CN106771229A

CN106771229A - 一种类风湿因子IgG化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN106771229A
Application number: CN201611018791.6A
Authority: CN
Inventors: 邓爱凤; 刘美婷; 姜儒
Original assignee: Shenzhen Yhlo Biotech Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Yhlo Biotech Co Ltd
Priority date: 2016-06-30
Filing date: 2016-11-21
Publication date: 2017-05-31

Abstract

本发明公开了一种类风湿因子IgG化学发光免疫检测试剂盒，所述试剂盒包括：类风湿因子IgG单克隆抗体包被的磁微粒、羊抗人IgG标记的吖啶酯、样本稀释液、类风湿因子IgG定标品、预激发液、激发液。另外本发明还公开了一种类风湿因子IgG化学发光免疫检测试剂盒的制备方法。本发明所述试剂盒与现有试剂盒相比操作简便，灵敏度高，检测范围广等优点。

Description

一种类风湿因子IgG化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及体外诊断免疫检测领域，具体地，本发明提供了一种化学发光免疫检测类风湿因子IgG试剂盒及其制备方法。

背景技术

类风湿因子（rheumatoid factor，RF）检测在临床上是比较常用的检测项目，主要用在对自身免疫性疾病的诊断，特别是对类风湿关节炎的诊断。类风湿因子（RF）是一种以变性IgG为靶抗原的自身抗体，主要为19S的IgM，也可见7S的IgG及IgA。是由于溶血性链球菌或其它细菌的代谢产物、慢性病毒等感染因子所引起的。

一般认为, RF 有两种来源, 一种是自然发生的RF，另一种是病理性RF。自然发生的RF发挥其调节机体免疫反应、激活补体加快清除微生物感染和清除免疫复合物使机体免受循环复合物的损伤等生理作用。病理性RF 则具有致病作用, 使RA 患者病情活动、关节骨质破坏、出现坏死性血管炎和类风湿结节等。类风湿性关节炎的发病率女性高于男性，女性是男性的2～3倍；欧美国家的发病率明显高于国人。

RF 最初由Rose 和Waller（1984 年）在类风湿性关节炎（RA）患者血清中发现。有研究表明RF 阳性率在正常人中只有2%，在老年人中是5%，而在RA 患者体内可高达80%，因此普遍认为RF 是RA 患者体内发现的最有诊断价值的自身抗体，RA 患者的RF 越高，病越严重。它可以和自体、异体或异种的天然或变性的IgG结合, 有IgG、IgM、IgA、IgE和IgD多种抗体类型RF,主要存在于类风湿性关节炎患者的血清和关节液中。RA是一个累及周围关节为主的多系统性炎症性疾病，是造成患者丧失劳动力和致残的主要原因之一。目前对RA的诊断主要依靠临床症状和血清学检查，RF 是类风湿关节炎诊治中最常用的一个临床检测指标。

IgM 类RF的含量与RA的活动性无密切关系；IgG类RF的含量与RA患者的滑膜炎、血管炎和关节外症状密切相关。IgA类RF见于RA、硬皮病、Felty 综合征和SLE，是RA临床活动的一个指标。IgD类RF研究甚少。IgE类RF除RA患者外，也见于Felty综合征和青年型RA。在RA患者，高效价的RF存在并伴有严重的关节功能受限时，常提示预后不良。在非类风湿患者中，RF的阳性率随年龄的增加而增加，但这些人以后发生RA者极少。

临床检测类风湿因子IgG的主要方法为酶联免疫吸附法，但该方法存在着下述的不足之处：

（1）使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96孔专用微孔板作为抗原包被用具和反应容器，在使用时只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，无法进行独立的、单人份的检测；

（2）定量测定所用的试剂种类较多，每一种检测试剂都要用试剂瓶来盛装，并且每使用一种试剂时都需要更换吸液嘴来分别加注到微孔板的微孔中，不但试剂瓶种类多，加注试剂的操作也极为繁琐；

（3）缺少对检测信息的相应标注，只能通过查看试剂盒外包装盒的标识才能了解或知悉检测试剂的生产批号及有效期信息，而且所知悉的信息在检测过程中不受控，具有很大的随意性；

（4）检测试剂在检测过程中处于开放的空间，容易引起各种试剂之间的交叉污染而影响检测结果的准确性；

（5）检测过程多采用手工操作，试剂或样本的加量不很精确，操作过程极为繁琐和复杂，容易发生操作差错，检测结果的准确度和精密度较差；

（6）在检测项目成套试剂的数量配置及使用上均为项目数×48/96人份，如果需要检测10 个项目，则试剂的配置及使用数须为10×48/96人份，如果只有一份样本需要检测10个不同的项目，也需要配置10×48/96人份的试剂，存在着不够经济合理的缺点。

