CN109870581A - 一种定量检测HBsAg的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及病毒学与免疫学领域。具体而言,本申请涉及一种定量检测HBsAg的试剂盒。此外,本申请还涉及一种定量检测含有HBsAg的样品中HBsAg含量的方法。
Description
技术领域
本申请涉及病毒学与免疫学领域。具体而言,本申请涉及一种定量检测HBsAg的试剂盒。此外,本申请还涉及一种定量检测含有HBsAg的样品中HBsAg含量的方法。
背景技术
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染,尤其是慢性乙型肝炎病毒感染是全球最为重的公共卫生问题之一,目前全球约有超过3.5亿的慢性乙型肝炎病毒感染者。慢性乙型肝炎病毒感染可造成慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)、肝硬化(Liver cirrhosis,LC)和原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)等肝脏疾病,由慢性乙型肝炎病毒感染感染及其所引起的相关疾病所导致的死亡,全球每年超过100万人(Dienstag JL.Hepatitis B virus infection.N Engl J Med 2008;359:1486-1500.)。
乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B virus surfaces antigen,HBsAg)是HBV外膜蛋白。临床上HBsAg是HBV感染最重要的诊断标志物,HBsAg长期阳性指示慢性HBV感染。近年来,HBsAg定量检测的临床意义被逐渐揭示并广泛应用。
在核苷类似物治疗过程中HBsAg下降水平与HBV DNA下降水平相一致(陈祥胜,廖雯君.乙肝HBsAg定量检测的临床诊断意义[J].湖北中医学院学报,2009,11(2):21-23.),出现耐药毒株时,血清HBsAg升高且常早于HBV DNA反弹和生化学突破(ALT水平升高)(陈祥胜,廖雯君.乙肝HBsAg定量检测的临床诊断意义[J].湖北中医学院学报,2009,11(2):21-23;以及陈瑞烈等人.重型乙型肝炎血清HBVDNA水平与肝功能及免疫指标的关系研究[J].中国基层医药,2006,13(9):1449-1450.)。
在接受干扰素治疗检测、预测应答方面,HBsAg定量水平在治疗早期出现快速而显著下降或治疗前较低HBsAg基线水平,有利于干扰素获得持续病毒学应答(SVR)和获得HBeAg血清转换(罗玮敏,王朝辉,刘中景.HBV DNA与其五项检测指标关系及意义[J].齐鲁医学杂志,2009,24(1):4-5;以及刘灿,翁义锐,陈永东.乙肝患者HBsAg定量与HBV-DNA及乙肝标志物模式的比较分析[J].福建医药杂志,2006,28(4):124-125.)。HBeAg阳性病人接受PEG-IFN治疗过程中,治疗第12周HBsAg定量<1500IU/mL是HBeAg血清学转换的一个重要预测指标,而治疗第12周HBsAg定量>20,000IU/mL是无应答的一个强效预测指标(Piratvisuth T等人.Hepatol Int.2013Jun;7(2):429-36.;以及Sonneveld MJ等人.Hepatology.2010;52:1251-1257.)。在HBeAg阴性病人接受PEG-IFN治疗过程中,HBsAg浓度不下降,且HBV DNA下降小于2Log10IU/ml是治疗无应答的一个强效预测指标,指示治疗可以停止,建议换用其它药物(Rijckborst V等人.Hepatology 2010,52:454-461;以及Rijckborst V等人.Journal of hepatology 2012,56:1006-1011.。
目前的HBsAg定量试剂均采用“包被抗体—抗原—标记抗体”的“三明治”式检测方法,不同试剂之间的差异主要在于包被介质和标记物的不同,此外,不同试剂间定量范围也有一定的差异,如Roche试剂采用生物素和稀有金属“钌”来分别标记检测抗原的两种抗体,再通过亲和素标记的磁微粒捕获抗原与抗体反应形成的双抗体夹心复合物来检测电化学信号,不对样本进行稀释条件下试剂的检测范围为0~130IU/mL;Abbott试剂则将一种抗体直接包被于磁微粒上,吖啶酯标记于另一抗体上,通过与样本反应形成双抗体夹心复合物,并检测化学发光信号,试剂不对样本稀释条件下的检测范围为0~250IU/mL。
然而,目前临床大部分慢乙肝病人HBsAg定量水平处于100IU/ml以上(Jaroszewicz J等人.Journal of hepatology,2010,52(4):514-522;以及Nguyen T等人.Journal of hepatology,2010,52(4):508-513.)。因此,对于大部分临床样品而言,现有商业化试剂均需要在检测前进行样本的稀释才能检测出定量值。但是由于稀释倍数大,在对样本进行稀释时需要反复进行几次稀释操作,稀释过程耗费时间。以Abbott试剂为例,手工稀释500倍时,需先将25μl样本加入475μl稀释液中进行20倍稀释后,再将20μl经1:20稀释后的样本加入480μl稀释液中,从而达到稀释500倍的目的,并且手工稀释降低准确性。而全自动仪器自动稀释同样需要进行多次稀释操作,稀释倍数越大,仪器检测通量越低,降低了检测精确性。
因此,本领域需要开发无需样品稀释、且检测上限更高的HBsAg定量检测方法,以实现更加简便、快速、准确地测定临床样本中HBsAg的含量。
发明内容
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的病毒学、生物化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的,术语“HBsAg”是指,乙型肝炎病毒(HBV)的表面抗原主蛋白,其是本领域技术人员公知的(参见,例如NCBIGENBANK数据库登录号:AAF24729.1)。
如本文中所使用的,术语“特异性结合”是指,两分子(即结合分子与靶分子)之间的非随机的结合反应,如抗体和其所针对的抗原之间的反应。两分子之间的结合亲和力可用KD值描述。KD值是指由kd(特定的结合分子-靶分子相互作用的解离速率;亦称为koff)与ka(特定结合分子-靶分子相互作用的缔合速率;亦称为kon)之比得到的解离常数,或者指表示为摩尔浓度(M)的kd/ka。KD值越小,两分子结合越紧密,亲和力越高。在某些实施方式中,特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指,抗体以小于大约10-5M,例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。KD值可通过本领域熟知的方法确定,例如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定。
如本文中所使用的,术语“免疫学检测”是指,利用抗原-抗体之间的特异性相互作用/结合亲和力来进行的测定,其一般可用于检测特定抗原或者抗体在样品中的存在或水平。此类免疫学检测是本领域技术人员公知的,包括但不限于,酶免疫测定法(EIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)、Western印迹法、免疫比浊法、表面等离子共振法等。在某些实施方式中,所述免疫学检测为酶免疫测定法(EIA),例如ELISA检测法、Elispot检测法或CLEIA检测法。关于免疫学检测的详细描述,可参见例如,Fundamental Immunology,Ch.7Paul,W.,ed.,第2版,Raven Press,N.Y.(1989)。
