CN112379100B

CN112379100B - 血小板抗人球蛋白实验免疫区带分布检测方法

Info

Publication number: CN112379100B
Application number: CN202011088787.3A
Authority: CN
Inventors: 段生宝; 李勇; 陈维佳; 冯立岗; 丁少华; 王红梅; 谢劲松; 王玉珏; 陈晔洲; 魏双施; 田晶晶; 刘杰; 王泽龙; 刘永茂; 隋金晶; 冷向武; 张妍
Original assignee: Bioxun Biotech Co ltd; Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Current assignee: Bioxun Biotech Co ltd; Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Priority date: 2020-10-13
Filing date: 2020-10-13
Publication date: 2024-01-23
Anticipated expiration: 2040-10-13
Also published as: CN112379100A

Abstract

本发明公开了一种血小板抗人球蛋白实验免疫区带分布检测方法，其采用免疫标记抗人球蛋白实验，通过免疫标记物包括但不限于放射性同位素、胶体金、荧光素、量子点、化学(或生物)发光剂指示或有机染料等标记抗人球蛋白试剂，然后与血小板特异性抗体反应结合，并通过离心进入区带分布检测卡中，呈现不同的区带分布，从而判定检测结果。本发明方法操作简单、结果直观可靠、成本低廉而结果准确，可满足临床常规血小板抗体检测的需求，辅助临床血小板相关免疫性疾病的诊断，以及进行输血前相容性实验检测，减少血小板输注无效症的发生及其引起的出血及死亡病例，保障临床安全、有效、科学的血小板输血，同时还可节约宝贵的血小板资源。

Description

血小板抗人球蛋白实验免疫区带分布检测方法

技术领域

本发明涉及免疫学和医学检验领域，特别涉及一种血小板抗人球蛋白实验免疫区带分布检测方法。

背景技术

血小板表面具有复杂的血型抗原，包括ABO抗原、HLA-I抗原及血小板特异性HPA抗原、CD36抗原，这些抗原均可以刺激机体产生血小板抗体。血小板抗体可引起患者发生血小板免疫损伤，产生免疫性血小板减少，如血小板输注无效、输血后紫癜、自身免疫性血小板减少症，以及新生儿血小板减少症等。特别是抗血小板CD36特异性抗体，在我国临床血小板免疫性疾病的发生过程中具有重要意义。

血小板输血是目前血小板减少症和多种疾病的最主要治疗手段之一。大量研究结果表明，患者输注血小板前进行抗体检测和交叉配型以筛选相容性的血小板进行输注，输血有效率大于70％，而仅ABO血型相同的随机输注血小板有效率低于30％。这不仅仅浪费了宝贵的血液资源，而且不相容血小板使患者体内生成血小板抗体，导致免疫反应，造成输血无效，患者也几乎无例外地病情加重，特别是对于长期依赖血小板输注的血液病患者，往往导致体内产生高效价的血小板抗体，出血症状得不到改善乃至病情加重。

要准确、高效率、及时地诊断血小板相关免疫性疾病和输血治疗，理论上都必须进行血小板抗体检测和交叉配血。目前国际上血小板抗体分析的金标准方法“单克隆抗体固着血小板抗原分析技术(The monoclonal antibody immobilization of plateletantigen assay,MAIPA)”实验程序繁杂，操作时间长至5小时以上，同时对实验操作人员技术要求高，不能应用于临床常规检测应用。

抗人球蛋白实验是检测红细胞血型不完全抗体的经典方法，但未能有效应用于血小板抗体检测，主要原因在于红细胞呈现肉眼可见红色，形态规则，大小较均匀，凝集与非凝集易于判定。而血小板本身无颜色，形态不规则，大小分布不均匀，并且容易被激活聚集，难以通过凝集方法检测抗体。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种血小板抗人球蛋白实验免疫区带分布检测方法，该方法将经典的抗人球蛋白实验技术和创新的免疫标记区带分布技术相结合，操作简便、准确性高。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种血小板抗人球蛋白实验免疫区带分布检测方法，包括以下步骤：

