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Hintergrund der Erfindung
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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung
zum immunologischen Analysieren eines Messobjekts auf dem Gebiet
des klinischen Testens, der biochemischen Probenmessung und der
Qualitätssteuerung
von Medikamenten und ähnlichem.
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Beschreibung des Hintergrunds
der Technik
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Immunologische
Analyseverfahren, die eine Antigen-Antikörper-Reaktion verwenden, umfassen eine
Fluoreszenz-Immununtersuchung
und eine Leucht-Immununtersuchung. Bei einem dieser Verfahren reagiert
ein Antigen, das mit einem Fluoreszenzmaterial oder einem Chemielumineszenzmaterial
markiert ist mit einem Antikörper
mit einem Antigen, das ein Messobjekt in Konkurrenz ist, um einen Immunkomplex
zu bilden, der ein Molekularkomplex ist, durch die Antigen-Antikörper-Reaktion,
zum Messen der Fluoreszenz oder Lumineszenz aus dem Etikett, wodurch
das Zielmaterial quantitativ analysiert wird.
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Andererseits
ist ein Verfahren zum Hinzufügen
eines Antigens oder eines Antikörpers
eines Messobjekts zu einem Antikörper
oder Antigen und Messen der Absorption oder Streuung von Licht durch
einen Immunkomplex, der durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion gebildet wird,
wodurch eine quantitative Analyse durchgeführt wird, als ein optisches
Messverfahren bekannt, das weder Fluoreszenz noch Lumineszenz verwendet.
Quantitative Analyseverfahren, die Lichtstreuungsphänomene verwenden,
umfassen Turbidimetrie und Nephelometrie. Das Erstere ist angepasst,
um übertragenes Licht
zu messen, das durch Absorption und Streuung gedämpft wird, während das
Letztere angepasst ist, um eine Streulichtintensität zu messen.
Das Verfahren durch Lichtstreuung ist angepasst, um eine Rayleigh-Streuung
oder eine Mie-Streuung
zu messen, ansprechend auf Größen von
Partikeln, die gemessen wurden.
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Eine
Fluoreszenz-Immununtersuchungsvorrichtung, die zu der Fluoreszenz-Immununtersuchung
gehört,
wird als eine Immununtersuchungsvorrichtung vorgeschlagen, die eine
Totalreflexionszelle verwendet (siehe japanische Patentoffenlegung
Gazetten-Nr. 5-203574 (1993)). Bei dieser Fluoreszenz-Immununtersuchung
ist ein Antikörper
fest an einer Oberfläche
eines Totalreflexionsprismas, ein Antigen, das in einer Probe enthalten
ist, ist mit dem Antikörper
durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion verbunden,
und ein Antikörper,
der mit einem Fluoreszenzmaterial markiert ist, ist ferner mit dem
Antigen durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion
verbunden. Nachfolgend wird eine B-F-Trennung durchgeführt, um
einen nicht-reagierten Antikörper
zu entfernen, der mit dem Fluoreszenzmaterial markiert ist, und
dann wird ein Erregungsstrahl in das Totalreflexionsprisma eingebracht,
um den markierten Antigen-Antikörper-Immunkomplex
zu erregen, der auf der Oberfläche
des Totalreflexionsprismas begrenzt ist, zum Messen einer Fluoreszenz,
die aus dem Fluoreszenzmaterial erzeugt wird.
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Das
Verfahren, das die Lichtstreuung verwendet, was eine homogene Immununtersuchung ist,
ist ein einfaches Verfahren, das weder B-F-Trennung noch -Waschen
erfordert. Das Verfahren jedoch, das Rayleigh-Streuung oder Mie-Streuung
verwendet, hat Probleme bei der Niedrigerfassungsempfindlichkeit
und Niedrigmessgenauigkeit im Hinblick auf ein Material mit geringer
Konzentration.