如本文中所使用的,术语“可检测的标记”是指,可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物。在本发明中,特别优选的是,此类标记能够适用于免疫学检测(例如,酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。这类标记是本领域熟知的,包括但不限于,酶(例如,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶,等)、放射性核素(例如,3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如,异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、吖啶酯类化合物、磁珠(例如,)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如,聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶,等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如,链霉亲和素)的生物素。教导此类标记物的使用的专利包括,但不限于,美国专利3,817,837;3,850,752;3,939,350;3,996,345;4,277,437;4,275,149;及4,366,241(全部通过引用并入本文)。本发明中涵盖的标记物可通过本领域已知的方法检测。例如,放射性标记可使用摄影胶片或闪烁计算器检测,荧光标记物可使用光检测器检测,以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物及检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测,及测热标记物通过简单可视化着色标记物来检测。
如本文中所使用的,表述“能够识别并结合HBsAg的检测试剂”是指,能够和HBsAg特异性结合的物质。这类物质是本领域所公知的,或者可以利用本领域公知的方法制备得到,例如为抗体、靶向多肽或核酸适体等。通常而言,特别优选的是,此类试剂能够通过免疫学检测来确定样品中HBsAg的量。免疫学检测的使用是特别有利的,因为其利用了抗原-抗体之间的特异性相互作用/结合亲和力。因此,只要试剂保留了与HBsAg特异性结合的反应性,那么该试剂即可以通过免疫学检测来确定样品中HBsAg的量(也即,该试剂即可用作能够识别并结合HBsAg的检测试剂)。保留与HBsAg特异性结合的反应性的各种试剂是本领域技术人员容易想到并且可容易获得的,其包括但不限于,抗HBsAg的抗体或其抗原结合片段,例如抗HBsAg的多克隆抗体或单克隆抗体。
如本文中所使用的,术语“抗体”是指,通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内,可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接,重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR)),其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991)),或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如,其包括,特别地,重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体,例如,IgG(例如,IgG1,IgG2,IgG3或IgG4亚型),IgA1,IgA2,IgD,IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的,术语“核酸适体(Aptamer)”是指,能够高亲和性和高特异性地结合目的靶蛋白(例如HBsAg)或其它生物靶分子的单链寡核苷酸,其可折叠形成例如茎环(Stem-Loop)、发夹(Hairpin)、假结(Pseudoknot)或G-四聚体(G-tetramer)的热力学稳定的三维空间结构,通过例如结构互补、碱基堆积力、范德华力、氢键或静电作用与目的靶蛋白或其它生物靶分子特异性结合。核酸适体可以为DNA或RNA,也可以包含核酸类似物(例如锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、二醇核酸(GNA)或苏糖核酸(TNA))。获得结合特定靶蛋白的核酸适体的方法是本领域公知的,例如SELEX(Systematic evolution of ligands byexponential enrichment)筛选技术。
如本文中所使用的,术语“靶向多肽”是指,可以特异性结合目的靶蛋白(例如HBsAg)的多肽分子。在本发明中,该靶向多肽可包含天然氨基酸、合成的氨基酸或采用与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸模拟物(mimetics)。天然存在的氨基酸为通过遗传密码来编码的那些以及后来修饰的那些氨基酸,例如,羟基脯氨酸、γ-羟基谷氨酸盐、O-磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸或磷酸酪氨酸。在本发明中,可基于亲和力来确定靶向多肽与其目的靶蛋白之间的“特异性”,该亲和力可用靶向多肽与其所结合的目的靶蛋白的解离平衡常数(即,KD值)进行描述。KD值越低,靶向多肽与其所结合的目的靶蛋白之间的结合强度越强。在本领域中通常已知,大于约10-3M的KD值通常被认为表示非结合或非特异性结合。取决于具体的目的靶蛋白,可以通过本领域技术人员已知的方法获得特异性结合该靶蛋白的靶向多肽,例如通过噬菌体展示技术或蛋白质微阵列技术进行筛选。
如本文中所使用的,表述“血液样品未经稀释”是指,所述血液样品从受试者获得后未经过任何稀释处理。
如本文中所使用的,术语“受试者”包括但不限于各种动物,特别是哺乳动物,例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、兔科动物、啮齿类动物(例如,小鼠或大鼠)、非人灵长类动物(例如,猕猴或食蟹猴)或人。
本发明人经过大量的实验研究,出人意料地发现:在HBsAg定量检测过程中,通过使用特定的试剂组合物,能够在待测样品未经稀释的情况下,显著提高检测上限至100000IU/mL,从而使得大部分临床样本落入该检测范围。基于这一发现,本发明人开发了新的HBsAg定量检测试剂盒以及检测方法。
因此,在一个方面,本发明提供了一种试剂盒,其包含特异性结合HBsAg的第一抗体和试剂组合物,所述试剂组合物包含三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)和尿素。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物还包括一种或多种选自下列的试剂:非离子型表面活性剂、无机盐和缓冲液。
在某些优选的实施方案中,所述非离子型表面活性剂选自Chaps、磺基甜菜碱(sulfobetaine)系列的表面活性剂、Triton系列的去污剂、Tween系列的去污剂及其任意组合。在某些优选的实施方案中,所述非离子型表面活性剂选自SB14、SB16、Tween-20、Tween-40、Triton X-100及其任意组合。在某些优选的实施方案中,所述非离子型表面活性剂为Triton X-100和/或Tween-20。
在某些优选的实施方案中,所述无机盐选自NH4SO4、NaCl等。
在某些优选的实施方案中,所述缓冲液为碳酸盐缓冲液。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物包含TCEP、尿素以及余量的水。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物包含TCEP、尿素、无机盐(例如,NaCl)以及余量的水。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物包含TCEP、尿素、无机盐(例如,NaCl)、非离子型表面活性剂(例如,Tween-20)以及余量的水。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物包含TCEP、尿素、无机盐(例如,NaCl)、非离子型表面活性剂(例如,Tween-20)、缓冲液(例如,碳酸盐缓冲液)以及余量的水。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物中的各成分的含量为:TCEP为1-100mM(例如,1-50mM,10-50mM,20-50mM,或30-50mM;例如40mM)、尿素为0.5-8M(例如,1-8M,1-6M,或2-6M;例如2M)、非离子型表面活性剂为0-10%(v/v)(例如0.1-1%,例如0.1%)、无机盐为0.5-8M(例如,0.5-1M,例如0.6mM)、缓冲液为0-200mM(例如,50-200mM,或50-150mM;例如,100mM)。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物包含40mM TCEP和2M尿素。在某些示例性实施方案中,所述试剂组合物由以下成分组成:40mM TCEP、2M尿素、600mM NaCl、100mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)、0.1%Tween-20(v/v)以及余量的水(例如,去离子水)。
