ES2610731T3 - Tipificaciones de aloantígenos plaquetarios y pruebas de anticuerpos plaquetarios - Google Patents

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Abstract

Un método para la detección de al menos un aloantígeno de plaquetas humano (HPA) en plaquetas humanas contenidas en una muestra, que es sangre entera anti-coagulada en una concentración de más del 25%, que comprende las etapas de: (a) proporcionar al menos una superficie que tiene al menos un anticuerpo unido a la misma, en el que dicho anticuerpo se dirige contra la glicoproteína que lleva al menos un HPA que se detecta; (b) lisar las plaquetas contenidas en la muestra y solubilizar las proteínas de la membrana de dichas plaquetas; (c) poner en contacto dicha superficie con la muestra lisada y solubilizada de la etapa (b), en el que las respectivas glicoproteínas contenidas en dicha muestra se inmovilizan sobre dicha superficie al unirse específicamente al anticuerpo de la etapa (a); (d) poner en contacto dicha superficie con un anticuerpo marcado con fluorescencia, en el que dicho anticuerpo se dirige contra al menos un HPA que se detecta, y en el que dicho anticuerpo, las respectivas glicoproteínas contenidas en dicha muestra, y el anticuerpo de la etapa (a) forman un complejo unido a la superficie; (e) excitar dicho complejo unido a la superficie con un campo evanescente de una fuente de luz; (f) medir la fluorescencia emitida a partir de dicho complejo unido a la superficie; y (g) detectar al menos un HPA basado en la fluorescencia emitida medida en la etapa (f).

Description

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Descripcion
Tipificaciones de aloantigenos plaquetarios y pruebas de anticuerpos plaquetarios Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a metodos para la deteccion de aloantigenos plaquetarios humanos (HPA) en plaquetas humanas, opcionalmente en combinacion con la deteccion de anticuerpos humanos contra HPA.
Las transfusiones de sangre son una terapia de rutina en todo el mundo. Por lo general, no se transfunde toda la sangre entera, sino solo los componentes espedficos de la sangre. La sangre consta de una parte lfquida y una parte celular. La parte lfquida se llama plasma y contiene numerosas protemas. El plasma sangumeo se utiliza como un agente terapeutico, ya sea como plasma entero fresco como congelado, o como componentes de plasma sangumeo que se purifican por medios bioqmmicos del plasma y que se dan como una terapeutica espedfica. Los ejemplos respectivos son inmunoglobulinas tales como las inmunoglobulinas intravenosas (IGIV) o los factores de coagulacion de la sangre. La fraccion celular de la sangre contiene tres tipos de celulas, globulos rojos, globulos blancos y plaquetas. La transfusion de los globulos rojos constituye la mayona de los productos celulares terapeuticos de los bancos de sangre, seguido de los concentrados de plaquetas, que suman aproximadamente una decima parte de los concentrados de hematies.
Los productos sangumeos son de donantes individuales y estan sujetos a pruebas de diagnostico intensivas. El primer grupo de pruebas es determinar los antfgenos de superficie en las celulas, ya que estos antfgenos pueden variar de un donante a otro. Estan los grupos sangumeos conocidos con los principales antfgenos ABO y otros mas de 30 antfgenos menores conocidos y descritos. Por otra parte, el suero y/o el plasma se analizan para la deteccion de anticuerpos contra estos antfgenos. El segundo grupo de pruebas que se realizan de forma rutinaria son las pruebas de la ausencia o presencia de enfermedades infecciosas en la sangre del donante. Esto es para asegurar que la transfusion de sangre terapeutica no lleva a agentes patogenos. Estas pruebas se realizan habitualmente por una combinacion de pruebas de anticuerpos, tales como la deteccion de plasma de sangre para los anticuerpos contra el VIH, VHB, VHC, las pruebas del panel de ToRCH, y las pruebas de antfgenos de plasma de protemas espedficas de patogenos, por ejemplo, una prueba del antfgeno p24 del VIH. Dependiendo de la practica de cribado en los pafses espedficos, las pruebas de antfgeno y anticuerpo pueden ser complementadas por una prueba de acido nucleico para acidos nucleicos virales basados en metodos de amplificacion, por ejemplo, la amplificacion de ADN/ARN usando la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR).
Para las plaquetas terapeuticas, todas las pruebas de los grupos serologicos y sangumeos ABO se realizan al igual que para los concentrados de los globulos rojos. Sin embargo, las plaquetas no solo llevan a los antfgenos del grupo sangumeo, sino antfgenos extra adicionales en su superficie. Estos antfgenos vanan entre personas y causan aloinmunizaciones cuando se transfunden en individuos humanos no compatibles. Las pruebas para estos aloantfgenos y para los anticuerpos contra estos aloantfgenos en pacientes no se realizan de forma rutinaria. Las razones para esto son la falta de pruebas de diagnostico adecuadas para determinar aloantfgenos y metodos practicos adecuados y pruebas para la deteccion de anticuerpos.
Los aloantfgenos plaquetarios resultan de polimorfismos bialelicos de glicoprotemas de membrana de plaquetas. Estos polimorfismos dan lugar a cambios de un solo aminoacido en las glicoprotemas que no tienen grandes consecuencias biologicas. Sin embargo, tras la transfusion de plaquetas incompatibles, una aloinmunizacion puede ocurrir y conducir a smtomas clmicos, que se describen a continuacion. Otra fuente de aloinmunizacion se produce durante el embarazo cuando la mujer embarazada se inmuniza contra aloantfgenos de las plaquetas incompatibles del feto. Los alo-anticuerpos contra las plaquetas son una fuente que da lugar a smtomas clmicos, pero tambien hay auto-anticuerpos dirigidos contra las plaquetas que conducen a trombocitopenia.
Los aloantfgenos plaquetarios son protemas bien estudiadas y la mayona de los aloantfgenos relevantes estan descritos. Una nomenclatura comun para describir los HPA existe de HPA-1 a HPA-15. La convencion es para designar el alelo mas comun con la "a" y el alelo menos comun con la "b". De todos los HPA conocidos, los antfgenos HPA-1a y HPA-5b son los aloantfgenos mas inmunogenicos, que representan en conjunto mas del 95% de los casos clmicos en los caucasicos. En las poblaciones de Asia, la aloinmunizacion HPA-4 es un problema relevante. Existen otros anticuerpos de glicoprotema anti-plaquetas, pero son mucho menos frecuentes. Para un banco de sangre, tiene sentido proporcionar concentrados de plaquetas negativas HPA-1a y HPA-5b, ya que ofrecen la oportunidad de un mejor tratamiento de los pacientes con uno de los tres smtomas causados por los anticuerpos anti-plaquetas, es decir, Trombocitopenia Alo-inmunologica Neonatal (NAIT), Obstinacia de las plaquetas (PR), o Purpura trombocitopenica postransfusional (PTP).
La tipificacion de antfgenos de plaquetas se hace hoy dfa solo para los pacientes y los donantes de plaquetas seleccionados. Los laboratorios suelen utilizar ensayos de genotipado caseros y ensayos de fenotipado. Los aloantfgenos plaquetarios mas prominentes son HPA-1a y HPA-5b. Un pequeno numero de pruebas de tipificacion HPA-1a son realizadas por fenotipificacion pero este enfoque no ha encontrado un amplio uso. Una razon de la ausencia de ensayos de fenotipado es la falta de reactivos de tipificacion monoclonales adecuados para la determinacion de los fenotipos de plaquetas y que el procedimiento es largo y tedioso para el fenotipado. A dfa de
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hoy, solo un anticuerpo monoclonal para la tipificacion de HPA-1a existe, sin embargo, no se ha adaptado ampliamente en la practica habitual.
La deteccion en los bancos de sangre de las plaquetas tiene dos ventajas principales; en primer lugar, genera beneficios por la mejora de la seguridad para el paciente receptor y, en segundo lugar, evita donaciones inapropiadas e inutiles de costosas preparaciones de plaquetas para el paciente equivocado.
El diagnostico de anticuerpos de plaquetas se realiza en muestras de sangre de pacientes con enfermedades causadas por anticuerpos plaquetarios, tales como NAIT, PR, y PTP. Como las pruebas de anticuerpos plaquetarios actuales son pruebas celulares complicadas, tales como el ensayo de Inmovilizacion de anticuerpo monoclonal de antfgeno de plaquetas (MAIPA) o la prueba de fluorescencia Inmune de plaquetas (PIFT), muy pocos productos diagnosticos in vitro (IVD) comerciales estan disponibles. Solo los laboratorios especializados de plaquetas realizan estas pruebas utilizando pruebas diagnosticas caseras. Estos laboratorios especializados ofrecen un servicio a otros bancos de sangre para la inmunologfa plaquetaria ya que un banco de sangre regular no realizar comunmente estas pruebas.
En este contexto, el documento EP 2 006 304 A1 describe un anticuerpo monoclonal que reconoce de forma selectiva un aloantfgeno plaquetario humano. Ademas, el documento WO 01/14859 A1 describe un metodo para la determinacion de sustancias que usan un metodo de campo evanescente.
En consecuencia, el problema tecnico subyacente de la presente invencion es proporcionar metodos para la deteccion de los aloantfgenos plaquetarios humanos (HPA) en plaquetas humanas, opcionalmente en combinacion con la deteccion de anticuerpos humanos contra antfgenos de plaquetas. Dichos metodos deben ser faciles de realizar, rentables, y deben entregar los resultados en un corto penodo de tiempo.
La solucion al problema tecnico anterior se consigue mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.
En particular, en un primer aspecto, la presente invencion se refiere a un primer metodo para la deteccion de al menos un aloantfgeno de plaquetas humano (HPA) en plaquetas humanas contenidas en una muestra, que es sangre entera anti-coagulada en una concentracion de mas de 25%, que comprende las etapas de:
(a) proporcionar al menos una superficie que tiene al menos un anticuerpo unido a la misma, en el que dicho anticuerpo se dirige contra la glicoprotema que lleva al menos un HPA para ser detectado;
(b) lisar las plaquetas contenidas en la muestra y solubilizar las protemas de la membrana de dichas plaquetas;
(c) poner en contacto dicha superficie con la muestra lisada y solubilizada de la etapa (b), en el que las respectivas glicoprotemas contenidas en dicha muestra se inmovilizan sobre dicha superficie uniendose espedficamente al anticuerpo de la etapa (a);
(d) poner en contacto dicha superficie con un anticuerpo marcado con fluorescencia, en el que dicho anticuerpo se dirige contra el al menos un hPa a detectar, y en el que dicho anticuerpo, las glicoprotemas respectivas contenidas en dicha muestra, y el anticuerpo de la etapa (a) forman un complejo unido a la superficie;
(e) excitar dicho complejo unido a la superficie con un campo evanescente de una fuente de luz;
(f) medir la fluorescencia emitida a partir de dicho complejo unido a la superficie; y
(g) detectar al menos un HPA basado en la fluorescencia emitida medida en la etapa (f).
En este aspecto, el termino "deteccion" no se limita espedficamente y no solo incluye la medicion cualitativa de los HPA de interes, sino que incluye expresamente la determinacion cuantitativa de los mismos. En este contexto, "cualitativa", como se usa en la presente memoria, significa una determinacion de la presencia o ausencia de un HPA de interes dentro de una muestra espedfica, mientras que el termino "cuantitativa", como se usa en este documento, significa una medida del contenido o cantidad de un HPA para ser detectado dentro de una muestra espedfica.
HPA para ser detectado con el primer metodo anterior de la presente invencion no estan particularmente limitados y se conocen en la tecnica. Preferiblemente, al menos un HPA se selecciona del grupo que consiste en HPA-1a, HPA- 1b, HPA-2a, HPA-2b, HPA-3a, HPA-3b, HPA-4a, HPA-4b, HPA-5a, HPA-5b, HPA-6a, HPA-6b, HPA-7a, HPA-7b, HPA-8a, HPA-8b, HPA-9a, HPA-9b, HPA-10a, HPA-10b, HPA-11a, HPA-11b, HPA-12a, HPA-12b, HPA-13a, HPA- 13b, HPA-14a, HPA-14b, HPA-15a, y HPA-15b. Mas preferiblemente, al menos un HPA se selecciona del grupo que consiste en HPA-1a, HPA-1b, HPA-3a, HPA-3b, HPA-4a, HPA-4b, HPA-5a, y HPA-5b. Incluso mas preferiblemente, al menos un HPA se selecciona del grupo que consiste en HPA-1a y HPA-5b, es decir, se detectan HPA-1a y/o HPA-5b.
De acuerdo con el primer metodo anterior de la presente invencion, se detecta al menos un HPA. Por lo tanto, tambien mas de un HPA se puede detectar, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o mas HPA. En estas realizaciones, se
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proporciona un numero de acuerdo de las superficies en la etapa (a) por ejemplo, cuando dos HPA van a ser detectados, se proporcionan dos superficies. Ademas, todas las superficies proporcionadas en la etapa (a) se ponen en contacto en las etapas (c) y (d), y los respectivos anticuerpos marcados con fluorescencia dirigidos contra los HPA que se detectan se utilizan en la etapa (d). Ademas, todos los complejos unidos a la superficie son excitados en la etapa (e), medidos en la etapa (f), y todos los HPA respectivos se detectan en la etapa (g).
La muestra que se analiza en el primer metodo anterior de la presente invencion es sangre completa anticoagulada en concentraciones de mas de 25%, mas del 33%, mas del 50% o incluso mas de 80%.
Sin embargo, sorprendentemente, es posible utilizar una muestra de sangre total anticoagulada en el primer metodo anterior de la presente invencion con la obtencion de resultados fiables y excelentes. La muestra de sangre entera se usa por encima de una concentracion de 25% en las pruebas finales, en donde es evidente que esto puede dar lugar a senales no espedficas debido a interacciones bioqmmicas no deseadas. Sin embargo, inesperadamente, se ha observado muy bajo fondo bioqmmico, lo que todavfa permite detectar espedficamente y selectivamente la glicoprotema plaquetaria. Aun mas importante a destacar es que el primer metodo anterior de la presente invencion permite detectar y distinguir con glicoprotemas de alta sensibilidad que difieren entre sf por un solo polimorfismo de un solo aminoacido. Ademas, la capacidad de las pruebas para dar una senal espedfica, incluso en presencia de un gran exceso de fluoroforos potenciales en una solucion de sangre completa lisada, a saber, la hemoglobina, las protemas citoplasmaticas de eritrocitos y otras celulas de la sangre, asf como la gran cantidad de protemas plasmaticas humanas, es sorprendente. No se observa una senal de autofluorescencia resultante de cualquier componente de la muestra de sangre entera. Notable es tambien que los procesos de degradacion biologica que ocurren en la sangre entera cuando se almacena a 4°C no tienen una influencia significativa en la senal de ensayo. Una muestra de sangre que se almacena a 4°C durante mas de un ano se puede utilizar en el ensayo y dar un resultado correcto. Esto indica de nuevo la ausencia de fenomenos de autofluorescencia y la estabilidad de las glicoprotemas plaquetarias durante el almacenamiento y el envejecimiento.
