DE102004010788A1 - Verfahren und Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von Blutmerkmalen durch optische Messung - Google Patents

Abstract

Zur Bestimmung der Blutgruppe und auch seltener Blutmerkmale wird eine Blutprobe auf ein Substrat gegeben, das aus einer Vielzahl geordneter Kapillaren besteht. Diese Kapillaren bilden zusammen mit den Stegen dazwischen eine Kapillarplatte, in der die Kapillaren zu beiden Seiten der Platte hin offen sind. Die Bestimmung der Blutgruppe wird durch einen optischen Nachweis der Bindung von Blutgruppenmerkmalen an die entsprechend stark bindenden Nachweismoleküle an der Kapillarwandung durchgeführt. Es kann eine Vielzahl von Blutmerkmalen gleichzeitig auf einem Substrat an unterschiedlichen Orten getestet werden, ohne dass eine Agglutination oder Zentrifugation notwendig ist.

Description

• Aufgabenstellung
• Es wird ein Verfahren gesucht, mit dem die Blutgruppenbestimmung auch seltener Merkmale mit hoher Empfindlichkeit, mit wenig Blut, ohne Vorbehandlung des Bluts, bei kurzer Inkubationszeit gleichzeitig bei allen zu untersuchenden Merkmalen erfolgt. Das Verfahren soll auf Merkmale, die sich auf der Zelloberfläche befinden, genauso anwendbar sein wie auf Merkmale im Blutplasma.
• Es werden für Laboruntersuchungen relativ große Mengen von Blutproben entnommen und verwendet. Dies ist häufig mit hohen Kosten, Zeit und Umweltunfreundlichkeit verbunden. Darüberhinaus können dadurch viele Patienten anemisch werden und müssen sogar aus diesem Grund transfundiert werden. Es ist allgemein bekannt, dass mehr als 90% der Bluttransfusionen bei Neonaten allein durch Blutentnahmen verursacht werden. Die Analytik soll schneller, effektiver und sicherer werden, womit medizinisch, gesundheitspolitisch als auch finanziell ein Fortschritt in diesem Bereich erzielt werden soll. Wesentlich ist, dass auch bei seltenen Antikörpern/Antigenen der Nachweis sensitiv und signifikant sein soll und zeitlich wie finanziell tragbar wird. Hierbei sind neue optischelspektroskopische Methoden zum Nachweis der Antigen-Antikörper-Reaktionen notwendig. Weiterhin soll das Verfahren auch auf anderen Gebieten, wie Gerinnungsanalysen, Infektiologie und Hämatologie anwendbar sein.
• Zur Zeit gibt es im Wesentlichen folgende unterschiedliche Systeme in der Routineanwendung,
• • Gelmethode zur Blutgruppenserologie (Fa. Diamed/Schweiz)
• • Festphasen-Immunassays auf Mikrotiterplatten (z.B. Fa. Immucor Medizinische Diagnostik GmbH/Deutschland)
• Für die Festphasen-Immunoassays und der Gelmethode gibt es Automaten, die die Analyse teilweise bis ganz durchführen und auch das Ablesen der Reaktion wird mit Hilfe von Bilderkennungssystemen erfasst. Für alle Nachweismethoden benötigt man für jede Einzelreaktion ein Tropfen Blut oder Serum, so dass z.B. für die Identifizierung eines irregulären transfusionsrelevanten IgG-Antikörper 15 Tropfen notwendig sind. Dies führt mehrere Pipetierschritte mit sich. Beim Festphasen-Immunoassay sind Waschvorgänge enthalten. Die Gelmethode hat den Vorteil, dass kein Waschen erforderlich ist. Beide Verfahren benötigen jedoch eine lange Inkubationszeit und einen Zentrifugationsschritt.
• In der Literatur findet man Studien für Single-Step, Mikrovolumen Immunassay, die auf Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung beruhen (Fa. Merlin Diagnostika GmbH/Deutschland, Fa. Arctic Diagnostics Oy/Finnland), aber nicht sensitiv genug sind. Der Nachweis mit beschichteten Schwingquarzen als Mikrowaagen ist ebenfalls möglich (E. Uttenthaler, C. Kößlinger, S. Drost, Biosensors and Bioelectronics 13, (1998), 1279-1286; Hauck, S; Kößlinger, C.; Drost, S. Prohaska, E.; Schaible, U.; Hengerer, A.; Decker, J.; Wolf, H., BIOforum 7–8/2000, pp. 495-496). Sie sind überwiegend für kinetische Messungen in der Anwendung und nur schlecht für eine parallele Analyse geeignet. Weiterhin wurde ein portables Mehrkanal-Immunosensorsystem auf Chemilumineszenz-Basis nach der Fused-Silica-Kapillaren-ELISA-Technologie mit einem miniaturisierten Fließsystem entwickelt (E. Yacoub-George, L. Meixner et.al. Analytica Chimica Acta 457 (2002) 3-12).
