es ist nicht notwendig, daß der Farbstoff ein Absorptionsmaximum in diesem Spektralbereich besitzt; eine Schulter in dem Absorptionsspektrum kann genügen. Beispielsweise können, wenn Fluorophore, wie APC oder Cy5 verwendet werden, die verwendeten Farbstoffe eine Absorption zwischen 600 nm und 700 nm besitzen, ähnlich wie beispielsweise Brillantblau FCF. Die Konzentration von hinzugefügtem Farbstoff hängt von der Frequenz des gestrahlten bzw. abgestrahlten Lichts ab. Die Konzentration des Farbstoffs kann in Abhängigkeit von dem Farbstoff so eingestellt werden, daß das penetrierende bzw. durchtretende Licht grundsätzlich bzw. im wesentlichen innerhalb von 1 mm über der Oberfläche absorbiert werden kann. Um die optimale Konzentration des Farbstoffs zu bestimmen, werden zuerst die Volumsfluoreszenz und die Fluoreszenz in dem Evaneszenzfeld, d.h. die Oberflächenfluoreszenz für verschiedene Farbstoffkonzentrationen gemessen. Dann wird das Verhältnis von Oberflächenfluoreszenz zu Volumsfluoreszenz gegen die Konzentration des Farbstoffs aufgetragen. Das Maximum dieses Verhältnisses stellt die optimale Konzentration des Farbstoffs dar. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist "Signal/Rausch-Verhältnis" das Verhältnis von Oberflächenfluoreszenz (Signal) zu Volumsfluoreszenz ("Rauschen"). "Grundsätzlich absorbiert" kann eine Intensitätsauslöschung von 70 %, vorzugsweise 80 %, und insbesondere bevorzugt wenigstens 90 % bedeuten.
Beispielsweise ist, wenn Brillantblau FCF als der Farbstoff verwendet wird, eine Konzentration von 0,04 mM ausreichend, um mehr als 95 % der Volumsfluoreszenz zu unterdrücken. Beispielsweise ist die Konzentration von Brillantblau FCF vorzugsweise wenigstens 0,001 mM.
Die kleine Abmessung und der niedrige Preis machen die Küvette der vorliegenden Erfindung in der Routinediagnostik und Analysen einsetzbar. In einer praktischen Anwendung kann diese Art von Küvette vorher hergestellt werden und kommerziell geschlossen mit einem speziellen Etikett verkauft werden. Wie dies bereits oben ausgeführt wurde, beinhaltet die Vorherstellung bzw. Vorbereitung ein Beschichten der Oberfläche der Küvette mit dem ersten Reaktionspartner R1, und falls notwendig, dann Blockieren der nicht beschichteten Stellen. Es ist insbesondere bevorzugt, wenn die beschichteten Küvetten lyophilisiert oder getrocknet ankommen bzw. geliefert werden. Ein Bereitstellen der Küvette mit einer Seriennummer macht es möglich, einen klaren Hinweis auf die Herstellungscharge, die Detektionsreaktion und die Probe zu jeder Zeit zu besitzen.
Beispiele von spezifischen Anwendungen, welche genannt werden können, sind eine große Vielzahl von Versuchen bzw. Assays, welche auf dem ELISA Prinzip basieren. Ein ELISA-Test kann verwendet werden, um die Konzentration von Antigenen oder Antikörpern zu bestimmen. Beispiele von spezifischen Antigenen sind HBV S-Protein, HCG, Herzmarkerproteine, und Hormone, wie Steroidhormone, Peptidhormone, Thyroidhormone. Antikörperversuche, die für eine vorangehende Infektion hinweisend sind oder für ein spezifisches Krankheitssymptom hinweisend sind, wie HIV Antikörperversuch, Hepatitis S Antikörperversuch oder die durch Antikörper mediatierte Heparin induzierten Thrombocytopenia können genannt werden. Auch die Detektion von Pflanzenproteinprodukten, wie Atrazin in Trinkwasser ist unter Verwendung der Küvette der vorliegenden Erfindung möglich.