1)制备抗人球蛋白，并采用免疫标记物标记得到免疫标记抗人球蛋白；

2)制备血小板悬液；

3)预先在区带分布检测卡的反应腔中加入免疫复合物分离增强介质，以在所述区带分布检测卡的分离柱中形成免疫复合物分离增强介质区域；

4)将待测样品与所述步骤2)制得的血小板悬液进行孵育反应，分离后将得到的反应产物与所述步骤1)制得的免疫标记抗人球蛋白加入所述步骤3)获得的区带分布检测卡的反应腔中反应，离心；

5)观察所述区带分布检测卡的检测窗，判定检测结果；

其中，血小板与待测样品孵育、分离后在所述区带分布检测卡的反应腔内与免疫标记抗人球蛋白反应，反应产物通过离心进入所述免疫复合物分离增强介质区域并呈现不同的区带分布：

阳性反应中血小板与相应抗体结合，然后经免疫标记抗人球蛋白桥连结合，形成颗粒型免疫复合物，穿过所述免疫复合物分离增强介质区域分布于所述检测窗下沿；

阴性反应中血小板未能与免疫标记抗人球蛋白结合，血小板与免疫标记抗人球蛋白不能穿过所述免疫复合物分离增强介质区域，仍分布于所述分离柱内；

从而通过所述检测窗内是否存在免疫标记物来判定检测结果。

优选的是，所述抗人球蛋白为羊抗人球蛋白、兔抗人球蛋白、鸡抗人球蛋白、鼠抗人球蛋白单克隆抗体中的一种。

优选的是，所述免疫标记物为胶体金、荧光素、量子点、放射性同位素、化学或生物发光剂、有机染料中的一种。

优选的是，所述免疫复合物分离增强介质包括聚蔗糖-泛影葡胺混合物、二抗溶液，所述免疫复合物分离增强介质的比重为1.05～1.10，渗透压为280～350mmol/L。

优选的是，所述二抗为羊抗人IgG、兔抗人IgG、鼠抗人IgG单克隆抗体或鸡抗人IgG抗体。

优选的是，所述步骤4)具体为：将待测样品、血小板悬液、低离子强度溶液加入EP管中，振荡混匀后，37℃下进行孵育反应；离心，弃上清，用含1％BSA的PBS重悬；将得到的血小板重悬液加入所述区带分布检测卡反应腔中，再加入免疫标记抗人球蛋白，37℃下进行孵育反应，离心。

优选的是，所述区带分布检测卡为4联～8联微柱卡，所述区带分布检测卡上的每个微柱均包括由上至下依次连通设置的反应腔、分离柱和检测窗。

优选的是，所述检测窗通过直径为0.1～0.5mm的管道与所述分离柱相连，所述检测窗的厚度为0.2～1mm，所述检测窗的平面形态为长方形、正方形或扇形。

优选的是，所述区带分布检测卡的材质为聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯或ABS塑料。

本发明至少包括以下有益效果：

(1)本发明所采用的免疫标记抗人球蛋白，既高效融合了经典抗人球蛋白实验凝集反应特点，又充分利用了免疫标记物的示踪性，提高了检测的准确性和灵敏度；

(2)本发明所采用的免疫复合物分离增强介质，可有效分离小分子物质、血小板、血小板免疫复合物，并结合区带分布检测卡的独特设计，使得血小板免疫复合物经免疫标记抗人球蛋白结合后，能在离心作用后分布于检测窗下沿；

(3)本发明所采用的区带分布检测卡，包括反应腔、分离柱和检测窗三个部分，集抗人球蛋白反应、免疫复合物分离和免疫标记结果显示于一体，不仅可判定检测窗下沿的标记信号，还可在检测窗口腔内判定弱阳性标记信号；

(4)本发明所采用的抗原为完整血小板，无需将血小板裂解，避免了裂解过程中造成的抗原性丢失，导致抗体漏检，因而检测准确性高；

(5)本发明采用抗人球蛋白实验，采用凝集反应方式检测与血小板结合的人血液中抗血小板抗体，所检测抗体为引起血小板凝集的功能性的、临床有意义的抗体，排除了无临床意义抗体的干扰；

