JPS58501481A - 光学的導波体による溶液中検査物の測定方法および装置 - Google Patents
光学的導波体による溶液中検査物の測定方法および装置Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
光学的導氾管による浴液に
おける検査物の測定方法
本発明は、液体中の溶液における剤(もしくは分析物)の濃度を特別な反応体か
らの解離または結合たとえば錯体(複合体)における接合(結合)した部分の率
(濃度依存性)を測足することによる定量用導波管を使用することに関するもの
である。更に詳しくは、本発明は溶液における分析物の測定方法に関するもので
あシ、分析物−反応体生成物の層は、反射した電磁波シグナルを全体的におよび
倍数的に運ばれたリツ) (lit )導波管の表面で生成し、該シグナル変性
する、測定されうる該変位および該測定用に使用されるように光学特性を変化さ
せる。本発明は化学および生物学的システムの多様体に応用され、特に、イムノ
アッセイ−型反応、たとえば抗体(AB)の抗原(AG)分子への付加もしくは
逆による複合体の生成に基づく反応による低濃度における生物活性な分子の測定
に応用できる。
生化学の典型的な手段(操作)に基づいて、上記記載の測定を遂行するため従来
分野かすでに存在している。たとえば、与えられた分析物を多くの異なった方法
で検出するために化学反応は用いることができる。典型的なシステムには、着色
生成物もしくは沈澱物を与える滴定または特別の試薬との反応が含まれる。この
検出システムに対して必要なことは、試薬が等量もしくは過剰(こあシ、生成物
か常法の測光法、混濁度測定法、比色測定法などによって測定さ九ることである
。測定システムは、1ii11足されうるシグナルのサイズに基づいて選択する
。非常に低い分析物の一度で、検出は困難になシ、より太さな識別、たとえば反
応生成物を局部的に濃縮することによって、たとえば溶媒抽出、遠心法などによ
って、得られうるが、手間がかかり、そして費用もかかる。
しかしながら前記の不利性は、極度に低濃度における生化学的分析物の測定用の
実際的システムが1960年に有効になってから、非常に減少した。この分析シ
ステム(ラジオイムノアッセイ)は、分子の認知用生物学システムの特性(抗原
−抗体反応)および放射能測定の非常に商い感度(放射性アイソドーグ標識化)
の有利性がある。この突破への本質的主要点は試薬−結合と遊離部分との間で測
定される分析物の分布を測足するために用いるトレーサー・ラベルと限定された
試薬分析の概念である〔たとえばニレビュー論文“飽和分析の理論的局面”R,
P、エキンズ著、@医学におけるラジオアイソトープとのイン・ビトロ操作(方
法)”1国際原子カエネルギー機関、1970年6月参照〕。イムノアッセイは
、初めは、限定された試薬分析として記載されたけれども、同じく、実際的なシ
ステム社、後に試薬過剰法について記載された(ミレズら、 Biochem
a J *108巻611ページ1968年参照)。
容積および重量分析に加えて、本方法は、比色法。
測光法および放射能測定のような非常に感度の良い方法が含まれる。しかしなが
らこのような手段の多くは、手間がかかるものとして時代遅れになシっつあシ、
正確にするには、分析物が相対的に多量を要し、準備が大変であシ、試薬を保存
するのが困難であり、高価な、厄介な装置および非常に熟練したオペレーターを
要する。今や、もつと敏感な方法で、よシ少ない試薬を要し、中程度の熟練者に
よって、正確に、迅速に、および安全に行なうことができる方法が開発される傾
向にある。このような方法は、最近報告され、あるものは反応体を含む光4涙管
の使用を含む。分析の際、導波管を溶液に2ける分析物と接触せしめ、導液管上
で反応体との反応が引き続いて生じ、後者の光学的特性を変性させる。このよう
な変性の測定は、分析物測定に対して要するデータを提供する。いくつかの最近
の参考文献に基づくと〔たとえば、USP 4,050,895 (〕・−ディ
)およびWO81100912(ブックレス)〕、導管(導子)は、反応中、分
析物が拡散するなかに反応体で飽和した多孔透射光線コアからなる(ブックレス
)。
または導表管(ブックレスまたは・・−ディ)は、反応体で飽和された多孔もし
くは浸透性のある鞘でコーテングされた非透射光線コア(例、ガラス)からなシ
、そのなかに分析物が拡散する。更にイムノアッセイ(バーディ、例3)に応用
された1つの特別な場合には、棒状4】導管は、ノフーールジメトキシランによ
って結合された抗体層でコーテングされ、抗原で処理されたポリスチレンラテッ
クス球と反応させる。抗原処理ビーズを導管(導子)に付着させ、後者の光シグ