Las expresiones "poner en contacto la superficie" o "poner en contacto dicha superficie" tal como se utiliza en este aspecto se pretende que se refieran a la puesta en contacto de las superficies que se saturan con por ejemplo, anticuerpos, agentes de bloqueo, complejos antfgeno-anticuerpo, u otros complejos que puedan aparecer en los metodos de la presente invencion. Cualquier persona experta en la tecnica entendera que, por ejemplo, en la etapa
(c) del primer metodo anterior, la muestra en realidad no esta en contacto con la superficie, sino los anticuerpos de la etapa (a) u, opcionalmente, agentes de bloqueo que se unen a la misma, ya que dicha superficie se satura con dichos anticuerpos y opcionalmente con agentes de bloqueo, y, por lo tanto, no esta realmente accesible. Sin embargo, los terminos anteriores se eligen para reflejar el punto de vista macroscopico de un medico que trabaja la presente invencion, que simplemente va a ver una superficie, y sabra lo que realmente esta unido a dicha superficie en cualquier punto dado.
Las superficies previstas en el primer metodo anterior de la presente invencion estan hechas de materiales que no estan particularmente limitados y que se conocen en la tecnica. Preferiblemente, tales materiales son de vidrio o de un plastico, preferiblemente un plastico, tal como poliestireno, polipropileno, polietileno, tereftalato de polietileno, policicloolefina, poliacrilonitrilo, polimetilmetacrilato y/o mezclas y combinaciones de estos plasticos. En principio, cualquier plastico que, basicamente, no absorba la luz en el rango visible es adecuado. En una realizacion, el plastico tambien se puede tenir de color azul claro, por ejemplo, con el fin de filtrar una emision causada por la luz de dispersion. Preferiblemente, la superficie de arriba es el interior de un recipiente concavo, como una cubeta o un pocillo de una placa de microtitulacion o de un cartucho de prueba, por ejemplo. Tales cubetas, placas de microtitulacion y los cartuchos de prueba pueden ser obtenidos economicamente por moldeo por inyeccion y preferiblemente tienen un volumen de reaccion para el lfquido de 1 a 400 |il, especialmente preferido de 5 a 100 |il, y lo mas preferido de 10 a 40 |il. Preferiblemente, las cubetas, placas de microtitulacion o cartuchos de prueba se hacen en una sola pieza. En este contexto, la expresion "cartucho de prueba" no se limita espedficamente e incluye cualquier objeto que pueda ser utilizado para proporcionar una superficie en la que el anticuerpo de la etapa (a) del primer metodo anterior de la presente invencion se una y que pueda ser puesto en contacto con las soluciones o reactivos respectivos. Por ejemplo, el cartucho de prueba puede ser un cartucho desechable de medicion de una sola via, que contenga varios pocillos de medicion totalmente separados, que son pre-condicionados a las necesidades espedficas de la medicion.
Tal como se utiliza en este aspecto, el termino "unido" significa preferiblemente que el anticuerpo de la etapa (a) se adhiere a la superficie mediante absorcion (absorcion directa). Sin embargo, dicho anticuerpo tambien se puede unir a la superficie a traves de un elemento de puente, por ejemplo una protema, tal como un anticuerpo adicional o un antfgeno. Dicho anticuerpo tambien puede unirse a la superficie por un enlace covalente. Esto puede ser, por ejemplo, producido usando una superficie de acrilato mediante la conversion con una carbodiimida. Ademas, el termino "unido" en el sentido de la presente invencion incluye la adhesion a una superficie o a otro ligando, e incluye tanto interacciones covalentes como no covalentes, como, por ejemplo, las interacciones basadas en interacciones ionicas, polares o no polares.
En este aspecto, el anticuerpo de la etapa (a) se puede colocar en la superficie por un metodo comun. Por ejemplo, dicho anticuerpo se puede recubrir en la superficie. Despues de este paso, la superficie se trata preferiblemente con
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otra solucion, y los sitios en la superficie no adheridos a dicho anticuerpo se bloquean o se bloquearan, por ejemplo, otra protema o un compuesto qmmico tal como un detergente.
De acuerdo con el primer metodo anterior de la presente invencion, el anticuerpo de la etapa (a) puede formar un complejo, en el que este complejo al menos incluye, ademas de dicho anticuerpo, el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa (d) y la glicoprotema que lleva el HPA que se detecta. Con el anticuerpo de la etapa (a) unido a la superficie, el complejo con la glicoprotema que lleva el HPA que se detecta es "anclado" a la superficie, es decir, fijado a la misma y puede al mismo tiempo ser detectado mediante el marcado con el anticuerpo de la etapa
(d) que contiene el fluoroforo.
El anticuerpo de la etapa (a) del primer metodo anterior de la presente invencion no esta particularmente limitado, con tal que se dirija contra la glicoprotema que lleva al menos un HPA que se detecta, es decir, a condicion de que se una espedficamente a dicha glicoprotema. Los anticuerpos adecuados se conocen en la tecnica y pueden ser obtenidos por ejemplo, comercialmente. Estos anticuerpos no estan restringidos espedficamente en relacion con su isotipo o su origen. Entre los anticuerpos ejemplares en este contexto podnan estar, por ejemplo, los anticuerpos IgG murinos. Las glicoprotemas de interes a este respecto son conocidas en la tecnica e incluyen, en particular, gpllbllla, gplalla, gpIbIX y HLA/beta-2-microglobulina. Los anticuerpos particulares que se pueden utilizar a este respecto son el anticuerpo monoclonal anti-gpllbllla RFGP56 y el anticuerpo monoclonal anti-gplalla AK7. Otros anticuerpos adecuados son, por ejemplo, el clon anti-gpllbllla P2 Immuntech o los clones anti-gplalla Gi9 y Y418. Muchos anticuerpos mas adecuados los pueden encontrar las personas expertas en la tecnica.
Ademas, el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa (d) del primer metodo anterior de la presente invencion no esta particularmente limitado, con tal que se dirija contra el HpA que se detecta, es decir, a condicion de que se una espedficamente a dicho HPA. Los anticuerpos adecuados no estan restringidos espedficamente en relacion con su isotipo y origen, y son conocidos en la tecnica. Ademas, el marcador fluorescente de dicho anticuerpo no esta particularmente restringido, siempre que pueda emitir luz fluorescente cuando se excita con un campo evanescente de una fuente de luz. Los marcadores fluorescentes adecuados son conocidos en la tecnica. En una realizacion preferida, dicho marcador fluorescente es alo-ficocianina (APC).
En una realizacion preferida del primer metodo anterior de la presente invencion, el anticuerpo de la etapa (a) y el anticuerpo de la etapa (d) tienen diferentes especificidades, es decir, se unen a diferentes epftopos.
En una realizacion particular del primer metodo anterior de la presente invencion, el anticuerpo de la etapa (a) y el anticuerpo de la etapa (d) se pueden intercambiar, es decir, el anticuerpo de la etapa (a) esta dirigido contra al menos un HPA que se detecta, y el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa (d) se dirige contra la glicoprotema que lleva al menos un HPA que se detecta. En esta realizacion particular, dichos anticuerpos, asf como el marcador fluorescente, son como se definen anteriormente.
Tal como se utiliza en este documento, el termino "anticuerpo" no solo se refiere al anticuerpo respectivo como tal, sino que tambien incluye cualquier fragmento y derivado de dicho anticuerpo, siempre que dichos fragmentos conserven la capacidad de unirse espedficamente al mismo epftopo. Los fragmentos respectivos pueden ser fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), o fragmentos F(ab')2. Ademas, en lugar de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, se puede utilizar cualquier otra macromolecula que tenga la capacidad de unirse espedficamente a un epftopo. Tales macromoleculas incluyen, por ejemplo, aptameros de nucleotidos, aptameros de peptidos, nanocuerpos, aficuerpos, anticalins, DARPins, Phylomers, AdNectins y protema A.
De acuerdo con el primer metodo anterior de la presente invencion, en la etapa (b) las plaquetas contenidas en la muestra se lisan y las protemas de la membrana de dichas plaquetas se solubilizan. Los metodos y agentes para la lisis y la solubilizacion no estan particularmente limitados y se conocen en la tecnica. lncluyen, por ejemplo, el tratamiento de dichas plaquetas con concentraciones adecuadas de tensioactivos tales como Tween 20 (polisorbato 20; polioxietileno (20) monolaurato de sorbitan) o NP40 (nonil fenoxipolietoxiletanol).
En el primer metodo anterior de la presente invencion, las etapas (c) y (d) pueden llevarse a cabo posteriormente o al mismo tiempo. En particular, en una realizacion preferida, el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa (d) puede estar contenido en la solucion de lisis y solubilizacion formada en la etapa (b), de manera que las etapas (c) y (d) se ejecutan simultaneamente, cuando la solucion respectiva se pone en contacto con la superficie.
De acuerdo con una realizacion preferida, el primer metodo anterior de la presente invencion no requiere mas de dos, mas preferiblemente mas de una, etapas de manipulacion de ftquidos. En este contexto, la expresion "paso de manipulacion de ftquidos", como se usa en este documento generalmente, incluye cualquier paso que transfiera, elimine o anada un ftquido desde y/o hacia un sitio de accion. Por ejemplo, los pasos de manipulacion de ftquido de acuerdo con la presente invencion incluyen la adicion, por ejemplo, pipeteando, un ftquido en el pocillo de una cubeta, una placa de microtitulacion o un cartucho de ensayo, o eliminando un ftquido de tal pocillo. Ademas, de acuerdo con otra realizacion preferida, el primer metodo anterior de la presente invencion no incluye ningun paso de lavado.
En particular, el primer metodo de la presente invencion preferiblemente no requiere etapas para retirar el volumen que contienen los reactivos en exceso, tales como el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa (d), y/o el
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lavado de la superficie en la que el anticuerpo de la etapa (a ) y/o el complejo que se mide estan unidos. Esto acelera ventajosamente el primer metodo anterior de la presente invencion para obtener rapidamente los resultados de las mediciones deseadas, evita la acumulacion de residuos Uquidos y los errores operacionales al llevar a cabo el metodo.
En este contexto, en una realizacion adicional de la presente invencion, el primer metodo como se define anteriormente es un metodo de un solo paso. Segun la presente invencion, metodo de "un solo paso" significa que solo se lleva a cabo una reaccion de formacion de complejo, lo que generalmente requiere solo una o, como mucho, dos etapas de manipulacion de lfquidos que se llevan a cabo por el operador con el fin de obtener el resultado de la medicion deseada. Por lo tanto, etapas adicionales de reaccion, tales como la adicion de mas reactivos despues de la formacion del complejo inicial se evitan ventajosamente.
Por otra parte, una realizacion adicional de la presente invencion se refiere a un metodo como se define anteriormente, en donde dicho metodo no incluye la agitacion del lfquido. En este contexto, la expresion "agitacion del lfquido" no esta limitada espedficamente e incluye cualquier tipo de agitacion que se produzca en el lfquido, a excepcion de la difusion natural. Por ejemplo, la agitacion del lfquido en el sentido de la presente invencion incluye agitacion, bombeo, centrifugacion, agitacion ultrasonica, etc. Al evitar cualquier agitacion del lfquido, a excepcion de la difusion natural que ocurre, el metodo puede llevarse a cabo de una manera simple y eficaz, y por lo tanto evita configuraciones tecnicas complicadas incluyendo los dispositivos de agitacion respectivos.
De acuerdo con una realizacion adicional del primer metodo anteriormente definido, el resultado determinado en la etapa (g) se obtiene a los 30 minutos, preferiblemente 20 minutos, mas preferiblemente 10 minutos o menos a partir del inicio de la etapa (c). Segun la presente invencion, se obtiene el resultado cualitativo o cuantitativo a los 30 minutos, preferiblemente 20 minutos, mas preferiblemente 10 minutos o menos despues de que la solucion que contiene la muestra lisada y solubilizada y el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa (d) se haya puesto en contacto con la superficie a la que el anticuerpo de la etapa (a) es unido. Preferiblemente, el resultado se obtiene a los 9 minutos o menos, 8 minutos o menos o 7 minutos o menos. Otros ejemplos incluyen penodos de 6 minutos o menos, 5 minutos o menos o 4 minutos o menos.
De acuerdo con una realizacion adicional del primer metodo anterior de la presente invencion, dicha superficie se pone en contacto antes de la etapa (e) con al menos un colorante que absorbe en el intervalo de absorcion y/o emision del marcador fluorescente del anticuerpo de la etapa (d). Segun la presente invencion, la excitacion del fluoroforo en el volumen, es decir, del fluoroforo que no forma parte del complejo unido a la superficie, se puede suprimir si la solucion que se coloca en contacto con la superficie tiene al menos un colorante anadido a la misma que tiene una absorcion en el intervalo de absorcion y/o emisiones de dicho fluoroforo. La absorcion del colorante anadido al volumen se coordina con el intervalo de absorcion y/o emision de dicho fluoroforo. Se puede utilizar un colorante individual o una mezcla de colorantes. El intervalo de absorcion del fluoroforo se correlaciona generalmente con la longitud de onda de la fuente de luz utilizada. No es necesario que el colorante tenga un maximo de absorcion en este intervalo especial; un hombro en el espectro de absorcion puede ser suficiente. Por ejemplo, si se utilizan fluoroforos como APC o Cy5, el colorante utilizado puede tener la absorcion entre 600 nm y 700 nm, como, por ejemplo, Brilliant Blue FCF. Otro ejemplo de un colorante que se puede utilizar a este respecto es Brilliant Black Bn. La concentracion de colorante anadido depende tanto del coeficiente de absorcion de cada colorante en solucion como de la frecuencia de la luz irradiada. La concentracion de colorante puede ajustarse, dependiendo del colorante, de modo que la luz que penetra, basicamente, pueda ser absorbida en un grado de mas del 90% de absorbancia en 0,1 mm por encima de la superficie.
De acuerdo con las etapas (e) a (g) del primer metodo anterior de la presente invencion, el complejo unido a la superficie generado en la etapa (a) a (d) de dicho metodo se excita con un campo evanescente de una fuente de luz, la fluorescencia emitida por dicho complejo se mide, y al menos un HPA de interes se detecta basandose en la fluorescencia emitida medida, en el que una senal de fluorescencia positiva indica la presencia de dicho complejo y, por tanto, la presencia de al menos una HPA de interes.
En este contexto, la expresion "fuente de luz", como se usa en el presente documento, no se limita espedficamente e incluye cualquier fuente de luz que sea adecuada para crear un campo evanescente y excitar el fluoroforo unido al anticuerpo de la etapa (d). Por ejemplo, se puede usar luz monocromatica como fuente de luz. La luz debe ser utilizada para que tenga una longitud de onda que preferiblemente no interfiera con la emision del fluoroforo y, preferiblemente que se cruce con la banda de absorcion del colorante. Un laser es especialmente preferido como fuente de luz, cuya luz emite una longitud de onda de 635 nm.
El primer metodo anterior de la presente invencion se basa en una nueva tecnologfa para el analisis de biomoleculas mediante la excitacion de campo evanescente de fluoroforos unidos y la medicion directa de los sucesos de union a tiempo real como se describe en las patentes europeas EP 1 079 226 B1, EP 1 204 856 B1 y EP 1 371 967 B1. El principio funcional de este biosensor de campo evanescente es la interaccion de un analito unido a la superficie con un ligando en solucion mediante una interaccion no covalente. El ligando en solucion se une covalentemente a una molecula fluorescente. La excitacion preferida de la molecula fluorescente es coherente con la luz tal como se genera, por ejemplo, por un diodo laser y luego se detectan los fotones emitidos. Los fluoroforos adecuados para ello son, por ejemplo, los colorantes Cy5, Alexa o la protema captadora de luz alo-ficocianina (APC).