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Andererseits
erfordert die Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Immununtersuchung eine komplizierte chemische
Behandlung zum Markieren eines Antigens oder eines Antikörpers mit
einem Fluoreszenz- oder Chemielumineszenz-Material. Ferner ist ein Großteil davon
eine heterogene Immununtersuchung, die zwingend eine B-F-Trennung
erfordert, zum Trennen eines Immunkomplexes (B), der die Antigen-Antikörper-Reaktion
durchführt,
von einem Antigen oder einem Antikörper (F), der keine Antigen-Antikörper-Reaktion
verursacht und durch eine große
Anzahl von analytischen Schritten wäscht.
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Die
EP-A-0 254 430 offenbart ein Immunanalyseverfahren zum Qualifizieren
oder zum weiteren Bestimmen eines Antigens oder eines Antikörpers, das
in einer Probe enthalten ist, durch Messen des Lichts, das von einem
Wechselwirkungspunkt zwischen Goldkolloidpartikeln, die mit einem
Antikörper oder
einem Antigen markiert sind, und einer abklingenden Welle zurückgestreut
wird.
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Die
EP-A-0 714 024, die ein Dokument gemäß Artikel 54(3) EPC ist, offenbart
ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Bestimmen von Wasserstoffperoxyd,
wobei die Vorrichtung ein optisches Einfallsystem, ein Totalreflexionsprisma,
eine Totalreflexionszelle und ein optisches Messsystem aufweist, das
einen Ausgangsstrahl aus dem Prisma empfängt, zum Messen der Absorbanz
durch eine Probenlösung,
die in der Zelle vorhanden ist.
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Es
ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Immunanalyseverfahren
und eine Immununtersuchungsvorrichtung zu schaffen, so dass das Durchführen der
Messung weniger kompliziert ist.
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Diese
Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 und eine Vorrichtung
gemäß Anspruch
6 gelöst.
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Die
Erfinder haben eine fundierte Studie durchgeführt, um einen Immunkomplex
qualitativ und quantitativ zu analysieren, durch eine Absorptionsmessung
des Immunkomplexes, um zu entdecken, dass die Absorption des Immunkomplexes
mit ausgezeichneter Empfindlichkeit gemessen werden kann, wenn der
Immunkomplex in einen Zustand gebracht wird, in dem er durch Edelmetallkolloidpartikel absorbiert
wird, obwohl keine Absorption, die eine Empfindlichkeit aufweist,
die geeignet für
eine Messung ist, von dem Immunkomplex selbst erhalten werden kann.
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Ein
Immunanalyseverfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung umfasst folgende Schritte: Mischen einer Lösung, die
einen Antikörper
oder ein Antigen enthält,
das mit Edelmetallkolloidpartikeln markiert ist, mit einer Probenlösung, um
eine gemischte Probenlösung
zu bilden, für
eine Reaktion eines Antigens oder eines Antikörpers, der in der Probenlösung enthalten
ist, mit dem markierten Antikörper
oder Antigen, wodurch ein edelmetallkolloid-markierter Immunkomplex
gebildet wird, und Verwenden einer Zelle, die ein Totalreflexionsprisma
zumindest an einer Oberfläche
derselben aufweist, und Einbringen eines Messstrahls einer Wellenlänge in einem Bereich
von sichtbaren zu Infrarot-Regionen in das Totalreflexionsprisma
mit einem Einfallswinkel, was eine Totalreflexion verursacht, wodurch
die Absorption des Messstrahls gemessen wird, die an der Grenzfläche zwischen
dem Totalreflexionsprisma und der gemischten Probenlösung verursacht
wird. Somit wird das Antigen oder der Antikörper, der in der Probe enthalten
ist, qualifiziert oder weiter bestimmt.