(6)本发明方法操作简单、结果直观可靠、成本低廉而结果准确，可满足临床常规血小板抗体检测的需求，辅助临床血小板相关免疫性疾病的诊断，以及进行输血前相容性实验检测，减少血小板输注无效症的发生及其引起的出血及死亡病例，保障临床安全、有效、科学的血小板输血，同时还可节约宝贵的血小板资源。

附图说明

图1为本发明的区带分布检测卡的结构示意图；

图2为实施例1中的抗人球蛋白SDS-PAGE电泳检测结果；

图3为实施例1中的量子点标记抗人球蛋白检测结果；

图4为实施例2中的量子点标记抗人球蛋白血小板抗体免疫区带分布检测结果；

图5为实施例2中的有机染料标记抗人球蛋白血小板抗体免疫区带分布检测结果；

图6为实施例2中的胶体金标记抗人球蛋白血小板抗体免疫区带分布检测结果。

附图标记说明：

1—区带分布检测卡；2—微柱；3—反应腔；4—分离柱；5—检测窗；6—管道。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供的一种血小板抗人球蛋白实验免疫区带分布检测方法，包括以下步骤：

2)制备血小板悬液；

3)预先在区带分布检测卡的反应腔中加入免疫复合物分离增强介质，以在区带分布检测卡的分离柱中形成免疫复合物分离增强介质区域；

4)将待测样品与步骤2)制得的血小板悬液进行孵育反应，分离后将得到的反应产物与步骤1)制得的免疫标记抗人球蛋白加入步骤3)获得的区带分布检测卡的反应腔中反应，离心；

5)观察区带分布检测卡的检测窗，判定检测结果；

其中，血小板与待测样品孵育、分离后在区带分布检测卡的反应腔内与免疫标记抗人球蛋白反应，反应产物通过离心进入免疫复合物分离增强介质区域并呈现不同的区带分布：

阳性反应中血小板与相应抗体结合，然后经免疫标记抗人球蛋白桥连结合，形成颗粒型免疫复合物，并携带免疫标记物；颗粒型免疫复合物因比重较大，其可穿过免疫复合物分离增强介质区域分布于检测窗下沿，在检测窗下沿可检测出免疫标记信号；

而阴性反应中血小板未能与免疫标记抗人球蛋白结合，比重较小，血小板与免疫标记抗人球蛋白不能穿过免疫复合物分离增强介质区域，仍分布于分离柱内，检测窗内不能检测出免疫标记信号；从而通过检测窗内是否存在免疫标记物来判定检测结果。

其中，抗人球蛋白包括但不限于羊抗人球蛋白、兔抗人球蛋白、鸡抗人球蛋白、鼠抗人球蛋白单克隆抗体。

其中，免疫标记物包括但不限于胶体金、荧光素、量子点、放射性同位素、化学或生物发光剂、有机染料。

其中，免疫复合物分离增强介质预装于分离柱内，其包括聚蔗糖-泛影葡胺混合物、二抗溶液，免疫复合物分离增强介质的比重为1.05～1.10，渗透压为280～350mmol/L。二抗包括但不限于羊抗人IgG、兔抗人IgG、鼠抗人IgG单克隆抗体或鸡抗人IgG抗体。

参照图1，本发明还提供了一种区带分布检测卡1，区带分布检测，1为4联～8联微柱卡，区带分布检测卡1上的每个微柱2均包括由上至下依次连通设置的反应腔3、分离柱4和检测窗5，反应腔3用于免疫标记抗人球蛋白与血小板抗原抗体反应；分离柱4用于离心过程中血小板免疫复合物与未结合抗体的分离，同时增强血小板免疫复合物反应；检测窗5用于观察阳性反应中血小板免疫复合物的位置、免疫标记物信号强度。进一步优选的，检测窗5通过直径为0.1～0.5mm的管道6与分离柱4相连，检测窗5的厚度为0.2～1mm，检测窗5的平面形态为长方形、正方形或扇形。其中，区带分布检测卡1的材质包括但不限于聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯或ABS塑料。

在一种优选的实施例中，该血小板抗人球蛋白实验免疫区带分布检测方法，包括以下步骤：

1)制备抗人球蛋白，并采用免疫标记物标记得到免疫标记抗人球蛋白：

2)制备血小板悬液：

采集新鲜EDTA抗凝全血，900rpm离心10min后，取富血小板血浆，用含1％BSA的PBS溶液2倍稀释成血小板悬液；若为机采血小板，则采用含1％BSA的PBS溶液进行10倍稀释成血小板悬液。

