CN106950385A - 一种血小板抗体检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种血小板抗体检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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CN106950385A CN201710372209.4A CN201710372209A CN106950385A CN 106950385 A CN106950385 A CN 106950385A CN 201710372209 A CN201710372209 A CN 201710372209A CN 106950385 A CN106950385 A CN 106950385A
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Abstract

本发明提供一种血小板抗体检测试剂盒及其使用方法，所述血小板抗体检测试剂盒包括检测板(1)、凝胶管(2)和封口膜(3)，所述凝胶管(2)有六个，呈左右排列设置在检测板(1)的顶端，所述封口膜(3)设置在检测板(1)的上方，且覆盖在六个凝胶管(2)的顶端，所述六个凝胶管(2)中包含抗人球蛋白试剂和葡聚糖凝胶，其中第一和第六凝胶管分别为阳性对照管和阴性对照管，第二到第四凝胶管作为反应管，本发明的血小板抗体检测试剂盒中采用抗人IgG及IgG致敏红细胞作为指示系统，以取代抗人IgG包被的醛化红细胞，检测结果清晰准确，可重复性强，检测结果同时达到肉眼和自动化机器准确判读的效果，检测结果易于标准化。

Description

一种血小板抗体检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于输血检验技术领域，涉及一种血小板抗体检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
随着肿瘤、血液系统疾病患者的显著增加及临床输血医学的快速发展，血小板输用量逐年攀升。血小板输血作为提升血小板计数，防止出血，保障患者生命安全的有效措施，其安全、科学、有效的输注已成为临床输血技术发展的必然要求。然而，目前我国大多数血小板输血仍然采用随机输注(即“盲输”)，不相合的血小板输入患者体内后迅速被机体免疫系统破坏清除，导致血小板输注无效症频繁发生，不仅浪费了宝贵的血小板资源，而且延误了患者的最佳治疗时机，还增加了患者痛苦和经济负担。目前血小板抗体主要有血小板同种异体抗体，包括HLA抗体，HPA抗体及其它血小板反应性抗体。血小板自身抗体，包括患者自身血小板结合抗体和自身游离抗体。血小板抗体主要在肿瘤患者、白血病、再生障碍性贫血、溶血性贫血、特发性血小板减少症、新生儿血小板减少症、骨髓异常综合症﹑妊娠史等血小板输注无效疾病患者中存在，同时会存在各种血小板抗体产生的临床综合症。
为改善这一现状，提高患者血小板输血效果，国内部分临床医院新增开展了血小板抗体检测项目。目前已存在的血小板血型检测技术有：血小板免疫荧光试验、酶联免疫吸咐试验；混合被动血凝技术、混合细胞粘附试验(固相技术)、特异的单克隆抗体对血小板抗原固定试验等，但这些试验的操作程序都比较复杂，需要时间长，有的所需设备仪器昂贵，所以血小板血型配型到目前还没有成为临床血小板输血的常规检测项目，部分项目在临床开展过程中因准确性和灵敏度达不到安全输血要求，操作过于繁琐，逐渐被临床淘汰。目前临床常用的固相红细胞吸附试验技术(solid-phase red cell adherence,SPRCA)和单克隆特异的血小板抗原固定试验(monoclonal antibody-specific immobilization ofplatelet antigens assay,MAIPA)，SPRCA技术原理为在反应板中包被抗血小板单克隆抗体，血小板悬液经离心洗涤后可在反应孔底部形成血小板单层。加入血清或血浆，在孔中经过孵育后，若该血清或血浆中含有血小板抗体，则该抗体与反应孔中的血小板单层结合，未结合的成分通过洗涤被去除。