• Ein tumoranzeigendes Antigen in Blutserum wurde durch einen monoklonalen Antikörper der in einer Nylonmembran immobilisiert ist durch fluoreszenzoptischen Nachweis bestimmt (M. Askari et.al., Biotechnol. Prog. 17 (2001) 543-552)
• Weiterhin ist ein Patent ( US 5,932,428 ) bekannt, bei dem die Immunofluoreszenz von Zellen in einer Kapillare untersucht werden. Die Zellkonzentration wird anhand eines optischen Rasterns über die Einzelkapillare bestimmt. Mit dieser Anordnung kann in einer Messung immer nur ein Merkmal bestimmt werden. Die Betonung bei der Messung liegt darauf, dass die Zellen statisch in der Kapillare gehalten werden. Dies dient der Abgrenzung zu einem weiteren Instrument das in der Technik bekannt ist, dem Zellsorter und -zähler („FACS"). Bei dem FACS werden die fluoreszenzmarkierten Zellen durch eine Kapillare geleitet und das Fluoreszenzsignal zum Zählen genutzt. Auch diese Methode ist nicht geeignet, um mehrere Merkmale parallel untersuchen. Beide Methoden beruhen auf der Bestimmung von Zellen.
• In einem Patent ( EP 0 568 664 ) zur Bestimmung von Antigenen in Flüssigkeiten, ist eine Anordnung beschrieben, die aus drei Kammern besteht. Eine Reaktionskammer, eine Sammelkammer und eine Testkammer in einer Kapillaren. Diese Kammern können durch Bewegungen gezielt in Kontakt gebracht werden. In der Testkammer ist eine Membran eingebracht die den zu untersuchenden Liganden bindet. Ebenfalls nur für ein Merkmal geeignet können mit dieser Anordnung keine Zellen untersucht werden.
• Es wird in mehreren Patenten beschrieben (WO 02/059622, US 2003/0224457) wie die Blutgruppenbestimmung auf einer optischen Bio-Disc durchgeführt wird. Hierzu wird jeweils Blut für einen Antigen-Antikörper-Test in eine Kammer eingebracht und durch Rotation der Disc werden die nicht gebundenen Erythrozyten entfernt. Für die Bestimmung der Antikörper muss jedoch erst durch Zentrifugation Blutserum gewonnen werden, eine Agglutination herbeigeführt werden, bevor wie bei den Erythrozyten diese in eine Kammer eingebracht wird und durch Rotation separiert wird. Dann kann die Disc in einem optischen Lesegerät ausgelesen werden.
• Auf der Agglutination beruht ein weiteres Patent ( US 6,330,058 ), bei dem eine Blutmenge aufgeteilt wird und getrennt mit verschiedenen Antikörpern gemischt wird. Mit einem Spektrometer wird die spektrale optische Dichte bestimmt und einem Agglutinationsindex zugewiesen aus dem die Blutgruppe ablesbar ist.
• Die Bindung zwischen Antikörper und Antigen wird in einem weiteren Patent ( DE 695 12 909 , EP 0 760 103 ) genutzt, um mit Erythrozyten Komplexe zu bilden, die durch eine Membran abgetrennt werden und dadurch nachgewiesen werden können.
• In einem weiteren Patent (WO 02/090989) wird die Antigen-Antikörper Reaktion durch einen Bindungspartner auf Mikrokügelchen durchgeführt. Der Nachweis erfolgt durch Zentrifugation und Agglutinationstest.
• Erfindungsgemäße Lösung
• Es werden Nachweismoleküle, die eine starke Affinität zu den zu untersuchenden Merkmalen besitzen, jeweils an bestimmten Probenorten (2) eines Substrats gebunden. Innerhalb eines Probenorts (2) kommen immer nur Nachweismoleküle einer Sorte vor, durch mehrere räumlich getrennte Probenorte auf dem Substrat können mehrere Merkmale auf einem Substrat gemeinsam und gleichzeitig untersucht werden (Zeichnung 1).
• Die Untersuchung der Merkmale geschieht, indem das Substrat mit dem zu untersuchenden Blut in Form von Vollblut, Zitratblut, Blutkonzentrat, Blutserum oder Blutplasma in unverdünnter oder verdünnter Form in Kontakt gebracht wird. Durch die hohe spezifische Affinität binden die Moleküle, die ein Merkmal darstellen, an die Nachweismoleküle. Durch Spülen mit einer Spülflüssigkeit werden nichtgebundene Moleküle oder Zellen aus dem Substrat entfernt. Falls notwendig werden die gebundenen Moleküle mit einer optischen Markierung versehen und nochmals mit Spülflüssigkeit gespült. Die verbliebenen Moleküle oder Zellen, die ein Merkmal darstellen werden optisch quantitativ an den jeweiligen Probenorten gemessen, so dass eine Stoffmenge bestimmt wird. Durch die Kenntnis