在某些优选的实施方案中,所述第一抗体是单克隆抗体。在某些示例性实施方案中,所述第一抗体选自15D1(M1056)、42B6(M1058)、6C10(M10510)、2C1(M1057)、SF(M10517)及其任意组合,其中所述各抗体均来自厦门万泰沧海生物技术有限公司。
在某些优选的实施方案中,所述试剂盒还包括能够识别并结合HBsAg的检测试剂。这类检测试剂是本领域熟知的,包括但不限于能够和HBsAg特异性结合的抗体、靶向多肽或核酸适体。在某些示例性实施方案中,所述检测试剂为能够特异性结合HBsAg的第二抗体。在某些示例性实施方案中,所述第二抗体为多克隆抗体。
在某些优选的实施方案中,所述检测试剂带有可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)或荧光染料。在某些示例性实施方案中,当所述可检测的标记为酶时,所述试剂盒还可以包含显色液,例如用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS或鲁米诺类化合物,或用于碱性磷酸酶的对硝基苯磷酸酯(p-NPP)或AMPPD。
在某些优选的实施方案中,所述试剂盒还包含固相载体,任选地还包含用于将所述第一抗体包被于所述固相载体上的包被试剂,例如包被缓冲液(例如,碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液或硼酸盐缓冲液)。在某些优选的实施方案中,所述固相载体包括由聚合物材料(例如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺或纤维素)制成或包被的凹孔平板、试管、珠粒(例如乳胶颗粒)或薄膜(例如硝酸纤维素膜),或由功能基团(例如氨基、羧基、生物素或亲和素)预包被的磁珠。在某些示例性实施方案中,所述固相载体为微量滴定板,例如微孔板或酶标板。在某些示例性实施方案中,所述固相载体是磁珠。将蛋白或多肽包被于固相载体上的方法是本领域熟知的,例如物理吸附、通过氨基化或羧基化表面实现的共价偶联或通过亲和素-生物素系统、聚赖氨酸预包被表面、蛋白A或蛋白G预包被表面实现的介导结合。
在某些优选的实施方案中,所述第一抗体包被在所述固相载体的表面。在某些示例性实施方案中,所述第一抗体包被在微量滴定板(例如微孔板或酶标板)的表面。在某些示例性实施方案中,所述第一抗体包被在磁珠的表面。
在某些优选的实施方案中,所述试剂盒还包含一种或多种选自下列的试剂或装置:标准品(例如,含有不同已知量的HBsAg的系列样品);阳性对照样品(例如,含有已知量的HBsAg的样品);阴性对照样品(例如,不含有HBsAg的样品);用于终止酶催化底物显色反应的终止液(例如,硫酸、盐酸或氢氧化钠溶液);用于抑制非特异性结合的封闭液;和,采血装置(例如,无热原真空采血管)。
在另一个方面,本发明提供了一种反应体系,其包含HBsAg、特异性结合HBsAg的第一抗体和试剂组合物,所述试剂组合物包含三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)和尿素。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物还包括一种或多种选自下列的试剂:非离子型表面活性剂、无机盐和缓冲液。
在某些优选的实施方案中,所述非离子型表面活性剂选自Chaps、磺基甜菜碱(sulfobetaine)系列的表面活性剂、Triton系列的去污剂、Tween系列的去污剂及其任意组合。在某些优选的实施方案中,所述非离子型表面活性剂选自SB14、SB16、Tween-20、Tween-40、TritonX-100及其任意组合。在某些优选的实施方案中,所述非离子型表面活性剂为Triton X-100和/或Tween-20。
在某些优选的实施方案中,所述无机盐选自NH4SO4、NaCl等。
在某些优选的实施方案中,所述缓冲液为碳酸盐缓冲液。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物包含TCEP、尿素以及余量的水。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物包含TCEP、尿素、无机盐(例如,NaCl)以及余量的水。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物包含TCEP、尿素、无机盐(例如,NaCl)、非离子型表面活性剂(例如,Tween-20)以及余量的水。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物包含TCEP、尿素、无机盐(例如,NaCl)、非离子型表面活性剂(例如,Tween-20)、缓冲液(例如,碳酸盐缓冲液)以及余量的水。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物中的各成分的含量为:TCEP为1-100mM(例如,1-50mM,10-50mM,20-50mM,或30-50mM;例如40mM)、尿素为0.5-8M(例如,1-8M,1-6M,或2-6M;例如2M)、非离子型表面活性剂为0-10%(v/v)(例如0.1-1%,例如0.1%)、无机盐为0.5-8M(例如,0.5-1M,例如0.6mM)、缓冲液为0-200mM(例如,50-200mM,或50-150mM;例如,100mM)。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物包含40mM TCEP和2M尿素。在某些示例性实施方案中,所述试剂组合物由以下成分组成:40mM TCEP、2M尿素、600mM NaCl、100mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)、0.1%Tween-20(v/v)以及余量的水(例如,去离子水)。
在某些优选的实施方案中,所述第一抗体是单克隆抗体。在某些示例性实施方案中,所述第一抗体选自15D1(M1056)、42B6(M1058)、6C10(M10510)、2C1(M1057)、SF(M10517)及其任意组合,其中所述各抗体均来自厦门万泰沧海生物技术有限公司。
在另一个方面,本发明提供了一种定量检测含有HBsAg的样品中HBsAg含量的方法,其包括以下步骤:
(1)在试剂组合物中将所述样品与特异性结合HBsAg的第一抗体接触,以获得免疫复合物;
(2)测定步骤(1)获得的免疫复合物的量;
其中,在步骤(1)中,所述试剂组合物包含TCEP和尿素。
在某些优选的实施方案中,本发明的方法用于非诊断目的。在此类实施方案中,由于待测的样品已知含有HBsAg,也即在施用本发明的方法进行检测前,该样品的同一主体已具备诊断结果;因此,本发明的方法对于该样品的诊断步骤而言并无任何帮助。由此可见,本发明的方法的直接目的并不在于获得该样品的同一主体的诊断结果,而是在于对该已知诊断信息的样品进行进一步的精确定量检测。
在某些优选的实施方案中,所述样品是血液样品,例如全血、血浆或血清。在某些优选的实施方案中,所述血液样品未经稀释。
在某些优选的实施方案中,在步骤(1)中,所述试剂组合物还包括一种或多种选自下列的试剂:非离子型表面活性剂、无机盐和缓冲液。
在某些优选的实施方案中,所述非离子型表面活性剂选自Chaps、磺基甜菜碱(sulfobetaine)系列的表面活性剂、Triton系列的去污剂、Tween系列的去污剂及其任意组合。在某些优选的实施方案中,所述非离子型表面活性剂选自SB14、SB16、Tween-20、Tween-40、TritonX-100及其任意组合。在某些优选的实施方案中,所述非离子型表面活性剂为Triton X-100和/或Tween-20。