加入抗人IgG及人IgG致敏红细胞(指示红细胞)，经离心后指示红细胞通过抗人IgG的桥连与血小板单层上的血小板抗体结合，因此阳性反应为指示红细胞平铺在反应孔底部表面。而阴性反应为指示红细胞在离心力的作用下聚集于反应孔底部中央；MAIPA技术原理为血小板先结合人的同种抗体，然后与不同的抗血小板膜糖蛋白的(抗GPIb、GPIIb、GPIIIa、GPIX、HLA等)鼠抗人血小板单克隆抗体孵育。经洗涤后裂解血小板，将产物移至包被的羊抗鼠IgG微孔板内，通过辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG，经酶底物显色可以检测血小板膜糖蛋白特异的同种抗体。
以上方法进行血小板抗体定性检测时，其灵敏度和特异性仅有30％-40％，结果判读存在人为误差，约几个小时才能完成检测，不能满足了临床医生的快速需求，同时该技术也没有相应的质控技术。目前国内只有少部分临床开展了该方法的血小板抗体检测，部分也只是试用阶段。为了克服临床上其他血小板抗体检测方法灵敏度低，特异性差，临床操作复杂，检测时间过长，结果判读困难、缺乏相应的试剂质控等实际问题；现有微柱凝胶法进行的血小板抗体检测指示红细胞一般会采用化学试剂(如戊二醛)将红细胞醛化处理，然后包被抗人IgG来指示反应结果，该方法不仅技术要求高，操作时间长(需静置过夜)，且醛化红细胞破坏抗原结构，容易造成漏检，因此限制了使用，难以达到临床快速安全配血要求。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种血小板抗体检测试剂盒及其使用方法。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种血小板抗体检测试剂盒，所述血小板抗体检测试剂盒包括检测板(1)、凝胶管(2)和封口膜(3)，所述凝胶管(2)有六个，呈左右排列设置在检测板(1)的顶端，所述封口膜(3)设置在检测板(1)的上方，且覆盖在六个凝胶管(2)的顶端，所述六个凝胶管(2)中包含抗人球蛋白试剂和葡聚糖凝胶，其中第一和第六凝胶管分别为阳性对照管和阴性对照管，第二到第四凝胶管作为反应管。
优选地，所述每个凝胶管(2)从上到下均包括管口(2.1)、缓冲腔(2.2)和反应腔(2.3)，所述管口(2.1)的开口朝上。
优选地，所述每个凝胶管(2)的外壁还设有两块支撑板(2.4)，所述两块支撑板(2.4)分别设置于每个凝胶管(2)的前后方。
优选地，所述检测板(1)为聚丙烯塑料透明板。
优选地，所述六个凝胶管中葡聚糖凝胶的体积为凝胶管体积的2/3。
优选地，所述葡聚糖凝胶为G-25、G-50、G-100、S-100或S-200。
优选地，所述六个凝胶管中还含有咪唑缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钠、叠氮钠和吐温-20中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述咪唑缓冲液中咪唑的摩尔浓度为0.1-1M，例如0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M或1M。
优选地，所述牛血清白蛋白在每个凝胶管中的质量体积终浓度为1-10％，例如1％、1.3％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％。
优选地，所述氯化钠在每个凝胶管中的质量体积终浓度为0.5-1％，例如0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％。
优选地，所述叠氮钠在每个凝胶管中的质量体积终浓度为0.1-1％，例如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％。
优选地，所述吐温-20在每个凝胶管中的体积浓度为0.1-2％，例如0.1％、0.3％、0.5％、0.7％、0.9％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％或2％。