Nicht-Immuno-Versuche können auch unter Verwendung der Küvette der vorliegenden Erfindung ausgeführt werden, wenn ein detektierendes bzw. Detektionsreagens markiert werden kann und dieses Reagens ein spezifischer Ligand für einen Rezeptor ist. Daher wird ein Rezeptormolekül an die Oberfläche der Küvette gebunden und der markierte Ligand oder das Hormon usw. kann sich spezifisch an den Rezeptor binden. Hormonrezeptoren können natürliche Rezeptoren oder rekombinante Rezeptormoleküle sein. Dies kann ein kompe titiver bzw. Konkurrenzversuch für pharmazeutische Wirkstoffe sein, wo der Wirkstoff fluoreszierend derivatisiert ist bzw. wird und das Rezeptorprotein auf der Oberfläche der Küvette immobilisiert ist bzw. wird. Alternativ wird der Wirkstoff auf der Oberfläche des Rezeptors immobilisiert und der fluoreszierende markierte Rezeptor bindet sich. Diese Anwendung kann auch für Erholungswirkstoffe verwendet werden.
Auch RNA- oder DNA-Detektion kann mit der Küvette der vorliegenden Erfindung ausgeführt werden. Ein komplementärer Strang, der auf der Oberfläche der Küvette immobilisiert ist, kann ein markiertes Oligonukleotid einfangen. Das Oligonukleotid kann beispielsweise mit APC markiert sein.
Wenn die Küvette gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, resultieren die oben definierten Verfahren zum Untersuchen von Substanzen überraschender Weise in einer analytischen Empfindlichkeit von wenigstens 10 Mal mehr bzw. besser als in üblichen ELISAs und in einer Analysezeit von wenigstens 10 Mal kürzer als bei üblichen ELISAs.
Die vorliegende Erfindung wird weiter unten unter Verwendung von Beispielen erklärt, welche selbstverständlich nicht den Schutzbereich der Erfindung einschränken, der durch die Ansprüche verliehen ist.
Beispiele
In den folgenden Beispielen wurden die Photonen jede Sekunde über eine Zeit von 10 min (= 600 s) gemessen. Normalerweise werden die Photonen am Start bei 0 min und nach 10 min gemessen und die Differenz wird berechnet. Diese Differenz ist positiv und direkt proportional dem Antigen, das in dem Versuch gemessen wird. Wenn eine Anzahl von statistischen Ereignissen, z.B. 10000 Photonen (n) beobachtet wird, wird der statistische Fehler als drei Mal der Quadratwurzel von n berechnet. In diesem Beispiel ist 3 × Quadratwurzel von 10000 = 3 × 100 = 300 Photonen.
In dem Beispiel werden nicht nur diese zwei Zeitpunkte gemessen, sondern während dieser 10 min 600 Zeitpunkte. Die Punkte passen auf eine gerade Linie. Wenn nun eine Trendfunktion mit einer linearen Regressionsfunktion generiert wird, und eine lineare Kurve berechnet wird, ist der Gesamtfehler für ein 99,99 % Konfidenz-Intervall auf etwa 30 Photonen reduziert. Dies bedeutet ein Zehntel des Fehlers von 300 Photonen, der durch die 2-Punkt-Berechnung erreicht wird. Daher verbessert diese lineare Regression die analytische Detektionsgrenze um einen Faktor von 10.
Beispiel 1: Kinetik von Biotin-HRP-Bindung an Streptavidin-Oberfläche
Eine Nunc maxisorp Mikroplatte wurde mit einer Lösung von Neutravidin (10μg/ml in 0,1M NaHCO₃) über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet. Dann wurde sie 3 Mal mit TBST (10 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20) gewaschen. Eine Lösung von biotinylierter Mehrrettichperoxidase ("HRP", kommerziell erhältlich von Pierce) (10 ng/ml in TBST) wurde zu den Vertiefungen hinzugefügt und für verschiedene Male von 1 Minute bis 6 Stunden inkubiert. Die Vertiefungen wurden 6 Mal mit TBST und 3 Mal mit TBS gewaschen (10 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl). Gebundenes HRP wurde durch TMB gezeigt bzw. enthüllt (kommerziell erhältlich von KPL) und die optische Dichte bei 630 nm wurde nach 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur gemessen. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
4 ist ein Ausdruck von OD ₆₃₀ als eine Funktion eine Bindungszeit von biotinylierter HRP an die Mikroplatte. Nach 10 Minuten wird eine OD von etwa 0,75 beobachtet. Die maximale OD nach 6 Stunden Reaktionszeit ist 2,10. Nach 10 Minuten ist ein Signal von etwa 30 % des Maximalwerts für HRP durch einen auf Diffusion basierenden Versuch gezeigt und es ist somit möglich, ein sinnvolles Ergebnis zu messen. Wenn beispielsweise ein Fluoreszenzdetektionssystem zur Verfügung steht bzw. verfügbar ist, kann man das geringere Bindungsniveau kompensieren und immer noch einen schnellen und empfindlichen Versuch besitzen.