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La reaccion bioqmmica se lleva a cabo en un pequeno pocillo, similar a un pocillo de ELISA en forma y dimensiones con una entidad optica adicional en la parte inferior. Como en el ELISA, el pocillo del biosensor y su parte inferior optica se producen mediante moldeo por inyeccion del material termoplastico, como, por ejemplo, poliestireno. Las principales diferencias entre el metodo de ELISA y los metodos evanescencia de biosensores son los marcadores del ligando en solucion. Para ELISA, el marcador es una enzima y para la tecnologfa de evanescencia el ligando esta marcado con una molecula fluorescente. La medicion del fluoroforo unido, es decir, el ligando fluorescente en solucion que se une al analito inmovilizado en la superficie evanescente, se logra mediante la excitacion espedfica del ligando marcado de manera fluorescente unido utilizando el principio de excitacion del campo evanescente. La excitacion selectiva del fluoroforo unido se produce por un campo evanescente de la luz utilizando una construccion optica resultante en una excitacion espedfica de una capa gruesa de aproximadamente 200 nm de lfquido situada en el fondo del pocillo y que no excita al ligando marcado de manera fluorescente en exceso presente en el solucion por encima de la superficie de union. Solo los ligandos marcados con fluorescencia que estan en el campo evanescente se excitan y emiten fotones. Este metodo permite la observacion de una reaccion de union del ligando soluble con el ligando inmovilizado en tiempo real.
Aunque la mayona de los ensayos inmunologicos utilizados en pruebas diagnosticas in vitro tienen un procedimiento largo y tedioso que implica tiempos de incubacion, lavados, adicion de reactivos o soluciones secundarias o terciarias para obtener un resultado de un biomarcador, el biosensor de evanescencia permite realizar ensayos diagnosticos in vitro en poco tiempo. La instrumentacion compleja y costosa de la automatizacion del ELISA o de los ensayos inmunologicos basados en perlas no es requerida ni necesaria cuando se utiliza el biosensor de evanescencia para aplicaciones de diagnostico.
Los metodos de la presente invencion se pueden llevar a cabo usando un primer dispositivo de prueba diagnostico que comprenda al menos una superficie que tenga al menos el anticuerpo de la etapa (a) unido a la misma.
En este aspecto, la superficie, el anticuerpo de la etapa (a), agentes de lisis y solubilizacion adecuados utilizados en la etapa (b), y el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa (d) son como se definen anteriormente. Ademas, las definiciones dadas anteriormente se aplican tambien a este aspecto.
Preferiblemente, el primer dispositivo de prueba de diagnostico anterior tiene la forma de una cubeta, placa de microtitulacion o cartucho de prueba, preferentemente esta hecho de vidrio o de un plastico, preferiblemente un plastico, tal como poliestireno, polipropileno, polietileno, tereftalato de polietileno, policicloolefina, poliacrilnitrilo, polimetilmetacrilato y/o mezclas y composiciones de estos plasticos. En principio, cualquier plastico que, basicamente, no absorba luz en el rango visible es adecuado. El plastico tambien se puede tenir de color azul claro, por ejemplo, con el fin de filtrar alguna emision causada por la luz de dispersion. Las cubetas de plastico, placas de microtitulacion y los cartuchos de prueba pueden ser obtenidos economicamente por moldeo por inyeccion y preferiblemente tienen un volumen de reaccion de 1 a 400 |il, especialmente preferido de 5 a 100 |il, y lo mas preferido de 10 a 40 |il. Preferiblemente, las cubetas, placas de microtitulacion o cartuchos de prueba se hacen en una sola pieza.
En este contexto, la expresion "cartucho de prueba" no se limita espedficamente e incluye cualquier objeto que pueda ser utilizado para proporcionar una superficie sobre la que se une el anticuerpo de la etapa (a) y que puede ponerse en contacto con las soluciones o reactivos respectivos. Por ejemplo, el cartucho de prueba puede ser un cartucho desechable de medicion de una sola via, que contiene varios pocillos de medicion totalmente separados, que son pre-acondicionados a las necesidades espedficas de la medicion.
En este contexto, ya que el cartucho de prueba tfpico tiene multiples pocillos, varios ensayos se pueden ejecutar en paralelo. Los respectivos ejemplos incluyen la tipificacion de varios alo-antfgenos al mismo tiempo, incluyendo opcionalmente controles internos positivos y negativos para el control de la realizacion de las pruebas. Otro ejemplo podna ser la tipificacion de uno o mas alo-antfgenos y el establecimiento de una curva de calibracion al mismo tiempo.
En otro aspecto, los metodos de la presente invencion se pueden llevar a cabo en combinacion con un segundo metodo para la deteccion de anticuerpos humanos dirigidos contra aloantfgenos de plaquetas humanas (HPA), en una muestra, que comprende las etapas:
(a) proporcionar al menos una superficie que tiene al menos plaquetas humanas o fracciones de membrana de plaquetas unidas a la misma, en el que los HPA de interes que estan presentes en dichas plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas son conocidos;
(b) poner en contacto dicha superficie con dicha muestra, en el que los anticuerpos humanos dirigidos contra los HPA que estan presentes en dichas plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas, contenidos en dicha muestra, se inmovilizan sobre dicha superficie al unirse espedficamente a las plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas del paso (a);
(c) poner en contacto dicha superficie con un agente de deteccion marcado con fluorescencia, en el que dicho agente de deteccion se une espedficamente a anticuerpos humanos dirigidos contra los HPA que estan presentes en dichas plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas, y en el que dicho agente de deteccion, anticuerpos
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humanos respectivos contenidos en dicha muestra, y las plaquetas humanas o fracciones de membrana de plaquetas de la etapa (a) forman un complejo unido a la superficie;
(d) excitar dicho complejo unido a la superficie con un campo evanescente de una fuente de luz;
(e) medir la fluorescencia emitida a partir de dicho complejo unido a la superficie; y
(f) detectar los anticuerpos humanos contra los HPA que estan presentes en dicho plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas en base a la fluorescencia emitida medida en la etapa (e).
En este aspecto, el termino "deteccion" no se limita espedficamente y no solo incluye la medicion cualitativa de anticuerpos humanos dirigidos contra el HPA de interes, sino que incluye expresamente la determinacion cuantitativa de los mismos. En este contexto, "cualitativa", como se usa en la presente memoria, significa una determinacion de la presencia o ausencia de un anticuerpo de interes dentro de una muestra espedfica, mientras que el termino "cuantitativa", como se usa en este documento, significa una medida del contenido o la cantidad de un anticuerpo que se detecta dentro de una muestra espedfica.
Los anticuerpos que se detectan con el segundo metodo anterior no estan particularmente limitados e incluyen cualquiera de los anticuerpos dirigidos contra un HPA. Preferiblemente, dicho HPA se selecciona del grupo que consiste en HPA-1a, HPA-1b, HPA-2a, HPA-2b, HPA-3a, HPA-3b, HPA-4a, HPA-4b, HPA-5a, HPA-5b , HPA-6a, HPA-6b, HPA-7a, HPA-7b, HPA-8a, HPA-8b, HPA-9a, HPA-9b, HPA-10a, HPA-10b, HPA-11a, HPA-11b, HPA-12A, HPA-12b, HPA-13a, HPA-13b, HPA-14a, HPA-14b, HPA-15a, y HPA-15b. Mas preferiblemente, dicho HPA se selecciona del grupo que consiste en HPA-1a, HPA-1b, HPA-3a, HPA-3b, HPA-4a, HPA-4b, HPA-5a, y HPA-5b. Aun mas preferiblemente, dicho HPA se selecciona del grupo que consiste en HPA-1a y HPA-5b, es decir, se detectan anticuerpos dirigidos contra HPA-1a y/o HPA-5b.
Segun el segundo metodo anterior, los anticuerpos dirigidos contra un HPA o mas HPA se detectan, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o mas anticuerpos dirigidos contra diferentes HPA. En estas realizaciones, se proporciona un numero de acuerdo de las superficies en la etapa (a), por ejemplo, cuando se detectan anticuerpos contra dos HPA, se proporcionan dos superficies. Ademas, todas las superficies proporcionadas en la etapa (a) se ponen en contacto en las etapas (b) y (c). Ademas, todos los complejos unidos a la superficie son excitados en la etapa (d), medidos en la etapa (e), y todos los anticuerpos respectivos se detectan en la etapa (f).
En este contexto, el segundo metodo anterior se puede realizar como un metodo multiplex, es decir, mas de una, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o mas diferentes plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas se pueden recubrir en diferentes posiciones sobre una superficie, por lo que, por ejemplo, todos los HPA o alo-antfgenos de plaquetas pueden ser cubiertos. Por ejemplo, de acuerdo con la presente invencion, un solo microchip puede ser utilizado en el segundo metodo definido anteriormente, que utiliza una seleccion de plaquetas o fragmentos de los mismos para cubrir todos los HPA de interes, lo que permite la determinacion facil y rapida de anticuerpos anti-HPA en una muestra.
La muestra a analizar en el segundo metodo anterior no esta particularmente limitada, siempre y cuando sea una muestra que contenga, o se sospeche que contiene, anticuerpos contra HPA. Preferiblemente, dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en plasma sangumeo y suero sangumeo.
Las expresiones "poner en contacto la superficie" o "poner en contacto dicha superficie", tal como se utilizan en este aspecto, tienen la intencion de referirse a la puesta en contacto de las superficies que se saturan con, por ejemplo, plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas, agentes de bloqueo, complejos de plaquetas-anticuerpos, u otro complejos que pueden aparecer en los metodos de la presente invencion. Cualquier persona experta en la tecnica entendera que, por ejemplo, en la etapa (b) del segundo metodo anterior, la muestra en realidad no esta en contacto con la superficie, sino las plaquetas humanas o fracciones de membrana de plaquetas de la etapa (a) u opcionalmente agentes de bloqueo que se unen a la misma, puesto que dicha superficie se satura con dichas plaquetas humanas o fracciones de membranas de plaquetas y, opcionalmente, con agentes de bloqueo, y, por lo tanto, no esta realmente accesible. Sin embargo, las expresiones anteriores se eligen para reflejar el punto de vista macroscopico de un medico que trabaja la presente invencion, que simplemente va a ver una superficie, y sabra lo que realmente esta unido a dicha superficie en cualquier punto dado.
Las superficies proporcionadas en el segundo metodo anterior estan hechas de materiales que no estan particularmente limitados y que se conocen en la tecnica. Preferiblemente, tales materiales son de vidrio o de un plastico, preferiblemente un plastico, tal como poliestireno, polipropileno, polietileno, tereftalato de polietileno, policicloolefina, poliacrilonitrilo, polimetilmetacrilato y/o mezclas y combinaciones de estos plasticos. En principio, cualquier plastico que, basicamente, no absorba la luz en el rango visible es adecuado. En una realizacion, el plastico tambien se puede tenir de color azul claro, por ejemplo, con el fin de filtrar la emision causada por la luz de dispersion. Preferiblemente, la superficie de arriba es el interior de un recipiente concavo, como una cubeta o un pocillo de una placa de microtitulacion o de un cartucho de prueba, por ejemplo. Tales cubetas, placas de microtitulacion y cartuchos de prueba pueden ser obtenidos economicamente por moldeo por inyeccion y preferiblemente tienen un volumen de reaccion de 1 a 400 |il, especialmente preferido de 5 a 100 |il, y lo mas preferido de 10 a 40 |il. Preferiblemente, las cubetas, placas de microtitulacion o cartuchos de prueba se hacen en
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una sola pieza. En este contexto, la expresion "cartucho de prueba" no se limita espedficamente e incluye cualquier objeto que pueda ser utilizado para proporcionar una superficie sobre la que las plaquetas humanas o fracciones de membrana de plaquetas de la etapa (a) del segundo metodo anterior se unan y se pongan en contacto con las soluciones o reactivos respectivos. Por ejemplo, el cartucho de prueba puede ser un cartucho desechable de medicion de una sola via que contiene varios pocillos de medicion totalmente separados que son pre- acondicionados a las necesidades espedficas de la medicion.
Tal como se utiliza en este aspecto, el termino "unido" preferentemente significa que las plaquetas humanas o fracciones de membrana de plaquetas de la etapa (a) se adhieren a la superficie por absorcion (absorcion directa). Sin embargo, dichas plaquetas humanas o fracciones de membranas de plaquetas tambien se pueden unir a la superficie a traves de un elemento de puente, por ejemplo una protema, tal como un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra un antfgeno de superficie de plaquetas comun tal como gpVI o beta-2-microglobulina. Otra posibilidad sena la de biotinilar las plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas y unirlas a una superficie revestida por avidina o estreptavidina. Dichas plaquetas humanas o fracciones de membranas de plaquetas tambien pueden estar unidas a la superficie por un enlace covalente. Esto puede producirse, por ejemplo, usando una superficie de acrilato mediante la conversion con una carbodiimida. Ademas, el termino "unido" en el sentido de la presente invencion incluye la adhesion a una superficie o a otro ligando, e incluye tanto interacciones covalentes como no covalentes, como, por ejemplo, las interacciones basadas en interacciones ionicas, polares o no polares.
En este aspecto, las plaquetas humanas o fracciones de membrana de plaquetas de la etapa (a) se pueden colocar en la superficie por un metodo comun. Por ejemplo, dichos plaquetas humanas o fracciones de membrana de las plaquetas se pueden aplicar sobre la superficie. Despues de este paso, la superficie se trata preferiblemente con otra solucion, y los sitios en la superficie no adheridos a dicha plaquetas humanas o fracciones de membranas de plaquetas se bloquean o se bloquearan, por ejemplo, por una protema.
Segun el segundo metodo anterior de la presente invencion, las plaquetas o fracciones de membranas de plaquetas de la etapa (a) puede formar un complejo, en el que este complejo al menos incluye, ademas de dichas plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas, el agente de deteccion marcado con fluorescencia de la etapa (c) y el anticuerpo humano dirigido contra un HPA a detectar. Con las plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas de la etapa (a) unidas a la superficie, dicho complejo es "anclado" a la superficie, es decir, fijado a la misma y puede al mismo tiempo ser detectado mediante el marcado con el agente de deteccion marcado con fluorescencia de la etapa
(c) que contiene el fluoroforo.
