CN1197927A - 一种直接检测血清乙肝病毒核心抗原试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种直接检测血清乙肝病毒核心抗原试剂,采用抗原抗体复合物进行双抗体包被、固相裂解和使用促进剂,其特征在于采用12孔聚苯乙烯酶标板条、将抗－HBs、抗－HBc同时包被于固相载体上、HRP－抗－HBc、MC－抗HBc、MC－抗－HBs、裂解剂为NP－40、巯基乙醇、Tris缓冲液、促进剂为PEG,按常规方法操作。本发明操作简便快速,反应模式清晰,结果易判,适用于临床和基层医院。

Description

一种直接检测血清乙肝病毒核心抗原试剂
本发明属于一种直接检测乙型肝炎病毒核心抗原的体外诊断试剂。
乙型肝炎病毒(HBV)颗粒，又称Dane颗粒，乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)存在于Dane颗粒的核心和乙型肝炎患者的肝细胞核内，是乙型肝炎病毒直接复制指标。由于血清内极少有游离核心抗原，故用常规方法不能检出。有关核心抗原的检测，从70年代以来国内外学者就进行了研究和报道。1975年Kaplan和Jan，Desmyter报道，供血者一受血者临床和血清学的反应中有HBcAg检测一项，方法是用Parcell等用的RIA。1976年，Takahashi用IAHA法检测血清中HBcAg。1977年Howard Zuckerman Roberts报道用离心沉淀法和NP-40及二巯基乙醇检测HBcAg用RIA。在国内也曾报道过以下几种方法，一种是固相放射免疫法(RIA)，1986年刘锡光等在病毒性肝炎实验诊断专著中详细介绍了血清中HBcAg的检测方法，采用抗原抗体复合物的原理，在待检标本内加入过量的抗-HBs，和适量的NP-40脱蛋白外壳，然后采用固相放射免疫法检测血清HBcAg。该法特异性好，敏感度高，但需r射线测定仪等设备条件；另一种试管法，1986年黄华芳等在病毒学杂志中关于RIA法及ELISA法检测血清中HBcAg的报道，在试管中利用抗-HBs与样品中的HBsAg(即Dane颗粒)形成HBsAg，抗-HBs复合物，然后将此免疫复合物多次离心沉淀，洗净沉淀物中之抗-HBc，再加NP-40，使Dane颗粒脱壳裂解，释放出HBcAg。用抗-HBc包被聚苯乙烯酶标板，将裂解物加入酶标板后，加入酶标记抗-HBc，即可检测样品中的HBcAg，此方法操作程序繁琐，流程长，反复离心沉淀，易丢失被检成份而致假阴性；再一种是斑点ELISA法，1989年，喻植群等在上海免疫学杂志上报道用斑点ELISA检测血清HBcAg，其方法是在样品中加入抗-HBs处理后，通过抽滤反应物(Dane颗粒，抗-HBs结合物)至NC(硝酸纤维膜)上，干燥过液后，用硫氰化钠裂解HBV壳蛋白，暴露HBcAg后再与酶标记抗-HBc反应，即可检测样品中HBcAg，此方法阳性检出率较试管的方法高，但样品用量大，操作流程也较长，不适于大批量标本检测。
本发明的目的是提供了一种直接检测血清乙肝病毒核心抗原试剂，利用双抗体同时包被于微孔板和固相化孔内裂解乙型肝炎病毒Dane颗粒，操作程序简便快速，结果易判。
为达到上述的目的，本发明采用以下技术方案：一是采用抗原抗体复合物的形成及乙肝病毒抗原至少有两个能与抗体结合的位点，将抗-HBs、抗-HBc同时包被于固相载体上，当加入样品时，样品中的HBsAg(即Dane颗粒)与载体上的抗-HBs形成固相HBsAg，抗-HBs免疫复合物；二是固相裂解。固相化的免疫复合物的HBsAg若有Dane颗粒，在微孔板内经裂解剂进行固相裂解HBVDane颗粒壳蛋白，HBcAg即释放入孔内，并与原来固相于孔内的抗-HBc结合，形成固相HBcAg，抗-HBc免疫复合物，该复合物的HBcAg可与加入的抗-HBc酶标记物结合形成双抗体夹心；三是采用促进剂。使用促进剂其目的是为了促使形成更多的固相化的HBsAg。抗-HBs免疫复合物，当固相孔内裂解后，HBcAg的释放量增多，从而提高了检测HBcAg的灵敏度。其特征采用12孔聚苯乙稀酶标板条、将抗-HBs、抗-HBc同时包被于固相载体上、HRP-抗-HBc、MC-抗-HBc、MC-抗-HBs裂解剂即NP-40、硫基乙醇、Tris缓冲液、促进剂即PEG，按常规方法操作。包被物抗-HBs。抗-HBc包被于12孔聚苯乙烯酶标板条，主要使加入的样品中的HBsAg(即Dane颗粒)形成固相的抗-HBs、HBsAg复合物，加入促进剂后使固相化的抗原抗体免疫复合物形成更多，加入裂解剂进行孔内固相裂解，使HBcAg游离，再次与固相于孔内的抗-HBc结合，形成固相的抗-HBc.HBcAg免疫复合物，加入酶标记抗-HBc形成双抗体夹心，进行检测HBcAg。
本发明与现有技术相比具有以下优点：筒化了检测血清HBcAg的操作程序，特异性好，与HBV-DNA探针阳性符合率为91.4％，不须特殊仪器设备，直接在微孔板内检测，操作简便快速，反应模式清晰，结果易判。且与乙肝“二对半”同步检测，完善了ELISA法检测血清乙型肝炎病毒三系标志。患者血清内如有HBVDane颗粒，经裂解剂裂解后，检测HBcAg阳性，即表示HBV在体内复制，具有极强的传染性，HBcAg检测可作为疾病传染性和乙肝活动性病变的标志，作为抗病毒及免疫治疗的有效指标。该发明适用于临床和基层医院。
实施例(按以下方法和步聚)：
1、包被缓冲液：无水Na2co31.6g
                   NaHco3 2.9g
                   NaN3   0.2g
                   H2O至  1000ml；
2、包被双抗体：将抗-HBs、抗-HBc同时包被于固相载体上；
3、HRP-抗HBc稀释液：NaCl           8g
                    KH2PO4      0.2g
              无水  Na2HPO4     1.14g
                    KCl           0.2g
                    NaN3         0.2g
                    正常人血清    10-100ml
                    H2O至        1000ml；
4、底物缓冲液A：    Na2HPO4     7.3g
                    柠檬酸        5.1g
                    30％H2O2    1.0ml
                    无水乙醇      30ml
                    H2O至        1000ml；
5、底物缓冲液B：    TMB           1.0g
                    无水乙醇      1000ml
                    无H2O2底物缓冲液A 2000ml；
6、终止液：         2molH2SO4   溶液；
7、12孔聚苯乙烯酶标板条；
8、MC-抗-HBc：工作浓度    1∶300-3000；
9、MC-抗-HBs：工作浓度    1∶200-1000；
10、HEP-抗-HBc：工作浓度  1∶300-1500；
11、促进剂：PEG           0.05-1.5％；
12、裂解剂：    NP-40     1-9％
               巯基乙醇   0.05-1.5％
       Tris缓冲液    0.05-1.0M
                     PH  7.5；
13、阳性参考血清；
14、阴性参考血清；
15、洗涤液：  25％吐温-20  1.0m临用前洗入500ml 0.85-0.9％生理盐水内。