Beispiel 2: Maus IgG Titration
(A) ELISA
Eine Nunc maxisorp Mikroplatte wurde mit einer Lösung aus Streptavidin (10 μg/ml in PBSplus (100 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄, 100 mM CaCl pH 7,5)) über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet. Dann wurde die Lösung abgesaugt und die Vertiefungen wurden 4 Mal mit PBS (10 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄, 137 mM NaCl pH 7,4) gewaschen. Um verbleibende reaktive Stellen zu blockieren, wurde eine Lösung von 1 % BSA in PBSplus zu der Vertiefung hinzugefügt und 1 h stehengelassen.
Ein Ein-Stufen- und ein Drei-Stufen-ELISA-Verfahren wurden ausgeführt. Der Versuch ist ein Sandwich-ELISA, der ein Maus IgG detektiert.
Der Ein-Schritt-ELISA wurde durch ein Inkubieren einer Lösung von biotinylierter Ziegen bzw. Geiß Anti-Maus IgG (kommerziell erhältlich von Jackson) bei 1 μg/ml, Geiß Anti-Maus HRP (kommerziell erhältlich von Jackson) bei 8 μg/ml und verschiedenen Mengen an Maus IgG (kommerziell erhältlich von Jackson) in 1 % BSA PBSplus, enthaltend 0,025 % Tween 20 für 0,5 h bei Raumtemperatur ausgeführt.
Der Drei-Stufen-ELISA wurde bei einer 1 h Inkubation mit dem biotinylierten Geiß Anti-Maus IgG bei 1 μg/ml in 1 BSA PBSplus, enthaltend 0,025 % Tween 20, gefolgt durch drei PBS-Waschungen ausgeführt. Dann wurde eine Inkubation mit verschiedenen Mengen von Maus IgG in denselbem Puffer, gefolgt durch drei PBS-Waschungen, gefolgt durch eine 1 h Inkubation mit Geiß Anti-Maus HRP bei 8 μg/ml in demselben Puffer ausgeführt.
Nach diesen Inkubationsschritten war das Verfahren identisch für beide ELISA-Verfahren und bestand aus 5 PBS Waschungen, gefolgt durch den Zusatz von TMB für eine Farbentwicklung für 10 Minuten und Lesen von OD bei 630 nm. Die Ergebnisse sind in 5(A) gezeigt.
5(A) zeigt einen Ausdruck von OD ₆₃₀ als eine Funktion der Maus IgG Konzentration in der Probe. Detektionsgrenzen für Maus IgGs sind etwa 3 ng/ml für einen einstufigen ELISA nach 40 Minuten und 1 ng/ml für einen dreistufigen ELISA nach 3 Stunden.
Beispiel 2: Maus IgG Titration
(B) Fluoreszenzversuch
Ein Fluoreszenzchip bzw. -stück als ein Beispiel für die Küvette der vorliegenden Erfindung, die durch ein Spritzgießen aus Polystyrol hergestellt wurde, wurde mit einer Kobalt-60-Quelle γ bestrahlt. Die resultierende Polystyroloberfläche wird für Proteinabsorption aktiviert. Die Vertiefungen wurden durch Absorption von Streptavidin bei 10 μg/ml in PBSplus (100 mM KPO₄, 100 mM NaCl pH 7,5) über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet. Die Lösung wurde an- bzw. abgesaugt und die Vertiefungen wurden 4 Mal mit PBS (10 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄, 137 mM NaCl pH 7,4) gewaschen. Um verbleibende reaktive Stellen zu blockieren, wurde eine Lösung von 0,25 % Tween 20 in PBSplus zu der Vertiefung hinzugefügt und 1 Stunde belassen.