发明内容

目前类风湿因子IgG检测技术存在以下缺点：检测成本高、检测灵敏度低、检测线性范围窄、重现性低、不能定量、操作复杂等。

本发明正是为了克服以上所述缺点，公开了一种检测成本低、灵敏度高、检测线性范围广、重现性高、可以定量、操作简单的类风湿因子IgG试剂盒及其制备方法。本发明首先制备化学发光免疫分析试剂盒，主要包括：类风湿因子IgG单克隆抗体包被的磁颗粒、羊抗人IgG标记的吖啶酯以及类风湿因子IgG定标品；然后利用全自动化学发光免疫分析仪对定标品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件，测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度；最后对类风湿因子IgG全自动化学发光免疫分析系统进行性能（灵敏度、线性、精密度、干扰性）的评价。

本发明与目前技术相比，具有以下优点：

1、本发明选择吖啶酯作为标记材料，并应用于化学发光免疫分析系统，该发光体系为直接化学发光，与传统的酶促化学发光相比，该反应不需要酶的参与，更加节约成本；

2、本发明选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统检测灵敏度高，能够达到0.7 AU/mL，相比其它的类风湿因子IgG检测方法灵敏度至少提高了5倍；

3、本发明选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统线性范围宽，能达到4-240 AU/mL，其它的类风湿因子IgG化学发检测方法的检线性范围为10-200 AU/mL；

4、本发明选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统重复性高，批内及批间差均在5%以内，这是其它化学发光免疫分析系统难以达到的；

5、本发明的化学发光免疫分析系统已实现样本的定量，通过内置标准曲线到测试软件，只需测试样本就可直接得到样本的浓度值；

6、本发明的化学发光免疫分析系统已实现全自动化，试剂及样本的添加全有仪器完成，操作更加简便，减少了人为的误差。

附图说明

图1为实施例3得到的抗Jo-1抗体IgG标准曲线图。

具体实施方式

实施例1：类风湿因子IgG化学发光免疫检测试剂盒制备方法

（1）类风湿因子IgG单克隆抗体包被的纳米磁珠制备：

取50mg羧基化的磁微粒（粒径为0.05-1um）悬浮液，磁分离去上清，用0.02 M，pH为5.5MES缓冲液重悬，加入0.5-2mL新配置的10 mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入3-5mg 类风湿因子IgG单克隆抗体，室温下混悬2-10 h，磁分离，去除上清，用含2% BSA 的0.1M pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到类风湿因子IgG单克隆抗体包被的磁颗粒，每瓶5mL分装保存于4℃备用。

（2）羊抗人IgG标记的吖啶酯的制备：

取50 uL 25mg/mL的羊抗人IgG，加入150 uL 0.1-0.2 M pH 9.0-9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入1-2 uL 5 mg/mL的吖啶酯混匀，室温下避光反应，1-2 h后取出，用2 mL的zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的羊抗人IgG标记的吖啶酯溶液，收集离心管中的液体至保存管得到羊抗人IgG标记的吖啶酯，每瓶5 mL分装保存于4℃备用。

（3）类风湿因子IgG定标品的制备：

用标准品缓冲液（40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0）将类风湿因子IgG配置成浓度为0.0 AU/mL、5.2 AU/mL、20.8 AU/mL、50.5 AU/mL、102.2 AU/mL、299.2 AU/mL，每瓶0.5 mL分装，4 ℃保存备用。

(4)化学发光预激发液的配制：

量取1.0升纯化水，依次加入80uL质量分数为20%的双氧水(H₂O₂)、1.0克叠氮化钠、1.5克吐温20，摇匀后避光存放。

(5)化学发光激发液的配制：

量取1.0升纯化水，依次加入0.6克氢氧化钠、0.5克PC300、0.5g叠氮化钠、1.5克Triton405，摇匀后避光存放。

实施例2：类风湿因子IgG化学发光免疫检测方法：

本发明以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，本发明的方法学模式为间接法，即仪器依次加入5 uL的样品（1:20稀释）、50 uL的类风湿因子IgG单克隆抗体包被的磁颗粒反应10 min后，清洗，加入100 uL的羊抗人IgG标记的吖啶酯，反应10 min后，进行磁分离，仪器将反应混合物送入暗室，依次加入50uL化学发光预激发液、50uL化学发光激发液进行发光反应，最后记录发光强度，从标准曲线计算出被测样品的类风湿因子IgG含量。

实施例3：类风湿因子IgG化学发光免疫检测试剂盒性能评价

检测曲线见附图1。

灵敏度的检测：

参照CLSI EP17-A 文件推荐实验方案，计算类风湿因子IgG化学发光免疫层析试剂盒的灵敏度，求得的灵敏度为0.7 AU/ mL。

线性的检测：

对浓度为5.2 AU/mL、20.8 AU/mL、50.5 AU/mL、102.2 AU/mL、299.2 AU/mL标准品做线性分析，计算线性相关系数，r=0.9996，另外，该试剂盒对类风湿因子IgG样品检测的线性范围为4-240 AU/mL。