在某些优选的实施方案中,所述无机盐选自NH4SO4、NaCl等。
在某些优选的实施方案中,所述缓冲液为碳酸盐缓冲液。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物包含TCEP、尿素以及余量的水。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物包含TCEP、尿素、无机盐(例如,NaCl)以及余量的水。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物包含TCEP、尿素、无机盐(例如,NaCl)、非离子型表面活性剂(例如,Tween-20)以及余量的水。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物包含TCEP、尿素、无机盐(例如,NaCl)、非离子型表面活性剂(例如,Tween-20)、缓冲液(例如,碳酸盐缓冲液)以及余量的水。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物中的各成分的含量为:TCEP为1-100mM(例如,1-50mM,10-50mM,20-50mM,或30-50mM;例如40mM)、尿素为0.5-8M(例如,1-8M,1-6M,或2-6M;例如2M)、非离子型表面活性剂为0-10%(v/v)(例如0.1-1%,例如0.1%)、无机盐为0.5-8M(例如,0.5-1M,例如0.6mM)、缓冲液为0-200mM(例如,50-200mM,或50-150mM;例如,100mM)。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物包含40mM TCEP和2M尿素。在某些示例性实施方案中,所述试剂组合物由以下成分组成:40mM TCEP、2M尿素、600mM NaCl、100mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)、0.1%Tween-20(v/v)以及余量的水(例如,去离子水)。
在某些优选的实施方案中,在步骤(2)中,通过免疫学检测来测定所述免疫复合物的量。在某些优选的实施方案中,所述免疫学检测是酶免疫测定法或化学发光免疫分析法。在某些示例性实施方案中,所述免疫学检测选自CLEIA检测法和CLIA检测法。在某些实例性实施方案中,在步骤(2)中,使用能够特异性结合HBsAg的第二抗体来检测所述免疫复合物的量,所述第二抗体带有可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)或荧光染料。在此类实施方案中,所述第二抗体与步骤(1)获得的免疫复合物能够形成“抗体-抗原-抗体”三明治式复合物。
在某些优选的实施方案中,在步骤(2)之前,还包括洗涤所述免疫复合物以去除未参与反应的物质的步骤。
在某些优选的实施方案中,所述第一抗体包被在固相载体的表面。在某些优选的实施方案中,所述固相载体包括由聚合物材料(例如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺或纤维素)制成或包被的凹孔平板、试管、珠粒(例如乳胶颗粒)或薄膜(例如硝酸纤维素膜),或由功能基团(例如氨基、羧基、生物素或亲和素)预包被的磁珠。在某些示例性实施方案中,所述第一抗体包被在微量滴定板(例如微孔板或酶标板)的表面。在某些示例性实施方案中,所述第一抗体包被在磁珠的表面。
在另一个方面,本发明涉及试剂组合物在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于检测受试者的血液样品中HBsAg含量,其中所述试剂组合物包含三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)和尿素。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物还包括一种或多种选自下列的试剂:非离子型表面活性剂、无机盐和缓冲液。
在某些优选的实施方案中,所述非离子型表面活性剂选自Chaps、磺基甜菜碱(sulfobetaine)系列的表面活性剂、Triton系列的去污剂、Tween系列的去污剂及其任意组合。在某些优选的实施方案中,所述非离子型表面活性剂选自SB14、SB16、Tween-20、Tween-40、TritonX-100及其任意组合。在某些优选的实施方案中,所述非离子型表面活性剂为Triton X-100和/或Tween-20。
在某些优选的实施方案中,所述无机盐选自NH4SO4、NaCl等。
在某些优选的实施方案中,所述缓冲液为碳酸盐缓冲液。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物包含TCEP、尿素以及余量的水。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物包含TCEP、尿素、无机盐(例如,NaCl)以及余量的水。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物包含TCEP、尿素、无机盐(例如,NaCl)、非离子型表面活性剂(例如,Tween-20)以及余量的水。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物包含TCEP、尿素、无机盐(例如,NaCl)、非离子型表面活性剂(例如,Tween-20)、缓冲液(例如,碳酸盐缓冲液)以及余量的水。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物中的各成分的含量为:TCEP为1-100mM(例如,1-50mM,10-50mM,20-50mM,或30-50mM;例如40mM)、尿素为0.5-8M(例如,1-8M,1-6M,或2-6M;例如2M)、非离子型表面活性剂为0-10%(v/v)(例如0.1-1%,例如0.1%)、无机盐为0.5-8M(例如,0.5-1M,例如0.6mM)、缓冲液为0-200mM(例如,50-200mM,或50-150mM;例如,100mM)。
在某些优选的实施方案中,所述试剂组合物包含40mM TCEP和2M尿素。在某些示例性实施方案中,所述试剂组合物由以下成分组成:40mM TCEP、2M尿素、600mM NaCl、100mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)、0.1%Tween-20(v/v)以及余量的水(例如,去离子水)。
在某些优选的实施方案中,所述试剂盒还包含特异性结合HBsAg的第一抗体。在某些优选的实施方案中,所述第一抗体是单克隆抗体。在某些示例性实施方案中,所述第一抗体选自15D1(M1056)、42B6(M1058)、6C10(M10510)、2C1(M1057)、SF(M10517)及其任意组合,其中所述各抗体均来自厦门万泰沧海生物技术有限公司。
在某些优选的实施方案中,本发明涉及所述试剂组合物和所述第一抗体在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于检测受试者的血液样品中HBsAg含量。
在某些优选的实施方案中,所述试剂盒还包括能够识别并结合HBsAg的检测试剂。这类检测试剂是本领域熟知的,包括但不限于能够和HBsAg特异性结合的抗体、靶向多肽或核酸适体。在某些示例性实施方案中,所述检测试剂为能够特异性结合HBsAg的第二抗体。在某些示例性实施方案中,所述第二抗体为多克隆抗体。
在某些优选的实施方案中,所述检测试剂带有可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)或荧光染料。在某些示例性实施方案中,当所述可检测的标记为酶时,所述试剂盒还可以包含显色液,例如用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS或鲁米诺类化合物,或用于碱性磷酸酶的对硝基苯磷酸酯(p-NPP)或AMPPD。