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Das
Edelmetallkolloid kann aus einem Kolloid aus Gold, Silber oder Kupfer
vorbereitet sein, und eine angemessene Korngröße dafür ist 5 bis 50 nm.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann eine Absorptionsmessung durch den Messstrahl ausgeführt werden,
ohne den Antikörper
oder das Antigen zu trennen, das mit dem Edelmetallkolloid markiert
ist, oder ein Nicht-Reagiertes aus dem Antigen oder dem Antikörper, das
in der Probenlösung
enthalten ist, wodurch eine homogene Immununtersuchungsanalyse implementiert
wird. Abgesehen davon kann eine Hochempfindlichkeitsmessung implementiert
werden durch Verwenden des Edelmetallkolloids.
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Eine
Immununtersuchungsvorrichtung, die angepasst ist, um das zuvor erwähnte Verfahren
zu implementieren, weist eine Totalreflexionszelle, mit einem Totalreflexionsprisma,
das aus einem Material besteht, das einen größeren Brechungsindex aufweist
als die gemischte Probenlösung,
an zumindest einer der Wandoberflächen, die einen Raum definieren,
in dem die gemischte Probenlösung
vorliegt, ein optisches Einfallsystem zum Einbringen eines Messstrahls
einer Wellenlänge
in einem Bereich von sichtbaren bis Infrarot-Regionen in das Totalreflexionsprisma
bei einem Einfallswinkel, der eine Totalreflexion verursacht, und
ein optisches Messsystem auf, das einen ausgehenden Strahl aus dem
Totalreflexionsprisma empfängt,
zum Messen der Absorbanz durch die gemischte Probenlösung. Die
Absorption bei der Totalreflexion wird aus der Intensität der gedämpften Totalreflexion
gemessen.
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Die
Totalreflexionszelle kann durch eine Zelle vom Behältertyp
gebildet sein, die nur eine Öffnung aufweist,
um eine Antigen-Antikörper-Reaktion
in der Zelle zu verursachen, zum Bilden eines Edelmetallkolloid-markierten
Immunkomplexes oder zum Durchführen
einer Antigen-Antikörper-Reaktion in einem
anderen Behälter
zum Bilden eines Edelmetallkolloid-markierten Immunkomplexes und
nachfolgend Speichern einer gemischten Probelösung, die den Edelmetallkolloid-markierten
Immunkomplex enthält,
oder eine Flusszelle, die ein Lösungseinlasstor
und ein Lösungsauslasstor
aufweist, die mit einer gemischten Probenlösung gespeist werden sollen, nach
der Bildung eines Edelmetallkolloidmarkierten Immunkomplexes.
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Eine
Lichtquelle, die in dem optischen Einfallsystem umfasst ist, kann
gemäß dem Verfahren aus
Anspruch 1 gebildet werden, zum Emittieren eines Strahls einer durchgehenden
Wellenlänge,
oder sowohl dem Verfahren gemäß Anspruch
1 als auch der Vorrichtung gemäß Anspruch
6, durch eine Einwellenlängen-Lichtquelle,
wie z. B. eine Lasereinheit, die einen Einwellenlängenstrahl
emittiert. Wenn die Lichtquelle einen Strahl mit kontinuierlicher
Wellenlänge
emittiert, kann eine Spektrometrie ausgeführt werden, obwohl das optische
Einfall- oder Messsystem ein Spektroskop umfassen muss. Wenn eine Einwellenlängen-Lichtquelle
verwendet wird, wird andererseits eine Absorptionsmessung nur an
der einen Wellenlänge
der Lichtquelle ausgeführt,
ohne ein Spektroskop zu erfordern.
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Wenn
nur ein Antikörper
oder ein Antigen, das mit einem Edelmetall markiert ist, in einer
gemischten Probenlösung
vorliegt, die in einer Totalreflexionszelle vorhanden ist, wird
keine Absorption mit einer Empfindlichkeit erkannt, die geeignet
für eine Messung
ist. Wenn ein Immunkomplex nicht mit einem Edelmetallkolloid markiert
ist, wird auch keine Absorption mit einer Empfindlichkeit erkannt,
die geeignet für
eine Messung ist. Eine Absorption mit einer Empfindlichkeit, die
geeignet für
eine Messung ist, wird bei einer spezifischen Wellenlänge nur
erkannt, wenn ein Immunkomplex, der mit einem Edelmetallkolloid
markiert ist, vorhanden ist. Das Merkmal der vorliegenden Erfindung
liegt in diesem Punkt, durch den eine homogene Immununtersuchungsanalyse ermöglicht wird.