des Nachweismoleküls am jeweiligen Probenort kann die Stoffmenge dem Merkmal zugewiesen werden. Erfindungsgemäß werden durch die Form und Art des Substrats entsprechend der Aufgabenstellung die verschiedenen Merkmale bestimmt. Das Substrat ist eine Platte, in der eine Vielzahl zylindrischer Hohlräume durchgängig eine Verbindung zwischen den beiden Seiten der Platte herstellen. Die gesamte innere Oberfläche der zylindrischen Hohlräume, im folgenden Kapillaren (1) genannt, ist deutlich größer als die Oberfläche der Platte. Die Nachweismoleküle werden nun erfindungsgemäß an der Innenseite der Kapillaren gebunden. Durch die sehr große innere Oberfläche kann damit eine sehr große Menge an Nachweismolekülen gebunden werden, die eine hohe Nachweisempfindlichkeit ermöglicht. Dadurch wird der Nachweis auch seltener Merkmale, die in nur in geringer Konzentration vorliegen mit einer sehr geringen Menge an Blut ermöglicht.
• In Weiterführung des Erfindungsgedankens haben die Kapillaren (1) einen kleinen Durchmesser, so dass die Entfernung eines Moleküls oder einer Zelle zur Kapillarwand klein ist, und damit in kurzer Zeit per Diffusion das Molekül oder die Zelle zu den Nachweismolekülen gelangt. Dies resultiert in kurzen Inkubationszeiten und insgesamt in der schnellen Analyse aller Merkmale.
• Durch die Öffnung der Kapillaren zu beiden Seiten der Platte hin wird das Befüllen der Kapillaren mit Blut und das Spülen sehr vereinfacht.
• Die Erfindung kommt besonders stark zum Ausdruck durch die optische Messung der Anzahl gebundener Moleküle oder Zellen.
• Merkmale auf Zellen:
• Für die Bestimmung eines Merkmals, das auf der Zellmembran von Erythrozyten vorkommt, z.B. ein Antigen, wird der entsprechende Antikörper an die Kapillarwand als Nachweismolekül gebunden. Im chemischen Gleichgewicht bindet eine bestimmte Anzahl von Erythrozyten pro Oberfläche mit Nachweismolekülen. Durch Spülen werden nicht bindende Zellen und Moleküle entfernt. Da in der Anordnung mit kleinen Kapillaren die Oberfläche um ein Vielfaches größer ist als in einer flachen Anordnung, kann ein entsprechendes Vielfaches an Erythrozyten gebunden werden. Erst diese Verstärkung ermöglicht in einer einfachen Extinktionsmessung diese Anzahl an Erythrozyten zu bestimmen (Zeichnung 2).
• Merkmale im Blutplasma:
• Als Merkmale im Blutplasma werden beispielsweise in Routineuntersuchungen unterschiedliche Antikörper nachgewiesen. Hierzu werden in dieser Erfindung passende Antigene auf der Kapillaroberfläche gebunden. Im Inkubationsschritt werden die passenden Antikörper an die Antigene gebunden. Nach einem Spülschritt kann das Substrat mit einem unspezifischen optisch markierten Nachweismolekül für Antikörper inkubiert werden. Die optische Markierung kann beispielsweise ein Fluorophor sein. Damit werden alle Antikörper anhand ihrer Fluoreszenz optisch einfach nachweisbar. Die Spezifität des Nachweises wird durch die Antigene bewirkt.
• Weiterhin ist eine Markierung mit unspezifischen Erythrozyten möglich, gefolgt von einer weiteren Transmissionsmessung.
• Nachweis der Antikörper oder Zellen ohne Markierung
• Die hohe optische Qualität der Kapillaren kann auch genutzt werden, um ohne einen zusätzlichen Markierungsschritt, wie z.B. beim Antikörpernachweis durch Fluorophore oder unspezifische Erythrozyten, die Bindung von Antikörpern nachzuweisen. Hierzu wird ausgenutzt, dass nach dem Spülvorgang an der Kapillarwand die in unterschiedlicher Konzentration vorhandenen Antikörper eine lokale Veränderung des Brechungsindex darstellen. Durch Beleuchten der Kapillaren mit einer Lichtquelle wird das Licht teilweise an der Kapillarwand und teilweise von den gebundenen und nachzuweisenden Molekülen oder Zellen reflektiert. Diese beiden Lichtanteile interferieren miteinander. Dieser Vorgang geschieht entlang der Kapillaren mehrfach und verstärkt damit die Interferenzeffekte. Die Analyse des Lichts nach einem Standardverfahren, wie zum Beispiel Zweistrahlinterferenz, Spektralanalyse des Lichts, Winkelabhängigkeit der Lichtintensität ermöglicht die Bestimmung des mittleren Brechungsindex und damit die Bestimmung einer der Stoffmenge proportionalen Größe.