Las plaquetas humanas o fracciones de membrana de plaquetas de la etapa (a) del segundo metodo anterior no estan particularmente limitadas, las plaquetas humanas o fracciones de membranas de plaquetas proporcionadas se usan, en donde los HPA de interes que estan presentes en dichas plaquetas o fracciones de membranas de plaquetas se conocen. A modo de ejemplo, en los casos en que los anticuerpos dirigidos contra HPA-1a deban ser detectados, las plaquetas humanas o fracciones de membrana de plaquetas que son HPA-1a positivo tienen que ser utilizadas en la etapa (a). Los metodos para obtener plaquetas humanas o fracciones de membrana de plaquetas que llevan HPA conocidos no estan particularmente limitados y se conocen en la tecnica. Una forma de generar fracciones de membrana de plaquetas es, por ejemplo, lisando las plaquetas, por ejemplo, qmmicamente y/o mecanicamente, y purificando las fracciones de membrana en funcion de su solubilidad en tampones acuosos. Una alternativa es purificar las membranas en funcion de su densidad, por ejemplo, por sedimentacion en un campo gravitatorio por ultracentrifugacion. Otro metodo para preparar membranas es por centrifugacion por densidad de sacarosa. En este metodo, se anade sacarosa solida a un lisado de celulas hipotonico a una concentracion de preferiblemente 70%. A continuacion, se centrifuga la mezcla, preferiblemente en una ultracentnfuga y las membranas flotan en la solucion de sacarosa. La concentracion de sacarosa minima que hace flotar a las membranas es 35%, por lo que se pueden preparar gradientes por etapas mediante la superposicion de lisado de sacarosa a 70%, con un colchon de sacarosa al 55% y un colchon de 35% en la parte superior del colchon de 55%. Una alternativa es generar pequenos liposomas membranosos por sonicacion y/o prensa francesa opcionalmente seguido de una etapa de calibrado. En este contexto, la expresion "fracciones de membrana de plaquetas", como se usa en este documento, abarca en algunas realizaciones liposomas derivados de las plaquetas. Medios para generar u obtener liposomas derivados de las plaquetas no estan particularmente limitados y se conocen en la tecnica.
Ademas, el agente de deteccion marcado con fluorescencia de la etapa (c) del segundo metodo anterior no esta particularmente limitado, siempre que pueda unirse espedficamente a anticuerpos humanos dirigidos contra HPA que estan presentes en dichas plaquetas o fracciones de membranas de plaquetas.
En una realizacion particular, dicho agente de deteccion es un anticuerpo marcado con fluorescencia dirigido contra anticuerpos humanos. En esta realizacion, dicho anticuerpo no esta particularmente limitado, y los anticuerpos adecuados son conocidos en la tecnica y pueden ser obtenidos, por ejemplo, comercialmente. Estos anticuerpos no estan restringidos espedficamente en relacion con su isotipo o su origen. Entre los anticuerpos ejemplares en este contexto, podnan estar, por ejemplo, los anticuerpos IgG murinos. Ademas, en esta realizacion, el marcador fluorescente de dicho anticuerpo no esta particularmente restringido, con tal de que pueda emitir luz fluorescente cuando se excita con un campo evanescente de una fuente de luz. Los marcadores fluorescentes adecuados son conocidos en la tecnica. En una realizacion preferida, dicho marcador fluorescente es la alo-ficocianina (APC).
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En otra realizacion particular, el agente de deteccion anterior es plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas marcadas con fluorescencia, en el que dichas plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas llevan los mismos HPA que las plaquetas o fracciones de membranas de plaquetas de la etapa (a). Preferiblemente, dichas plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas son identicas a las plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas de la etapa (a), con la excepcion de que el primero esta marcado con fluorescencia. En esta realizacion, el marcador fluorescente de dichas plaquetas o fracciones de membrana de las plaquetas no esta particularmente limitado, siempre que pueda emitir luz fluorescente cuando se excita con un campo evanescente de una fuente de luz. Los marcadores fluorescentes adecuados son conocidos en la tecnica. En una realizacion preferida, dicho marcador fluorescente es un colorante fluorescente lipofflico que se asocia con las membranas de las plaquetas, por ejemplo, un derivado de carbocianina. Los colorantes lipofilos adecuados y los metodos de marcaje de las plaquetas no estan particularmente limitados y se conocen en la tecnica. Son ejemplos de colorantes de la serie de tintes ebiosience CellVue o los colorantes disponibles de Molecular Probes. Alternativamente, las plaquetas podffan ser marcadas por medio de un anticuerpo marcado con fluorescencia dirigido contra un anffgeno de superficie de las plaquetas, o mediante biotinilacion de las plaquetas o fracciones de membrana de las plaquetas y la interaccion con avidina o estreptavidina marcada con fluorescencia.
En este contexto, es importante tener en cuenta que el segundo metodo anterior utiliza principalmente plaquetas o fragmentos de plaquetas o liposomas derivados de plaquetas todos los cuales tienen en comun la presencia de glicoprotemas nativas que no se desnaturalizan por un proceso ffsico o por la actividad de detergentes para solubilizar. Esto es particularmente importante para las glicoprotemas plaquetarias que por naturaleza a menudo existen en una forma conformacionalmente restringida, y despues de la activacion, tal como mediante un tratamiento ffsico, un acontecimiento de union o tambien por tratamiento con detergente, cambian su conformacion y son consecuentemente de diferente forma a las glicoprotemas nativas que quedan en las plaquetas no activadas en terminos de su funcion y sus caracteffsticas como anffgeno.
Tal como se utiliza en el contexto del agente de deteccion de la etapa (c) del segundo metodo anterior, el termino "anticuerpo" no solo se refiere al anticuerpo respectivo como tal, sino tambien incluye cualquier fragmento y derivado de dicho anticuerpo, siempre que dichos fragmentos conserven la capacidad de unirse espedficamente al mismo epffopo. Los fragmentos respectivos pueden ser fragmentos Fab, fragmentos F(ab') o fragmentos F(ab')2. Ademas, en lugar de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, cualesquiera otras macromoleculas que tengan la capacidad de unirse espedficamente a un epffopo se pueden utilizar. Tales macromoleculas incluyen, por ejemplo, aptameros de nucleotidos, aptameros de peptidos, nanocuerpos, aficuerpos, anticalins, DARPins, Phylomers, AdNectins y protema A.
Los anticuerpos humanos dirigidos contra HPA que se detectan en el segundo metodo anterior no estan particularmente limitados y se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en anticuerpos IgG, anticuerpos IgA, anticuerpos IgE, y anticuerpos IgM. En este contexto, los anticuerpos que se detectan con dicho metodo son principalmente aloanticuerpos. De esta manera, una terapia puede ser dirigida por la eleccion de las plaquetas correctas de la etapa (a). Sin embargo, dichos anticuerpos pueden tambien ser auto-anticuerpos, en el que el perfil alo-antigenico presentado en la etapa (a) no es relevante. Los respectivos auto-anticuerpos son la causa de PTP donde un anticuerpo anti-HPA-la preformado, ffpicamente derivado de un embarazo, se somete a evolucion y se convierte en un auto-anticuerpo.
En el segundo metodo anterior, las etapas (b) y (c) pueden llevarse a cabo posteriormente o al mismo tiempo. En particular, en una realizacion preferida, el agente de deteccion marcado con fluorescencia de la etapa (c) se puede combinar con la muestra, opcionalmente diluida, antes de que la superficie se ponga en contacto, de manera que las etapas (b) y (c) se ejecutan simultaneamente, cuando la solucion respectiva se pone en contacto con la superficie. En consecuencia, la superficie solo tiene que ponerse en contacto con la muestra, opcionalmente diluida, de manera que las etapas (b) y (c) se ejecutan simultaneamente.
Segun una realizacion preferida, el segundo metodo anterior no requiere mas de dos, mas preferiblemente mas de una, etapas de manipulacion de lfquidos. En este contexto, la expresion "etapa de manipulacion de lfquidos", como se usa en este documento, generalmente incluye cualquier etapa que transfiera, elimine o anada un ifquido desde y/o hacia un sitio de accion. Por ejemplo, las etapas de manipulacion de lfquidos de acuerdo con la presente invencion incluyen la adicion, por ejemplo, pipeteando, un lfquido en el pocillo de una cubeta, una placa de microtitulacion o un cartucho de ensayo, o la eliminacion de un ffquido de un tal pocillo. Ademas, de acuerdo con otra realizacion preferida, el segundo metodo anterior no incluye ninguna etapa de lavado.
En particular, el segundo metodo anterior preferiblemente no requiere ninguna etapa de retirar el volumen que contiene los reactivos en exceso, tales como el agente de deteccion marcado con fluorescencia de la etapa (c), y/o el lavado de la superficie en la que las plaquetas o las fracciones de membrana de las plaquetas de la etapa (a) y/o el complejo a medir estan unidos. Esto acelera ventajosamente el segundo metodo anterior para obtener rapidamente los resultados de las mediciones deseadas, evita la acumulacion de residuos lfquidos y los errores operacionales al llevar a cabo el metodo.
En este contexto, en una realizacion adicional de la presente invencion, el segundo metodo como se define anteriormente es un metodo de una sola etapa. Segun la presente invencion, metodo de "una sola etapa" significa
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Por otra parte, una realizacion adicional de la presente invencion se refiere a un metodo como se define anteriormente, en donde dicho metodo no incluye la agitacion del lfquido. En este contexto, la expresion "agitacion del Kquido" no esta limitada espedficamente e incluye cualquier tipo de agitacion que se produzca en el lfquido, a excepcion de la difusion natural. Por ejemplo, la agitacion del lfquido en el sentido de la presente invencion incluye agitacion, bombeo, centrifugacion, agitacion ultrasonica, etc. Al evitar cualquier agitacion del lfquido, a excepcion de la difusion natural que ocurre, el metodo puede llevarse a cabo de una manera simple y eficaz, y por lo tanto evitar configuraciones tecnicas complicadas incluyendo los dispositivos de agitacion respectivos.
De acuerdo con una realizacion adicional del segundo metodo anteriormente definido, el resultado determinado en la etapa (f) se obtiene en 30 minutos, preferiblemente 20 minutos, mas preferiblemente 10 minutos o menos a partir del inicio de la etapa (b). Segun la presente invencion, se obtiene el resultado cualitativo o cuantitativo en 30 minutos, preferiblemente 20 minutos, mas preferiblemente 10 minutos o menos despues de que la solucion que contiene la muestra y el agente de deteccion marcado con fluorescencia de la etapa (c) se hayan puesto en contacto con la superficie a la que se unen las plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas de la etapa (a). Preferiblemente, el resultado se obtiene en 9 minutos o menos, 8 minutos o menos o 7 minutos o menos. Otros ejemplos incluyen penodos de 6 minutos o menos, 5 minutos o menos o 4 minutos o menos.
De acuerdo con una realizacion adicional del segundo metodo anterior, dicha superficie se pone en contacto antes de la etapa (d) con al menos un colorante que absorbe en el intervalo de absorcion y/o emision del marcador fluorescente del agente de deteccion de la etapa (c). Segun la presente invencion, la excitacion del fluoroforo en el volumen, es decir, del fluoroforo que no forma parte del complejo unido a la superficie, se puede suprimir si la solucion que se coloca en contacto con la superficie tiene al menos un colorante anadido a la misma que tiene una absorcion en el intervalo de absorcion y/o emisiones de dicho fluoroforo. La absorcion del colorante anadido al volumen se coordina con el intervalo de absorcion y/o emision de dicho fluoroforo. Un colorante individual o una mezcla de colorantes se puede utilizar. El intervalo de absorcion del fluoroforo se correlaciona generalmente con la longitud de onda de la fuente de luz utilizada. No es necesario que el colorante tenga un maximo de absorcion en este intervalo especial; un hombro en el espectro de absorcion puede ser suficiente. Por ejemplo, si se utilizan fluoroforos como APC o Cy5, el colorante utilizado puede tener la absorcion entre 600 nm y 700 nm, como por ejemplo Brilliant Blue FCF. Otro ejemplo de un colorante que se puede utilizar a este respecto es Brilliant Black Bn. La concentracion de colorante anadido depende tanto del coeficiente de absorcion de cada colorante en solucion como de la frecuencia de la luz irradiada. La concentracion de colorante puede ajustarse, dependiendo del colorante, de modo que la luz que penetra, basicamente, puede ser absorbida en un grado de mas del 90% de absorbancia en 0,1 mm por encima de la superficie.
De acuerdo con las etapas (d) a (f) del segundo metodo anterior, el complejo unido a la superficie generado en la etapa (a) a (c) de dicho metodo es excitado con un campo evanescente de una fuente de luz, la fluorescencia emitida a partir de dicho complejo se mide, y los anticuerpos humanos contra el HPA de interes se detectan basado en la fluorescencia emitida medida, en el que una senal de fluorescencia positiva indica la presencia de dicho complejo y, por tanto, la presencia de anticuerpos humanos dirigidos contra el HPA de interes.
En este contexto, la expresion "fuente de luz", como se usa en el presente documento, no se limita espedficamente e incluye cualquier fuente de luz que sea adecuada para crear un campo evanescente y excitar el fluoroforo unido al agente de deteccion de la etapa (c). Por ejemplo, la luz monocromatica se puede usar como la fuente de luz. La luz debe ser utilizada con una longitud de onda que preferiblemente no interfiera con la emision del fluoroforo y, preferiblemente, que se cruce con la banda de absorcion del colorante. Un laser es especialmente preferido como fuente de luz, cuya luz emite una longitud de onda de 635 nm.
El segundo metodo anterior de la presente invencion se basa en una nueva tecnologfa para el analisis de biomoleculas mediante la excitacion del campo evanescente de fluoroforos unidos y la medicion directa de los eventos de union en tiempo real como se describe en las patentes europeas EP 1 079 226 B1, EP 1 204 856 B1 y EP 1 371 967 B1. El principio funcional de este biosensor de campo evanescente es la interaccion de un analito unido a la superficie con un ligando en solucion mediante una interaccion no covalente. El ligando en solucion se une covalentemente a una molecula fluorescente. La excitacion preferida de la molecula fluorescente es coherente con la luz, tal como la generada, por ejemplo, por un diodo laser y luego se detectan los fotones emitidos. Los fluoroforos adecuados para ello son, por ejemplo, los colorantes Cy5, Alexa o la protema captadora de luz alo- ficocianina (APC).
La reaccion bioqmmica se lleva a cabo en un pequeno pocillo, similar a un pocillo ELISA en forma y dimensiones con una entidad optica adicional en la parte inferior. Como en el ELISA, el pocillo del biosensor y su parte inferior optica se producen mediante el moldeo por inyeccion de material termoplastico, como, por ejemplo, poliestireno. Las principales diferencias entre el metodo ELISA y los metodos de biosensores de evanescencia son los marcadores del ligando en solucion. Para el ELISA, el marcador es una enzima y para la tecnologfa de evanescencia el ligando
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esta marcado con una molecula fluorescente. La medicion de la fluoroforo unido, es dedr, el ligando fluorescente en solucion que se une al analito inmovilizado en la superficie evanescente, se logra mediante la excitacion espedfica del ligando marcado de manera fluorescente unido utilizando el principio de excitacion de campo evanescente. La excitacion selectiva del fluoroforo unido se produce por un campo evanescente de luz utilizando una construccion optica resultante en una excitacion espedfica de una capa gruesa de aproximadamente 200 nm de lfquido situada en el fondo del pocillo y no excitante del ligando marcado de manera fluorescente en exceso presente en la solucion por encima de la superficie de union. Solo los ligandos marcados con fluorescencia que residen en el campo evanescente se excitan y emiten fotones. Este metodo permite la observacion de una reaccion de union del ligando soluble con el ligando inmovilizado en tiempo real.
Aunque la mayona de los ensayos inmunologicos utilizados en pruebas diagnosticas in vitro tienen un procedimiento largo y tedioso que implica tiempos de incubacion, lavados, adicion de reactivos o soluciones secundarias o terciarias para obtener un resultado de un biomarcador, el biosensor de evanescencia permite realizar ensayos diagnosticos in vitro en poco tiempo. La instrumentacion compleja y costosa de la automatizacion del ELISA para ensayos inmunologicos basados en perlas no se requiere ni es necesaria cuando se utiliza el biosensor de evanescencia para aplicaciones de diagnostico.