在本发明中，所述在每个凝胶管中各组分的质量体积终浓度是指每个组分的质量与每个凝胶管中总物质的体积之比，吐温-20在每个凝胶管中的体积浓度是指吐温-20的体积与每个凝胶管中总物质的体积之比。
另一方面，本发明提供一种利用如上所述的血小板抗体检测试剂盒的使用方法，所述方法为：
在所述小板抗体检测试剂盒的阳性对照管中加入含有抗人血小板抗体的阳性质控、血小板指示红细胞、血小板抗原进行阳性反应；在阴性对照管中加入不含有抗人血小板抗体的阴性质控、血小板指示红细胞、血小板抗原进行阴性反应；在反应管中加入血小板指示红细胞、血小板抗原和待检血清样本进行反应。
优选地，所述血小板指示红细胞由以下方法制备得到：采集新鲜O型Rh(D)阳性EDTA抗凝的压积红细胞，将抗血小板糖蛋白Ib/IX单克隆抗体与红细胞混匀，0-4℃(例如0℃、0.5℃、1℃、1.5℃、2℃、2.5℃、3℃、3.5℃或4℃)过夜，生成IgG致敏红细胞，洗涤去除未结合的IgG，用红细胞保存液配制成0.8％的指示红细胞悬液。
优选地，所述抗血小板糖蛋白Ib/IX单克隆抗体与红细胞的体积比为(1-3):1，例如但不限于1:1、1.5:1、2:1、2.5:1或3:1。
优选地，所述0.8％指示红细胞悬液的鉴定方法为:1)直接抗球蛋白试验结果强阳性；2)红细胞IgG结合量检测:将抗IgG试剂倍比稀释，加入1滴0.8％指示红细胞，离心后显微镜下观察至不凝集管的前1管作为滴度，以此滴度作为IgG结合量滴度；保存期检测:直接抗球蛋白试验结果肉眼观察凝集强度﹥3+，IgG结合量滴度﹥32。
优选地，所述血小板指示红细胞用低离子强度盐溶液进行稀释。
优选地，所述低离子强度盐溶液为包括质量体积终浓度如下的组分的的混合溶液：0.1％-0.9％(例如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％或0.9％)氯化钠、1％-10％(例如1％、1.3％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％)甘氨酸、0.23-0.25g/L(例如0.23g/L、0.24g/L或0.25g/L)磷酸二氢钾、0.4-0.5g/L(例如0.4g/L、0.42g/L、0.45g/L、0.48g/L或0.5g/L)磷酸氢二钠、0.1％-1％(例如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)叠氮钠。
在本发明中，所述血小板指示红细胞用低离子强度盐溶液稀释的倍数根据测定时的要求，本领域技术人员可以根据需求确定。
在本发明中，所述血小板抗原由以下制备方法制备得到：提取O型健康志愿者血小板，然后用西林瓶进行分装，血小板浓度在(50-150)×109/L(例如50×109/L、55×109/L、60×109/L、65×109/L、70×109/L、75×109/L、85×109/L、95×109/L、100×109/L、125×109/L、150×109/L)，O型志愿者血小板分装体积0.5mL/瓶，而后将血小板抗原低温冷冻干燥，真空条件下进行密封包装，备用。
优选地，所述冷冻干燥时冻干机的真空度为1-15Pa(例如1Pa、3Pa、5Pa、7Pa、9Pa、10Pa、12Pa或15Pa)，冻干温度为-40℃至35℃(例如-40℃、-30℃、-10℃、-5℃、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃或35℃)。
优选地，所述冷冻干燥工艺曲线包括但不限于以下的一种或几种：曲线1：-40℃、2h—-20℃、2h—-10℃、2h—0℃、2h—10℃、2h—20℃、2h—30℃、2h—35℃、4h以上—真空压盖密封。曲线2：-40℃、2h—-30℃、2h—-20℃、2h—-10℃、2h—0℃、2h—10℃、2h—20℃、2h—30℃、4h以上—真空压盖密封。曲线3：-40℃、2h—-35℃、2h—-30℃、2h—-25℃、2h—-20℃、2h—-15℃、2h—-10℃、2h—-5℃、2h—0℃、2h—5℃、2h—10℃、2h—15℃、2h—20℃、2h—25℃、2h—30℃-35℃、4h以上—真空压盖密封。