Ein einstufiger Immunoassay, welcher Maus IgG detektiert, wurde ausgeführt und gebundene Fluoreszenz durch Evaneszenzerregung gemessen.
Eine Mischung von biotinyliertem Geiß Anti-Maus IgG bei 1 μg/ml, Geiß Anti-Maus APC-Konjugat hergestellt, entsprechend dem Verfahren, das durch den Lieferanten von aktiviertem APC (kommerziell erhältlich von Intergen) gegeben ist, bei 10 μg/ml und verschiedene Mengen an Maus IgG in 1 BSA PBSplus, enthaltend 0,05 % Tween 20, wurden zu den Polystyrol-Fluoreszenzchip hinzugefügt. Der Chip wurde dann unmittelbar in dem Lesegerät angeordnet und die Emission von Fluoreszenzphotonen wurde über die Zeit beobachtet und aufgezeichnet. Wenn bzw. da die Reaktion fortschreitet, binden sich fluoreszierende Moleküle an die Oberfläche und die gemessene Fluoreszenz steigt mit der Zeit an. Ein Messen der Photonenzählungen am Zeitpunkt 0 und am Zeitpunkt 10 Minuten und ein Berechnen der Differenz gibt eine Anzahl von Photonenzählungen aufgrund der biochemischen Reaktion an der Oberfläche, die durch das Evaneszenzfeld erregt ist. Dieser Anstieg an Photonen hängt von der Antigen-Konzentration in der Probe ab. Es gibt eine kleinere Änderung in dem Hintergrund von Chip zu Chip. Diese Chip-zu-Chip-Variation verändert sich nicht während der Meßzeit von 10 Minuten und scheint daher nicht in dem Ergebnis auf. Die Menge an Maus IgG wurde über den Bereich von 0,1 bis 10000 ng/ml titriert. Die Ergebnisse sind in 5(B) gezeigt.
5(B) zeigt die Fluoreszenzphotonen, ausgedrückt als Zählungen, die in 10 Sekunden Intervallen als eine Funktion der Maus IgG Konzentrationen in der Probe gemessen sind.
Die Detektionsgrenze ist durch die statistische Variation von gemessenen Photonen gegeben, welche 3 Mal der Quadratwurzel der Hintergrundemission von Photonen in der Vorrichtung entspricht. Die Hintergrundfluoreszenz ist in diesem Beispiel 500000, was eine statistische Variation bzw. Abweichung von 3 × 707 = 2121 Zählungen ergibt.
Die Probe, enthaltend 0,1 ng/ml Maus IgG ergab ein Signal von 5000 Photonen, deutlich über der Detektionsgrenze der Vorrichtung. Daher ist das System zehn Mal empfindlicher als ein vergleichbares ELISA, wie dies in Beispiel 2 (A) beschrieben ist.
Beispiel 3: Titration von Maus IgG in unterschiedlichen Matrizen
Experimentelle Bedingungen und Reagentien sind dieselben, wie in Beispiel 2 (B) gezeigt. Der Sandwichversuch verwendet eine Mischung von biotinyliertem Geiß Anti-Maus IgG bei 1 ng/ml, Geiß Anti-Maus APC-Konjugat, das in Übereinstimmung mit dem Verfahren hergestellt wurde, das durch den Hersteller von aktiviertem APC gegeben wurde, bei 10 μg/ml und verschiedene Mengen von Maus IgG (kommerziell erhältlich von Jackson). Messungen wurden in zwei unterschiedlichen Matrizen ausgeführt: (a) in 1 % BSA PBSplus, enthaltend 0,05 % Tween 20; und (b) in menschlichem EDT-Plasma. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt.
6 zeigt die Fluoreszenzphotonen, die als Zählungen ausgedrückt sind, gemessen in 1 Sekunden Intervallen als eine Funktion der Maus IgG Konzentration in der Probe sind.
Ergebnisse sind vergleichbar in beiden Puffersystemen unter Verwendung entweder der synthetischen Mischung von BSA, PBS, Tween 20 oder einer natürlichen Matrix, wie menschlichem Plasma. Plasma scheint keine bemerkenswerte Autofluoreszenz zu generieren bzw. zu erzeugen.