在某些优选的实施方案中,所述试剂盒还包含固相载体,任选地还包含用于将所述第一抗体包被于所述固相载体上的包被试剂,例如包被缓冲液(例如,碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液或硼酸盐缓冲液)。在某些优选的实施方案中,所述固相载体包括由聚合物材料(例如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺或纤维素)制成或包被的凹孔平板、试管、珠粒(例如乳胶颗粒)或薄膜(例如硝酸纤维素膜),或由功能基团(例如氨基、羧基、生物素或亲和素)预包被的磁珠。在某些示例性实施方案中,所述固相载体为微量滴定板,例如微孔板或酶标板。在某些示例性实施方案中,所述固相载体是磁珠。将蛋白或多肽包被于固相载体上的方法是本领域熟知的,例如物理吸附、通过氨基化或羧基化表面实现的共价偶联或通过亲和素-生物素系统、聚赖氨酸预包被表面、蛋白A或蛋白G预包被表面实现的介导结合。
在某些优选的实施方案中,所述第一抗体包被在所述固相载体的表面。在某些示例性实施方案中,所述第一抗体包被在微量滴定板(例如微孔板或酶标板)的表面。在某些示例性实施方案中,所述第一抗体包被在磁珠的表面。
在某些优选的实施方案中,所述试剂盒还包含一种或多种选自下列的试剂或装置:标准品(例如,含有不同已知量的HBsAg的系列样品);阳性对照样品(例如,含有已知量的HBsAg的样品);阴性对照样品(例如,不含有HBsAg的样品);用于终止酶催化底物显色反应的终止液(例如,硫酸、盐酸或氢氧化钠溶液);用于抑制非特异性结合的封闭液;和,采血装置(例如,无热原真空采血管)。
在某些优选的实施方案中,所述试剂盒通过包括下述步骤的方法来检测受试者的血液样品中HBsAg含量:
(1)在所述试剂组合物中将所述血液样品与所述第一抗体接触,以获得免疫复合物;
(2)测定步骤(1)获得的免疫复合物的量;
其中,在步骤(1)中,所述血液样品未经稀释。
在某些优选的实施方案中,在步骤(2)中,通过免疫学检测来测定所述免疫复合物的量。在某些优选的实施方案中,所述免疫学检测是酶免疫测定法或化学发光免疫分析法。在某些示例性实施方案中,所述免疫学检测选自CLEIA检测法和CLIA检测法。在某些实例性实施方案中,在步骤(2)中,使用能够特异性结合HBsAg的第二抗体来检测所述免疫复合物的量,所述第二抗体带有可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)或荧光染料。在此类实施方案中,所述第二抗体与步骤(1)获得的免疫复合物能够形成“抗体-抗原-抗体”三明治式复合物。
在某些优选的实施方案中,在步骤(2)之前,还包括洗涤所述免疫复合物以去除未参与反应的物质的步骤。
在某些优选的实施方案中,所述受试者患有HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。
在某些优选的实施方案中,所述血液样品选自全血、血浆和血清。
发明的有益效果
临床中大部分HBV感染者或者乙肝患者的HBsAg水平远高于目前商业化HBsAg定量试剂的检测上限,因此往往需要对待测样品反复多次进行稀释操作。而稀释过程不仅耗费时间,并且无论是手工稀释还是全自动仪器的自动稀释,都容易降低检测的准确性。
本发明提供了一种包含特定试剂组合物的HBsAg定量检测试剂盒以及基于该试剂组合物建立的HBsAg定量检测方法。与现有技术相比,本发明的技术方案在保证检测准确率的同时,其检测范围能够涵盖临床大部分样本的血清/血浆HBsAg浓度分布范围,因此无需对待测样品进行稀释即可直接检测,极大地简化了操作步骤。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了实施例1中使用制备例2的试剂盒获得的HBsAg定量标准曲线。
图2显示了实施例1中使用制备例2的试剂盒获得的HBsAg定量检测结果与商业化试剂(Roche)检测结果的相关性分析。
图3显示了实施例1中使用制备例2的试剂盒获得的HBsAg定量检测结果与商业化试剂(Abbott)检测结果的相关性分析。
图4显示了对比例1中使用不同配方的解离液进行HBsAg定量检测的曲线图。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明,本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法,基本上参照J.Sambrook等人,分子克隆:实验室手册,第2版,冷泉港实验室出版社,1989,以及F.M.Ausubel等人,精编分子生物学实验指南,第3版,John Wiley&Sons,Inc.,1995中所述的方法进行;限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓,实施例以举例方式描述本发明,且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
制备例1:解离液的制备
配方:40mM TCEP+2M脲+600mM NaCl+100mM CB9.6+0.1%Tween-20。
试剂:TCEP(货号68957)、Tween-20(货号P1379)、NaCl(货号:V900058)、碳酸氢钠(货号:S5761-500g)、尿素(V800441)碳酸钠(V800371)购于Sigma-Aldrich公司。
配制步骤:
1、称取31.8g碳酸钠、58.6g碳酸氢钠,用去离子水溶解后定容至1000mL,配制成1MpH值为9.6的碳酸盐缓冲液(CB)。
2、称取87.66g NaCl,用去离子水溶解后定容至500mL,配制成3M NaCl溶液。
3、称取240.24g尿素,用去离子水溶解后定容至500mL,配制成8M脲溶液。
4、称取5.733g TCEP,用100mL去离子水溶液解,随后加入50mL1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)、125mL 8M脲、100mL 3M NaCl溶液和0.5mL Tween-20,混匀后用去离子水定容至500mL。
制备例2:用于化学发光酶联免疫检测法(CLEIA)的HBsAg检测试剂盒的制备
1.固相化抗体的制备
(1-1)将鼠抗HBsAg单克隆抗体(购自厦门万泰沧海生物技术有限公司)用pH9.6的50mM CB缓冲液(NaHCO3/Na2CO3缓冲液,终浓度为50mM,pH值为9.6)稀释,终浓度为4μg/ml,制得包被液。
(1-2)在96孔化学发光反应板每孔加入100μl前面步骤(1)中制得的包被液,2~8℃包被16~24小时。
(1-3)用PBST洗涤液(20mM PB7.4,150mM NaCl,0.1%Tween20)洗涤1次,以去除未包被的鼠抗HBsAg单克隆抗体。然后每孔加入200μl的封闭液(含有20%婴牛血清、1%BSA及1%酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液),放入37℃封闭2小时;弃去封闭液。干燥后装入铝箔袋2-8℃保存备用。
2.标记抗体的制备
抗HBsAg多克隆抗体的HRP标记采用改良过碘酸钠法。下面以标记10mg抗HBsAg多克隆抗体为例。
(2-1)将浓度为2mg/mL的羊抗HBsAg多克隆抗体(5mL)(购自厦门万泰沧海生物技术有限公司,货号G1051)装入透析袋,对20mM CB缓冲液在4℃透析4小时,中途每2小时更换透析缓冲液1次。
(2-2)准确称取辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)(sigma-Aldrich/77332)40mg,溶解于2mL ddH2O,溶解后加入20mg/mL的NaIO4溶液2ml,室温反应30分钟;加入乙二醇40μL,4℃反应30分钟后制成HRP活化溶液(10mg/mL,4mL)。
(2-3)将经步骤(2-2)制成的HRP活化溶液,加入装有羊抗HBsAg多克隆抗体的透析袋,混匀后继续对20mM CB缓冲液在4℃避光条件下进行透析,中途每2小时更换透析缓冲液1次,透析6-8小时。
(2-4)配制NaBH4溶液(20mg/mL)0.5mL,加入完成步骤(2-3)的标记反应溶液,并混匀,置于4℃避光条件下反应2小时,每30min混匀一次。
(2-5)完成步骤(2-4)后,再次将标记反应溶液装入新的透析袋,对PBS缓冲液在4℃透析4小时。
(2-6)完成(2-5)步骤后,加50%饱和硫酸铵(50%是指在透析袋中硫酸铵的浓度,主要目的是沉淀羊多抗-HRP标记物)。12000rpm离心10min,去上清,沉淀,用终浓度50%甘油+10%NBS(NBS是婴牛血清的缩写)吹溶,混匀后-20℃保存备用。