优选地，所述含有抗人血小板抗体的阳性质控含有抗人血小板抗体及质量体积浓度0.1％的叠氮钠。
优选地，所述不含有抗人血小板抗体的阴性质控含有质量体积浓度0.1％的叠氮钠。
在本发明中，所述溶液的质量体积终浓度(例如质量体积浓度0.1％的叠氮钠)是指溶质质量/溶液体积。
在本发明中，将低离子强度盐溶液，血小板抗原、待检患者样本、血小板指示红细胞一次加入血小板抗体检测卡中，如果待测样本中存在血小板抗体，则结合了血小板抗原的血小板指示红细胞将会与血小板抗体结合，形成抗原抗体复合物(血小板抗体-血小板抗原-指示红细胞复合物)。如待测血清中无血小板抗体，离心后指示红细胞沉于微柱管凝胶尖底部，呈现阴性反应。
在本发明中，在于对血小板抗体检测试剂进行质控测试，将低离子强度盐溶液，血小板抗原、阳性质控/阴性质控、血小板指示红细胞一次加入血小板抗体检测卡中，结合了血小板抗原的血小板指示红细胞将会与阳性质控结合，形成抗原抗体复合物(阳性质控-血小板抗原-指示红细胞复合物)。如检测质控为阴性质控，离心后指示红细胞沉于微柱管凝胶尖底部，呈现阴性反应。
在本发明中，制备血小板抗体检测卡(微柱凝胶法)，血小板抗体检测卡中含有特定效价的抗人球蛋白试剂、并包含有适量的牛血清白蛋白、叠氮钠、吐温-20。血小板抗体检测卡阳性孔临床用于加入含有抗人血小板抗体质控、血小板指示红细胞、血小板抗原进行阳性反应；血小板抗体检测卡阴性孔临床用于加入不含有抗人血小板抗体的阴性质控、血小板指示红细胞、血小板抗原进行阴性反应；血小板抗体检测卡的反应管中主要加入血小板指示红细胞、血小板抗原、待检血清样本。
在检测时指示红细胞需分别加入到血小板检测卡中的各检测孔中，用于阴阳结果指示，低离子强度盐溶液用于稀释指示红细胞。
在本发明中，利用血小板抗体检测试剂盒进行待检血清或血浆血小板抗体检测以及交叉配型检测。
在本发明中，所述血小板抗体检测包括以下步骤：
1、将冻干的血小板抗原用生理盐水0.5mL/瓶复溶，18-25℃静置5min，使其充分溶解，溶解后的血小板浓度约为(50-150)×109/L。
2、将鼠单克隆抗体包被的红细胞用低离子盐溶液稀释成0.8％-1％的红细胞悬液。
3、将血小板抗原和致敏红细胞各50μL加入血小板抗体检测卡的样品检测管中，然后在检测管中加入待检患者血清50μL；
4、37℃孵育15min，将血小板检测卡放入血型卡专用离心机中，900rpm离心2min，2500rpm离心3min，红细胞位于凝胶的表面，为4+强阳性反应；红细胞悬浮在凝胶中则为1+～3+阳性反应，越靠近凝胶底部效价愈小；红细胞全部沉积在凝胶的底部则为阴性。
在本发明中，所述血小板交叉配型检测实验步骤；
(1)制备与受血者ABO同型的供者血小板悬液：将有效期内机采血小板用生理盐水进行5-10倍稀释；或采用当天8小时内EDTA或枸橼酸钠抗凝的全血经200×g离心10min，取上层2/3富血小板血浆。血小板悬液的适宜浓度为50-150×109/L。
(2)将鼠单克隆抗体包被的红细胞用低离子盐溶液稀释成0.8％-1％的红细胞悬液。
(3)将供者血小板悬液和致敏红细胞各50μL加入血小板抗体检测卡的样品检测管中，然后在检测管中加入待检受血者血清50μL
(4)37℃孵育15min,将血小板检测卡放入血型卡专用离心机中，900rpm离心2min,2500rpm离心3min,红细胞位于凝胶的表面，为4+强阳性反应；红细胞悬浮在凝胶中则为1+～3+阳性反应，越靠近凝胶底部效价愈小；红细胞全部沉积在凝胶的底部则为阴性。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明的血小板抗体检测试剂盒中采用抗人IgG及IgG致敏红细胞作为指示系统，以取代抗人IgG包被的醛化红细胞，简化了指示红细胞的制备方法，提高了指示红细胞的IgG抗体的包被量和效价，提高血小板抗体检测试剂盒的灵敏度及准确性，血小板指示红细胞可保存时间长，一般可保存2年，使临床检验时操作简便，省时，样本用量少，一般只需要50μL血清即可，检测结果清晰准确，可重复性强，检测结果同时达到肉眼和自动化机器准确判读的效果，检测结果易于标准化。同时在进行血小板抗体检测卡实验时增加了血小板抗体阴性和阳性对照质控，保证实验结果的有效性和质量控制。