ナル出力を変性させ、その変位を分析的測定用に用いる。
上記の手段は、有利な点があるが、しかし、反応速度を含む典型的分析には良く
応用されない。実際に、率が、本質的分析データ、特に自動化テストシステムの
場合、を提供しうろことは知られており、浸透もしくは多孔体内に生ずる反応は
、常に肢体への分析物の予備的拡散が含まれており、そして、拡散の過程は、一
般的に化学反応よシも非常に遅く、後者の率は面接測定されないからであシ、こ
のような場合、単に平衡データが得られる。知られている従来分野において、実
施態様として、明らかな低感度が結果として期待されるという理由で、コアの屈
折インデックスよシ小さい反応体鞘でコーテングされた透明なコアの使用を含む
ことは避ける。このような場合、実際に、導管のインプットで光電した光シグナ
ルの大部分は、全反射過程によってコア内に伝わり、このような場合、靴内に局
在している反応生成物とシグナルの相互作用、たとえばコアの外側は、小である
(重要でない)ということは、一般的に認められている。その結果として、従来
分野において、鞘(反応が生ずる場所)の屈折インデックスn2は、鞘へ屈折さ
れるインプットでコア内に充電された光を与えるコアのnl よシ、常に犬であ
シ、その点から、靴内で導管(導子)のアウトプットに適当に伝わり続ける。従
来の報告のいくつかに反して、アウトプットシグナル(光の結末は、反応生成物
:靴内における反応体→分析物を通過することによって変性する)は、コアに容
易に再入せず、バックエンドに達せず(この反応は、後に議論するが、基本的光
学原理によって生ずる)、測定については、アラj−j 、)光は検波するかも
しくはテスト検体のすぐ近くに局在させねばならない(例、鞘のパックエンド)
。このような配置は常に実際的な作製様態ではなく、すなわち導管(プラス鞘)
は、溶液における分析物測定用液体に浸される。
本発明は、無多孔性コアもしくは鞘およびマトリックス構造(鞘もしくはコア)
を通じて拡散しないことを含むような欠点を改善することである。更に本発明に
おいて、全反射による導し交管内での光シグナル、伝送は、反応体−分析物生成
物内に透射もがイドもされず、むしろ、シグナルインプットの一過性の波構成成
分(すなわち全反射の場合にコアの領域外へ延びた波の部分)だけが含まれる。
−過性波の作用範囲は波長(λ)の分数(fraction )であり、必要と
される生成物の量(反応体十分折物)は、極度に小さく1.最大限の感度(分析
される種の全量について)が達成される。
本発明の目的は光学的導敗管を用いて、液体での溶液における分析物もしくは化
学種の濃度の迅速な正確測定法を提供することである。本発明の他の目的は、顕
著な特性および高感度での生物学的分析物の測定用分析法を提供することである
。他の目的は、中程度の熟練者によって容易に実施できる分析法であり、分析溶
液の少量を用いる方法を提供することである。更に本発明他の目的は、前記1己
載の方法を実施するに用いる町転性、自動化測足装置を提供するものである。
それらの目的(およびこの明細書の記載中に、その上に更に出現する目的)は、
波導管コア、該分析物溶液の屈折インデックス(n2 )よシ尚くなるように選
択された屈折インデックス(nl )を用いることを含んでなる本方法によって
適当に満たされ、導管における該光シグナル伝送と関連する電磁場での浴液にお
ける透過(透通)深度が実際的に適合するかまたは分析物−反応体生成物の該層
の厚さを越えるような割合n l / n 2を提供することである。このよう
に、たとえば特定の反応体の薄いフィルムでコーテングされたワット(非−多孔
性)専厭管のセクションを、分析物の溶成を用いて、該分析物をフィルムの該反
応体と反応せしめるために該反応物と接触せしめ、反応体−分析物生成物層を生
成させ、該生成物層形成の結果として、該コアのアウトプットでコアを通じて伝
送する光シグナルに生ずる時間に関する光−y“豹変化を観察し、該分析物の検
量試料から同様の操作で得られた標準参考データと得られたデータ、該溶液の屈
折インデックス(n2 )より犬である該コアの屈折インデックス(nl )お
よびシグナル波長の分数(fraction )である該フィルムの〜さの率を
比較する。
この段階でいわゆる全反射工程によるコアにおける光の透射についてのいくつか
の一般的な情報を提供することは、有用である。これは次の添付図一部分の一助
で、より良く説明することができる。
図1は、臨界全反射角θC/よシ大きい角θで稠密な(nl )および希薄な媒
質(n2 )との境界で入射光線Nの全反射工程を図式で示めす。この図でEo
は、よシ希薄な媒質におけるOの深さで、光の電場素子の初期のマグニチーード