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Angenommen,
dass n2 den Brechungsindex einer gemischten
Probenlösung
darstellt, die einen Immunkomplex enthält, und n1 (n2 < n1) den Brechungsindex eines Totalreflexionsprismas
darstellt, wird ein kritischer Winkel θc, der eine Totalreflexion verursacht,
wie folgt ausgedrückt: θc
= sin–1(n2/n1)
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Wenn
ein Messstrahl in das Totalreflexionsprisma von einem optischen
Einfallsystem eingebracht wird, ist ein Einfallswinkel θ (siehe 1)
an der Grenzfläche
zwischen dem Totalreflexionsprisma und der gemischten Probenlösung auf
die nachfolgende Bedingung eingestellt: θ > θc
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Wenn
die homogene Immununtersuchungsanalyse ausgeführt wird, ist eine gemischte
Probenlösung,
die einer Absorptionsmessung unterzogen wird, eine gemischte Lösung, die
einen mit Edelmetallkolloid markierten Antikörper (oder Antigen), einen mit
Edelmetallkolloid markierten Immunkomplex, ein nicht-reagiertes
Antigen (oder Antikörper),
ein Biopolymer und ähnliches
aufweist.
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Der
Messstrahl ist der, der einen Strahl mit kontinuierlicher Wellenlänge in einer
entsprechenden Region aus einer Nahe-Infrarot-, Mittel-Infrarot-
und Entfernt-Infrarot-Region,
oder einen Einwellenlängenstrahl
aufweist.
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Eine
Absorption bei dem Totalreflexionsprisma wird durch eine Absorbanz
A wie folgt ausgedrückt: A = N·α·de·logewobei
N die Anzahl von Malen einer Totalreflexion in dem Totalreflexionsprisma
darstellt, α den
Absorptionskoeffizienten der gemischten Probenlösung darstellt und de eine
optische Weglänge
darstellt, entlang der der Messstrahl in die gemischte Probenlösung bei
einer einzelnen Totalreflexion eindringt.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine Absorption durch einen mit Edelmetallkolloid
markierten Immunkomplex, der in einer gemischten Probenlösung vorhanden
ist, mit einer Totalreflexionszelle bei hoher Empfindlichkeit gemessen.
Eine Absorption mit einer Empfindlichkeit, die geeignet für eine Messung
ist, wird nur in einem Immunkomplex gemessen, der in einem Zustand
vorliegt, markiert mit einem Edelmetallkolloid, und keine Absorption
mit einer Empfindlichkeit, die für
eine Messung geeignet ist, wird in nur einem Antikörper oder
einem Antigen erkannt, das mit einem Edelmetallkolloid markiert
ist, oder in einem Immunkomplex, der in einem Zustand ist, der nicht
mit einem Edelmetallkolloid markiert ist, wodurch eine Qualifikation
und Bestimmung des Immunmaterials durch eine Absorption durch eine
Totalreflexionsmessung ausgeführt
werden kann, ohne Durchführen
einer B-F-Trennung, während
eine Immununtersuchung durch eine einfache Operation und eine einfache
Messvorrichtung ausgeführt
werden kann.