El segundo metodo anterior se pone en practica usando un segundo dispositivo de prueba de diagnostico que comprende al menos una superficie que tiene al menos las plaquetas humanas o fracciones de membrana de plaquetas de la etapa (a) unidas a la misma, en el que los HPA que estan presentes en dichas plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas son conocidos.
En este aspecto, la superficie, las plaquetas humanas o fracciones de membrana de plaquetas de la etapa (a), y el agente de deteccion marcado con fluorescencia de la etapa (c) son como se define anteriormente. Ademas, las definiciones dadas anteriormente se aplican tambien a este aspecto.
Sorprendentemente e inesperadamente, cuando se consideran las dimensiones geometricas de un campo evanescente y las dimensiones de las plaquetas tfpicas, siendo el campo evanescente 200 nm de altura y las plaquetas utilizadas para el recubrimiento de la superficie de deteccion con un diametro de 1 a 4 micrometros, todavfa se puede observar una serial. Solo una minona de las plaquetas recubiertas y la membrana de las plaquetas se encuentran dentro del campo evanescente y, por lo tanto, pueden absorber y por consiguiente emitir senales fluorescentes, mientras que la mayona de las plaquetas de 2-3 micrometros y los antfgenos de la superficie de las plaquetas estan fuera del campo evanescente. Esto indica una bastante alta estabilidad del sistema hacia las dimensiones del analito biologico. Ademas, de nuevo hay que senalar que las plaquetas recubiertas y los fragmentos de plaquetas son ricos en enzimas y actividades enzimaticas tales como peroxidasas y fosfatasa, que son enzimas utilizadas comunmente como marcadores para las pruebas de ELISA. Sin embargo, la deteccion de fluorescencia utilizando excitacion evanescente evita cualquier problema que pudiera resultar de esas enzimas contaminantes por completo.
Preferiblemente, el segundo dispositivo de prueba de diagnostico anterior tiene la forma de una cubeta, placa de microtitulacion o cartucho de prueba, estando hecho preferentemente de vidrio o de un plastico, preferiblemente un plastico, tal como poliestireno, polipropileno, polietileno, tereftalato de polietileno, policicloolefina, poliacrilonitrilo, polimetilmetacrilato y/o mezclas y combinaciones de estos plasticos. En principio, cualquier plastico que, basicamente no absorba la luz en el intervalo visible es adecuado. El plastico tambien se puede tenir de color azul claro, por ejemplo, con el fin de filtrar una emision causada por la luz de dispersion. Las cubetas de plastico, placas de microtitulacion y los cartuchos de prueba pueden ser obtenidos economicamente por moldeo por inyeccion y preferiblemente tienen un volumen de reaccion de 1 a 400 |il, especialmente preferido de 5 a 100 |il, y lo mas preferido de 10 a 40 |il. Preferiblemente, las cubetas, placas de microtitulacion o cartuchos de prueba de la presente invencion se hacen en una sola pieza.
En este contexto, la expresion "cartucho de prueba" no se limita espedficamente e incluye cualquier objeto que pueda ser utilizado para proporcionar una superficie sobre la que se unan las plaquetas humanas o fracciones de membrana de las plaquetas de la etapa (a) y que pueda ponerse en contacto con las respectivas soluciones o reactivos. Por ejemplo, el cartucho de prueba puede ser un cartucho desechable de medicion de una sola via, que contenga varios pocillos de medicion totalmente separados, que son pre-acondicionados a las necesidades espedficas de medicion.
En este contexto, ya que el cartucho de prueba tfpico tiene multiples pocillos, varios ensayos se pueden ejecutar en paralelo.
En otro aspecto, los metodos de la presente invencion se ponen en practica en combinacion con un tercer metodo para la deteccion de anticuerpos humanos dirigidos contra los aloantfgenos de plaquetas humanas (HPA), en una muestra, que comprende las etapas:
(a) realizar al menos un ensayo de inmovilizacion de anticuerpo monoclonal de antfgeno de plaquetas (MAIPA) para generar al menos un complejo tri-molecular hecho de al menos una glicoprotema de plaquetas que lleva el HPA de interes, al menos un anticuerpo dirigido contra dicha al menos una glicoprotema de plaquetas, y un anticuerpo
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humano de interes dirigido contra dicho HPA, en el que dicho anticuerpo humano se ha contenido en dicha muestra;
(b) proporcionar al menos una superficie con al menos un anticuerpo dirigido contra dicho al menos un anticuerpo dirigido contra dicha al menos una glicoprotema de plaquetas unida a la misma;
(c) poner en contacto dicha superficie con dicho complejo tri-molecular, en el que dicho complejo tri-molecular es inmovilizado en dicha superficie por unirse espedficamente al anticuerpo de la etapa (b);
(d) poner en contacto dicha superficie con un anticuerpo marcado con fluorescencia dirigido contra anticuerpos humanos, en el que dicho anticuerpo marcado con fluorescencia, dicho complejo tri-molecular, y el anticuerpo de la etapa (b) forman un complejo unido a la superficie;
(e) excitar dicho complejo unido a la superficie con un campo evanescente de una fuente de luz;
(f) medir la fluorescencia emitida a partir de dicho complejo unido a la superficie; y
(g) detectar los anticuerpos humanos dirigidos contra dichos HPA en base a la fluorescencia emitida medida en la etapa (f).
En este aspecto, el termino "deteccion" no se limita espedficamente y no solo incluye la medicion cualitativa de anticuerpos humanos dirigidos contra HPA de interes, sino que incluye expresamente la determinacion cuantitativa de los mismos. En este contexto, "cualitativa", como se usa en la presente memoria, significa una determinacion de la presencia o ausencia de un anticuerpo de interes dentro de una muestra espedfica, mientras que el termino "cuantitativa", como se usa en este documento, significa una medida del contenido o la cantidad de un anticuerpo que se detecta dentro de una muestra espedfica.
Los anticuerpos que se detectan con el tercer metodo anterior no estan particularmente limitados e incluyen cualquiera de los anticuerpos dirigidos contra un HPA. Preferiblemente, dicho HPA se selecciona del grupo que consiste en HPA-1a, HPA-1b, HPA-2a, HPA-2b, HPA-3a, HPA-3b, HPA-4a, HPA-4b, HPA-5a, HPA-5b , HPA-6a, HPA-6b, HPA-7a, HPA-7b, HPA-8a, HPA-8b, HPA-9a, HPA-9b, HPA-10a, HPA-10b, HPA-11a, HPA-11b, HPA-12A, HPA-12b, HPA-13a, HPA-13b, HPA-14a, HPA-14b, HPA-15a, y HPA-15b. Mas preferiblemente, dicho HPA se selecciona del grupo que consiste en HPA-1a, HPA-1b, HPA-3a, HPA-3b, HPA-4a, HPA-4b, HPA-5a, y HPA-5b. Aun mas preferiblemente, dicho HPA se selecciona del grupo que consiste en HPA-1a y HPA-5b, es decir, se detectan anticuerpos dirigidos contra HPA-1a y/o HPA-5b.
De acuerdo con el tercer metodo anterior, los anticuerpos dirigidos contra un HPA o mas HPA se detectan, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o mas anticuerpos dirigidos contra diferentes HPA. En estas realizaciones, mas de un ensayo MAIPA se lleva a cabo en la etapa (a), y un numero de acuerdo de las superficies se proporciona en la etapa (b), por ejemplo, cuando los anticuerpos contra dos HPA son para ser detectados, se proporcionan dos superficies. Ademas, todas las superficies proporcionadas en la etapa (b) se ponen en contacto en las etapas (c) y (d). Ademas, todos los complejos unidos a la superficie son excitados en la etapa (e), medidos en la etapa (f), y todos los anticuerpos respectivos se detectan en la etapa (g).
Un ensayo MAIPA es tambien util para la deteccion de auto-anticuerpos, lo que esta tambien dentro del alcance de la presente invencion. Las plaquetas de los pacientes se examinan para IgG humana unida con solo la sensibilizacion con anticuerpos monoclonales de raton, a continuacion, lavando y solubilizando el complejo trimolecular.
Alternativamente, un ensayo MAIPA se puede realizar en la etapa (a) que utiliza no solo un anticuerpo dirigido contra una glicoprotema de plaquetas, sino 2, 3, 4 o mas anticuerpos dirigidos contra un numero respectivo de glicoprotemas de plaquetas. A modo de ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra gpllbllla, gplalla, gpIbIX y HLA/beta-2-microglobulina se pueden utilizar en una reaccion, por lo que los complejos tri-moleculares entre dichos anticuerpos, todas las glicoprotemas respectivas, y todos los anticuerpos humanos contenidos en la muestra que se dirigen contra los HPA que estan presentes en dichas glicoprotemas se forman en una reaccion. Estos complejos tri- moleculares pueden entonces analizarse despues en el tercer metodo anterior.
En este contexto, el ensayo MAIPA y las maneras de generar los respectivos complejos tri-moleculares utilizando dicho ensayo no estan particularmente limitados y se conocen en la tecnica. Preferiblemente, dicho ensayo MAIPA comprende las etapas:
(a1) poner en contacto las plaquetas humanas o fracciones de membranas de plaquetas con al menos un anticuerpo dirigido contra al menos una glicoprotema de plaquetas que lleve al menos un HPA;
(a2) poner en contacto dicha plaquetas humanas o fracciones de membrana de las plaquetas con dicha muestra, en donde los anticuerpos humanos dirigidos contra dichos HPA, contenidos en dicha muestra, se unen a dicho HPA;
(a3) lisar dichas plaquetas en el caso que se utilicen las plaquetas; y
(a4) solubilizar al menos un complejo tri-molecular hecho de dicha al menos una glicoprotema de plaquetas, dichos anticuerpos humanos, y dicho anticuerpo de la etapa (a1).
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En este contexto, la lisis de las plaquetas y la solubilizacion de al menos un complejo tri-molecular puede efectuarse como se describe anteriormente en el primer metodo de la presente invencion para la lisis de las plaquetas y la solubilizacion de las protemas de membrana. Ademas, en una realizacion preferida, el anticuerpo de la etapa (a1) y el anticuerpo humano de la etapa (a2) tienen diferentes especificidades, es decir, se unen a diferentes epftopos.
La muestra a ser analizada en el tercer metodo anterior no esta particularmente limitada, siempre y cuando sea una muestra que contenga o se sospeche que contenga anticuerpos contra HPA. Preferiblemente, dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en plasma sangumeo y suero sangumeo.
Las expresiones "poner en contacto la superficie" o "poner en contacto dicha superficie", tal como se utiliza en este aspecto, tienen la intencion de referirse a la puesta en contacto de las superficies que estan saturadas, por ejemplo, con anticuerpos, agentes de bloqueo, o complejos que pueden aparecer en los metodos de la presente invencion. Una persona experta en la tecnica entendera que, por ejemplo, en la etapa (c) del tercer metodo anterior, el complejo tri-molecular en realidad no esta en contacto con la superficie, sino los anticuerpos de la etapa (b) u, opcionalmente, agentes de bloqueo que se unen a la misma, ya que dicha superficie se satura con dichos anticuerpos y opcionalmente con agentes de bloqueo, y, por lo tanto, no esta realmente accesible. Sin embargo, los terminos anteriores se eligen para reflejar el punto de vista macroscopico de un medico que trabaja la presente invencion, que simplemente va a ver una superficie, y sabra lo que realmente esta unido a dicha superficie en cualquier punto dado.
Las superficies proporcionadas en el tercer metodo anterior estan hechas de materiales que no estan particularmente limitadas y se conocen en la tecnica. Preferiblemente, tales materiales son de vidrio o de un plastico, preferiblemente un plastico, tal como poliestireno, polipropileno, polietileno, tereftalato de polietileno, policicloolefina, poliacrilonitrilo, polimetilmetacrilato y/o mezclas y combinaciones de estos plasticos. En principio, cualquier plastico que, basicamente, no absorba la luz en el rango visible es adecuado. El plastico tambien se puede tenir de color azul claro, por ejemplo, con el fin de filtrar una emision causada por la luz de dispersion. Preferiblemente, la superficie de arriba es el interior de un recipiente concavo, como una cubeta o un pocillo de una placa de microtitulacion o de un cartucho de prueba, por ejemplo. Tales cubetas, placas de microtitulacion y los cartuchos de prueba pueden ser obtenidos economicamente por moldeo por inyeccion y preferiblemente tienen un volumen de reaccion de 1 a 400 |il, especialmente preferido de 5 a 200 |il, y lo mas preferido de 10 a 40 |il. Preferiblemente, las cubetas, placas de microtitulacion o cartuchos de prueba se hacen en una sola pieza. En este contexto, la expresion "cartucho de prueba" no se limita espedficamente e incluye cualquier objeto que pueda ser utilizado para proporcionar una superficie sobre en la que se unan los anticuerpos de la etapa (b) del tercer metodo anterior y que se pondra en contacto con las soluciones o reactivos respectivos. Por ejemplo, el cartucho de prueba puede ser un cartucho desechable de medicion de una sola via, que contiene varios pocillos de medicion totalmente separados, que son pre-acondicionados a las necesidades espedficas de medicion.
Tal como se utiliza en este aspecto, el termino "unido" significa preferiblemente que el anticuerpo de la etapa (b) se adhiere a la superficie mediante absorcion (absorcion directa). Sin embargo, dicho anticuerpo tambien se puede unir a la superficie a traves de un elemento de puente, por ejemplo una protema, tal como un anticuerpo adicional o un antfgeno. Dicho anticuerpo tambien puede unirse a la superficie por un enlace covalente. Esto puede ser, por ejemplo, producido usando una superficie de acrilato mediante la conversion con una carbodiimida. Ademas, el termino "unido" en el sentido de la presente invencion incluye la adhesion a una superficie o a otro ligando, e incluye tanto interacciones covalentes como no covalentes, como por ejemplo las interacciones basadas en interacciones ionicas, polares o no polares.
En este aspecto, el anticuerpo de la etapa (b) se puede colocar en la superficie por un metodo comun. Por ejemplo, dicho anticuerpo se puede recubrir en la superficie. Despues de este paso, la superficie se trata preferiblemente con otra solucion, y los sitios en la superficie no adheridos a dicho anticuerpo se bloquean o se bloquearan, por ejemplo, mediante otra protema.
De acuerdo con el tercer metodo anterior, el anticuerpo de la etapa (b) puede formar un complejo, en el que este complejo al menos incluye, ademas de dicho anticuerpo, el complejo tri-molecular generado en la etapa (a), y el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa (d). Con el anticuerpo de la etapa (b) unido a la superficie, el complejo con dicho complejo tri-molecular generado en la etapa (a) es "anclado" a la superficie, es decir, fijado a la misma y puede al mismo tiempo ser detectado mediante el marcado con el anticuerpo de la etapa (d) que contiene el fluoroforo.