であシ、2は透過厚さ軸であシ、dは、下記の議論で定義する。Rは反射光線で
ある。
図2は、多くの中間面に関する入射角に対する全内部反射についてのより希薄な
体積媒質における受部分の電磁場の透過厚さを示めす。透過厚さは、臨界角で無
限に大きく、相対的に高インデックス媒質λ1=λ/n、は、稠密な媒質におけ
る波長である( N、Y、ハーリ、り、内部反射分光学、ライレイ196フ引用
)。
図3は、−過性波および反応生成物の層との相互作用を示めす。
屈折表面での相互作用機構への物理的洞察は、マックスウェル方程式の助力で、
もっと根本的なアプローチから得られる。この場合に、たとえは、希薄な媒質と
の境界で稠富な媒質における反射、次の質問は解答されなければならない:全内
部反射に対する反射中間面以上に、より希薄な媒質における電磁場は、何である
のか?。
この場合、中間面に平行に伝えるより希薄な媒質における波の関数(funct
ion )は、存在する。電場振幅< amplitude )は、表面力・ら
の距離とともに、指数的に減する(図1参照)、従って、−過性波といわれる。
理想的な場合に、もし希薄媒質が考慮される波長でそれ自体の吸収特性をもたな
いならば非吸収性のより希薄な媒質へのエネルギーのネット正味流量はない、な
ぜなら、ポインティンのベクトルによって記載されたエネルギーの時間平均(た
とえばM、ボルン、E、ウルフ共著、゛光掌の原理″)や−がモンプレス(19
59>参照)は0である。数学的に電場は、指数関数:
で表わすことができる。
表面でその値e になり始める電場振幅に要求される距離として、透過厚さdp
は定義され、下式によって力えられる。
λ1−λ/nIは、稠密媒質における波長であり、n2−1=n2./n、は、
よシ稠密な媒質の屈折インデックスによって割られたよシ希薄な、媒質の屈折イ
ンデックスの率である。この関係の意義は、図2に示めされておシ、入射およ1
び反射した波長λ□′によって割られた透過厚さが、多くの中間面について・の
−入射角θに対してゾロ、1する(すなわちn 2 /ri□ の異なった率)
。ノは(折インデックス間の相違が友きいとき、すなわちn2/rzi:小さく
、すれすれの角に近いとは注目すべきである。この透過はλがλに近づくように
無限に大きくなる。一定の角度で、透過厚さは、小さなインデックス相違の場合
(すなわち、n2−1は1に等しいとして)において、より大きい。
透過厚さは、波長に比例し、よシ長い波長で大である。例として、稠密媒質がガ
ラス(n1≧1.5)であるならば、希薄な媒質は水溶性分析物(n2≧1、3
) n2/n、= 0.867であり、図2の曲線11にほぼ対応する。この
場合、透過はすれすれの角度で約1/3波長であり、理論的には、臨界角(60
°)で無限であり、しかし65°以下である。
Eは、指数的に減少するので、生成物と相互作用するエネルギー量がまだ有意で
ある境界面以上の領域は、電場マグニチュードがまだ道理に合ったE。
分数である厚さZに対応し、少なくても0.IEo値でるシ、より良くは、Eが
E。とE。/3のIW]にある領域である。このように、最適相互作用効率のた
めに、反応生成物フィルムの厚さは、おおよそ領域の深度と適合する。これは、
図3において説明されており、入射(W)および反射光(R)、−過性波の0深
度ベクトルE。および反応体十分折物(A)のフィルム、Eが約E。/3である
透過厚さ・(深度)dにおおよそ適合する厚さである。図3において、薄いフィ
ルムAの屈折の影響は、重要と考えられず、なぜならこのフィルムの厚さは、−
過性波の透過厚さく深度)を越えることはない。実際に、反応域における分析物
−反応体フィルムの生ずることによる希薄媒質の屈折インデックスの変化は、非
常に小さいので、反射の臨界角の値の対応する変化は、反射するモード(mod
e )がまったく反射する角度のモードに近い場合を除いて、実際に無視する。
従来技術を越えた本発明に係る予期しない有利性を構成するという見解を支持す
るものとして、例は、前記記載のN、Y、ノ・−リ、クス文献P51.に見い出
すことができる。
従来分野との比較で強調すべき他の点は、反応生成物と光シグナルの相互作用の
効率に関するものである。典型的な分光計システムにおいて、光シグナルは、分
析物を含む透明なホルダー(ビーカーまたはキーペット)を通過し、エネルギー
の一部分は、試料によって吸収され、結果として測定されうる多少吸収として存
在する。さしあたっては、この方法は、通常の条件下に、光シグナルとの有意な
相互作用を提供するために、分析物の量が、相対的に犬であるべきであるので特
に効率的ではない。、一過性の波の透過とおおよそ適合するフィルムの厚さと一