• Besondere Vorteile dieser Erfindung
• In besondere Weise zeichnet sich die Erfindung dadurch aus, das Blut mit Zellen und Zellplasma gemeinsam, ohne vorherigen Trennschritt, aufgebracht und untersucht werden kann. Damit können in einem Schritt mehrere Merkmale die auf Zelloberflächen und molekular im Plasma vorkommen untersucht werden.
• Es werden kurze Inkubationszeiten durch die kleinen Wege bis zum nächsten Bindungspartner an der Kapillarwand erreicht, die eine insgesamt kurze Analysezeit ermöglicht. Eine typische Diffusionszeit für Antikörper in einer Kapillare mit 20 μm Durchmessern beträgt zum Zurücklegen des Kapillarradius ca. 1 s.
• Durch die nach beiden Seiten der Platte hin offenen Kapillaren kann einfach und kontrolliert gespült und mit Blut oder Reagenzien beschickt werden. Das kontrollierte Spülen ist besonders wichtig, um zum einen unspezifisch bindende bzw. in Lösung befindliche Moleküle und Zellen zu entfernen und zum anderen die begrenzte Haftung der spezifisch gebundenen Zellen nicht zu überschreiten.
• Die Verwendung von vielen Kapillaren, um ein Merkmal zu bestimmen, erhöht nicht nur die Sensitivität, sondern macht die Messung gleichzeitig unempfindlich für ein Verstopfen oder eine fehlerhafte einzelne Kapillare. Ein solcher Fehler führt lediglich zu einer ungenaueren Bestimmung, jedoch unterhalb der notwendigen Fehlergrenzen.
• Ein besonders wichtiger Vorteil ist die Eignung der Kapillarplatte für die wichtigsten Methoden des optischen Auslesens der Menge an gebunden Molekülen und Zellen. Mit einer Oberflächenqualität der Kapillaren, die spiegelnde Reflektion ermöglicht, können die Standardverfahren für den optischen Nachweis in hervorragender Qualität und Sensitivität durchgeführte werden. Selbst eine interferometrische Auswertung des Lichts zur Quantifizierung ohne Markierung ist hiermit möglich.
• Bevorzugte Ausführungsformen
• Standard Bluttest für zwölf Merkmale zur Blutgruppenbestimmung
• Für die Blutgruppenbestimmung bestehend aus Antikörpertests und Antigentests ist eine Kapillarplatte (Zeichnung 1) mit einer Fläche von weniger als 20 mm² Fläche ausreichend. Herstellungsbedingt ist diese Kapillarplatte meist hexagonal. Für eine weitergehende Bestimmung von weiteren Merkmalen ist gegebenenfalls eine größere Kapillarplatte zu verwenden.
• Die Station zur Handhabung und zum Auslesen des Bluttest kann in unterschiedlichem Automatisierungsgrad hergestellt werden, der sich am Durchsatz an Tests orientiert.
• Vorbereitung der Kapillarplatte
• Die Kapillarplatte wird in einer Kunststoffhalterung für die einfache Handhabung eingebaut. Hierauf befinden sich Vorrichtungen zur Markierung mit Barcodes, Nummern oder Namen. Auf der Kunststoffhalterung ist weiterhin vorgesehen, ein Einfüllbereich für das Blut und Anschlüsse zum Spülen.
• Entsprechend den Merkmalen die untersucht werden sollen werden Testsubstanzen gegen diese Merkmale jeweils in getrennten Probenbereichen (2) eingebracht (Zeichnung 1).
• Diese Probenbereiche von z.B. 0,5 mm Durchmesser mit einem Abstand von z.B. 1 mm umfassen damit mehrere Kapillaren. Die Kapillardurchmesser liegen im Bereich von 5 bis 200 μm, bevorzugt jedoch im Bereich von 20 bis 50 μm. Die Stege zwischen den Kapillaren sind ungefähr so dick wie der Kapillardurchmesser. Die Kapillarplatte besitzt insgesamt eine Dicke, die der Länge der Kapillaren entspricht, von 200 bis 2000 μm. Die Dicke wird anhand der notwendigen Empfindlichkeit ausgewählt, da durch die Dicke die Größe der inneren Oberfläche bestimmt wird.
• In jedem Probenbereich ist somit ein Test gegen ein Merkmal vorhanden. Dieser Test in Form von Molekülen z.B. Antikörpern oder von Zellfragmenten z.B. mit Antigenen an der Oberfläche wird an der Innenseite der Kapillaren fest gebunden.
• Durch die Vielzahl von Probenbereichen mit jeweils einem Test gegen ein Merkmal kann somit eine komplette Standard-Blutgruppenbestimmung im AB0-System und im Rhesus-System durchgeführt werden.
• Die so vorbereiteten Kapillarplatten können steril eingeschweißt und bis zur Verwendung gelagert werden.
• Inkubation
