CN1096375A

CN1096375A - 血小板抗原抗体反应的指示试剂、其制备方法及其用途

Info

Publication number: CN1096375A
Application number: CN 93107452
Authority: CN
Inventors: 刘达庄; 包于勤; 陆萍; 王健莲; 吴国光
Original assignee: SHANGHAI BLOOD CENTER
Current assignee: SHANGHAI BLOOD CENTER
Priority date: 1993-06-11
Filing date: 1993-06-11
Publication date: 1994-12-14

Abstract

本发明涉及一种指示血小板抗原抗体反应指示试剂、其制备方法及其用途、该指示试剂系通过向1 ～10％羊红细胞悬浮液中加入戊二醛溶液固定，再与鞣酸溶液混合，然后加入等体积的10— 150mg/ml抗人IgG抗体致敏1—2小时而制得了 SEPSA—抗IgG指示试剂。该试剂可用于简易致敏红细胞血小板血清学技术来测定出血小板抗原和抗体及检出血小板血型。

Description

本发明涉及一种血小板抗原抗体反应的指示剂、其制备方法及其应用方法。

准确、快速、简使地测定血小板抗原、抗体对研究血小板血型及血小板抗体的检出，对免疫性血小板疾病的诊断、治疗等方面都起到了很关键的作用。目前，据文献报道，一般采用血凝、补体结合、抗人球蛋白消耗、免疫荧光、放射免疫、5-羟色胺释放、酶联免疫等方法来测定血小板抗原和抗体。但这些方法存在着或是仪器复杂和操作困难的问题，或是对试剂及实验条件要求苛刻，实验的重现率低及稳定性差等问题，这给临床推广应用带来了困难。

1987年研究成功的固相血小板免疫血清学试验（SPISA）在血小板抗原、抗体检出等都起到了很大的作用，但由于SPISA中的指示系统试剂系由抗人IgG和抗IgG抗D致敏的红细胞组成，其配制过程要求高，且不易长期保存，必须在试验中临时配制，这对SPISA的推广使用造成了一定的障碍。为了使SPISA试验成为一种简易、快速的血小板免疫血清学技术，亟待研制出一种新的指示试剂以替代SPISA中的指示系统试剂，这样可使SPISA法达到一个全新的、更高的水准，成为一种简易、快速和准确的血小板免疫血清学技术，从而具备了临床实用的价值。

为了推广普及血小板血清学试验在临床诊断、治疗与输血上的应用，本发明者在简易致敏红细胞血小板血清学技术（SEPSA）领域进行了长年不懈的研究，现研制出指示血小板抗原抗体反应的指示试剂-SEPSA-抗Ig指示细胞。

本发明的一个目的是提供一种具有快速、简易、敏感、稳定、特异性高和实用性强等优点的，用于致敏红细胞血小板血清学技术（SEPSA）中的指示试剂SEPSA-抗IgG指示试剂。

本发明另一个目的是提供SEPSA-抗IgG指示试剂的制备方法。

本发明再一个目的是提供SEPSA-抗IgG指示试剂的应用。

本发明的目的是通过以下构思来实现的：一种指示试剂，它包括1～10%（体积）的羊红细胞悬液，经最终浓度为0.5～2%的戊二醛溶液固定及1-10mg/dl鞣酸溶液处理，再加等体积的10-150mg/ml抗人IgG抗体溶液致敏后，得到0.1-0.2%（体积）SEPSA-抗IgG指示试剂。

本发明的另一个方面涉及一种指示试剂的制备方法，它包括：

（1）向1～10%羊红细胞悬浮液中加入戊二醛溶液;

（2）取2～5%（1）中所得的悬液与1mg/dl鞣酸溶液混合;

（3）加入与（2）悬液等体积的10～150mg/ml抗人IgG抗体致敏1～2小时。

（4）需要时，用0.01M，pH7.2PBS时以上各步骤产物进行洗涤。

较为优选的是，（1）步骤中所加入的戊二醛溶液最终浓度为悬液的0.5～2%（体积）。

本发明的再一个方面涉及SEPSA-抗IgG指示试剂的用途，将0.1～0.2%（体积）指示试剂按该技术领域人员所熟知的方法制成试剂盒来测定血小板抗原和抗体及检出血小板血型。

抗人IgG抗体的制备

人γ-球蛋白血清通过DEAE-Sephadex A50（瑞典Pharmacia产品）层析，得到人IgG抗原，免疫羊或兔，获得单价抗人IgG抗体。

需要时，用CNBr-Sepharose 4B柱（瑞典pharmacia产品）进行亲和层析，获得高纯度的抗人IgG抗体。

图1是SEPSA-抗IgG指示试剂的组成及作用原理图。图中：

1.羊红细胞

2.羊抗人IgG

3.血小板抗体

4.血小板

若血小板上存在抗血小板抗体，则2的Fab端与3的Fc端结合，指示细胞向孔底移动被阻止，而复盖在固定的血小板单层上（阳性结果）。无抗血小板抗体存在，则指示细胞向孔底移动不受阻，从而聚集在孔底中央，成为细胞扣（阴性结果）。

以下将结合实施例本发明作进一步详细的阐述。

实施例1

取适量羊红细胞，用0.01M、pH7.2PBS洗涤3次，加入上述pH7.2PBS以配成10%悬浮液，加入最终浓度为2%的戊二醛溶液固定，在室温下放置1小时后，固定细胞用0.01M、pH7.2的PBS洗涤4次，加入上述pH7.2PBS以配成5%戊二醛固定的羊红细胞悬浮液，向内加入1mg/dl的鞣酸室温下处理10分钟左右。向内加入等体积的前述制得的抗人IgG抗体溶液（其浓度为150mg/ml）在室温下致敏1小时，用0.01M，pH7.2的PBS洗涤3次，加入PH7.2PBS以配制成0.1%的SEPSA-抗人IgG指示试剂。