附图说明
图1为本发明血小板抗体检测试剂盒的结构示意图，其中1为检测板，2为凝胶管，其中从左至右包括第一至第六共六个凝胶管，2.1为管口，2.2为缓冲腔，2.2.1为缓冲柱，2.3为反应腔，2.4为支撑板，3为封口膜。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
如图1所示，所述血小板抗体检测试剂盒包括检测板(1)、凝胶管(2)和封口膜(3)，所述凝胶管(2)有六个，呈左右排列设置在检测板(1)的顶端，所述封口膜(3)设置在检测板(1)的上方，且覆盖在六个凝胶管(2)的顶端，所述每个凝胶管(2)从上到下均包括管口(2.1)、缓冲腔(2.2)和反应腔(2.3)，所述管口(2.1)的开口朝上，所述每个凝胶管(2)的外壁还设有两块支撑板(2.4)，所述两块支撑板(2.4)分别设置于每个凝胶管(2)的前后方，所述检测板(1)为聚丙烯塑料透明板。所述六个凝胶管(2)中包含效价为64-128的抗人球蛋白试剂IgG、并包含有0.1-1M咪唑缓冲液、1％-10％的牛血清白蛋白、0.5％-1％的氯化钠、0.1％-1％的叠氮钠、0.1％-2％的吐温-20；含有2/3体积的G-25，调PH值为7.2-7.4，其中第一和第六凝胶管分别为阳性对照管和阴性对照管，第二到第四凝胶管作为反应管。
所述血小板抗体检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
制备血小板抗体检测卡(微柱凝胶法)，血小板抗体检测卡中含有特定效价的抗人球蛋白试剂、并包含有适量的牛血清白蛋白、叠氮钠、吐温-20；
(1)凝胶的洗涤
将葡聚糖凝胶用20倍体积的纯水进行浸泡，沉淀后倒出上清液体，重复洗涤3-4次，然后用生理盐水洗涤3-4次，弃出上清待用。
(2)抗体溶液及凝胶配制
配制咪唑缓冲液，分别加入牛血清白蛋白、氯化钠、叠氮钠、吐温-20；将抗人球蛋白(IgG)试剂按照64-128的效价比例与缓冲液咪唑混合；将葡聚糖凝胶与抗体溶液按照体积比2:1混合。
(3)凝胶灌装
将配制好的凝胶抗体溶液按照25-35μL/管进行灌装。
其中，在S1中的血小板抗体检测卡中含有效价为64-128的抗人球蛋白试剂IgG、并包含有0.1-1M咪唑缓冲液、1％-10％的牛血清白蛋白、0.5％-1％的氯化钠、0.1％-1％的叠氮钠、0.1％-2％的吐温-20；含有2/3体积的G-25、G-50、G-100、S-100、S-200葡聚糖凝胶的之一或其混合，PH值为7.2-7.4。
实施例2
利用实施例1的血小板抗体检测试剂盒进行血小板抗体检测的方法，所述方法包括以下步骤：在所述小板抗体检测试剂盒的阳性对照管中加入含有抗人血小板抗体的阳性质控、血小板指示红细胞、血小板抗原进行阳性反应；在阴性对照管中加入不含有抗人血小板抗体的阴性质控、血小板指示红细胞、血小板抗原进行阴性反应；在反应管中加入血小板指示红细胞、血小板抗原和待检血清样本进行反应。
其中：具体包括以下操作：
S1、包被鼠抗人血小板单克隆抗体的指示红细胞的制备方法，并将指示红细胞分装后置于西林瓶内；
包被鼠抗人血小板单克隆抗体的指示红细胞的制备方法，包括如下步骤：
采集新鲜O型Rh(D)阳性EDTA抗凝的压积红细胞,用抗血小板糖蛋白Ib/IX单克隆抗体按试剂与红细胞按照以下体积比但不限于1:1、2:1、3:1比例混匀，4℃过夜，生成IgG致敏红细胞，洗涤去除未结合的IgG，用特制的红细胞保存液配制成0.8％的指示红细胞悬液。0.8％指示红细胞悬液的鉴定:1)直接抗球蛋白试验结果强阳性；2)红细胞IgG结合量检测:将抗IgG试剂倍比稀释，加入1滴0.8％指示红细胞，离心后显微镜下观察至不凝集管的前1管作为滴度，以此滴度作为IgG结合量滴度；保存期检测:直接抗球蛋白试验结果肉眼观察凝集强度﹥3+，IgG结合量滴度﹥32。
S2、低离子强度盐溶液的配制，包括但不限于0.1％-0.9％氯化钠、1％-10％甘氨酸、0.23g/L磷酸二氢钾、0.47g/L磷酸氢二钠、0.1％-1％叠氮钠的混合溶液，调PH7.2-7.4。并将配制好的低离子溶液分装后置于西林瓶内；
S3、血小板抗原试剂制备；