4)将待测样品、步骤2)制得的血小板悬液、低离子强度溶液(选用常规产品即可)加入EP管中，振荡混匀后，37℃下进行孵育反应；离心，弃上清，用含1％BSA的PBS重悬；将得到的血小板重悬液加入区带分布检测卡反应腔中，再加入免疫标记抗人球蛋白，37℃下进行孵育反应，离心；

5)通过肉眼观察或借助检测设备如荧光灯观察区带分布检测卡的检测窗，通过检测窗内是否存在免疫标记物来判定检测结果。

以上为本发明的总体构思，以下还进一步提供更为详细的实施例，以对本发明作进一步说明。

实施例1：制备量子点免疫标记抗人球蛋白

(1)抗人球蛋白的制备

从人血浆中提取丙种球蛋白，用佐剂乳化后，免疫羊(1mg/只)或兔(0.5mg/只)等，每次多点免疫，免疫5次后抽取静脉血。全血经2000rpm离心30min，分离出血浆，用50％硫酸铵沉淀蛋白，并用DEAE-52离子交换层析柱纯化，收集纯化蛋白，测定蛋白浓度并经SDS-PAGE电泳纯度检测和试管抗人球蛋白实验检测效价后，备用。检测结果如图2所示，其中，1、Marker；2、0.05M NaCl溶液洗脱液；3、0.1M NaCl溶液洗脱液。检测结果说明：0.05M NaCl溶液洗脱液中的抗人球蛋白纯度优于0.1M NaCl溶液洗脱液，因此采用0.05M NaCl溶液洗脱液进行后续免疫标记。

(2)量子点标记抗人球蛋白

取浓度为5μM的羧基量子点50μL于EP管中，加入25μL 10mg/mL EDC溶液和7.5μL10mg/mL NHS溶液。混匀后，室温反应0.5h。12000rpm离心5min，弃上清，加入50μL 0.01M，pH7.2硼酸盐缓冲液。再加入50μL上述步骤(1)制得的抗人球蛋白(预先用0.01M，pH7.2硼酸盐缓冲液稀释至2mg/mL)，混匀后，室温孵育2h。最后用100μL 1％BSA封闭，室温0.5h。4℃保存备用。

进一步的，按照与以上相同的方法，本实施例中还制备的有机染料标记抗人球蛋白和胶体金标记抗人球蛋白。

(3)免疫标记蛋白检定

称取1g的琼脂糖粉末，加入100mL 10mM pH8.0硼酸钠-HCl电泳缓冲液，并配制成1％琼脂糖凝胶。电泳槽中加入10mM pH8.0硼酸钠-HCl电泳缓冲液，准备好合适浓度的上述步骤(2)制得的样品，按10:1的比例与50％甘油混合后加样。以40V电压电泳1h左右。在此过程中可直接使用365nm紫外灯激发观察电泳中的条带。通过凝胶成像仪(365nm光源)或365nm荧光灯和相机配合，记录荧光显色结果。通过考马斯亮蓝R-250染色可使蛋白(抗体)和量子点都呈现深蓝色显色。因此染色结果蛋白(抗体)、偶联产物、游离量子点都可显色。通过与荧光观察的结果比较可得出相应物质的条带位置。使用凝胶成像仪获得的结果，进一步计算推出偶联效率。参照图3为量子点标记抗人球蛋白检测结果，其中3a为荧光检测结果，3b为考马斯亮蓝染色结果，图3a、3b中，1表示量子点，2表示量子点标记抗人球蛋白。从检测结果可以看出：抗人球蛋白经量子点标记后，其分子量显著大于量子点，并且荧光检测结果与考马斯亮蓝染色结果一致，显示标记效果很好。

实施例2：血小板抗体检测

(1)血小板悬液的制备

采集3人份新鲜O型EDTA抗凝全血，900rpm离心10min后，取富血小板血浆，用含1％BSA的PBS溶液2倍稀释成血小板悬液。若为机采血小板，则采用含1％BSA的PBS溶液进行10倍稀释成血小板悬液。