過性の波の相互作用を含んでなる本発明のどの比較において、効率はかなシ尚い
、なぜなら相互作用の域(部分)における強度の光増幅があるからである。
実際に先に述べた・・−リック文献における例で示めしたように、反応体−分析
物層との相互作用の範囲内に一過性波の力場(the field stren
gth )は、はいってくるシグナルよりももつと強力である。これは現実には
、はいってくるそしてでていく光束場振幅の両方の同時の存在によるものである
。
本発明の操作原理を理解するために必要な上記で議論した光学的原理(原則、ハ
、不偏光性光の使用に及ぶ実施において、O厚さくEO)での電場の初期マグニ
チュードは、入射光線波の偏光性の状態に依存していることは注目に値する。こ
のように、ある場合には、普通光の場における偏光性光は、本発明を実施するこ
とにおいて、有利に用いることができ(楕円測定法によってシグナル変化を測定
する場合、偏光性光が必要であることは、下記に見られる)、そして、このよう
な場合、いろいろの光学パラメーターが調整され、最大応答および感度に対して
最適にし;たとえば、適当な入射偏光角(たとえは入射面に平行かもしくは垂直
i偏光)の選択は、Eoを最大化するために行なう。
上記の考察のゆえに、従来分野と関係のある本発明の次の利点は、十分に認識さ
れうる。このように、分析物に対して、1つの特別の特異反応体が含まわるテス
トの場合において、生成物層の厚さは、通常生成物分子の各々のサイズによって
測定される。たとえば、典型的なイムノア、セイで、生成物層は、抗体の第一フ
ィルムおよび抗原の第二フィルムから構成されうる。この厚さは、数オングスト
ロームから数百1ングストロームもしくはそれ以上の分子型に依存した範囲にあ
る。今や、上記で議論した・母ラメーターは、できるだけ適合するように、層の
厚さに関して、コアの屈折インデックスが、そしていくつかの場合には波長も、
選択される。説明の方法によって例を示めすために、含まれる層が相対的に薄い
場合、高い屈折インデックスをもつコアが選択され(たとえば、サファイア、n
−]−,8;シリコン、n=3.4)および、含まれる光学工程と両立するな5
(げ(すなわち、吸収、散乱、螢光など)、よシ短い波長が選択される。分析の
反応が生ずる空間の厚さよp深い分析物@液の領域をもつ一過性波の相互作用を
最少限にし、望ましくない外来要因(・クックグランドノイズ、溶液における不
純物および類似物の存在)の影響を最少にしうる。明らかに従来分野の方法は、
このような可能性を達成することはできない。鞘の厚さが、−過性波の透通以上
に拡がり(その際、鞘の屈折インデックス(n2 )は、本発明において起こる
ものと対比して、決定基となる)、n2は、コアのインデックス(nl )より
も大きく、最初にコアに注入されそして鞘で屈折した光シグナルは容易にコアに
再入せず、一部によって(たとえばWO81100912参照)明らかに信じら
れているようにそのアウトプットに存在することは、従来分、野と本発明との間
の相、違を認識する土で、記憶すべきである。実際に、稠密な媒質によって、か
こまれた、よシ希薄な媒質内に、光シグナルが伝わる時、該光シグナルの鞘への
屈折が生ずる。次いで、この屈折した波は、全体的に鞘の外側境界によって反射
し、コアの後方向にバウンドする。今や、コアのインデックスn1は、鞘のイン
デックスより小さく、波は、次の二つの事項のいずれかである二入射角が、臨界
角より太きいならば、波は再び反射し、鞘において、確かにとどまる。入射角が
臨界角より小さいならば、波はコアを通過し、鞘などへ他側で透通ずる。もし、
鞘によってまだかこ捷れていなければコアに初めから注入され、そして靴内で屈
折した波は、コア内に単独にもどシ、コアのアウトプットでそのまま存在するこ
とは決してない。これは、USP4.050,895の図3Bにおいて、完全に
説明される。
コア内にキイ光シグナルは、コア内に伝わ)、反応体および分析物を含む外側層
内に伝わらない本発明に関して、この種の欠点は存在しない。
本発明の方法に含まれる光学的変化は、異なる種類の現象と関連させることがで
きる;たとえば、次の現象が含まれる:コア内に伝わる光の吸収;反応生成物に
よる光シグナルの散乱;コア内における光シグナルによって励起に基づく反応生
成物の螢光。
更に、コアにおける励起シグナルは、偏光化し、楕円偏光因子は、分析反応によ
って改善(変法)され、モニターされる。これらの可能性は、以降にこの明細書
で更に詳細に説明する。
本発明でなし遂げることのできる分析的測定の型は非常に多いので、それらの全
部を挙げることは不可能である。しかしながら、図示によって、数例を以降に述
べる。し2かしながらこの方向に更にすすむ前に、生物学的および診断的分析に