El anticuerpo de la etapa (b) del tercer metodo anterior no esta particularmente limitado, con tal de que se dirija contra al menos un anticuerpo dirigido contra dicha al menos una glicoprotema de plaquetas, es decir, a condicion de que se una espedficamente a dicho anticuerpo. Los anticuerpos adecuados se conocen en la tecnica y pueden ser obtenidos, por ejemplo, comercialmente. Estos anticuerpos no estan restringidos espedficamente en relacion con su isotipo o su origen. Entre los anticuerpos ejemplares en este contexto, podnan estar, por ejemplo, anticuerpos IgG murinos.
Ademas, el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa (d) del tercer metodo anterior no esta particularmente limitado, siempre que se dirija contra anticuerpos humanos, es decir, a condicion de que se una espedficamente a
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dichos anticuerpos humanos. Los anticuerpos adecuados no estan restringidos espedficamente en relacion con su isotipo y origen, y son conocidos en la tecnica. Ademas, el marcador fluorescente de dicho anticuerpo no esta particularmente restringido, siempre que pueda emitir luz fluorescente cuando se excite con un campo evanescente de una fuente de luz. Los marcadores fluorescentes adecuados son conocidos en la tecnica. En una realizacion preferida, dicho marcador fluorescente es alo-ficocianina (APC).
En una realizacion particular del tercer metodo anterior, el anticuerpo de la etapa (b) y el anticuerpo de la etapa (d) se pueden intercambiar; es decir, el anticuerpo de la etapa (b) se dirige contra los anticuerpos humanos, y el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa (d) se dirige contra al menos un anticuerpo dirigido contra al menos una glicoprotema. En esta realizacion particular, dichos anticuerpos, asf como el marcador fluorescente, son como se definen anteriormente.
Tal como se utiliza en el contexto de los anticuerpos de las etapas anteriores (b), (d), y (a1) del tercer metodo anterior, el termino "anticuerpo" no solo se refiere al anticuerpo respectivo como tal, sino que tambien incluye cualquier fragmentos y derivados de dicho anticuerpo, siempre que dichos fragmentos conserven la capacidad de unirse espedficamente al mismo epftopo. Los fragmentos respectivos pueden ser fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), o fragmentos F(ab')2. Ademas, en lugar de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, cualesquiera otras macromoleculas que tengan la capacidad de unirse espedficamente a un epftopo se pueden utilizar. Tales macromoleculas incluyen, por ejemplo, aptameros de nucleotidos, aptameros de peptidos, nanocuerpos, aficuerpos, anticalins, DARPins, Phylomers, AdNectins y protema A.
Los anticuerpos humanos dirigidos contra HPA que se detectan en el tercer metodo anterior no estan particularmente limitados y se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en anticuerpos IgG, anticuerpos IgA, anticuerpos IgE, y los anticuerpos IgM.
En el tercer metodo anterior, las etapas (c) y (d) pueden llevarse a cabo posteriormente o al mismo tiempo. En particular, en una realizacion preferida, el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa (d) se puede combinar con la solucion que contiene el al menos complejo tri-molecular formado en la etapa (a) antes de que se ponga en contacto la superficie, de modo que las etapas (c) y (d) se ejecutan simultaneamente, cuando la solucion respectiva se pone en contacto con la superficie. De acuerdo con ello, la superficie tiene solo que ser puesta en contacto con la solucion que contiene al menos el complejo tri-molecular formado en la etapa (a), de modo que las etapas (c) y (d) se realizan simultaneamente.
De acuerdo con una realizacion preferida, el tercer metodo anterior no requiere mas de dos, mas preferiblemente mas de una, etapas de manipulacion de ftquidos. En este contexto, la expresion "etapa de manipulacion de ftquidos", como se usa en este documento, generalmente incluye cualquier etapa que transfiera, elimine o anada un ftquido desde y/o hacia un sitio de accion. Por ejemplo, las etapas de manipulacion de ftquidos de acuerdo con la presente invencion incluyen la adicion, por ejemplo, pipeteando un ftquido en el pocillo de una cubeta, una placa de microtitulacion o un cartucho de ensayo, o eliminando un ftquido de un tal pocillo. Ademas, de acuerdo con otra realizacion preferida, el tercer metodo anterior de la presente invencion no incluye ninguna etapa de lavado.
En particular, el tercer metodo anterior preferiblemente no requiere de etapas de retirar el volumen que contiene los reactivos en exceso, tales como el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa (d), y/o el lavado de la superficie en la que los anticuerpos de la etapa (b) y/o el complejo a medir estan unidos. Esto acelera ventajosamente el tercer metodo anterior para obtener rapidamente los resultados de las mediciones deseadas, evita la acumulacion de residuos ftquidos y los errores operacionales al llevar a cabo el metodo.
En este contexto, en una realizacion adicional de la presente invencion, el tercer metodo como se define anteriormente es un metodo de una sola etapa. Segun la presente invencion, un metodo de "una sola etapa" significa que solo una reaccion de formacion de complejo se lleva a cabo, lo que generalmente requiere solo una o, como mucho, dos etapas de manipulacion de ftquidos que se llevan a cabo por el operador con el fin de obtener el resultado de la medicion deseada. Por lo tanto, etapas adicionales de reaccion, tales como la adicion de mas reactivos despues de la formacion del complejo inicial, se evitan ventajosamente.
Por otra parte, una realizacion adicional de la presente invencion se refiere a un metodo como se define anteriormente, en donde dicho metodo no incluye la agitacion del ftquido. En este contexto, la expresion "agitacion del ftquido" no esta limitada espedficamente e incluye cualquier tipo de agitacion que se produzca en el ftquido, a excepcion de la difusion natural. Por ejemplo, la agitacion del ftquido en el sentido de la presente invencion incluye agitacion, bombeo, centrifugacion, agitacion ultrasonica, etc. Al evitar cualquier agitacion del ftquido, a excepcion de la difusion natural que ocurre, el metodo puede llevarse a cabo de una manera simple y eficaz, y por lo tanto evita configuraciones tecnicas complicadas incluyendo los dispositivos de agitacion respectivos.
De acuerdo con una realizacion adicional del tercer metodo anteriormente definido, el resultado determinado en la etapa (g) se obtiene a los 30 minutos, preferiblemente 20 minutos, mas preferiblemente 10 minutos o menos a partir del inicio de la etapa (c). Segun la presente invencion, se obtiene el resultado cualitativo o cuantitativo a los 30 minutos, preferiblemente 20 minutos, mas preferiblemente 10 minutos o menos despues de que la solucion que contiene la muestra y el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa (d) se hayan puesto en contacto con la
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De acuerdo con una realizacion adicional del tercer metodo anterior, dicha superficie se pone en contacto antes de la etapa (e) con al menos un colorante que absorbe en el intervalo de absorcion y/o emision del marcador fluorescente del anticuerpo de la etapa (d). Segun la presente invencion, la excitacion del fluoroforo en el volumen, es decir, del fluoroforo que no forma parte del complejo unido a la superficie, se puede suprimir si la solucion a ser colocada en contacto con la superficie tiene al menos un colorante anadido a la misma que tiene una absorcion en el intervalo de absorcion y/o emisiones de dicho fluoroforo. La absorcion del colorante anadido al volumen se coordina con el intervalo de absorcion y/o emision de dicho fluoroforo. Se puede utilizar un colorante individual o una mezcla de colorantes. El intervalo de absorcion del fluoroforo se correlaciona generalmente con la longitud de onda de la fuente de luz utilizada. No es necesario que el colorante tenga un maximo de absorcion en este intervalo especial; un hombro en el espectro de absorcion puede ser suficiente. Por ejemplo, si se utilizan fluoroforos como APC o Cy5, el colorante utilizado puede tener absorcion entre 600 nm y 700 nm, como, por ejemplo, Brilliant Blue FCF. Otro ejemplo de un colorante que se puede utilizar a este respecto es Brilliant Black BN. La concentracion de colorante anadido depende tanto del coeficiente de absorcion de cada colorante en solucion como de la frecuencia de la luz irradiada. La concentracion de colorante puede ajustarse, dependiendo del colorante, de modo que la luz que penetra, basicamente, puede ser absorbida en un grado de mas del 90% de absorbancia a 0,1 mm por encima de la superficie.
De acuerdo con las etapas (e) a (g) del tercer metodo anterior, el complejo unido a la superficie generado en las etapas (a) a (d) de dicho metodo se excita con un campo evanescente de una fuente de luz, la fluorescencia emitida a partir de dicho complejo se mide, y los anticuerpos humanos contra el HPA de interes se detectan basado en la fluorescencia emitida medida, en el que una senal de fluorescencia positiva indica la presencia de dicho complejo y, por tanto, la presencia de anticuerpos humanos dirigidos contra el HpA de interes.
En este contexto, la expresion "fuente de luz", como se usa en el presente documento, no se limita espedficamente e incluye cualquier fuente de luz que sea adecuada para crear un campo evanescente y excitar el fluoroforo unido al anticuerpo de la etapa (d). Por ejemplo, la luz monocromatica se puede usar como fuente de luz. La luz debe ser utilizada para que tenga una longitud de onda que preferiblemente no interfiera con la emision del fluoroforo y que, preferiblemente, se cruce con la banda de absorcion del colorante. Un laser es especialmente preferido como fuente de luz, cuya luz emite una longitud de onda de 635 nm.
El tercer metodo anterior se basa en una nueva tecnologfa para el analisis de biomoleculas mediante la excitacion de campo evanescente de fluoroforos unidos y la medicion directa de los eventos de union en tiempo real como se describe en las patentes europeas EP 1 079 226 B1, EP 1 204 856 B1 y EP 1 371 967 B1. El principio funcional de este biosensor de campo evanescente es la interaccion de un analito unido a la superficie con un ligando en solucion mediante una interaccion no covalente. El ligando en solucion se une covalentemente a una molecula fluorescente. La excitacion preferida de la molecula fluorescente es coherente con la luz tal como se genera, por ejemplo, por un diodo laser y luego se detectan los fotones emitidos. Los fluoroforos adecuados para ello son, por ejemplo, colorantes Cy5, Alexa o la protema captadora de luz alo-ficocianina (APC).
La reaccion bioqmmica se lleva a cabo en un pequeno pocillo, similar a un pocillo de ELISA en forma y dimensiones con una entidad optica adicional en la parte inferior. Como en el ELISA, el pocillo del biosensor y su parte inferior optica se producen mediante moldeo por inyeccion de material termoplastico, como, por ejemplo, poliestireno. Las principales diferencias entre el metodo de ELISA y los metodos de biosensores por evanescencia son los marcadores del ligando en solucion. Para el ELISA, el marcador es una enzima y para la tecnologfa de evanescencia el ligando esta marcado con una molecula fluorescente. La medicion del fluoroforo unido, es decir, el ligando fluorescente en solucion que se une al analito inmovilizado en la superficie evanescente, se logra mediante la excitacion espedfica del ligando marcado de manera fluorescente unido utilizando el principio de excitacion de campo evanescente. La excitacion selectiva del fluoroforo unido se produce por un campo evanescente de la luz utilizando una construccion optica resultante en una excitacion espedfica de una capa gruesa de aproximadamente 200 nm de lfquido situada en el fondo del pocillo y que no excita al ligando marcado de manera fluorescente en exceso presente en la solucion por encima de la superficie de union. Solo ligandos marcados con fluorescencia que se encuentran en el campo evanescente se excitan y emiten fotones. Este metodo permite la observacion de una reaccion de union del ligando soluble con el ligando inmovilizado en tiempo real.
Aunque la mayona de los ensayos inmunologicos utilizados en pruebas diagnosticas in vitro tienen un procedimiento largo y tedioso que implica tiempos de incubacion, lavados, adicion de reactivos o soluciones secundarias o terciarias para obtener un resultado de un biomarcador, el biosensor de evanescencia permite realizar ensayos diagnosticos in vitro en poco tiempo. La instrumentacion compleja y costosa de la automatizacion de ELISA o para ensayos inmunologicos basados en perlas no es requerida ni necesaria cuando se utiliza el biosensor de evanescencia para aplicaciones de diagnostico.
El tercer metodo anterior puede llevarse a cabo usando un tercer dispositivo de prueba de diagnostico que comprende al menos una superficie que tiene al menos el anticuerpo de la etapa (b) unido a la misma.
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En este aspecto, la superficie, el anticuerpo de la etapa (b), y el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa
(d) se definen como antes. Ademas, las definiciones dadas anteriormente se aplican solo a este aspecto.
Preferiblemente, el tercer dispositivo de prueba de diagnostico anterior tiene la forma de una cubeta, placa de microtitulacion o cartucho de prueba, estando preferentemente hecho de vidrio o de un plastico, preferiblemente un plastico, tal como poliestireno, polipropileno, polietileno, tereftalato de polietileno, policicloolefina, poliacrilonitrilo, polimetilmetacrilato y/o mezclas y combinaciones de estos plasticos. En principio, cualquier plastico que, basicamente, no absorba la luz en el rango visible es adecuado. El plastico tambien se puede tenir de color azul claro, por ejemplo, con el fin de filtrar una emision causada por la luz de dispersion. Las cubetas de plastico, placas de microtitulacion y los cartuchos de prueba pueden ser obtenidos economicamente por moldeo por inyeccion y preferiblemente tienen un volumen de reaccion de 1 a 400 |il, especialmente preferido de 5 a 200 |il, y lo mas preferido de 10 a 40 |il. Preferiblemente, las cubetas, placas de microtitulacion o cartuchos de prueba se hacen en una sola pieza.
En este contexto, la expresion "cartucho de prueba" no se limita espedficamente e incluye cualquier objeto que pueda ser utilizado para proporcionar una superficie sobre la que los anticuerpos de la etapa (a) se unan y que puedan ponerse en contacto con las soluciones o reactivos respectivos. Por ejemplo, el cartucho de prueba puede ser un cartucho desechable de medicion de una sola via, que contenga varios pocillos de medicion totalmente separados, que son pre-acondicionados a las necesidades espedficas de medicion.
En este contexto, ya que el cartucho de prueba tfpico tiene multiples pocillos, varios ensayos se pueden ejecutar en paralelo.
En un aspecto final, la presente invencion se refiere a un cuarto metodo para la deteccion simultanea de (i) al menos un aloantigeno de plaquetas humanas (HPA) en plaquetas humanas contenidas en una muestra, y (ii) anticuerpos humanos dirigidos contra aloantigenos plaquetarios humanos (HPA), en una muestra, que comprende las etapas de:
(a) llevar a cabo el primer metodo anterior de la presente invencion; y
(b) llevar a cabo el segundo o tercero metodo anterior.
En este aspecto, todas las realizaciones y definiciones como se dan anteriormente para dichos metodos se aplican.
En la presente solicitud, se han descrito metodos y pruebas para la tipificacion de antigenos de plaquetas de diagnostico para ensayos de anticuerpos basados en la tecnologfa de biosensores de evanescencia. Esta invencion ofrece ensayos de fenotipado de plaquetas y analisis de anticuerpos para ser llevados a cabo con solo una o dos simples manipulaciones y dando el resultado en diez minutos o menos. La presente invencion no necesita de una instrumentacion sofisticada o conocimiento en profundidad de la inmunologfa plaquetaria por el lado del operario. Los formatos de ensayo son productos unicos y dan al usuario final un resultado en diez minutos o menos. Para realizar el ensayo de acuerdo con algunas realizaciones, el usuario solo tiene que anadir una muestra y medir en el lector de biosensor. Esta sera la unica etapa de trabajo manual requerida y el resultado esta disponible sin ningun tipo de manipulaciones adicionales, tales como lavados y pipeteados.