Beispiel 4: Herstellung von Lyophilisat in der Küvette
Ein Polystyrolchip als ein Beispiel für die Küvette der vorliegenden Erfindung wurde zur Verfügung gestellt und eine Avidinschicht wurde durch Absorption auf dem Polystyrol hergestellt. Alternativ wurde eines der Verfahren, die oben erwähnt wurden (Poly-L-Lysin oder Allyldextran) verwendet. Der Ausdruck "Avidin" in dem allgemeinen Kontext umfaßt Avidin oder Streptavidin oder Neutravidin oder irgendein anderes Biotin bindendes Molekül. 50 μl/Vertiefung Lösung I (z.B. 20 mM Hepes pH 7,5, 1 % BSA, 1 Dextran T70, 10 mM EDTA und gegebenenfalls 32 mg/ml Trimethoprim und 160 mg/ml Sulfamethoxazol) wurden hinzugefügt und für 4 h bei –20 °C gefroren. Die Lösung I bildet die Abstandhalterschicht. Dann wurden 10 μl/Vertiefung Lösung II (z.B. 20 mM Hepes pH 7,5, 1 % BSA, 1 % Dextran T70, 2 Glycin, 1 % Brij, 0,5 % Tween 20, 100 mM NaCl und gegebenenfalls 32 mg/ml Trimethoprim und 160 mg/ml Sulfamethoxazol und ein Farbstoff, wie Lissamin-Grün B, Indigo-Carmin, Brillant-Schwarz BN oder Cu-Chlorophyllin) auf der Oberseite der gefrorenen Abstandhalterschicht hinzugefügt und 4 h bei –20 °C gefroren. Lösung II enthält die reaktiven Immunglobuline, z.B. 50 μg/ml Geiß Anti-Maus IgG-XL-APC oder 5 μg/ml Geiß Anti-Maus IgG. Schließlich wurde es lyophilisiert, um eine zur Verwendung fertige Küvette zu ergeben.

10: Küvette
12: Handhabungsabschnitt
14: Ausnehmung bzw. Aussparung
16: Analysierabschnitt
18: Vertiefungsabschnitt
20: Vertiefung
22: Seitenwandglieder von Vertiefungen
24: Basisabschnitt
26: erste Oberfläche
28: zweite Oberfläche
30: Anregungs- bzw. Erregungsoberfläche
32: Basisoberfläche
26S: erste Seite eines Trapezoids
28S: zweite Seite eines Trapezoids
30S: Oberseite eines Trapezoids
32S: Basisseite eines Trapezoids
40: Reaktionspartner R2
44: Reaktionspartner R3
46: Reaktionspartner R1
48: Verankerungsverbindung
50: Konjugat
52: Komplex
54: Evaneszenzfeld

Claims

Küvette (10) für ein Lesegerät für Versuche bzw. Assays unter Verwendung der Evaneszenzfeld-Methode, umfassend: – wenigstens einen Vertiefungsabschnitt (18), der wenigstens eine Vertiefung (20) zum Aufnehmen einer Lösung aufweist, die zu untersuchende Substanzen enthält; und – wenigstens einen Basisabschnitt (24), der Seitenwandglieder (22) des Vertiefungsabschnitts (18) abstützt und eine Erregungs- bzw. Anregungsoberfläche (30) der Vertiefung (20) zur Verfügung stellt; wobei der Basisabschnitt (24) aus einem optisch transparenten Material hergestellt ist und eine Querschnittsform eines gleichschenkeligen Trapezoids bzw. Trapezes in einer Ebene (B-B) aufweist, die senkrecht die Erregungsoberfläche (30) der Vertiefung (20) schneidet, wobei das Trapezoid erste und zweite Seiten (26S, 28S) gleicher Länge und parallele Basis- und Oberseiten (32S, 30S) aufweist; wobei der Basisabschnitt (24) weiters umfaßt – eine Basisoberfläche (32), die von der Erregungsoberfläche (30) beabstandet und parallel zu dieser ist, wobei der Querschnitt der Basisoberfläche (32) in der Ebene (B-B) die Basisseite (32S) des Trapezoids ist; – eine erste Oberfläche (26) zum Aufnehmen eines Erregungs-Lichtstrahls (34) einer externen Erregungslichtquelle, wobei der Querschnitt der ersten Oberfläche (26) in der Ebene (B-B) die erste Seite (26S) des Trapezoids ist; und – eine zweite Oberfläche (28) gegenüberliegend der ersten Oberfläche (26), wobei der Querschnitt der zweiten Oberfläche (28) in der Ebene (B-B) die zweite Seite (28S) des Trapezoids ist; und wobei der Basisabschnitt (24) adaptiert ist, um den Erregungslichtstrahl (24) wenigstens teilweise entlang eines optischen runden Pfads bzw. eines optischen Umlaufpfads von einem Auftreff- bzw. Einfallspunkt auf der ersten Oberfläche (26) über Reflexionen auf der Erregungsoberfläche (30), der zweiten Oberfläche (28) und der Basisoberfläche (32) zurück zu dem Einfallspunkt zu führen.