おいて、望ましく′用いられる、゛′限定された試薬″および゛′過剰試薬″に
ついての本発明の応用に関する原理についていくぶんか説明することは、有効で
ある。このような議論の目的のために、慣例的に、分析物゛′抗原″A Cおよ
び試薬パ抗体”ABと名づける、言うまでもなく、可逆条件もまた有効である。
°゛過剰試薬″分析は、分析物に関する反応体の過剰が用いられる場合について
、であるパ限定さnた試薬”は、本質的には、テスト物質もしくは分析物(測定
される抗原を含む)を、特異試薬の限定量(抗体)と処理し、分析物−反応体生
成物(たとえばAG、AB複合体)プラスいくらかの残留分析物を与えるような
システムの使用を含む。反応を完了するまでその丑まにしておく場合、すなわち
、分、折が平衡(″飽和分析″)になるならば、すなわち限定した接合(結合)
試薬(AB)が分析物で飽和され、反応前に(または、続いての分析において、
最終的な平衡に達する前にある点で、すなわち測定前に)、テスト下にある反応
混合物に、標識化形態の分析物の一定量(AC)を加えることが必要である。抗
体試薬で分析される抗原の例について、未標識化抗原(未知)に対する標識化抗
原(AG*)の割合は、初期のように該残留物において同じである。なぜなら用
いられたABの既知量は、AG十八へ*混合物の既知量に結合し、試料に初めか
ら存在するAGの量を計算するためにABに結合したAG*または残留AG*(
標識の手段によって)測定するに、十分である。簡単な例を挙げるために、AG
、AB複合体(たとえは、両方の取分の1:1分子比で)を生成する酵素結合(
接合)体(AB)の既知量1によって測定される酵素(AC)の等量Xを含む試
料を想定する。次いで、反応の前に、測定される同じ酵素の8等量、しかし標識
化形態(AG*)で、試料に加えられる。反応過等量によって消費される。混合
物から複合体を除去して、すぐ残留AG*を常法によって、確かめる。残留AC
に対して測定された値を減することによって、実際に使用された蚤が5等量に匹
敵することが見い出されたならば、明らである、なぜならば、AGおよびAG
は化学的に同一であシ同じ率で消費され、消費されたACについての消費された
AG*の割合、すなわち、b/g−bは、初めの割合a /Xに等しく、X=a
(g−b)/bから計算されうる。
この種のアプローチは、非常に興味深いけれども、先行分野の応用において、い
くつかの欠点を経験し、一般的に要求されているそれらのなかの1つは、しばし
ば長たらしいそして可能なエラーの原因となる反応媒質から複合体(、AG 、
AB+AG、ABの混合物)を分離しなければならない。目下のところ、本発明
を応用する際、この欠点は、存在しなくなり、生成した複合体は、礫二皮、青へ
付層させる場合、溶液から分析物を自動的に除去する。“飽和型分析″への重力
法の適用を説明するために、再び樺涙管で始め、仮りに特異抗体ABでコーテン
グした光学的ファイバーを緩衝液に浸し、平衡化する。測定される補体抗原AG
の未知量を、前述のように加え、しかし同時に特異光学特性、たとえば光学吸収
、螢光などを存する分子で標識化された同じ抗原既知少量(AG*)を加え、こ
の明細書で記載される適切な光学的配置を用いてのコーチイブされたファイバー
の表面で一過性波相互作用によって検出される。標識化および未標識化AGの両
方ともにAB−コーチイブされた光学的ファイバーへの反応性において、本質的
に同一であるが、しかし、標識化種のみ、標識を経て検出されることができ、フ
ァイバーを通して検出される光学的特性における明らかな変化(たとえば吸収標
識が用いられるならば、吸収における減)は、逆にAGの未知濃度に比例し、既
知の標準の適切なシリーズに対照して測定できる。この種の応用は以下の実施例
の1つで説明する。
この点で、生ずる反応を測定するに用いる標識に関する、明確な陳述をするに有
効である。通常は、イムノアッセイにる・いて、分析物を直接に測定することは
、可1ヒでなく、なぜなら分析物および試薬の濃度は、極端に低いからである。
限定された試薬分析における平衡混合物は、本質的に、単に過剰分析物および結
合した複合体の一定量を含み、前者は、直接に測定されず、後者は一定量であシ
、初めの分析物濃度の量的測定は、過剰抗原および複合体の分離後ですら、得る
ことができない。加えられた標識化トレーツー(標識化分析物の少量)は、結合
部分および遊離部分との間の分布(配分)に基づいて標識を経ての測定をするた
めに必要である。
しかしながら、局部的に濃縮された場合(すなわち、イン・シトつ分別およびイ
ン・シトウ濃縮分析物が、検出されうる固有な特性、を有するならば、たとえば
ファイ・ぐ−光学検体の表面で、標識化分析物トレーサーの添加は、もはや必要