• Eine Blutprobe, diese kam aus Vollblut, Blutplasma, Blutserum, Blutkonzentrat, Zitratblut in verdünnter oder unverdünnter Form bestehen, wird in einer bestimmten Menge auf den Einfüllbereich der Kapillarplattenhalterung gegeben. Durch Kapillarkräfte wird die Blutprobe in alle Kapillaren (1) bewegt. In der bevorzugten Ausführungsform ist nun kein Überschussvolumen an Blut und kein weiterer Mischschritt notwendig.
• Bei der Untersuchung von selteneren Merkmalen, die in geringerer Konzentration vorkommen, wird jedoch ein Überschussvolumen mit der Blutprobe gefüllt. Durch mehrmaliges Mischen der Blutprobe im Überschussvolumen mit der in den Kapillaren befindlichen Blutprobe wird eine Anreicherung der merkmalstragenden Moleküle und Zellen im jeweiligen Probenbereich erzielt.
• Nach Einbringen des Blutes und ggf. nach jedem Mischschritt wird eine Inkubationszeit abgewartet. Hierdurch können sich Bindungspartner durch Eigenbewegung finden. Diese Zeit ist vom jeweiligen Test abhängig und liegt im Sekunden- bis Minutenbereich.
• Nach Ablauf der Inkubationszeit und ggf. der Mischschritte sind die merkmalstragenden Moleküle bzw. Zellen in angereichertem Maße an der Kapillarwand in den jeweiligen Probenbereichen vorhanden. Weiterhin befinden sich jedoch auch ungebunden oder unspezifisch schwach gebunden die merkmalstragenden Moleküle oder Zellen in den Kapillaren, die nicht an die Testsubstanzen an der Kapillarwand binden. Diese müssen in einem nachfolgenden Spülschritt entfernt werden.
• Spülen
• Über die Spülanschlüsse wird eine geeignete Spülflüssigkeit so zugegeben, dass die Blutprobe aus dem Überschussbereich und dem Kapillarvolumen verdrängt wird und in einen zweiten Spülanschluss, der als Abfluss dient in ein Abfallvolumen verschoben wird. Dieser Vorgang wird mit einer ausreichenden Flüssigkeitsmenge durchgeführt, um die notwendige Reinheit zu erzielen. Weiterhin wird der Flüssigkeitsdurchsatz durch die Kapillarplatte so eingestellt, das die Scherrate möglichst so hoch ist, dass unspezifisch bindende Moleküle und Zellen abgelöst werden, jedoch nicht so groß ist, dass die spezifisch bindenden ebenfalls abgelöst werden.
• Bestimmung der Antigen-Merkmale auf Erythrozyten durch eine Extinktionsmessung (Zeichnung 2)
• Die Anzahl der gebundenen Erythrozyten in einem Probenbereich wird durch eine Extinktionsmessung bestimmt. Hierzu wird bei einer Wellenlänge mit hoher Absorption von Hämoglobin, wie zum Beispiel 420 oder 550 nm mit einer Lichtquelle (3), die eine einfache LED sein kann, der Probenbereich (2) in der Kapillarplatte beleuchtet. Das transmittierte Licht wird mit einem Photodetektor (9) erfasst. Ein Teil des Lichts wird bevor es die Kapillarplatte durchdringt über einen Strahlteiler (6) ausgekoppelt und auf einen zweiten Photodetektor (5) geleitet. Durch die Bildung des Quotienten der Messwerte der beiden Photodetektoren wird eine mögliche Schwankung der Lichtleistung der Lichtquelle kompensiert und die Messung der Transmission erreicht eine höhere Genauigkeit. Diese Genauigkeit kann noch weiter verbessert werden und die Messung kann noch unempfindlicher gegen Verunreinigungen oder andere Störungen gemacht werden, indem bei einer zweiten Wellenlänge, außerhalb der Absorptionsbanden von Hämoglobin, eine weitere Transmissionsmessung durchgeführt wird. Hier sind Wellenlängen oberhalb von 650 nm am geeignetsten. Diese Messung wird über eine zweite Lichtquelle (4) und den Strahlteiler (6) mit den bereits genannten Photodetektoren (5 und 9) durchgeführt. Ein Quotient der Transmissionen bei beiden Wellenlängen liefert einen noch genaueren und stabileren Wert für die Absorption durch Hämoglobin in den Erythrozyten. Im Sinne der Erfindung kann jedoch auch bei nur einer Wellenlänge gemessen werden.
• Bei Extinktionsmessungen mit einer und auch mit zwei Wellenlängen kann eine Genauigkeit von 1 % einfach erreicht werden. Dies bedeutet somit für eine Transmission von 99% bezogen auf eine Transmission ohne Erythrozyten (100%) eine Schwächung um ein Prozent. Bei einem Probenbereich von 0,5 mm Durchmesser und der Messung in der blauen Absorptionsbande von Hämoglobin bei 420 nm (Zeichnung 4) bedeutet diese Schwächung um ein Prozent eine Menge von 79 Erythrozyten im Probenvolumen. Dies kann noch weiter verbessert werden, ist jedoch schon ausreichend für die meisten Tests.