(2-7)将经(2-6)步骤制得的羊多抗-HRP标记物,按体积比1/4000稀释至酶标记物稀释缓冲液(含有20%小牛血清、1%酪蛋白、10%蔗糖、0.05%氨基比林的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液),制成酶标记物反应液,混匀后2-8℃保存备用。
3.定量标准品
HBsAg中高浓度标本定量检测的定量标准品为含不同浓度的乙型肝炎病毒表面抗原的系列样品,共8个标准品,浓度分别为100000IU/mL、50000IU/mL、10000IU/mL、5000IU/mL、1000IU/mL、500IU/mL、100IU/mL、20IU/mL,体积为500μl/管。表面抗原由厦门万泰凯瑞生物技术有限公司提供可以溯源至NIBSC发布的WHO标准品(Code:00/588),稀释标准品用的基质溶液可以为HBsAg和HBsAb阴性的健康献血者血浆或血清,也可以是含20%婴牛血清的PBS溶液。
4.解离液
制备例1所制备。
制备例3:用于以管式微粒化学发光检测法(CLIA)的HBsAg检测试剂盒的制备
1.抗体标记磁微粒的制备
(1-1)取4mg磁珠(日本JSR公司的MagnosphereMS300/Carboxyl,粒径为3μm),用1mL活化缓冲体系(50mM MES5.0)洗涤2遍,弃上清。加入4mg EDC和4mg NHS试剂(均用50mMMES 5.0配置成10mg/mL),混匀后,室温振荡活化20分钟;
(1-2)将活化好的磁珠用1mL活化缓冲体系(50mM MES 5.0)洗涤3遍,以除去多余的EDC和NHS,弃上清。加入1mL 50mM PH值为6.0的磷酸盐缓冲液和鼠抗HBsAg单克隆抗体160μg,混匀后,室温振荡反应3h;
(1-3)将(1-2)中获得的磁珠用1ml PBST洗涤液(20mM PB7.4,150mM NaCl,0.1%Tween20)洗涤3次后加入1ml封闭缓冲液(20mMPB7.4,1%甘氨酸,0.1%BSA,0.05%吐温-20),混匀后,室温振荡反应3h;
(1-4)将(1-3)步骤获得的封闭好的磁微粒用PBST洗涤液(20mM PB7.4,150mMNaCl,0.1%Tween20)洗涤3次,然后加入1ml保存缓冲液(20mM Tris-HCl缓冲液pH 8.0,0.5%BSA,150mMNaCl,0.5%酪蛋白,0.1%防腐剂)2-8℃保存备用;
(1-5)将包被好的磁微粒用保存缓冲液(20mM Tris-HCl缓冲液pH 8.0,0.5%BSA,150mM NaCl,0.5%酪蛋白,0.1%防腐剂)稀释10倍后,2-8℃保存备用。
2.羊抗HBsAg多克隆抗体的吖啶酯标记
(2-1)取100μg羊抗HBsAg多克隆抗体,加入到300μl标记缓冲体系(50mM磷酸盐缓冲液,PH8.0)中,加入12μL吖啶酯(5mMNHS-SAE),避光室温反应30min。
(2-2)在步骤(2-1)中反应好的标记物中加入200μL终止缓冲液(含100mM甘氨酸的磷酸盐缓冲液,PH8.0),避光室温反应30min。
(2-3)将经过步骤(2-2)的标记物装入透析袋,用透析缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液,pH 7.4)在4℃避光条件下进行透析,中途每2小时更换透析缓冲液1次,透析6-8小时。
(2-4)将步骤(2-3)所得标记物移入保存管,加入2%BSA和50%甘油,-20℃保存备用。
(2-5)将经(2-4)步骤制得的吖啶酯标记物,按体积比1/3000稀释至吖啶酯标记物稀释缓冲液(含有0.5%BSA、0.5%酪蛋白、0.05%吐温-20和0.1%防腐剂的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液),制成发光记物反应液,混匀后2-8℃保存备用。
3.定量标准品
使用与制备例2步骤3中的相同的定量标准品作为本制备例的试剂盒的定量标准品。
4.解离液
制备例1所制备。
实施例1:临床样本中HBsAg的定量检测
1.实验试剂/试剂盒
制备例2的试剂盒。
2.实验方法
选取38份慢性乙型肝炎患者的血清(编号P1~P38),按照下列步骤进行HBsAg的定量检测。
(1)样品反应:取已包被的化学发光反应板一块,每孔加入90μL解离液,每孔再加入10μL标本或者标准品,震荡混匀后,置于37℃温箱反应30分钟。
(2)酶标记物反应:完成步骤(1)后,将化学发光反应板用PBST洗液(20mM PB7.4,150mM NaCl,0.1%Tween20)洗涤5遍,以去除反应解离液和未反应的样本。每孔加入100μL如制备例2中的步骤(2-7)制备的酶标记物反应液,置于37℃温箱反应30分钟。
(3)发光反应和测量:完成步骤(2)后,将化学发光反应板用PBST洗液(20mMPB7.4,150mM NaCl,0.1%Tween20)洗涤5遍,以除去多余的酶标记物反应液。每孔加入Pierce公司生产的PICO Chemiluminescent Substrate 100μL,立即采用Orin II化学发光检测仪读取各反应孔发光值(RLU)。
(4)定量标准曲线的绘制:完成步骤(3)后,对8个定量标准品的测量值及其对应浓度进行线性回归,获得标准曲线。结果如图1所示,结果显示,上述检测方法能准确定量的上限值为100000IU/mL,下限值为20IU/mL,其线性动力学范围为3.5个数量级。由RLU测量值计算HBsAg浓度的公式为:Conc.HBsAg(IU/mL)=10(Log10(RLU)-2.7252)/×0.8668。
(5)待测样品HBsAg浓度的获得:P1~P38样本经(1)-(4)的步骤测量后,可获得对应样本的RLU值;将上述测量值代入步骤(4)中获得的HBsAg浓度计算公式,从而计算获得样本中乙型肝炎病毒表面抗原的浓度。
同时,对于同一批样本使用Roche乙型肝炎病毒表面抗原定量检测试剂盒(100测试/盒,货号:07143737190)和Abbott乙型肝炎病毒表面抗原定量检测试剂盒(100测试/盒,货号:6C36)进行检测;操作完全按试剂盒的说明书进行,并且Roche和Abbott的试剂盒是配套各自公司的全自动化学发光仪来检测的,样品的稀释及检测均由仪器自动化运行。
3.实验结果
使用制备例2的试剂盒、Roche试剂盒(100测试/盒,货号:07143737190)和Abbott试剂盒对同一批样品进行检测的结果分别如表1所示。
表1:样本P1~P38中乙型肝炎病毒表面抗原的浓度测定
对表1中检测结果进行定量相关性分析,结果分别如图2和图3所示。其中,图2显示了制备例2的试剂盒对38份临床样本的检测结果与Roche试剂检测结果的相关性分析结果,结果显示,两者相关性系数R2为0.9448。图3显示了制备例2的试剂盒与Abbott试剂检测结果的相关性结果,结果显示,两者相关性系数R2为0.95。以上结果表明,本发明的试剂盒具有良好的检测准确性。
另外,本发明人使用制备例2的试剂盒对747例临床HBsAg阳性样本进行了检测,从而对样本浓度分布范围进行了统计。结果如表2所示,92.1%的临床样本浓度分布在本发明的试剂盒检测范围20~100000IU/mL内,相比之下,仅有25.97%的样本浓度分布在常规HBsAg定量检测试剂检测范围内(0.05~250IU/mL)。
表2:临床HBsAg阳性样本浓度分布范围
对比例1:不同配方的解离液对检测上限的影响
1、实验试剂:乙型肝炎病毒表面抗原测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)(购自厦门万泰凯瑞生物技术有限公司);制备例1的解离液、40mM TCEP溶液、600mM NaCl溶液、2M脲溶液和6M脲。
2、实验样本:取HBsAg浓度为100000IU/mL的样本用HBsAg和HBsAb均为阴性的样本进行3倍梯度稀释,直至0.03IU/mL。
3、实验步骤:
(1)样品反应:取20μL样本加入反应管,分别加入100μL制备例1中制备的解离液、2M脲、6M脲、600mM NaCl、40mM TCEP溶液,随后加入50μl厦门万泰凯瑞生物技术有限公司生产的乙型肝炎病毒表面抗原测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)中的磁微粒试剂,震荡混匀后,置于37℃温箱反应15分钟。