具体为：提取O型健康志愿者血小板，或将有效期内机采血小板用生理盐水进行5-10倍稀释；或采用当天8小时内EDTA或枸橼酸钠抗凝的全血经200×g离心10min，取上层2/3富血小板血浆。血小板悬液的适宜浓度为50-150×109/L，O型志愿者血小板分装体积0.5ml/瓶。
S4、将制备的血小板抗原试剂置于西林瓶进行低温冷冻干燥，真空条件下进行真空密封包装；
具体为：将分装好的样品杯与西林瓶直接放置在冻干机托盘中，设定冻干机真空度1-15Pa，设定冻干机的冻干曲线，温度范围从-40℃至35℃，冻干曲线的设定为：首先，温度为-40℃，保存时间2小时；然后温度为-20℃，保存时间2小时；然后温度为-10℃，保存时间2小时；然后温度为0℃，时间为2小时；然后温度为10℃，时间为2小时；然后温度为20℃，时间为2小时；然后温度为30℃，时间为2小时；然后温度为35℃，保存至取出。
将冻干后的西林瓶在真空条件下做压盖密封操作，使样品杯处于真空环境；冻干后，在真空条件下对西林瓶进行压盖处理，保证了冻干后的试剂与外界环境分离，避免了试剂因接触空气中的氧气和水分而失效，提高了试剂的稳定性。
S5、血小板抗体阳性对照质控的制备，血小板抗体阴性对照质控的制备；
具体为：血小板抗体阳性对照质控含有抗人血小板抗体及0.1％的叠氮钠，血小板抗体阴性对照质控不含有抗人血小板抗体，含有0.1％的叠氮钠；
S6、按照血小板抗体及血小板交叉配型检测步骤将上述试剂用于检测待检血清或血浆血小板抗体检测、交叉配型实验；
血小板抗体检测实验步骤如下：
1、将冻干的血小板抗原用生理盐水0.5ml/瓶复溶，18-25℃静置5min，使其充分溶解，溶解后的血小板浓度约为50-150×109/L。
2、将S1中的鼠单克隆抗体包被的红细胞用低离子盐溶液稀释成0.8％-1％的红细胞悬液。
3、将血小板抗原和致敏红细胞各50μL加入血小板抗体检测卡的样品检测管中，然后在检测管中加入待检患者血清50μL；
4、37℃孵育15min，将血小板检测卡放入血型卡专用离心机中，900rpm离心2min,2500rpm离心3min，红细胞位于凝胶的表面，为4+强阳性反应；红细胞悬浮在凝胶中则为1+～3+阳性反应，越靠近凝胶底部效价愈小；红细胞全部沉积在凝胶的底部则为阴性。
其中血小板交叉配型检测实验步骤；
(1)制备与受血者ABO同型的供者血小板悬液：将有效期内机采血小板用生理盐水进行5-10倍稀释；或采用当天8小时内EDTA或枸橼酸钠抗凝的全血经200×g离心10min，取上层2/3富血小板血浆。血小板悬液的适宜浓度为50-150×109/L。
(2)将S1中的鼠单克隆抗体包被的红细胞用低离子盐溶液稀释成0.8％-1％的红细胞悬液。
(3)将供者血小板悬液和致敏红细胞各50μL加入血小板抗体检测卡的样品检测管中，然后在检测管中加入待检受血者血清50μL
(4)37℃孵育15min,将血小板检测卡放入血型卡专用离心机中，900rpm离心2min,2500rpm离心3min,红细胞位于凝胶的表面，为4+强阳性反应；红细胞悬浮在凝胶中则为1+～3+阳性反应，越靠近凝胶底部效价愈小；红细胞全部沉积在凝胶的底部则为阴性。
综上所述，本发明提供了一种血小板抗体检测试剂盒制备方法，该方法应用包被鼠抗人血小板单克隆抗体的指示红细胞进行微柱凝胶抗人球蛋白实验，检测血小板抗体，实验将低离子强度盐溶液、血小板抗原、待检样本/质控、血小板指示红细胞依次加入血小板抗体检测卡中，进行血小板抗体检测和质控检测。采用抗人IgG及IgG致敏红细胞作为指示系统，以取代抗人IgG包被的醛化红细胞，简化了指示红细胞的制备方法，提高了指示红细胞的IgG抗体的包被量和效价，该试剂盒中血小板指示红细胞可保存时间长，一般可保存2年，使临床检验时操作简便，省时，样本用量少，一般只需要50μL血清即可，检测结果清晰准确，可重复性强，检测结果同时达到肉眼和自动化机器准确判读的效果，检测结果易于标准化。同时在进行血小板抗体检测卡实验时增加了血小板抗体阴性和阳性对照质控，保证实验结果的有效性和质量控制。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的血小板抗体检测试剂盒及其使用方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种血小板抗体检测试剂盒，其特征在于，所述血小板抗体检测试剂盒包括检测板(1)、凝胶管(2)和封口膜(3)，所述凝胶管(2)有六个，呈左右排列设置在检测板(1)的顶端，所述封口膜(3)设置在检测板(1)的上方，且覆盖在六个凝胶管(2)的顶端，所述六个凝胶管(2)中包含抗人球蛋白试剂和葡聚糖凝胶，其中第一和第六凝胶管分别为阳性对照管和阴性对照管，第二到第四凝胶管作为反应管。