• In einer alternativen Ausführungsform wird durch einen Reflektor die durch die Kapillarplatte transmittierte Strahlung reflektiert und nochmals durch die Erythrozyten abgeschwächt. Durch einen zusätzlichen Strahlteiler kann diese transmittierte Strahlung von der Beleuchtung getrennt werden und auf einem Photodetektor bestimmt werden.
• Zugabe von Nachweisreagenzien
• In einer bevorzugten Ausführungsform wird nach dem Spüldurchgang eine Nachweisreagenz zugefügt, die unspezifisch alle Antikörper markiert. Die Markierung kann mit einem Fluorophor oder auch mit Erythrozyten geschehen. Nach einer Inkubationszeit für die Markierung wird wie vorher beschrieben das Überschussvolumen und die Kapillarplatte gespült.
• Bei einer Markierung mit Erythrozyten wird danach eine Extinktionsmessung wie vorher beschrieben (Zeichnung 2) durchgeführt.
• Bei einer Fluoreszenzmarkierung wird nun eine Messung der Fluoreszenz zur Bestimmung der Menge an gebunden Antikörpern durchgeführt.
• Bestimmung der Antikörpermerkmale durch eine Fluoreszenzmessung (Zeichnung 3)
• Im Anschluss an das Ausspülen der Fluoreszenzmarkierung sind nur noch gebundene Markierungen in der Kapillarplatte vorhanden und es können die Merkmale quantifiziert werden. Hierzu wird mit einer schmalbandigen Lichtquelle (10) im Absorptionsbereich des genutzten Fluorophors die Fluoreszenz angeregt. Hierzu wird die Strahlung der Lichtquelle (10) durch eine Linse (11) so an die Größe des Probenbereichs angepasst, dass der gesamte Probenbereich oder ein Teil des Probenbereichs angeregt wird. Die entstehende Fluoreszenz kann nun in Epifluoreszenzanordnung (Zeichnung 3) oder auch in Durchlichtanordnung (Zeichnung 2 mit im Strahlengang befindlichem Filter 8) erfasst werden. In der bevorzugten
• Epifluoreszenzanordnung wird durch einen wellenlängenselektiven Strahlteiler (12) der Strahlengang der Anregung vom Strahlengang der Fluoreszenz getrennt und mit einer Linse (11) die Fluoreszenzstrahlung auf den Detektor (14) fokussiert. Durch einen optionalen Reflektor (18) unter der Kapillarplatte kann die messbare Fluoreszenz nahezu vervierfacht werden, da Anregungslicht die Kapillarplatte zweifach durchstrahlt und das Fluoreszenzlicht, das die Kapillarplatte in die detektorabgewandte Richtung verlässt, nun reflektiert wird und ebenfalls gemessen werden kann.
• Durch eine Verhältnisbildung (15) von Fluoreszenzleistung und Anregungslichtleistung (16) wird die Information der Fluoreszenz unabhängig von Schwankungen der Anregungslichtquelle (10).
• Alternative Ausführungsform
• In einer weiteren Ausführungsform kann auf die Zugabe von Nachweisreagenzien und das damit verbundene zweite Spülen verzichtet werden. Es ist eine unterschiedliche Anzahl an gebundenen Antikörpern an der Kapillarwand vorhanden, die nachgewiesen werden soll. Hierfür kann ohne zusätzliche Markierung nur eine vorhandenen physikalische Eigenschaft genutzt werden. Dies ist der Brechungsindexunterschied des gebundenen Moleküls im Vergleich zum Medium in der Kapillare. Durch die bekannten interferometrischen Verfahren kann dieser Brechungsindexunterschied quantifiziert werden und damit die Stoffmenge bestimmt werden.
• Weitere Ausführungsformen
• Weiterhin können die Kapillaren auch parallel zur Oberfläche angelegt oder in sogenannten V-grooves-Formen angeordnet sein. Die Form der Kapillaren kann sowohl zylindrisch als auch konisch sein.
• Beschreibung der Zeichnungen
• Zeichnung 1: Ausschnitt aus einer Kapillarplatte. In A ist eine Aufsicht gezeigt und in B ein Schnitt durch die Kapillarplatte.
• Zeichnung 2: Messaufbau zur Bestimmung der Transmission in der Kapillarplatte.
• Zeichnung 3: Messaufbau zur Anregung und Messung der Fluoreszenz in der Kapillarplatte.
• Zeichnung 4: Darstellung des Absorptionskoeffizienten in der Einheit mm^–1 von Erythrozyten der Konzentration 0,24 Millionen pro μl aufgetragen über der Wellenlänge in nm.