(2)区带分布检测卡的制备

在区带分布检测卡的反应腔中加入100μL免疫复合物分离增强介质，免疫复合物分离增强介质是比重为1.05～1.10，渗透压为280～350mmol/L，并含有0.1～1mg/mL二抗溶液，1000rpm离心1min后备用。

(3)检测步骤

在EP管中加入50μL血小板悬液、50μL待检测标本和50μL低离子强度溶液，振荡混匀后，37℃孵育反应30min；3800rpm离心3min，弃上清；用50μL含1％BSA的PBS重悬血小板；检测卡反应腔中加入上述血小板重悬液，再加入50μL免疫标记抗人球蛋白(实施例1制备得到)，37℃孵育反应20min；将区带分布检测卡孵育后，置于血型专用离心机中，1800rpm离心5min。

(4)结果判定

通过肉眼观察或借助检测设备如荧光灯观察检测卡的检测窗，记录检测结果，通过检测窗内是否存在免疫标记信号的血小板免疫复合物来判定检测结果。若检测窗内存在免疫标记的血小板免疫复合物即为阳性，说明待检测标本含有血小板抗体；检测窗内无免疫标记的血小板免疫复合物即为阴性，说明待检测标本不含有血小板抗体。

参照图4-6，为针对相同的待检测标本，采用三种不同的免疫标记抗人球蛋白：量子点标记抗人球蛋白(图4)、有机染料标记抗人球蛋白(图5)、胶体金标记抗人球蛋白(图6)进行血小板抗体免疫区带分布检测的结果，从检测结果可以看出：阳性样本经2¹～2⁵稀释后，样本中的抗体与血小板反应结合，然后经免疫标记抗人球蛋白桥连结合，形成颗粒型免疫复合物，穿过免疫复合物分离增强介质区域分布于检测窗下沿，并形成不同的反应强度(4+、3+、2+、1+、W+)。而健康人血浆样本中无血小板抗体，血小板与免疫标记抗人球蛋白不能穿过免疫复合物分离增强介质区域，仍分布于分离柱内，形成阴性反应格局(-)。

实施例3：血小板交叉配型

(1)血小板悬液的制备

采集与患者ABO血型相同的献血员EDTA抗凝全血，900rpm离心10min，取上层富血小板血浆即PRP；用含1％BSA的PBS溶液2倍稀释成血小板悬液。若为机采血小板，则采用含1％BSA的PBS溶液进行10倍稀释成血小板悬液。

(2)检测卡的制备

在区带分布检测卡反应腔中加入100μL免疫复合物分离增强介质，免疫复合物分离增强介质是比重为1.05～1.10，渗透压为280～350mmol/L，并含有0.1～1mg/mL二抗溶液，1000rpm离心1min后备用。

(3)交叉配血步骤

在EP管中加入50μL供者血小板悬液、50μL待检测标本和50μL低离子强度溶液，振荡混匀后，37℃孵育反应30min；3800rpm离心3min，弃上清；用50μL含1％BSA的PBS重悬血小板；检测卡反应腔中加入上述血小板重悬液，再加入50μL免疫标记抗人球蛋白，37℃孵育反应20min；将区带分布检测卡孵育后，置于血型专用离心机中，1800rpm离心5min。

(4)结果判定

通过肉眼观察或借助检测设备如荧光灯观察检测卡的检测窗，记录检测结果，通过检测窗内是否存在免疫标记信号的血小板免疫复合物来判定检测结果。若检测窗内存在免疫标记的血小板免疫复合物即为阳性，说明供血者血小板与受血者配型不相合；检测窗内无免疫标记的血小板免疫复合物即为阴性，说明供血者血小板与受血者配型相合。