2.根据权利要求1所述的血小板抗体检测试剂盒，其特征在于，所述每个凝胶管(2)从上到下均包括管口(2.1)、缓冲腔(2.2)和反应腔(2.3)，所述管口(2.1)的开口朝上。
3.根据权利要求1或2所述的血小板抗体检测试剂盒，其特征在于，所述每个凝胶管(2)的外壁还设有两块支撑板(2.4)，所述两块支撑板(2.4)分别设置于每个凝胶管(2)的前后方。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的血小板抗体检测试剂盒，其特征在于，所述检测板(1)为聚丙烯塑料透明板。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的血小板抗体检测试剂盒，其特征在于，所述六个凝胶管中葡聚糖凝胶的体积为凝胶管体积的2/3；
优选地，所述葡聚糖凝胶为G-25、G-50、G-100、S-100或S-200；
优选地，所述六个凝胶管中还含有咪唑缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钠、0.1％-1％叠氮钠和吐温-20中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述咪唑缓冲液中咪唑的摩尔浓度为0.1-1M；
优选地，所述牛血清白蛋白在每个凝胶管中的质量体积终浓度为1-10％；
优选地，所述氯化钠在每个凝胶管中的质量体积终浓度为0.5-1％；
优选地，所述叠氮钠在每个凝胶管中的质量体积终浓度为0.1-1％；
优选地，所述吐温-20在每个凝胶管中的体积浓度为0.1-2％。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的血小板抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法为：在所述小板抗体检测试剂盒的阳性对照管中加入含有抗人血小板抗体的阳性质控、血小板指示红细胞、血小板抗原进行阳性反应；在阴性对照管中加入不含有抗人血小板抗体的阴性质控、血小板指示红细胞、血小板抗原进行阴性反应；在反应管中加入血小板指示红细胞、血小板抗原和待检血清样本进行反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述血小板指示红细胞由以下方法制备得到：采集新鲜O型Rh(D)阳性EDTA抗凝的压积红细胞，将抗血小板糖蛋白Ib/IX单克隆抗体与红细胞混匀，0-4℃过夜，生成IgG致敏红细胞，洗涤去除未结合的IgG，用红细胞保存液配制成0.8％的指示红细胞悬液。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述抗血小板糖蛋白Ib/IX单克隆抗体与红细胞的体积比为(1-3):1。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述血小板指示红细胞用低离子强度盐溶液进行稀释；
优选地，所述低离子强度盐溶液为包括质量体积终浓度如下的组分的混合溶液：0.1％-0.9％氯化钠、1％-10％甘氨酸、0.23-0.25g/L磷酸二氢钾、0.4-0.5g/L磷酸氢二钠、0.1％-1％叠氮钠。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述含有抗人血小板抗体的阳性质控含有抗人血小板抗体及质量体积浓度0.1％的叠氮钠；
优选地，所述不含有抗人血小板抗体的阴性质控含有质量体积浓度0.1％的叠氮钠。
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