ではない。このように、本発明において、分析物−試薬複合体のイン・シトつ濃
度は、標識化トレーサーへの手段なしで分析物の検出を可能にする。しかしなが
ら分析物試薬複合体の局部濃縮(なぜなら試薬量は一定である)は、分析物およ
び試薬との間の反応が速度論的に測定されないかまたは分析物の全量が試薬結合
位置の数より少なくないならば、初めの分析物濃度の量的測定を許容することは
ない。このように、本発明におけるように、イン・シトつでの速度論的(動力学
的)形態における感度の良い検出システムと関連して分析物を結合した複合体の
濃度および分離を用いることは、標識化トレーサーの手段なしに限定された試薬
システムで分析物の定量的検出を、可能にする。
標識化ラベルに関する限りでは、反応に痕跡量加えられた分析物の標識化型式の
トレーサーシステムと特異試薬に付着した標識の標識化試薬システムとの間の相
違点を指摘する。前者のトレーサー試薬は、通常、限定された試薬分析で用いら
れ(たとえば標準ラノオイムノアッセイ)、一方後者は、通常、過剰試薬分析に
おいて用いられ(たとえば標準サントイ、チ分析)、速度論(動力学)的試薬の
ある型(たとえばクロニックら、USP 3,939,350 )、使用された
標識が光学的導流管システムで検出されることができるならば(たとえば吸収ま
たは螢光標識)、本発明にふされしい標識化分析物および標識化試薬システムを
用いることができる。
議論の次の部分に対して、次の添付図の他の部分を参照する。
図4はパ直接型分析”と呼ばれる分析の第一型を示めす図である。
図5は、競合(拮抗)″限定された試薬″型分析を示めす図である。
図6は、非間接競合(拮抗)゛限定された試薬″型分析を示めす図である。
図7は、結果として起こる゛′飽飽和梨型分析示めす図である。
図8は″ザンドイッチ″型分析を示めす図である。
本発明が応用される最も簡単な分析の事例を図4に図式化する。これはパ直接″
型分析といわれる。
この分析において、表示される部分(屈折インデックスnl )のみのφslコ
ア1は、抗体ABのフィルムで準備され、コアを測定される抗原AG?を含む屈
折インデックスn2 (nl>n2 )を存する分析物溶液に浸す。抗原は、抗
原濃度(AG?)に比例して、率でAB分子に付着しくなぜならコア上のABフ
ィルムの量は、一定単位である)、そして、この率が測定される場合、検量用A
G浴溶液ら得られた標準比率と相関し、〔AG?〕は測定されうる。そのように
、利用されうるABの量は限定されるかまだは過剰でありうるのは、反応が平衡
化にすすむ。コアに生じた光学的変化の手段によるAB−AC複合体生成を検出
するために、いろいろな前述の方法を用いることができ(すなわち吸収によるシ
グナルの消衰、散乱および螢光現象など。)、要した光学的変化を生ずるA B
、 ACの生成を提供する。このように、テストは光を散乱できまたはある波
長による励起下での螢光の放射または測定した波長での観察できる特性を存する
大きな分子に特に良く適用される。このような特性がない場合、テストはほとん
ど価値がなく、″限定された試薬″′競合(拮抗)型テストは、分析物へ加えら
れた標識化AG(AG*)の量で好ましく用いられる。これは、図5に示めされ
、その表示は(文字と数字9図4におけると同様に用いられている。このテスト
で、もし標準化されているならば(すなわち検量曲線およびテストの一連につい
て常に一定である)、AG*の量は知られている必要はなく、なぜならいろいろ
のAG?の量で分析的反応の率は、常にA G*/A G ?の比と直接的な関
係があるからである(導派管における観察しうる光学的変化は、標識化反応生成
物AG*、ABにのみよることは、当然記憶にとどめておく)。
゛′限定された試薬″型分析の他の非常に有用な変化において、導波管は、既知
もしくは一定量の同じ抗原(好ましくは精製された形で)でコーティングし、コ
アを試料に接触せしめ、同時に、遊離検出可能な抗体一定量を加えた後、分析用
試料で測定する。
これは図6に示めされておシ、表示は前述で用いたのと同じである。図において
、抗体ABの参考量は、コア上の参考ACおよび測定されるAG?と同時に反応
する。このように、観察した率は(コアに生ずる光学的変化によって描かれたよ
うにAB/AG?モル比と関連しており、望ましい結果を提供する標準参考比率
曲線と相関がある。明らかに、この事例において、ABはこのテストに用いた光
学的方法における観察しうる特性をもたねばならず、すなわち、ABは適当なλ
での吸収を示めすかまたは散乱光もしくは類似物に適合させうる。任意に、AG
と反応する場合、ABが直接導管上で観察されないならば、標識化され、たとえ