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Das
Vorangehende und andere Ziele, Merkmale, Aspekte und Vorteile der
vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden detaillierten
Beschreibung der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit den beiliegenden
Zeichnungen offensichtlich.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 stellt
schematisch ein Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung dar;
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2 ist
ein Blockdiagramm, das eine Messvorrichtung zeigt, die gemäß Anspruch
1 arbeitet;
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3 stellt
Spektren eines mit Goldkolloid markierten Immunkomplexes und eines
mit Goldkolloid markierten Antikörpers
dar;
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4 stellt
Spektren des mit Goldkolloid markierten Immunkomplexes und einen
Immunkomplex, der nicht mit einem Edelmetallkolloid markiert ist,
dar;
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5 stellt
ein Totalreflexions-Absorptions-Spektraldifferenzspektrum des mit
Goldkolloid markierten Immunkomplexes basierend auf den Spektren
dar, die in 3 gezeigt sind;
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6 stellt
eine Konzentrationsabhängigkeit der
Absorbanz bei 2.942,5 cm–1 im Hinblick auf eine Kon zentration
des Antikörpers
IgG bei den Immununtersuchungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
dar;
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7 stellt
eine Konzentrationsabhängigkeit der
Absorbanz bei 2.888,1 cm–1 im Hinblick auf eine Konzentration
des Antikörpers
IgG bei dem Immununtersuchungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
dar;
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8 stellt
eine Konzentrationsabhängigkeit der
Absorbanz bei 1.112,4 cm–1 im Hinblick auf eine Konzentration
des Antikörpers
IgG bei dem Immununtersuchungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
dar;
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9 stellt
eine Konzentrationsabhängigkeit der
Absorbanz bei 1.043,3 cm–1 im Hinblick auf eine Konzentration
des Antikörpers
IgG bei dem Immununtersuchungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
dar;
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10 stellt
die Konzentrationsabhängigkeit der
Absorbanz bei 993,8 cm–1 im Hinblick auf eine Konzentration
des Antikörpers
IgG bei dem Immununtersuchungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
dar;
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11A ist eine Frontquerschnittansicht, die eine
exemplarische Totalreflexionszelle mit nur einer Öffnung darstellt;
und
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11B zeigt eine Frontquerschnittansicht und eine
Draufsicht, die eine weitere Totalreflexionszelle mit nur jeweils
einer Öffnung
darstellen; und
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12A ist eine perspektivische Ansicht und eine
Frontquerschnittansicht, die eine exemplarische Weg werf-Totalreflexionszelle
darstellt, und
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12B bis 12E sind
eine perspektivische Ansicht und eine Frontquerschnittansicht, die jeweils
eine andere exemplarische Totalreflexions-Flusszelle zeigen.
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Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsbeispiele
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1 stellt
schematisch ein Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung dar. Eine Totalreflexionszelle 2 weist
ein Totalreflexionsprisma 4 an zumindest einer Oberfläche derselben
auf. Eine gemischte Lösung 8,
die einen mit Goldkolloid markierten Antikörper 6 enthält, der
an einem Goldkolloid absorbiert ist, das als ein exemplarisches
Edelmetallkolloid dient, ist in der Totalreflexionszelle 2 gespeichert,
und eine Probenlösung 12,
die ein Antigen 10 enthält,
das eine Antigen-Antikörper-Reaktion
mit dem Antikörper 6 verursacht,
wird zu derselben hinzugefügt,
so dass der Antikörper 6 und
das Antigen 10 eine Antigen-Antikörper-Reaktion in der gemischten
Lösung 8 durchführen, die
in der Totalreflexionszelle 2 gespeichert ist, wodurch
ein mit Goldkolloid markierter Immunkomplex 14 gebildet
wird. Ein Messstrahl wird in das Totalreflexionsprisma 4 von
einem optischen Einfallsystem 16 bei einem Einfallswinkel θ eingebracht,
was eine Totalreflexion verursacht, wodurch der Messstrahl durch
das Totalreflexionsprisma 4 übertragen wird, während er
total reflektiert wird, und etwas in die gemischte Lösung 8 eindringt,
durch die Schnittstelle zwischen dem Totalreflexionsprisma 4 und
der gemischten Lösung 8,
um durch den mit Goldkolloid markierten Immunkomplex 14 in
der gemischten Lösung 8 absorbiert
zu werden. Ein ausgehender Strahl von dem Totalreflexionsprisma 4 wird
durch ein optisches Messsystem 18 empfangen, so dass dessen
Absorbanz gemessen wird, wodurch das Antigen 10, das in
der Probenlösung 12 enthalten
ist, qualifiziert und bestimmt werden kann.