精密度测定：

取浓度为42.5 AU/mL及202.4 AU/mL两个类风湿因子IgG样品，每个样本每个浓度各做3个平行，用三批试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果表明该试剂盒批内及批间差均小于5%。

干扰性实验：

取混合血清分别添加干扰物包括：结合胆红素、游离胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、甘油酯，添加比例按照 1: 20 进行，分别测定混合血清及添加了各种干扰物后混合血清的测值，计算二者之间的偏差，以 ±10%为可接受范围。结果表明，干扰性均达到 NCCLS 的文件标准，可用于临床实验室类风湿因子IgG状况的准确评估。

实施例4:类风湿因子IgG化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度对比实验

分别用化学发光检测方法和传统的酶联免疫吸附法对浓度为0 AU/mL的校准品或样本稀释液为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的RLU值（相对发光值），计算其平均值（M）和标准差（SD），得出M+2SD，将该发光值代入校准曲线计算得到相应的浓度值。采用化学发光检测方法得到的浓度值为0.7 AU/mL，相对于传统的酶联免疫吸附法最低检测限3.8 AU/mL，提高了约5倍。

Claims

1.一种类风湿因子IgG化学发光免疫检测试剂盒，所述试剂盒包括：类风湿因子IgG单克隆抗体包被的-纳米磁微球、化学发光标记物、化学发光底物液、类风湿因子IgG定标品。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述类风湿因子IgG单克隆抗体包被的固相载体为磁微粒。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述类风湿因子IgG单克隆抗体包被的固相载体为羧基化的粒径为0.05-1um磁微粒。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物为吖啶酯、吖啶酯磺酰胺、吖啶酯甲苯磺酰胺、吖啶酯对甲基磺酰胺、吖啶酯三氟甲基磺酰胺。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物优选吖啶酯。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液包括化学发光激发液、化学发光预激发液。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光预激发液为质量分数0.005% ~ 0.5%的双氧水(H₂O₂)溶液，激发液为0.005mol/L ~ 0.025mol/L的氢氧化钠(NaOH)溶液。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述类风湿因子IgG定标品为用标准品缓冲液将类风湿因子IgG配制成浓度为0.0 AU/mL、5.2 AU/mL、20.8 AU/mL、50.5 AU/mL、102.2 AU/mL、299.2 AU/mL，4 ℃保存备用。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的制备方法，其特征在于包括类风湿因子IgG单克隆抗体包被的磁微粒的制备、羊抗人IgG标记的吖啶酯的制备、化学发光底物液的制备、类风湿因子IgG定标品的制备。

10.根据权利要求1和权利要求9所述试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）类风湿因子IgG单克隆抗体包被的磁微粒的制备：

取羧基化的纳米磁珠悬浮液，磁分离去上清， MES缓冲液重悬，加入EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入类风湿因子IgG单克隆抗体，室温下混悬2-10 h，磁分离，去除上清， Tris缓冲液重悬，得到类风湿因子IgG单克隆抗体包被的磁微粒；可选的，羧基化纳米磁珠直径为0.1μm ~ 2.0μm；MES缓冲液浓度为10mM ~ 100mM，pH 5.5 ~ 8.5；

2）羊抗人IgG标记的吖啶酯的制备：

取羊抗人IgG，加入碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入吖啶酯混匀，室温下避光反应，1-2 h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的羊抗人IgG标记的吖啶酯溶液，收集离心管中的液体至保存管得到羊抗人IgG标记的吖啶酯；

3）类风湿因子IgG定标品的制备：

用标准品缓冲液将类风湿因子IgG配置成浓度为0.0 AU/mL、5.2 AU/mL、20.8 AU/mL、50.5 AU/mL、102.2 AU/mL、299.2 AU/mL， 4 ℃保存备用；

4）化学发光预激发液的制备：

量取1.0升纯化水，依次加入0.5 ~100uL质量分数为20%的双氧水(H₂O₂)、0.5 ~ 5克防腐剂、0.5 ~ 5克表面活性剂，摇匀后避光存放；可选的，防腐剂为商品化叠氮化钠、PC300，表面活性剂为吐温20、吐温80、Triton X100、Triton 405；

5）化学发光激发液的制备：

量取1.0升纯化水，依次加入0.2 ~ 1克氢氧化钠、0.5 ~ 5克防腐剂、0.5 ~ 5克表面活性剂，摇匀后避光存放；可选的，防腐剂为商品化叠氮化钠、PC300，表面活性剂为吐温20、吐温80、Triton X100、Triton 405。