Küvette (10) nach Anspruch 1, wobei die Höhe H des Trapezoids gegeben ist durch
wobei (90° – γ) der Trapezoidbasiswinkel zwischen der Basisseite (32S) und der ersten Seite (26S) ist, n₂ der Brechungsindex des Basisabschnitts (24) ist, A die Länge der oberen Seite (30S) des Trapezoids ist, und
Küvette (10) nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Basisseiten-Reflexionswinkel δ = 90° – (β + y) größer als arcsin(1/n₂) ist, wobei n₂ der Brechungsindex des Basisabschnitts (24) ist und
Küvette (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Erregungsseiten-Reflexionswinkel ε = 90° – (β – γ) größer als arcsin(1/n₂) ist, wobei n₂ der Brechungsindex des Basisabschnitts (24) ist und
Küvette (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Trapezoid im wesentlichen ein Rechteck ist, das eine Höhe H und eine Breite A aufweist und A/H n₂ ist.
Küvette (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Vertiefungsabschnitt (18) und der Basisabschnitt (24) einstückig aus einem Harzmaterial geformt sind, vorzugsweise umfassend PMMA, Polystyrol, Polycarbonat, SAN, Cyclocopolymerolefin oder Polyolefin.
Küvette (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Küvette (10) eine Mehrzahl von Vertiefungen (20) umfaßt.
Küvette nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Erregungsoberfläche (30) hydrophil ist.
Küvette nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Erregungsoberfläche (30) wenigstens teilweise mit einer hydrophilen Verbindung beschichtet ist.
Küvette nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei eine Verbindung als ein Reaktionspartner R1 auf der fakultativ beschichteten Erregungsoberfläche (30) immobilisiert ist, wobei der Reaktionspartner R1 eine Affinität zu der Substanz besitzt, die als Reaktionspartner R2 zu untersuchen ist.
Küvette nach Anspruch 10, wobei der Reaktionspartner R2 einen Fluorophor enthaltenden Rest umfaßt.
Küvette nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei eine Verankerungsverbindung für eine Verbindung als Reaktionspartner R1 auf der fakultativ beschichteten Erre gungsoberfläche (30) immobilisiert ist, wobei der Reaktionspartner R1 eine Affinität zu der Substanz besitzt, die als Reaktionspartner R2 untersuchen wird.
Küvette nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei der Reaktionspartner R1 oder die Verankerungsverbindung in lyophilisierter Form vorhanden ist.
Küvette nach Anspruch 13, wobei der lyophilisierte Reaktionspartner R1 oder die lyophilisierte Verankerungsverbindung durch eine lyophilisierte Abstandhalter- bzw. Abstandsschicht überdeckt ist, enthaltend eine oder mehrere Pufferverbindung(en), eine oder mehrere proteinartige Verbindung(en), eine oder mehrere hydrophile Verbindung(en), einen oder mehrere Komplexbildner/Anticoagulans (-coagulantien) und gegebenenfalls bakteriostatische Verbindungen, oder eine Mischung, enthaltend einen oder mehrere dieser Bestandteile.