实施例4：血小板CD36特异性抗体鉴别分析

(1)血小板悬液的制备

分别采集CD36(+)和CD36(-)的O型EDTA抗凝全血，900rpm离心10min后，取富血小板血浆，用含1％BSA的PBS溶液2倍稀释成血小板悬液。

(2)检测卡的制备

(3)检测步骤

在EP管中分别加入50μL上述CD36(+)和CD36(-)血小板悬液，然后再各加入50μL待检测血浆标本和50μL低离子强度溶液，振荡混匀后，37℃孵育反应30min。3800rpm离心3min，弃上清；用50μL含1％BSA的PBS重悬血小板；检测卡反应腔中加入上述血小板重悬液，再加入50μL免疫标记抗人球蛋白，37℃孵育反应20min；将区带分布检测卡孵育后，置于血型专用离心机中，1800rpm离心5min。

(4)结果判定

通过肉眼观察或借助检测设备如荧光灯观察检测卡的检测窗，记录检测结果，通过检测窗内是否存在免疫标记信号的血小板免疫复合物来判定检测结果。若检测窗内存在免疫标记的血小板免疫复合物即为阳性，否则为阴性。CD36(+)血小板检测孔结果为阳性，CD36(-)血小板检测孔结果为阴性时即可鉴定该样本中含有抗CD36特异性抗体。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims

1.一种血小板抗人球蛋白实验免疫区带分布检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）制备抗人球蛋白，并采用免疫标记物标记得到免疫标记抗人球蛋白；

2）制备血小板悬液：

采集新鲜EDTA抗凝全血，900rpm离心10min后，取富血小板血浆，用含1%BSA的PBS溶液2倍稀释成血小板悬液；若为机采血小板，则采用含1%BSA的PBS溶液进行10倍稀释成血小板悬液；

3）预先在区带分布检测卡的反应腔中加入免疫复合物分离增强介质，以在所述区带分布检测卡的分离柱中形成免疫复合物分离增强介质区域；

4）将待测样品与所述步骤2）制得的血小板悬液进行孵育反应，分离后将得到的反应产物与所述步骤1）制得的免疫标记抗人球蛋白加入所述步骤3）获得的区带分布检测卡的反应腔中反应，离心；

5）观察所述区带分布检测卡的检测窗，判定检测结果；

从而通过所述检测窗内是否存在免疫标记物来判定检测结果；

其中，免疫复合物分离增强介质预装于分离柱内，其包括聚蔗糖-泛影葡胺混合物、二抗溶液，免疫复合物分离增强介质的比重为1.05~1.10，渗透压为280~350mmol/L；二抗包括羊抗人IgG、兔抗人IgG、鼠抗人IgG单克隆抗体或鸡抗人IgG抗体；

所述步骤4）具体为：将待测样品、血小板悬液、低离子强度溶液加入EP管中，振荡混匀后，37℃下进行孵育反应；离心，弃上清，用含1%BSA的PBS重悬；将得到的血小板重悬液加入所述区带分布检测卡反应腔中，再加入免疫标记抗人球蛋白，37℃下进行孵育反应，离心。

2.根据权利要求1所述的血小板抗人球蛋白实验免疫区带分布检测方法，其特征在于，所述抗人球蛋白为羊抗人球蛋白、兔抗人球蛋白、鸡抗人球蛋白、鼠抗人球蛋白单克隆抗体中的一种。

3.根据权利要求1所述的血小板抗人球蛋白实验免疫区带分布检测方法，其特征在于，所述免疫标记物为胶体金、荧光素、量子点、放射性同位素、化学或生物发光剂、有机染料中的一种。

4.根据权利要求1所述的血小板抗人球蛋白实验免疫区带分布检测方法，其特征在于，所述二抗为羊抗人IgG、兔抗人IgG、鼠抗人IgG单克隆抗体或鸡抗人IgG抗体。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的血小板抗人球蛋白实验免疫区带分布检测方法，其特征在于，所述区带分布检测卡为4联~8联微柱卡，所述区带分布检测卡上的每个微柱均包括由上至下依次连通设置的反应腔、分离柱和检测窗。

6.根据权利要求5所述的血小板抗人球蛋白实验免疫区带分布检测方法，其特征在于，所述检测窗通过直径为0.1~0.5mm的管道与所述分离柱相连，所述检测窗的厚度为0.2~1mm，所述检测窗的平面形态为长方形、正方形或扇形。

7.根据权利要求6所述的血小板抗人球蛋白实验免疫区带分布检测方法，其特征在于，所述区带分布检测卡的材质为聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯或ABS塑料。