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2 stellt
schematisch eine Messvorrichtung gemäß Anspruch 1 dar. Das optische
Einfallsystem 16 umfasst eine Lichtquelle 16a,
die den Messstrahl emittiert, und ein optisches Strahleinstellsystem 16b.
Das optische Strahleinstellsystem 16b umfasst ein optisches
System zum Umwandeln des Strahls aus der Lichtquelle 16a in
einen parallelen Strahl, einen Strahlsplitter zum Splitten des Strahls
in einen Messstrahl 20s und einen Referenzstrahl 20r und
ein optisches System zum Einbringen des Messstrahls 20s in
das Totalreflexionsprisma 4 der Totalreflexionszelle 2 mit
einem Einfallswinkel, der eine Totalreflexion verursacht. Ein optisches
System 22 zum Einstellen des Lichtstroms des Messstrahls 20s,
der total reflektiert und durch das Totalreflexionsprisma 4 der
Totalreflexionszelle 2 übertragen
wird und ein Spektroskop 23 zum Empfangen des Messstrahls 20s,
das durch das optische System 22 eingestellt wird und den
empfangenen Messstrahl in seine Spektralkomponenten unterteilt,
sind auf einem optischen Weg des Messstrahls 20s angeordnet,
so dass der Messstrahl 20s, der in seine Spektralkomponenten
unterteilt ist, zu einem Erfassungsteil 26 geleitet und
durch dasselbe erfasst wird. Das optische Messsystem 18,
das in 1 gezeigt ist, umfasst das optische System 22,
das Spektroskop 23 und das Erfassungsteil 26.
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Andererseits
ist ein optisches System 24 zum Einstellen des Lichtstroms
des Referenzstrahls 20r auf einem optischen Weg des Referenzstrahls 20r angeordnet,
zum Korrigieren einer Fluktuation des Messstrahls 20s,
so dass der eingestellte Referenzstrahl 20r zu dem Erfassungsteil 26 geleitet
und durch dasselbe erfasst wird. Das Erfassungsteil 26 ist so
gebildet, um den Messstrahl 20s zu korrigieren, der durch
das Totalreflexionsprisma 4 übertragen wird und in seine
Spektralkomponenten durch das Spektroskop 23 unterteilt
wird, durch die Intensität des
Referenzstrahls 20r, der die Lichtquellenintensität anzeigt,
wodurch die Absorbanz berechnet wird.
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Das
Bezugszeichen 28 bezeichnet eine Steuerung, die die Spektraloperation
des Spektroskops 23 steuert, zum Übertragen eines Erfassungsausgangssignals
von dem Erfassungsteil 26 zu einem Datenprozessor 30.
Das Bezugszeichen 32 bezeichnet eine Ausgabeeinheit, wie
z. B. eine Aufzeicheneinheit oder eine CRC (CRC = Cathode Ray Tube
= Kathodenstrahlröhre),
die das Ergebnis des Verarbeitens in dem Datenprozessor 30 ausgibt.
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Die
Lichtquelle 16a, die verwendet wird, um das Immunanalyseverfahren
zu implementieren, das in Anspruch 1 definiert ist, kann durch eine
Fluoreszenzlampe, eine Xenonlampe, eine Schwarzkörper-Strahlungsquelle, einen
Gaslaser, einen Festkörperlaser
oder einen Halbleiterlaser gebildet sein.
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Das
Material für
das Totalreflexionsprisma 4 kann vorbereitet werden aus
ZnSe, Ge, Si, Al2O3 oder MgO.
Nur das Totalreflexionsprisma 4 oder die gesamten Wandoberflächen der
Totalreflexionszelle 2, die das Totalreflexionsprisma 4 umfasst,
können
aus einem solchen Material hergestellt sein.