Las figuras muestran:
Figura 1:
Formatos de ensayo para ensayos de tipificacion de antfgenos y ensayos de deteccion de anticuerpos
(A) Formato de ensayo para los ensayos de tipificacion de antfgenos. Un anticuerpo anti-glicoprotema (a) se inmoviliza sobre la superficie del sensor en la parte inferior del pocillo. La glicoprotema de membrana de plaquetas (b) de la muestra se une en un ensayo de una etapa con el reactivo espedfico de la glicoprotema alelo (c) modificado covalentemente con un fluoroforo (asterisco).
(B) El formato del ensayo para ensayos de anticuerpos de un solo paso y de dos pasos. Las plaquetas (a) que llevan la glicoprotema (d) se inmovilizan sobre la superficie del sensor y se hacen reaccionar con anticuerpos (b) en la muestra del paciente. Estos se detectan con un anticuerpo anti-inmunoglobulina fluorescente (c).
(C) El formato del ensayo para ensayos de anticuerpos de un solo paso y de dos pasos alternativos. Las plaquetas
(a) que llevan la glicoprotema (d) se inmovilizan sobre la superficie del sensor y se hacen reaccionar con anticuerpos
(b) en la muestra del paciente. Estos se detectan con plaquetas marcadas con fluorescencia (c) que llevan la misma glicoprotema (d).
Figura 2:
Esquema de ensayo para un ensayo basado en MAIPA
Un ensayo MAIPA tiene una parte de ensayo celular de union a las plaquetas con anticuerpos anti-glicoprotema e IgG del plasma humano (A) y una parte de deteccion (B).
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(A) Una plaqueta (a) con la glicoprotema de plaquetas (b) se pone en contacto con la muestra de plasma humano a ser analizada (e). La union del anticuerpo anti-plaquetas humanas (d) se produce, dejando atras el suero con un anticuerpo anti-plaquetario reducido o empobrecido (f). El exceso de plasma humano se lava manualmente. Posteriormente, se anade un anticuerpo monoclonal (c) dirigido contra la glicoprotema de plaquetas bajo examen que se une a dicha glicoprotema en la superficie de las plaquetas. Tfpicamente, se realizan cuatro reacciones para cuatro glicoprotemas diferentes con anticuerpos monoclonales contra gpllbllla, gplalla, gpIbIX y HLA/beta-2- microglobulina. Despues de que se forma el complejo, (b) y (c) interaction y el exceso de anticuerpo monoclonal no unido (c) se lava manualmente. Usando un detergente que contiene tampon de lisis, el complejo tri-molecular hecho de anticuerpo espedfico de glicoprotema (c), la glicoprotema de plaquetas (b) y la inmunoglobulina humana (d) se solubiliza.
(B) Deteccion del complejo tri-molecular (b), (c), (d) en un ensayo de evanescencia de una etapa. Un anticuerpo anti- raton IgG (g) esta inmovilizado en la parte inferior del pocillo del biosensor y se incuba con el complejo analito trimolecular (b), (c), (d) y se detecta con el conjugado fluoroforo de inmunoglobulina anti-humana (h).
Figura 3:
Resultados obtenidos con un ensayo de tipificacion HPA-1a
Se ensayaron muestras de sangre HPA-1a positivos y HPA-1a negativas tanto en un ensayo de tipificacion comercial de HPA-1a (DiaMed, Cressier FR, Suiza), (OD 630 nm, eje x), como con el ensayo del biosensor de evanescencia de acuerdo con la presente invencion (fluorescencia dC cps, eje y).
Figura 4:
Resultados obtenidos con un ensayo de tipificacion HPA-5b
Se ensayaron muestras de sangre conocidas de HPA-5b positivos y HPA-5b negativos con el ensayo de biosensor de evanescencia de acuerdo con la presente invencion (fluorescencia dC cps, eje y).
Figura 5:
Ensayo MAIPA basado en ELISA y ensayo MAIPA de la presente invencion
Esta figura muestra la comparacion de los ensayos de MAIPA, ya sea con la senal de deteccion de ELISA (densidad optica OD 630 nm en el eje x) y el resultado del biosensor de evanescencia de acuerdo con la presente invencion (fluorescencia dc cps en el eje y).
Figura 6:
Ensayo MAIPA basado en ELISA y ensayo MAIPA de la presente invencion
Esta figura muestra la comparacion de los ensayos de MAIPA donde cuatro glicoprotemas se ponen a prueba en tubos individuales y un MAIPA del biosensor de evanescencia acuerdo con la presente invencion. Para las pruebas del biosensor de evanescencia, cuatro anticuerpos monoclonales diferentes que reaccionaban con las cuatro glicoprotemas de plaquetas individuales gpIIbIIIa, gpIaIIa, gpIbIX y HLA se combinaron en un tubo de union a un grupo de plaquetas que representan todos las posibles aloantfgenos. La deteccion se realizo como se describio previamente con el biosensor de evanescencia. La senal de deteccion de ELISA (densidad optica OD 630 nm en el eje x) y el resultado biosensor (fluorescencia dc cps en el eje y).
Figura: 7:
Ensayo de anticuerpos de dos etapas
Resultados de un ensayo de anticuerpos de dos etapas, realizado de acuerdo con el esquema que se muestra en la Figura 1B. Las plaquetas, ya sea con el fenotipo HPA-1a positivo o HPA-1a negativo (dos muestras cada uno) se recubrieron sobre la superficie del biosensor y se hicieron reaccionar con el anticuerpo monoclonal HPA-1a anti- humano diluido en diversas concentraciones. Los pocillos se lavan y el anticuerpo anti-HPA-la humanizado unido se detecta con un conjugado fluoroforo de IgG secundario anti-humano. Las concentraciones anti HPA-1a en el eje x, la senal observada como fluorescencia dC cps se muestra en el eje y.
Figura 8:
Ensayo de anticuerpos de dos etapas
Esta figura muestra el resultado de un ensayo de anticuerpos de dos etapas de acuerdo con el esquema que se muestra en la Figura 1B y esencialmente identico al ejemplo que se muestra en la Figura 7. Seis muestras de plasma humano se ensayaron frente a plaquetas HPA-1a positivos y HPA-1a negativos recubiertas en el biosensor evanescente. El eje x muestra el plasma individual y la senal obtenida se representa en el eje y.
Esta figura muestra un formato identico de ensayo en el que la etapa de lavado se omitio y el ensayo de dos etapas mostrado en la Figura 7 se realiza como un ensayo de una etapa. Se hicieron tres revestimientos, plaquetas 5 HPA1a+5b+, plaquetas HPA1a-5b- y un control no revestido designado 0-. La senal obtenida se muestra en el eje y como fluorescencia dC cps.
Figura 10:
Ensayo sandwich doble de antigeno anticuerpo para anticuerpos de toxoplasmosis
Esta prueba se realiza mediante el recubrimiento del antigeno de la Toxoplasmosis en la superficie del biosensor y 10 otra alfcuota del antigeno de Toxoplasmosis se marca con APC en solucion. La IgG es biofuncional y un brazo reacciona con el antigeno de Toxoplasmosis unido y el otro brazo de la IgG individual reacciona con el antigeno marcado con APC. Y es asf como el cartucho se forma dando lugar a una senal. Sorprendentemente, esto funciona como un ensayo de una etapa. Se muestra una titulacion del anticuerpo estandar de Toxoplasmosis en el eje x y la senal de fluorescencia de 10 min en el eje y. La sensibilidad se encuentra por debajo de aproximadamente 5 UI, 15 segun sea necesario.
La presente invencion se ilustrara adicionalmente por los siguientes ejemplos sin limitarse a los mismos.
Ejemplos Ejemplo 1:
Ensayo de tipificacion de HPA-1a
20 Una prueba del biosensor de evanescencia de HPA-1a se lleva a cabo por reaccion de una superficie recubierta de anticuerpo anti-gpllbllla (anticuerpo monoclonal anti-gpllbllla RFGP56), una parte de sangre anticoagulada EDTA y dos partes de una mezcla de deteccion que contiene el anticuerpo espedfico anti-HPA-1a conjugado con alo- ficocianina (APC).
Un chip biosensor de evanescencia se recubre con una solucion de RFGP56 en PBS. El recubrimiento se realiza por 25 dilucion de la solucion madre de RFGP56 a una solucion de 10 microgramos por mililitro en PBS, anadiendo 30 microlitros de esta solucion a cada pocillo e incubando durante 2 horas a temperatura ambiente. Luego se retira la solucion de revestimiento, el pocillo se lava 3 veces con PBS y se anade al pocillo finalmente 50 microlitros de solucion de bloqueo. La solucion de bloqueo es una solucion de 1% de BSA en PBS y contiene 0,25% de Tween 20. El bloqueo es de aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente y se termina mediante la eliminacion de la 30 solucion de bloqueo y la adicion de la solucion de la muestra a medir. Una parte de la sangre EDTA se mezclo con dos partes de un tampon de deteccion que contiene APC anti-HPA-1a en 7,5 microgramos por mililitro en un tampon PBS suplementado con 4,5% de BSA, 3% de sacarosa, EDTA 15 mM, 0,08% de Tween 20, 0,9% de NP40, 0,75% de PEG6000, 1,5% de PVPK90, 0,2 mg/ml de IIR y 0,06% de Brilliant Black BN. 25 microlitros de la mezcla se ponen en un pocillo revestido y se mide la fluorescencia en tiempo real en 10 minutos utilizando un instrumento biosensor 35 de evanescencia y el dispositivo descrito en las patentes europeas EP1079226, EP1204856, EP1371967.
El aumento de los fotones medidos se da como un numero entero y es el aumento de los fotones contados dentro de los primeros 10 minutos de la reaccion para un pocillo espedfico. El aumento de los fotones medidos en un pocillo se da como el cambio de los fotones desde el tiempo cero segundos a tiempo 600 segundos como 'delta cuentas' (DC) con la unidad de medicion cuentas por segundo o abreviado 'cps'. Los fotones de emision de un pocillo 40 espedfico se miden durante la reaccion bioqmmica a intervalos de tiempo, cada medicion es de un segundo, pero
cualquier valor entre 10 milisegundos o 20 segundos por punto de medicion tambien se puede utilizar. Los fotones medidos se representan en un grafico en el eje Y frente al tiempo en el eje x y este procedimiento se lleva a cabo para cada pocillo individualmente. A continuacion, se genera una curva de regresion lineal por el software del instrumento lector y el aumento medio de los fotones por tiempo de observacion de 10 minutos se calcula 45 automaticamente.
Un dc de 23099 cuentas por segundo, cps, los fotones medidos en un segundo, significa para este espedfico pocillo que el numero de fotones medidos se ha incrementado en 23099 cps en 10 minutos de medicion. El aumento de los fotones a traves del tiempo, dc en cps, es ahora una medida de la cantidad de analito en la muestra.
Para su comparacion, las muestras de sangre se analizaron con el ensayo de tipificacion de HPA-1a de DiaMed, 50 Cressier FR, Suiza. El resultado mostrado en la figura 3 se obtiene representando en el eje x los resultados con el ensayo de tipificacion HPA-1a DiaMed como OD630nm y en el eje Y los resultados de fluorescencia obtenidos con el biosensor de evanescencia. Mas de 200 muestras de sangre con fenotipo conocido fueron probadas y no se observo ninguna discrepancia.
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Un ensayo de tipificacion de HPA-5b sencillo con el sistema de biosensor de evanescencia de acuerdo con la presente invencion se lleva a cabo por la reaccion de una superficie recubierta de anticuerpo anti-gpIaIIa (anticuerpo monoclonal anti-gpIaIIa AK7), una parte de sangre anticoagulada de EDTA y dos partes de una mezcla de deteccion que contema un anticuerpo anti HPA-5b espedfico conjugado con alo-ficocianina (APC). Metodos y tampones fueron los mismos que en el ejemplo 1 para la tipificacion de HPA-1a.
Mas de 100 muestras de sangre con fenotipos conocidos para HPA 5a y 5b se ensayaron y los resultados se muestran en la Figura 4. Hay una clara separacion de las plaquetas HPA-5aa negativas y las plaquetas HPA-5ab positivas. No se observo ninguna discrepancia entre el fenotipo conocido y el resultado obtenido con el ensayo de biosensor de evanescencia. Las pruebas con las plaquetas HPA-5bb y HPA5aa confirman la especificidad del ensayo.
Ejemplo 3:
Ensayo de MAIPA usando deteccion de evanescencia
Un ensayo MAIPA tiene una parte de ensayo celular que sensibiliza las plaquetas con anticuerpos anti-glicoprotema y el anticuerpo a partir de plasma humano o suero que se detecta como se esboza en la Figura 2A, y una parte de deteccion mostrada en la Figura 2B.
Las plaquetas (a) con la glicoprotema de plaquetas (b) se hacen reaccionar con un anticuerpo monoclonal (c) dirigido contra la glicoprotema de la plaqueta bajo examen. Tfpicamente, cuatro reacciones de cuatro glicoprotemas diferentes se realizan con anticuerpos monoclonales contra gpIIbIIIa, gpIaIIa, gpIbIX y HLA/beta-2-microglobulina. Despues de que el complejo se forma por la interaccion de (b) y (c), el plasma o suero de la muestra humana a analizar se anade (e) y la union del anticuerpo anti-HPA humana (d) se produce, dejando atras el suero con un anticuerpo anti-plaquetas reducido o agotado (f). El exceso de plasma humano se lava manualmente. Usando un detergente que contiene tampon de lisis, el complejo tri-molecular hecho de anticuerpo espedfico de glicoprotema
(c), glicoprotemas plaquetarias (B) y la inmunoglobulina humana (d) se solubiliza.
La deteccion del complejo tri-molecular (b), (c), (d) se realiza a continuacion en un ensayo de evanescencia de una sola etapa de acuerdo con la presente invencion. Un anticuerpo anti-raton IgG (g) se inmoviliza en 10 microgramos por mililitro, como se describe en el Ejemplo 1 en la parte inferior del pocillo del biosensor, el exceso de reactivo se lava seguido de una etapa de bloqueo. Para mejorar la estabilidad del anticuerpo recubierto, los pocillos se lavan a continuacion dos veces con PBS seguido de dos lavados con una solucion de sacarosa al 2%. El pocillo del biosensor se seca a continuacion al aire y se mantiene seco hasta su uso. Para realizar una prueba, las plaquetas recubiertas de anticuerpo se solubilizan con un tampon que contiene 2% de BSA, 0,25% de PVP, Hepes 10 mM, 0,9% de NaCl, 0,5% de Triton, 0,09% de NaN3. El lisado entonces se suplementa con 0,04% de Brilliant Black BN y un conjugado IgG APC anti-humano (Jackson) a 5 microgramos por mililitro y se mide durante 10 minutos en el instrumento biosensor de fluorescencia.
Mas de 100 muestras de suero se midieron con mas de 400 puntos de medicion individuales realizados por un MAIPA clasico con deteccion de ELISA o deteccion de biosensor de evanescencia de acuerdo con la presente invencion. Los resultados se muestran en la Figura 5 con el trazado en el eje x de los resultados con ensayos Maipa establecidos y en el eje Y los resultados de fluorescencia obtenidos con el biosensor de evanescencia. La correlacion entre los dos metodos es 0,84 y no se observa diferencia entre los metodos de deteccion.