Küvette nach Anspruch 14, wobei die lyophilisierte Abstandhalterschicht durch ein Lyophilisat abgedeckt ist, umfassend entweder (A) eine Fluorophor enthaltende Verbindung oder eine Verbindung als ein Reaktionspartner R3 oder eine Mischung davon, unter der Voraussetzung, daß der Reaktionspartner R1 auf der Erregungsoberfläche (30) immobilisiert ist; oder (B) Reaktionspartner R1 oder eine Fluorophor enthaltende Verbindung oder eine Verbindung als Reaktionspartner R3 oder eine Mischung davon, enthaltend zwei oder drei von diesen, unter der Voraussetzung, daß die Verankerungsverbindung auf der Erregungsoberfläche (30) immobilisiert ist, wobei der Reaktionspartner R3 eine Affinität zu der Substanz besitzt, die als Reaktionspartner R2 zu untersuchen ist, wobei der Reaktionspartner R3 gegebenenfalls einen Fluorophor enthaltenden Rest umfaßt und die Fluorophor enthaltende Verbindung eine Affinität zu dem Reaktionspartner R2 oder zu dem Reaktionspartner R3 besitzt.
Verfahren zur Herstellung einer Küvette nach einem der Ansprüche 10 bis 15, umfassend den Schritt eines: (a) Immobilisierens von Reaktionspartner R1 oder der Verankerungsverbindung auf der Erregungsoberfläche (30) der Küvette, die in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 16, weiters umfassend die Schritte eines: (b) Anwendens einer frierbaren Lösung I, enthaltend eine oder mehrere Pufferverbindung(en), eine oder mehrere proteinartige Verbindung(en), eine oder mehrere hydrophile Verbindungen) oder eine oder mehrere Komplexbildner/Antikoagulanzien und gegebenenfalls bakteriostatische Verbindungen, oder eine Mischung, enthaltend einen oder mehrere dieser Bestandteile auf dem immobilisierten Reaktionspartner R1 oder der immobilisierten Verankerungsverbindung; und (c) Frierens der Lösung I, um eine gefrorene Abstandhalterschicht zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei nach Schritt (c) die gefrorene Lösung I lyophilisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 17, weiters umfassend die Schritte eines: (d) Aufbringens einer frierbaren Lösung II, enthaltend entweder (A) eine Fluorophor enthaltende Verbindung oder eine Verbindung als Reaktionspartner R3 oder eine Mischung davon, unter der Voraussetzung, daß der Reaktionspartner R1 auf der Erregungsoberfläche (30) immobilisiert ist, oder (B) Reaktionspartner R1 oder eine Fluorophor enthaltende Verbindung oder eine Verbindung als ein Reaktionspartner R3 oder eine Mischung davon, enthaltend zwei oder drei von diesen, unter der Voraussetzung, daß die Verankerungsverbindung auf der Erregungsoberfläche (30) auf der gefrorenen Abstandhalterschicht immobilisiert ist; (e) Frierens der Lösung II, um eine gefrorene Lösung II auf der gefrorenen Lösung I zu erhalten; und (f) Lyophilisierens des gefrorenen Inhalts in der Küvette, um ein Lyophilisat zu erhalten.
Verwendung der Küvette nach einem der Ansprüche 1 bis 15 in medizinischer oder veterinärmedizinischer Diagnose, Nahrungsmittelanalyse, Umwelt- bzw. Umgebungsanalyse, chemischer oder biologischer Analyse oder Analyse von Fermentationsverfahren bzw. -prozessen.
Verwendung der Küvette nach einem der Ansprüche 1 bis 15 für eine qualitative und/oder quantitative Bestimmung von Substanzen über immunologische Reaktionen.