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Das
Spektroskop 23 kann durch ein FTIR gebildet sein (FTIR
= Fourier Transformation Infrared Spectrophotometer = Infrarot-Fouriertransformations-Spektrophotometer),
ein System, das ein IR-Blaze-Gitter und einen IR-empfindlichen Detektor
oder ähnliches
aufweist. Das Spektroskop 23 kann in dem optischen Einfallsystem 16 umfasst
sein. Wenn eine Einwellenlängen-Lichtquelle,
die einen Strahl einer einzelnen Wellenlänge emittiert, als die Lichtquelle 16a verwendet
wird, werden das Spektroskop 23 und die Steuerung 28 zum
Steuern desselben unnötig.
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Die
Zelle 2, die in 1 gezeigt ist, wurde verwendet,
das Spektroskop 23 der Messvorrichtung, die in 2 gezeigt
ist, wurde durch ein FTIR gebildet, und ein optisches ZnSe-Kristall
wurde als das Totalreflexionsprisma 4 der Zelle 2 verwendet, Anti-Mouse
IgG (Produkt von BioCell (U.S.A.)), absorbiert auf einem Goldkolloid
von 30 nm in seiner Korngröße, wurde
als der mit Edelmetallkolloid markierte Antikörper 6 verwendet,
und eine gemischte Lösung
(pH 7,65) aus 0,01 M von TWEEN 21 (eingetragenes Warenzeichen) und
PBS (phosphatgepuffertes Salin) wurde als ein Lösungsmittel für eine gemischte
Lösung
verwendet, die den Antikörper 6 enthält. Eine
Erfassung wurde 10 mal in einer einzelnen Messzeit von 2 Minuten
ausgeführt,
und die Ergebnisse der Erfassung wurden geschätzt. Das Spektroskop 23 wies
einen Spektralbereich von 800 bis 3.200 cm–1 und
eine Auflösung
von 2 cm–1 auf.
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3 und 4 zeigen
Totalreflexionsspektren der Ergebnisse der Messung. Bezug nehmend auf 3 ist
ein Spektrum 2 das einer gemischten Lösung, die nur das zuvor genannte
30 nm mit Goldkolloid markierte Anti-Mouse IgG enthält. Eine
umfassende Absorption ist die von Wasser, während keine andere charakteristische
Absorption erkannt wird. Bezug nehmend auf 4 ist andererseits
ein Spektrum 3 das einer gemischten Lösung von 2 mg/ml in Konzentration,
die nur einen IgG-Immunkomplex enthält, der nicht mit einem Edelmetallkolloid
markiert ist. Keine charakteristische Absorption wird auch in dem
Spektrum 3 erkannt, außer
der von Wasser. Andererseits ist ein Spektrum 1, das in
jeder der 3 und 4 erscheint,
das einer gemischten Lösung,
die einen mit Goldkolloid markierten Immunkomplex enthält, gebildet
durch eine Reaktion von 7,5 μg/ml
des zuvor genannten 30 nm mit Goldkolloid markierten Anti-Mouse
IgG-Antikörpers und
62,5 μg/ml
eines Mouse-IgG-Antigens, und eine charakteristische Absorption
wird zusätzlich
zu der von Wasser erkannt.
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5 stellt
ein Spektrum dar, das durch Subtrahieren des Spektrums 2 von
dem Spektrum 1 in 3 als ein
Hintergrund erhalten wird, um die Absorption deutlich zu zeigen.
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Dieses
Spektrum ist ein Totalreflexions-Absorptionsspektraldifferenzspektrum
des mit Goldkolloid markierten Immunkomplexes, der durch die Reaktion
von 7,5 μg/ml
des 30 nm mit Goldkolloid markierten Anti-Mouse IgG-Antikörpers und
62,5 μg/ml des
Mouse-IgG-Antigens gebildet wird. In diesem Spektrum erscheinen
charakteristische Absorptionsbänder
bei 2.888 cm–1 und
2.942 cm–1 in
der Nähe von
2.900 cm–1,
und 993 cm–1,
1.043 cm–1 und
1.112 cm–1 zwischen
ungefähr
900 cm–1 und
1.500 cm–1, und
dies ist eine Absorption durch eine interne Schwingung des IgG-Immunkomplexes.