Ejemplo 4:
Ensayo MAIPA utilizando de deteccion de evanescencia - Un tubo de MAIPA
El ensayo MAIPA utiliza rutinariamente cuatro tubos individuales en los que cada tubo se complementa con un anticuerpo monoclonal espedfico de glicoprotema de plaquetas; es decir, el tubo uno utiliza un anticuerpo anti- gpIIbIIIa, el tubo dos utiliza un anticuerpo anti-gpIaIIa, el tubo tres utiliza un anticuerpo anti-gpIbIX y el tubo cuarto un anticuerpo anti HLA. El usuario final debe realizar una prueba de deteccion de anticuerpos con cuatro ensayos individuales. Para reducir la complejidad, el ensayo se realizo como un ensayo de deteccion de anticuerpos de un unico tubo y a un conjunto de plaquetas se anadio un conjunto de los cuatro anticuerpos monoclonales espedficos de glicoprotema y la union se analizo con el ensayo de biosensor de evanescencia de acuerdo con la presente invencion. Metodos y tampones fueron por otro lado identicos a los dados en el Ejemplo 3.
100 muestras de suero se midieron por el MAIPA clasico con deteccion de ELISA o deteccion de biosensor de evanescencia de acuerdo con la presente invencion. Los resultados se muestran en la Figura 6 con el trazado en el eje x de los resultados con ensayos Maipa establecidos y en el eje Y los resultados de fluorescencia obtenidos con el biosensor de evanescencia. La correlacion entre los dos metodos es 0,84 y no se observa diferencia entre los dos metodos de deteccion. En comparacion con el MAIPA clasico con cuatro reacciones de tubo individuales y deteccion
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ELISA, el nuevo metodo utiliza un tubo solamente con los cuatro anticuerpos monoclonales y deteccion de evanescencia de los complejos tri-moleculares resultantes. La ventaja de los nuevos metodos es una carga de trabajo muy reducida en la parte celular y en la parte de la deteccion del ensayo con sensibilidad identica. Esto permite ahora que el MAIPA de un solo tubo modificado con la deteccion de biosensor de evanescencia se haga en un tercio del tiempo necesario que un MAIPA clasico con un cuarto de las etapas de manipulacion necesarias y una complejidad mucho menor para los procedimientos de manipulacion. El nuevo formato es ahora adecuado como una prueba de deteccion de anticuerpos para los anticuerpos anti-plaquetas.
Ejemplo 5:
Ensayo de anticuerpos de HPA-1a
Un ensayo de anticuerpos de HPA-1a sencillo con el sistema de biosensor de evanescencia de acuerdo con la presente invencion se lleva a cabo por la reaccion de una superficie del biosensor recubierto de plaquetas con un anticuerpo monoclonal anti HPA-1a y despues lavando el exceso de anticuerpo anti HPA-1a no unido; la deteccion de la fraccion de anti HPA-1a unido se realiza con un anticuerpo secundario marcado APC IgG anti-humano.
El recubrimiento del biosensor con plaquetas se realiza mediante el lavado de las plaquetas 3 veces en PBS y luego el recubrimiento de las plaquetas lavadas en PBS a aproximadamente 150.000 por microlitro en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Esto es seguido por tres lavados con PBS y una lisis hipotonica en tampon fosfato 10 mM con NaCl 10 mM durante 1 h a TA. Entonces hay tres lavados con PBS y una digestion con proteasa parcial con papama durante 1 h a 37°C (ID-papama, DiaMed, Cressier, Suiza), seguido de tres lavados con PBS y luego una etapa de bloqueo con BSA al 3% en PBS durante 1 h. Los pocillos se lavan tres veces con PBS, dos veces con 1% de sacarosa y luego se secan al aire despues de lo cual estan listos para su uso.
El ensayo de union pone a prueba diversas cantidades de anticuerpo monoclonal anti HPA-1a diluido en suero de ternera fetal, FCS, que contiene EDTA 10 mM durante 10 minutos en la superficie del biosensor, lavando los pocillos tres veces con PBS y detectando IgG unida anti HPA-1a con IgG APC anti-humano (Jackson) IgG a 5 microgramos por ml en FCS suplementado con EDTA 10 mM. Las medidas son como en el Ejemplo 1 con el biosensor de evanescencia durante 10 min.
Los resultados mostrados en la Fig. 7 se obtienen mediante el trazado sobre el eje x de la concentracion de anticuerpo anti-HPA1a y en el eje Y los resultados de fluorescencia en la fluorescencia dc cps tal como se obtiene con el biosensor de evanescencia. La especificidad con respecto al genotipo de las plaquetas 1a y 1b es correcta. Se observa a bajas concentraciones una curva respuesta a la dosis lineal que a concentraciones superiores a 1 microgramo por mililitro de anticuerpo entra en una meseta.
La inmovilizacion de las plaquetas a la superficie del sensor se puede efectuar con muchas tecnologfas de inmovilizacion diferentes. Las posibilidades son, por ejemplo, recubrimiento directo por absorcion ffsica, otras posibilidades son recubrir un anticuerpo de protemas de superficie anti-plaquetas como, por ejemplo, el clon anti- gpIIbIIIa RFGP56 o biotinilar plaquetas intactas enteras que conducen a una biotinilacion de protemas de superficie de las plaquetas y, posteriormente, la union a una superficie de biosensor de avidina. El revestimiento de dextrano y el acoplamiento covalente o revestimientos de poli-L-lisina, seguido de acoplamientos electrostaticos y/o covalentes son solo ejemplos de las posibilidades tecnicas en este sentido. Otros anticuerpos antiplaquetarios tales como anti- HPA-5b o anti-plaquetas auto-anticuerpos pueden ser detectados utilizando el mismo metodo.
Ejemplo 6:
Ensayo de anticuerpos de HPA-1a con muestras de plasma humano
El rendimiento del ensayo de anticuerpos HPA-1a descrito en el Ejemplo 5 se evaluo adicionalmente con un pequeno numero de sueros humanos. La produccion del ensayo y el metodo de ensayo y tampones fueron como se describe en el Ejemplo 5. El sistema de biosensor de evanescencia se lleva a cabo por reaccion de una superficie de biosensor recubierto de plaquetas con el anticuerpo monoclonal anti HPA-1a y despues lavando el exceso del anticuerpo anti HPA-1a no unido y la deteccion de la fraccion del antiHPA-1a unido con un anticuerpo secundario marcado IgG APC anti-humano.
El ensayo de union puso a prueba diluciones al 1% de seis plasmas humanos diferentes segun su capacidad para unirse con los biosensores recubiertos de plaquetas recubiertos con plaquetas HPA1a positivas o HPA1a negativas. Las muestras de plasma humano fueron cuatro de plasma humano negativo y un positivo y un control negativo del laboratorio de referencia de plaquetas Lyon EFS, Lyon Francia con un diametro exterior de 0,7 MAIPA para el plasma positivo y <0,1 DO para el plasma negativo. Este DO de 0,1 es el valor de corte para la positividad de MAIP o 7 veces la senal mas fuerte que el valor de corte.
La Figura 8 muestra el suero positivo de anti HPA-1a para reaccionar fuertemente con las plaquetas positivas HPA- 1a y solo con una reaccion de fondo a las plaquetas negativas HPA-1a. La relacion senal-ruido es similar a los resultados MAIPA. Los sueros de control negativo HPA1a, asf como los otros sueros negativos no dieron ninguna reaccion por encima de los niveles de fondo.
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Para mejorar aun mas la facilidad de uso en la realizacion del ensayo de anticuerpos de plaquetas se prepararon biosensores de plaquetas como se describe anteriormente por el revestimiento y secado de plaquetas en los pocillos.
A continuacion, el ensayo se realizo diluyendo el plasma humano marcado M del Ejemplo 6 tomando una parte de plasma en 200 partes de FCS suplementado con EDTA 10 mM. Se prepararon dos muestras, en la que la primera muestra utilizo plasma M y a la segunda muestra se le anadio un anticuerpo HPA-1a anti-humano. Se anadio IgG APC anti-humano (Jackson) a una concentracion final de 20 microgramos por mililitro y la mezcla se analizo con un biosensor recubierto de plaquetas. Tres revestimientos diferentes se utilizaron para este ensayo, las plaquetas HPA1a positivos, plaquetas HPA 1a negativos y pocillos no recubiertos vados como control negativo para el biosensor y la lmea de fondo del instrumento. Las mezclas se pipetearon en los pocillos y se midieron como se describe en los ejemplos anteriores durante 10 minutos en un instrumento biosensor de evanescencia y los resultados se registraron.
La figura 9 muestra una senal solo para el biosensor revestido con las plaquetas HPA1a+ con plasma M anadido mientras que el plasma M no anadido dio un resultado negativo. El biosensor de plaquetas HPA1a negativo y el biosensor solo dieron como resultado solo la senal de fondo. Esto confirma la sensibilidad y la especificidad de las pruebas del biosensor de evanescencia segun la presente invencion en un ensayo de anticuerpo de una sola etapa. Se ha demostrado a traves del ejemplo de tipificacion del aloantfgeno HPA-1a que el metodo de evanescencia es adecuado para todas las tipificaciones de aloantfgeno de plaquetas y pruebas de anticuerpos.
Ejemplo 8 (Ejemplo de referencia)
Se realiza un ensayo de anticuerpos de doble antfgeno de una sola etapa para la toxoplasmosis mediante el cultivo de toxoplasma en un cultivo de celulas y se lleva a cabo la purificacion del antfgeno a partir del cultivo por repetidas etapas de sonicacion y centrifugacion (DiaMed Eurogen, Turnhout, Belgica). El antfgeno esta en la forma de una materia especial y se utiliza tal como esta. Una alfcuota se utiliza para recubrir el chip biosensor a 10 microgramos por mililitro. Una segunda alfcuota se marca con APC como se describe. La prueba se realiza tomando dos partes de estandar IgG anti-toxoplasmosis y mezclando con una parte de una mezcla de deteccion triple concentrada tamponada con Tris casema 1%, 3% de BSA y 0,9% de Tween 20 y 10 microgramos por mililitro de antfgeno-APC de toxoplasmosis. Esta mezcla se transfiere a un pocillo recubierto de antfgeno de toxoplasmosis y se mide. Los resultados se muestran en la Fig. 10.

Claims (4)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para la deteccion de al menos un aloantfgeno de plaquetas humano (HPA) en plaquetas humanas contenidas en una muestra, que es sangre entera anti-coagulada en una concentracion de mas del 25%, que comprende las etapas de:
    (a) proporcionar al menos una superficie que tiene al menos un anticuerpo unido a la misma, en el que dicho anticuerpo se dirige contra la glicoprotema que lleva al menos un HPA que se detecta;
    (b) lisar las plaquetas contenidas en la muestra y solubilizar las protemas de la membrana de dichas plaquetas;
    (c) poner en contacto dicha superficie con la muestra lisada y solubilizada de la etapa (b), en el que las respectivas glicoprotemas contenidas en dicha muestra se inmovilizan sobre dicha superficie al unirse espedficamente al anticuerpo de la etapa (a);
    (d) poner en contacto dicha superficie con un anticuerpo marcado con fluorescencia, en el que dicho anticuerpo se dirige contra al menos un HpA que se detecta, y en el que dicho anticuerpo, las respectivas glicoprotemas contenidas en dicha muestra, y el anticuerpo de la etapa (a) forman un complejo unido a la superficie;
    (e) excitar dicho complejo unido a la superficie con un campo evanescente de una fuente de luz;
    (f) medir la fluorescencia emitida a partir de dicho complejo unido a la superficie; y
    (g) detectar al menos un HPA basado en la fluorescencia emitida medida en la etapa (f).
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que los HPA son HPA-1a y/o HPA-5b.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que se detecta mas de un HPA.
  4. 4. Un metodo para la deteccion simultanea de (i) al menos un aloantfgeno de plaquetas humanas (HPA) en plaquetas humanas contenidas en una muestra, y (ii) anticuerpos humanos dirigidos contra aloantfgenos plaquetarios humanos (HPA), en una muestra, que comprende las etapas de:
    (a) realizar el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y
    (b) llevar a cabo
    (M1) un metodo para la deteccion de anticuerpos humanos dirigidos contra aloantfgenos de plaquetas humanas (HPA), en una muestra, que comprende las etapas:
    (a1) proporcionar al menos una superficie que tenga al menos plaquetas humanas o fracciones de membrana de plaquetas unidas a la misma, en donde los HPA de interes que estan presentes en dichas plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas son conocidos;
    (b1) poner en contacto dicha superficie con dicha muestra, en el que los anticuerpos humanos dirigidos contra los HPA que estan presentes en dichas plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas, contenidos en dicha muestra, se inmovilizan sobre dicha superficie uniendose espedficamente a las plaquetas o fracciones de membranas de plaquetas de la etapa (a1);
    (c1) poner en contacto dicha superficie con un agente de deteccion marcado con fluorescencia, en el que dicho agente de deteccion se une espedficamente a anticuerpos humanos dirigidos contra los HPA que estan presentes en dichas plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas, y en el que dicho agente de deteccion, los respectivos anticuerpos humanos contenidos en dicha muestra, y las plaquetas humanas o fracciones de membrana de plaquetas de la etapa (a1) forman un complejo unido a la superficie;
    (d1) excitar dicho complejo unido a la superficie con un campo evanescente de una fuente de luz;
    (e1) medir la fluorescencia emitida a partir de dicho complejo unido a la superficie; y
    (f1) detectar los anticuerpos humanos contra los HPA que estan presentes en dicho plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas en base a la fluorescencia emitida medida en la etapa (e1), o
    (M2) un metodo para la deteccion de anticuerpos humanos dirigidos contra los aloantfgenos de plaquetas humanas (HPA), en una muestra, que comprende las etapas:
    (a2) realizar al menos un ensayo de inmovilizacion de anticuerpo monoclonal de antfgeno de plaquetas (MAIPA) para generar al menos un complejo tri-molecular hecho de al menos una glicoprotema de plaquetas que lleva los HPA de interes, al menos un anticuerpo dirigido contra dicha al menos una glicoprotema de plaqueta, y un anticuerpo humano de interes dirigido contra dicho HPA, en el que dicho anticuerpo humano se ha contenido en dicha muestra;
    10
    (b2) proporcionar al menos una superficie que tenga al menos un anticuerpo dirigido contra dicho al menos un anticuerpo dirigido contra dicha al menos una glicoprotema de plaqueta unidas a la misma;
    (c2) poner en contacto dicha superficie con dicho complejo tri-molecular, en el que dicho complejo tri-molecular es inmovilizado en dicha superficie uniendose espedficamente al anticuerpo de la etapa (b2);
    (d2) poner en contacto dicha superficie con un anticuerpo marcado con fluorescencia dirigido contra anticuerpos humanos, en el que dicho anticuerpo marcado con fluorescencia, dicho complejo tri-molecular, y el anticuerpo de la etapa (b2) forman un complejo unido a la superficie;
    (e2) excitar dicho complejo unido a la superficie con un campo evanescente de una fuente de luz;
    (f2) medir la fluorescencia emitida a partir de dicho complejo unido a la superficie; y
    (g2) detectar los anticuerpos humanos dirigidos contra dichos HPA en base a la fluorescencia emitida medida en la etapa (f2).
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