实施例2

除了用最终浓度为0.5%的戊二醛溶液代替实施例1中的2%戊二醛溶液来固定羊红细胞外，其它采用与实施例1相同的方法，可制得最终浓度为0.2%的SEPSA-抗人IgG指示试剂。

实施例3

重复实施例1中的固定羊红细胞的步骤，只是将戊二醛固定的羊红细胞悬浮液配成2%浓度，重复鞣酸处理步骤后，加入等体积的10mg/ml提纯的抗人IgG抗体溶液，致敏2小时，洗涤3次后，制得最终浓度为0.15%的SEPSA-抗人IgG抗体指示试剂。

试验：

1.指示试剂敏感度的测定

使用被动凝集法（PHA）测定SEPSA的指示系统与SPISA的指示系统的敏感度，结果如下表所示

结果显示SEASA-抗IgG抗体指示试剂的IgG最小感度为30ng/ml，而SPISA法检出IgG最小感度为250ng/ml。

2.指示试剂的保存期和试验的重复性测定

将一份抗YuK^a血清、另一份抗YuK^b血清置-30℃保存，抗IgG指示试剂从制备用于开始每2个月用上述-30℃保存的二份血清进行SEPSA间接测定法，测定抗体效价变化，结果表明，保存一年的SEPSA-抗IgG指示试剂稳定敏感性无变化。

临床试验：

1.选经临床及实验室确诊的ITP患者99例，SLE患者17例以及各种血小板减少症患者275例，使用实施例1制得的SEPSA-抗IgG指示试剂，采用SEPSA直接和间接测定法对上述391例患者进行血小板抗体的检测，结果如下表所示：

表2 SEPSA法对ITP和SLE等患者PAIgG和血清抗血小板抗体的测定

疾病例数直接法(PAIgG) 间接法(血清中抗体)

阳性数阳性% 阳性数阳性%

ITP 99 92 92.9 90 90.9

SLE 17 13 76.5 14 82.4

血小板减少症275 94 34.2

2.用实施例2制得的SEPSA-抗IgG指示试剂采用SEPSA直接测定法及间接测定法对经临床及实验室确诊的ITP60例，其中男性9例，女性51例，年龄7岁～52岁;MF18例，其中男性4例，女性14例，年龄14～39岁;AA患者10例，其中男性4例，女性6例，年龄14-27岁;SLE38例，男性3例，女性35，年龄17～29岁。进行检查，结果如下表所示。

表3 4种疾病的阳性率与其血小板计数的关系

病种例数阳性百分率阳性患者阴性患者 P值

例数血小板计数(×10⁹/1) 血小板计数(10⁹/1)

ITP 61 56 91.8% 33.8±13.2 59.1±17.5 <0.05

SLE 40 31 77.5% 67.7±11.5 93.4±17.9 <0.05

MF 18 13 72.2% 47.6～98.3 74～127.3 <0.05

AA 10 4 40% 50.5～97.1 56.8～104 >0.05

在临床使用中，SEPSA-抗IgG直接指示反应系统，不需要临时配制，保存期达一年，从而提高了本试验的稳定性、敏感性及实用性，具有操作简单（省去了3个操作步骤）更省时间（比原来方法减少1个小时）对紧急情况下血小板输注前的配合试验作用尤为突出，是一项易于一般实验室和血库能常规采用的血小板血清学技术，因此，SEPSA比原来的SPISA更有推广意义。

本发明的指示试剂，可应用于血小板抗原、抗体地研究，检测血小板同种及自身抗体，进行血小板交叉配合试验，具有快速、简易、敏感、稳定、特异性高及实用性强等优点。本发明的SEPSA-抗IgG指示试剂已制成试剂盒，保存期一年（4℃下保存）。另外，使用本发明的指示试剂进行SEPSA试验时不需要特殊的仪器和设备，重现性好，是一种理想、实用的测定血小板抗原抗体的方法。

Claims

1、一种指示试剂，其特征在于它包括1～10%(体积)的羊红细胞悬液，经最终浓度为0.5～2%的戊二醛溶固定及1-10mg/dl鞣酸溶液处理，再加等体积的10-150mg/ml抗人IgG抗体溶液致敏后，得到0.1～0.2%(体积)SEPSA-抗IgG指示试剂。

2、根据权利要求1所述的指示试剂，其特征在于其中SEPSA-抗IgG指示试剂的浓度为0.1%（体积）。

3、一种指示试剂的制备方法，其特征在于它包括：

（1）向1～10%羊红细胞悬浮液中加入戊二醛溶液;

（2）取2～5%（1）中所得的悬液与1mg/dl鞣酸溶液混合;

（3）加入与（2）悬液等体积的10～150mg/ml抗人IgG抗体致敏1-2小时。

4、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于其中步骤（1）在室温下进行1小时。

5、根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于其中戊二醛的浓度占悬浮液的0.5～2%。

6、根据权利要求3所述的方法，其特征在于其中步骤（2）进行10分钟。

7、根据权利要求3所述的方法，其特征在于各步骤完成后，用0.01M、pH7.2的PBS进行洗涤。

8、一种如权利要求1所述的指示试剂的用途，其特征在于将该试剂制成试剂盒来测定血小板抗原和抗体及检出血小板血型。