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6 bis 10 stellen
Konzentrationsabhängigkeitspegel
der Absorbanzwerte bei jeweiligen Wellenzahlen von 2.942,5 cm–1,
2.881,1 cm–1, 1.112,4
cm–1,
1.043,3 cm–1 bzw.
993,8 cm–1 im
Hinblick auf verschiedene Konzentrationswerte der Mouse-IgG-Antigene dar,
die mit 7,5 μg/ml
der mit 30 nm Goldkolloid markierten Anti-Mouse IgG-Antikörper reagierten.
Die x-Achsen zeigen IgG-Konzentrationswerte, und die y-Achsen zeigen
Absorbanzwerte. Jede ist gesättigt
in einer Hochkonzentrationsregion von IgG, während eine lineare Beziehung
in Niedrigkonzentrationsregionen vorliegt, und dies zeigt, dass
eine quantitative Analyse durch das erfinderische Verfahren möglich ist.
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11A und 11B zeigen
exemplarische Totalreflexionszellen ausschließlich mit Einzelöffnungen. 11A stellt die Zelle 2 dar, die in 1 gezeigt
ist, mit dem Totalreflexionsprisma 4 auf ihrer unteren
Oberfläche.
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11B zeigt eine Frontquerschnittansicht und eine
Draufsicht von oben von einer Zelle 40 mit einem Totalreflexionsprisma 4 auf
ihrer Seitenoberfläche.
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12A bis 12E zeigen
perspektivische Ansichten und Frontquerschnittansichten von Zellen
mit jeweils anderen Formen.
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12A zeigt eine einseitige Wegwerfzelle, die mit
einem schmalen Spielraum 42, zum Ansaugen einer gemischten
Probenlösung
durch ein Kapillarphänomen,
und einem Totalreflexionsprisma 4 versehen ist, das entlang
des Spielraums 42 gebildet ist. Das Bezugszeichen 15 bezeichnet
die gemischte Probenlösung,
die in den Spielraum 42 gesaugt wird.
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12B zeigt eine exemplarische doppelseitige Totalreflexions-Flusszelle,
die an der oberen und unteren Oberfläche derselben vorgesehen ist, mit
Totalreflexionsprismen 4 und 4' durch einen Raum, der mit einer
gemischten Probenlösung
gespeist wird. Das Bezugszeichen 44 bezeichnet ein Einlasstor
für eine
gemischte Probenlösung
für die Zelle,
und das Bezugszeichen 46 bezeichnet ein Auslasstor für eine gemischte
Probenlösung
aus der Zelle.
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12C zeigt eine exemplarische zylindrische Totalreflexions-Flusszelle,
die gebildet ist, um eine Seitenoberfläche eines zylindrischen Totalreflexionsprismas 4 einzuschließen. Eine
gemischte Probenlösung 15 wird
entlang der zylindrischen Oberfläche
des Totalreflexionsprismas 4 zugeführt.
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12D zeigt eine andere exemplarische doppelseitige
Totalreflexions-Flusszelle, die so gebildet ist, dass eine gemischte
Probenlösung 15 entlang zwei
gegenüberliegenden
Oberflächen
eines Totalreflexionsprismas 4 zugeführt wird. Die Bezugszeichen 44, 44' bezeichnen
Einlasstore für
eine gemischte Probenlösung
für die
Zelle, und die Bezugszeichen 46, 46' bezeichnen Auslasstore für eine gemischte Probenlösung aus
der Zelle.
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12E zeigt eine exemplarische einseitige Totalreflexions-Flusszelle
mit einem Totalreflexionsprisma 4 auf einer Oberfläche, die
einen Raum definiert, der mit einer gemischten Probenlösung 15 gespeist
wird.