Claims (6)

1、一种直接检测血清乙肝病毒核心抗原试剂，其特征是：
A、12孔聚苯乙烯酶标板条；
B、将抗-HBs、抗-HBc同时包被于固相载体上；
C、HRP-抗-HBc；
D、MC-抗-HBc
E、MC-抗-HBs；
F、裂解剂为NP-40、巯基乙醇、Tris缓冲液；
G、促进剂为PEG。
2、根据权利要求1所述的一种直接检测血清乙肝病毒核心抗原试剂，其特征是HRP-抗-HBc工作浓度为1∶300-1500。
3、根据权利要求1所述的一种直接检测血清乙肝病毒核心抗原试剂，其特征是MC-抗-HBc工作浓度为1∶300-3000。
4、根据权利要求1所述的一种直接检测血清乙肝病毒核心抗原试剂，其特征是MC-抗-HBs工作浓度为1∶200-1000。
5、根据权利要求1所述的一种直接检测血清乙肝病毒核心抗原试剂，其特征是PEG为0.05-1.5％。
6、根据权利要求1所述的一种直接检测血清乙肝病毒核心抗原试剂，其特征是：
NP-40         1-9％
巯基乙醇      0.05-1.5％
Tris缓冲液    0.05-1.0M PH7.5。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008003236A1 (fr) * 2006-06-27 2008-01-10 Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. Procédé de détection conjointe de l'antigène pres1 et de l'antigène de noyau de vhb, coffret d'expérimentation, substrat solide et solution de lyse de virus
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CN101501495B (zh) * 2005-07-05 2013-10-02 西托斯科莱顿股份有限公司 Rho蛋白质检测
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