ば螢光性もしくはほかにいくつかの光学的に検出しうる標識で力、ブリングされ
る。
まだ別のシステムは、図7によって示めされたいわゆる続いて起こるテストを含
む。このテストにおいて、ABの一定量とともにコアを提供し、この量は、測定
されるAG?に結合するに必要とされる対応する等量の過剰である。このように
最初の段階で、コーテングされたコアを試料と接触せしめ、その際利用できるA
、G?は結合し、試料から除去する。次いで、コアをコア上の抗体層内で空間を
充たす標識化AG*と接触せしめる。反応中または後測定する、AG*標識によ
る光学的変化は、初めのAG?量を計算するための必要なデータを提供する。
結局、本発明は、抗体につき1つの結合位置以上をもつ抗原、すなわち抗原id
、1,2またばnの異なる抗体と結合できる(1) 、 (21・・・(n)と
番号をつけた位置をもつ抗原の測定に関連するいわゆる°゛ザンドイツチ″分析
分析事例に良く適用される。
これは図式的に図8に示され、第一の抗体はABIとして示めされ、第二の抗体
はAB2として、そして2−位置抗原は(2) AG (1)として、表示され
ている。この場合に、抗原は、本来光学的に検出されないということを仮定し、
一方AB2は適当なAGの第二の位置で反応後、検出される。従って、(2)
AG (1)が測定される場合、第一・の抗体(ABI)の初めの基準コーテン
グとともにコアは用いられ、抗原溶液と接触せしめる。後者は、第一結合位置に
よってコアと結合し、その後、第抗体AB2を基準量で加え、抗原の位置2上に
結合する率を、この結合の結果としてコアに生ずる光学的変化を考恵して測定す
る。勿論、この操作中、第一の反応A B l +(1)AG(2)は、AB2
の基準量を加える前に平衡にさせることができ;または任意に、同時に起こる型
テストを行なうこともできる、すなわちABIでコーテングされた導管コアと接
触せしめながら、AB2を同時に溶液に加えることができる。これは、特にAB
、およびAB2が異なるモノクローナル抗体である場合(たとえばウォテ、イラ
ら、J 、 Immu n、o l 。
gical 、 Methods 42巻(1981)11−1.5ベ−ノ参照
)特に適用される。しかも前述の分析システム・のいかなる変化も、本発明の精
神、分析物の憚−■、溶液試料に関して定義されたこのような変化のいずれの操
作・マラメーターからはずれることなく当該分野での熟練した人々によって応用
されうる。
光学的吸収、螢光、および散乱同じく楕円偏光測定の分野における発明の方法の
種々の実施するための装置の例は、次の添付図の部分に関して提示される、
図9は、光学的ファイバー上でコンプレックスフィルムの沈澱によってひきおこ
された該光学的ファイバーを通じて伝わる光シグナルにおけるイン・シトウでの
変化測定用器械の表示であり、図10は、図9の器械で用いることができるファ
イバー光学検体を、拡張したスケールで図式的に表示し;図ioaは該検体の部
分的な平面図であり、図1. Obは図10aのB−B線側断面図である。
図11は、光モード変位測定用に特に応用した拡張したスケールでの他の実施検
体の図式的な表示である。図11aは正面図であシ、図11bは側面図であり、
図12は、螢光測定用に用いられることを除いて図9の同、様な器械の検出器で
光シグナルの図式的表示である。図12aは、反応が開始する前の状態に関する
ものである。図12bはテスト中かな9の時間での状態に関するものである。
図13aは、速製管内で光散乱によってひき起こさtだ光学的変化測定用器械を
図式的に(平面図)示めす。
図13bは、図138の器械の部分的図式の側面図である。
図14は図138および13bの実施の修正の部分を拡張したスケールで図式的
に示めす。
図15は、該実施の他の修正部分を図式的に示めすO
図16は、像液管内で螢光現象によってひき起こされた光学的変化測定用器械を
図式的に示めす。
図17は入射の反射面および含壕れる螢光を示めすために図16の器械の部分を
非常に拡張し/こスケールで図式的に示めす。
図188は該ファイバー上でコンプレックスフィルムの生成によってひき起こさ
れた光学的ファイバー内での楕円偏光測定的に、光学的変化測定用器械を図式的
に(平面図)示めす。
図18bは、図1.8 aにおける器械の部分のA−A線横断面図である。
図9に図式的に示めした器械は、本質的には次の成分を含んでなる:
a)光学的ファイバーIX測定される液体分析物を保持に関して、キュベツト2
または’&6を通過する中央部分;操作前に、成体に溶解した剤の特異複合試薬
の薄いフィルムで、この部分がコーティングされるように、液体に浸すファイバ
一部分のクラディングを除去し、測定さ才しるべきである。ファイバー1および