(2)发光标记物反应:完成步骤(1)后,将化学发光反应管用PBST洗液(20mMPB7.4,150mM NaCl,0.1%Tween20)洗涤2遍,每孔加入50μL厦门万泰凯瑞生物技术有限公司生产的乙型肝炎病毒表面抗原测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)中的吖啶酯标记试剂,置于37℃温箱反应10分钟。
(3)发光反应的测量:完成步骤(2)后,将化学发光反应管用PBST洗液(20mMPB7.4,150mM NaCl,0.1%Tween20)洗涤4遍,用Sirius-L单管式化学发光检测仪通过原位进样注入激发液,同时进行光强检测。
(4)定量标准曲线的绘制:完成步骤(3)后,对100000IU/mLHBsAg样本3倍梯度稀释后的一系列样本的测量值及其对应浓度进行线性回归,获得定量标准曲线。
结果如图4所示,使用40mM TCEP或2M脲作为解离液时,检测结果接近,两者的检测上限约为3700IU/mL,相比于常规HBsAg检测方法提高了10倍多;相比之下,使用制备例1的解离液时,检测上限可达到100,000IU/mL,相比于常规HBsAg检测方法提升了400倍。以上结果表明,本发明的解离液能够在保证检测准确率的同时,显著提高检测上限,其单次检测能准确定量的线性动力学范围达3.5个数量级,从而使得大部分临床标本的检测无需进行繁琐的稀释处理,大大提高了检测效率。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,但本领域技术人员将理解:根据已经公开的所有教导,可以对细节进行各种修改和变动,并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (9)
1.一种试剂盒,其包含特异性结合HBsAg的第一抗体和试剂组合物,所述试剂组合物包含三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)和尿素;
优选地,所述试剂组合物还包括一种或多种选自下列的试剂:非离子型表面活性剂、无机盐和缓冲液;
优选地,所述非离子型表面活性剂选自Chaps、磺基甜菜碱(sulfobetaine)系列的表面活性剂、Triton系列的去污剂、Tween系列的去污剂及其任意组合;优选地,所述非离子型表面活性剂选自SB14、SB16、Tween-20、Tween-40、Triton X-100及其任意组合;更优选地,所述非离子型表面活性剂为Triton X-100和/或Tween-20;
优选地,所述无机盐选自NH4SO4和NaCl;
优选地,所述缓冲液为碳酸盐缓冲液;
优选地,所述试剂组合物包含TCEP、尿素以及余量的水;或者,所述试剂组合物包含TCEP、尿素、无机盐(例如,NaCl)以及余量的水;或者,所述试剂组合物包含TCEP、尿素、无机盐(例如,NaCl)、非离子型表面活性剂(例如,Tween-20)以及余量的水;或者,所述试剂组合物包含TCEP、尿素、无机盐(例如,NaCl)、非离子型表面活性剂(例如,Tween-20)、缓冲液(例如,碳酸盐缓冲液)以及余量的水。
2.权利要求1的试剂盒,其中,所述试剂组合物中的各成分的含量为:TCEP为1-100mM(例如,1-50mM,10-50mM,20-50mM,或30-50mM;例如40mM)、尿素为0.5-8M(例如,1-8M,1-6M,或2-6M;例如2M)、非离子型表面活性剂为0-10%(v/v)(例如0.1-1%,例如0.1%)、无机盐为0.5-8M(例如,0.5-1M,例如0.6mM)、缓冲液为0-200mM(例如,50-200mM,或50-150mM;例如,100mM);
优选地,所述试剂组合物包含40mM TCEP和2M尿素;
优选地,所述试剂组合物由以下成分组成:40mM TCEP、2M尿素、600mM NaCl、100mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)、0.1%Tween-20(v/v)以及余量的水(例如,去离子水)。
3.权利要求1或2的试剂盒,其中,所述试剂盒还包括能够识别并结合HBsAg的检测试剂,例如能够特异性结合HBsAg的第二抗体;
优选地,所述检测试剂带有可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)或荧光染料;
优选地,所述试剂盒还包含固相载体,例如微量滴定板(例如微孔板或酶标板)或磁珠;
优选地,所述试剂盒包含表面包被有所述第一抗体的固相载体。
4.权利要求1-3任一项的试剂盒,其中,所述试剂盒还包含一种或多种选自下列的试剂或装置:标准品(例如,含有不同已知量的HBsAg的系列样品);阳性对照样品(例如,含有已知量的HBsAg的样品);阴性对照样品(例如,不含有HBsAg的样品);用于终止酶催化底物显色反应的终止液(例如,硫酸、盐酸或氢氧化钠溶液);用于抑制非特异性结合的封闭液;和,采血装置(例如,无热原真空采血管)。
5.一种反应体系,其包含HBsAg、特异性结合HBsAg的第一抗体和试剂组合物,其中,所述试剂组合物如权利要求1或2中所定义。
6.一种定量检测含有HBsAg的样品中HBsAg含量的方法,其包括以下步骤:
(1)在试剂组合物中将所述样品与特异性结合HBsAg的第一抗体接触,以获得免疫复合物;
(2)测定步骤(1)获得的免疫复合物的量;
其中,在步骤(1)中,所述试剂组合物如权利要求1或2中所定义;
优选地,所述样品是血液样品,例如全血、血浆或血清;
优选地,所述血液样品未经稀释;
优选地,所述第一抗体包被在固相载体的表面;优选地,所述第一抗体包被在微量滴定板(例如微孔板或酶标板)或磁珠的表面;
优选地,在步骤(2)之前,还包括洗涤所述免疫复合物以去除未参与反应的物质的步骤。
7.权利要求6的方法,其中,在步骤(2)中,通过免疫学检测来测定所述免疫复合物的量;
优选地,所述免疫学检测是酶免疫测定法或化学发光免疫分析法;优选地,所述免疫学检测选自CLEIA检测法和CLIA检测法;
优选地,在步骤(2)中,使用能够特异性结合HBsAg的第二抗体来检测所述免疫复合物的量,所述第二抗体带有可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)或荧光染料。
8.试剂组合物在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于检测受试者的血液样品中HBsAg含量,其中所述试剂组合物如权利要求1或2中所定义;
优选地,所述试剂盒还包含特异性结合HBsAg的第一抗体;
优选地,所述试剂盒还包括能够识别并结合HBsAg的检测试剂,例如能够特异性结合HBsAg的第二抗体;
优选地,所述检测试剂带有可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)或荧光染料;
优选地,所述试剂盒还包含固相载体,例如微量滴定板(例如微孔板或酶标板)或磁珠;
优选地,所述第一抗体包被在所述固相载体的表面。
9.权利要求8的用途,其中,所述试剂盒通过包括下述步骤的方法来检测受试者的血液样品中HBsAg含量:
(1)在所述试剂组合物中将所述血液样品与所述第一抗体接触,以获得免疫复合物;
(2)测定步骤(1)获得的免疫复合物的量;
其中,在步骤(1)中,所述血液样品未经稀释;
优选地,在步骤(2)中,通过免疫学检测(例如,酶免疫测定法或化学发光免疫分析法)来测定所述免疫复合物的量;
优选地,在步骤(2)中,使用能够特异性结合HBsAg的第二抗体来检测所述免疫复合物的量,所述第二抗体带有可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)或荧光染料;
优选地,在步骤(2)之前,还包括洗涤所述免疫复合物以去除未参与反应的物质的步骤;
优选地,所述受试者患有HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝);
优选地,所述血液样品选自全血、血浆和血清。
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Cited By (1)
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---|---|---|---|---|