1

Kapillare

2

Probenbereich für jeweils ein Merkmal

3

schmalbandige Lichtquelle, z.B. LED oder Laser mit einer

Wellenlänge bei einer Aborptionsbande von Hämoglobin

4

schmalbandige Lichtquelle, z.B. LED oder Laser mit einer

Wellenlänge außerhalb der Aborptionsbanden von Hämoglobin

5

Detektor z.B. Photodiode für die Messung der eingestrahlten

Lichtleistung

6

Strahlteiler zum Aufteilen des Lichts von den Beiden Lichtquellen 3

und 4 in einen Referenzzweig zum Detektor 5 und einen

Probenzweig zum Detektor 9

7

Kapillarplatte

8

optional in den Strahlengang einschiebbarer Filter

9

Detektor für die Lichtleistung nach Transmission durch die

Kapillarplatte

10

Schmalbandige Lichtquelle, z.B. ein Laser für die Anregung der

Fluoreszenz

11

Linse oder Objektiv zur Anpassung der Lichtverteilung an die

Größe des Probenorts

12

Wellenlängenselektiver Strahlteiler

13

Filter zur Blockung von Anregungslicht der Lichtquelle 10,

durchlässig für Fluoreszenzlicht

14

Photodetektor, z.B. Photodiode zur Messung der

Fluoreszenzintensität

15

Elektronik zum Vergleich von Fluoreszenzleistung und

Anregungslichtleistung

16

Übertragung der Information der Anregungslichtleistung zu 15

17

Kapillarplatte

18

Reflektor

Claims (20)

1. Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung molekularer Merkmale in Blut dadurch gekennzeichnet, dass a) Blut auf eine Platte aufgebracht wird, in der eine Vielzahl zylindrischer Hohlräume durchgängig eine Verbindung zwischen den beiden Seiten der Platte herstellen, b) durch Kapillarkräfte das Blut in die zylindrischen Hohlräume, im folgenden Kapillaren genannt, bewegt wird, c) in einem Teilbereich der Platte an der inneren Oberfläche der Kapillaren gleichartige Liganden gebunden sind, die ein molekulares Merkmal im Blut testen d) mehrere solche Teilbereiche auf der Platte mehrere unterschiedliche Merkmale des Blutes testen und e) die Stärke der Bindung zwischen den Liganden und den merkmalstragenden Zellen oder Molekülen durch optische Methoden nachgewiesen wird.
2. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass das Blut ein Vollblut, Zitratblut, Blutplasma, Blutserum oder Blutkonzentrat in verdünnter oder unverdünnter Form ist.
3. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Platte mit den Kapillaren aus Glas oder Kunststoff besteht, der transparent, opaque oder absorbierend für Licht ist.
4. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillaren einen Durchmesser im Bereich von 5 bis 200 μm haben.
5. V erfahren und Vorrichtung nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillarplatte zwischen 200 und 2000 μm dick ist.
6. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Liganden, die an der Innenseite der Kapillaren gebunden sind, Antikörper, Antigene oder andere Moleküle sind, die eine starke Affinität zu Blutbestandteilen haben.
7. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Merkmale die Blutgruppenmerkmale in Form von Antikörpern oder Antigenen auf den Erythrozyten sind.
8. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Merkmale krankheitsspezifisch in unterschiedlicher Konzentration vorkommende Moleküle sind.
9. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass das gebundene merkmalstragende Molekül die Zelle durch einen sekundären Antikörper oder eine Zelle markiert wird, so dass sie die Bindung des Merkmals an den Liganden optisch anhand einer Fluoreszenz oder Absorption nachweisbar ist.
10. Verfahren und Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9 dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung eines merkmalstragenden Moleküls oder Zelle durch eine optische Extinktionsmessung nachgewiesen wird.
11. Verfahren und Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9 dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung eines merkmalstragenden Moleküls oder Zelle durch eine optische Fluoreszenzmessung nachgewiesen wird.
12. Verfahren und Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9 dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung eines merkmalstragenden Moleküls oder Zelle durch eine optisch-interferometrische Messung des Brechungsindex nachgewiesen wird.
13. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 12 dadurch gekennzeichnet, dass die Interferenz und damit der Brechungsindex anhand eines wellenlängenabhägigen Spektrums bestimmt wird.
14. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 12 dadurch gekennzeichnet, dass die Interferenz und damit der Brechungsindex anhand einer winkelabhängigen oder ortsabhängigen Intensitätsverteilung bestimmt wird.
15. Verfahren und Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 14 dadurch gekennzeichnet, dass die Messung in Reflexionsanordnung geschieht.
16. Verfahren und Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 14 dadurch gekennzeichnet, dass die Messung in Transmissionsanordnung geschieht.
17. Verfahren und Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 10 bis 16 dadurch gekennzeichnet, dass als Lichtquelle eine Leuchtdiode (LED) genutzt wird.
18. Verfahren und Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 10 bis 16 dadurch gekennzeichnet, dass als Lichtquelle ein Laser genutzt wird.
19. Verfahren und Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 10 bis 16 dadurch gekennzeichnet, dass als Detektor ein Einzeldetektor genutzt wird und die unterschiedlichen Merkmale zeitsequentiell quantitativ bestimmt werden.
20. Verfahren und Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 10 bis 16 dadurch gekennzeichnet, dass als Detektor eine Kamera genutzt wird und mehrere Merkmale gleichzeitig quantitativ bestimmt werden.