Verwendung der Küvette nach einem der Ansprüche 10 bis 13 für die qualitative und/oder quantitative Bestimmung von Substanzen über immunologische Reaktionen, umfassend die Schritte eines: Anordnens in Kontakt mit dem immobilisierten Reaktionspartner R1 oder mit der immobilisierten Verankerungsverbindung oder mit der lyophilisierten Abstandhalterschicht einer Lösung, welche die Substanz, die als Reaktionspartner R2 zu untersuchen ist, enthält und entweder (A) eine Fluorophor enthaltende Verbindung oder eine Verbindung als Reaktionspartner R3 oder eine Mischung davon, unter der Voraussetzung, daß der Reaktionspartner R1 auf der Erregungsoberfläche (30) immobilisiert ist, oder (B) Reaktionspartner R1 oder eine Fluorophor enthaltende Verbindung oder eine Verbindung als Reaktionspartner R3 oder eine Mischung davon, enthaltend zwei oder drei von diesen, unter der Voraussetzung, daß die Verankerungsverbindung auf der Erregungsoberfläche (30) immobilisiert ist, wobei sich ein Komplex auf dem immobilisierten Reaktionspartner R1 oder auf der immobilisierten Verankerungsverbindung ausbildet, wobei der Komplex entweder enthält: (i) Reaktionspartner R1 und Reaktionspartner R2, welcher einen Fluorophor enthaltenden Rest oder eine Fluorophor enthaltende Verbindung umfaßt, die damit konjugiert ist; oder (ii) Reaktionspartner R1, Reaktionspartner R2 und Reaktionspartner R3, welcher einen Fluorophor enthaltenden Rest oder eine Fluorophor enthaltende Verbindung umfaßt, die damit konjugiert ist; oder (iii) Reaktionspartner R1, Reaktionspartner R2, Reaktionspartner R3 und die Fluorophor enthaltende Verbindung; oder (iv) die Verankerungsverbindung, Reaktionspartner R1 und Reaktionspartner R2, welcher einen Fluorophor enthaltenden Rest oder eine Fluorophor enthaltende Verbindung, die damit konjugiert ist; oder (v) die Verankerungsverbindung, Reaktionspartner R1, Reaktionspartner R2 und Reaktionspartner R3, welcher einen Fluorophor enthaltenden Rest oder eine Fluorophor enthaltende Verbindung umfaßt, die damit konjugiert ist; oder (vi) die Verankerungsverbindung, Reaktionspartner R1, Reaktionspartner R2, Reaktionspartner R3 und die Fluorophor enthaltende Verbindung; und – Erregens des Fluorophors, das an die Erregungsoberfläche (30) über den Komplex gebunden ist, durch das Evaneszenzfeld einer Lichtquelle und eines Messens der produzierten Fluoroeszenz.
Verwendung der Küvette nach Anspruch 15 für eine qualitative und/oder quantitative Bestimmung von Substanzen über immunologische Reaktionen, beinhaltend die Schritte eines: – Anordnens in Kontakt mit dem lyophilisierten Inhalt in der Küvette einer Lösung, welche die Substanz, die zu untersuchen ist, als Reaktionspartner R2 enthält, wobei sich ein Komplex auf dem immobilisierten Reaktionspartner R1 oder auf der immobilisierten Antwortverbindung ausbildet, wobei der Komplex entweder enthält: (i) Reaktionspartner R1 und Reaktionspartner R2, welcher einen Fluorophor enthaltenden Rest oder eine Fluorophor enthaltende Verbindung umfaßt, die damit konjugiert ist; oder (ii) Reaktionspartner R1, Reaktionspartner R2 und Reaktionspartner R3, welcher einen Fluorophor enthaltenden Rest oder eine Fluorophor enthaltende Verbindung umfaßt, die damit konjugiert ist; oder (iii) Reaktionspartner R1, Reaktionspartner R2, Reaktionspartner R3 und die Fluoro phor enthaltende Verbindung; oder (iv) die Verankerungsverbindung, Reaktionspartner R1 und Reaktionspartner R2, welcher einen Fluorophor enthaltenden Rest oder eine Fluorophor enthaltende Verbindung umfaßt, die damit konjugiert ist; oder (v) die Verankerungsverbindung, Reaktionspartner R1, Reaktionspartner R2 und Reaktionspartner R3, welcher einen Fluorophor enthaltenden Rest oder eine Fluorophor enthaltende Verbindung umfaßt, die damit konjugiert ist; oder (vi) die Verankerungsverbindung, Reaktionspartner R1, Reaktionspartner R2, Reaktionspartner R3 und die Fluorophor enthaltende Verbindung; und – Erregens des Fluorophors, das an der Erregungsoberfläche (30) über den Komplex gebunden ist, durch das Evaneszenzfeld einer Lichtquelle und eines Messens der gebildeten Fluoroeszenz.