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Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023057823A1 (en) * | 2021-10-10 | 2023-04-13 | Alipour Elias | Detecting an antigen of a virus using electrochemical analysis |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1197927A (zh) * | 1997-04-25 | 1998-11-04 | 武汉市第七医院 | 一种直接检测血清乙肝病毒核心抗原试剂 |
CN101600959A (zh) * | 2006-12-28 | 2009-12-09 | 雪印乳业株式会社 | 肽和蛋白的定量方法 |
US20150218274A1 (en) * | 2014-01-31 | 2015-08-06 | Novartis Ag | Antibody molecules to tim-3 and uses thereof |
CN106153935A (zh) * | 2015-03-26 | 2016-11-23 | 广州瑞博奥生物科技有限公司 | 一种定量检测CD79α的酶联免疫试剂盒 |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL154598B (nl) | 1970-11-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking. |
US3817837A (en) | 1971-05-14 | 1974-06-18 | Syva Corp | Enzyme amplification assay |
US3939350A (en) | 1974-04-29 | 1976-02-17 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation |
US3996345A (en) | 1974-08-12 | 1976-12-07 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
US4277437A (en) | 1978-04-05 | 1981-07-07 | Syva Company | Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay |
US4275149A (en) | 1978-11-24 | 1981-06-23 | Syva Company | Macromolecular environment control in specific receptor assays |
US4366241A (en) | 1980-08-07 | 1982-12-28 | Syva Company | Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays |
US4847080A (en) | 1984-03-07 | 1989-07-11 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipide vesicle carriers |
TR200003024T2 (tr) * | 1998-04-17 | 2000-12-21 | Innogenetics N.V. | İndirgeme ajanlarını kullanarak geliştirilen immünodiagnostik tahliller. |
GB0224688D0 (en) * | 2002-10-23 | 2002-12-04 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Method |
US20090017443A1 (en) * | 2004-05-19 | 2009-01-15 | Advanced Life Science Institute, Inc. | Method for Detection of Hepatitus B Virus |
WO2006033368A1 (ja) * | 2004-09-22 | 2006-03-30 | Advanced Life Science Institute, Inc. | B型肝炎ウイルスs抗原の検出法 |
GB0428394D0 (en) | 2004-12-24 | 2005-02-02 | Chiron Srl | Saccharide conjugate vaccines |
US20090098531A1 (en) * | 2007-09-13 | 2009-04-16 | Abbott Laboratories | Detecting hepatitis b virus |
US20090280474A1 (en) | 2008-05-08 | 2009-11-12 | Abbott Laboratories | Method for detecting a virus |
IN2012DN00446A (zh) | 2009-07-30 | 2015-05-15 | Pfizer Vaccines Llc | |
CN102081018A (zh) * | 2009-11-30 | 2011-06-01 | 希森美康株式会社 | 样品的预处理方法及hcv的免疫测定方法 |
CN106443000B (zh) * | 2013-01-28 | 2019-08-16 | 希森美康株式会社 | 用于检测HBs抗原的样品的预处理方法及其利用 |
JP6041824B2 (ja) * | 2014-03-22 | 2016-12-14 | 日本特殊陶業株式会社 | スパークプラグ、および、点火システム |
WO2019107279A1 (ja) * | 2017-11-30 | 2019-06-06 | 富士レビオ株式会社 | B型肝炎ウイルスs抗原の測定方法及び測定キット |
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1197927A (zh) * | 1997-04-25 | 1998-11-04 | 武汉市第七医院 | 一种直接检测血清乙肝病毒核心抗原试剂 |
CN101600959A (zh) * | 2006-12-28 | 2009-12-09 | 雪印乳业株式会社 | 肽和蛋白的定量方法 |
US20150218274A1 (en) * | 2014-01-31 | 2015-08-06 | Novartis Ag | Antibody molecules to tim-3 and uses thereof |
CN106153935A (zh) * | 2015-03-26 | 2016-11-23 | 广州瑞博奥生物科技有限公司 | 一种定量检测CD79α的酶联免疫试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
XIAOHAI LI 等: "Comparison of alternative analytical techniques for the characterisation of the human serum proteome in HUPO Plasma Proteome Project", 《PROTEOMICS》 * |
张超 等: "转 HBsAg 基因樱桃番茄组培苗叶片总蛋白双向电泳体系的建立", 《核农学报》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110954692A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-03 | 蓝怡科技集团股份有限公司 | 一种还原剂缓冲液及其制备方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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