ホルダー2の組み立て部分は、器械のテスト検体を構成する。
b)モーター4によって回転させられそして二つの全く反対側で、フィルター5
および6プラスホール7をもつ窓を備えたシヨ・や−デスク3゜C)主なる光源
8、規準レンズ9、輪状口径10および選択された光束を角度で測って、検体フ
ァイバーコアに注入するための焦束レンズ11゜この特別な実施態様(ておいて
、ファイバーは多様相であシそして口径JOは、以下に議論されるいくつかの必
要条件に基づいて、特別の様式の通過用に配置する。
しかしながら、本器械について、後で更に議論される修正とともに、低いモード
ファイバーたとえばシングルモードとの関連で用いることができる。図で図式的
に表示した焦束l/ンズは、光路にそっての変位に加えて、ファイバーフロント
エンドの正面で、正確に光線の位置を定めるために横に、上に、そしd)次いで
、器械は、射出光シグナルをコアから電子シグナルに変換するための主な光検出
器12、ロック−イン増幅器13および表示装置14からなる。標準シグナルは
他の源15によって供給され、ンヨノ?−のホール7を通過することによって/
Jルスされる光、検出器16に向けて、該検出器を対応するノ?ルスをロック−
イン増幅器13に適用する。
本器械で用いることのできる分析的検体の1つの実施例は、図10(図10 a
+ 10 b )に示めされており、S字型グローブの2つの反対側でプラス
チックホルダータンク2またけ切断されたスロット21 aおよび21bを示め
す。クラツディング22を有する光学ファイバー1の部分は、挿入され、該グロ
ーブによって保持される。ファイバーの中間部分のクラディングは除去され、た
とえば適当な溶媒でのエツチングによって、そしてその後手さな区画24によっ
て表示されるような種(species)で、測定される検査物(specie
s)の特異複合接合体(結合)の薄いフィルム23でコーテングされる。
本装置の操作についての記載は次のようである:フィルター5をコアを通過する
ように波長λlを選択し、波長はフィルム23と分析される溶解1〜だ分子24
との間((生ずる複合体物質のコーテングによる一過性波の部分吸収のために、
各々の内部反射位置での吸収によって、変化させられる。目的を説明するために
、23は抗体(AB)の非常に薄い層を表わし、24は、測定される特異抗原(
AG)の分子を表わし、図4で示めしたよりな゛直接型”の分析であると述べて
も良い。フィルター6は、このような複合体コーテングによって本質的に吸収さ
れずそして含1れる29
免疫反応によって影響されないコアを通過する波長λ2に対して選択される。シ
ヨパー3が回転する場合、二つのシグナルλlおよびλ2は任意に検体コアに供
給され、一方のシグナルλlは漸次に、コーティング23+24の増大とともに
吸収され、他のシグナルλ2は、参考(基準)シグナルとして作用する、すなわ
ち検量11111定および調整の目的のために(セル捷たはファイバー置換など
)検体は、光学的ファイバーの適切な長さを選択することによって用意しく図1
0に示めした場合の多−モード)、中間部分がキーベット2に水平に保持される
ようにグローブ21aおよび21bに挿入し;耐水は、ゴムの薄と またはセメ
ント溶液でグローブを満たしそして乾燥させることによって提供される。次いで
該中間部分のクラディングは腐食させる。樹脂クラッドファイバーに関しては、
このクラディングについて、適切な有機溶媒で行ない;がラスクラッドファイバ
ーに関しては、腐食は、希フッ化水素酸で行なう。後者の場合、下記に説明する
理由によって、完全に腐食させる必要はない。次いで溶解または腐食溶液を除去
した後、セルは蒸留水で十分洗浄し、ファイバーコアd1、常法によって抗体(
AB )のフィルムでコーティングし、すなわち均一層として、コア上にAB沈
澱するようにAB浴溶液セルを満たすことによって万が−、ファイバーの表面が
、その上に沈澱される分子に対して、十分な親和力がない場合、当該分野で知ら
れている特別な処理結合位置に合体(接合)すること、中間反応層を適用するこ
となどによって、前もって結合せしめる。この点で、この問題(ヨーロッパ特許
出願番号29411に開示されたように)に関する豊富な文献が存在する。セル
を空にした後、リンスし、後者は、レンズ8および検出器12の間に示めされて
いる場で器械の上に据えつけ、適切な緩衝溶媒を入れる。器械を活性化せしめ、
シヨ・ぐ−を都合の良いスピードたとえば1.2Orpmで回転させる。シグナ
ルλlおよびλ2を検体のコアに供給し、検出物12をロック−イン増幅器13
に供給している約2乗した電子・にルスにそれらを変換する。参考ロック−シグ
ナルは、ホール7を経由して、源15によって曲がり目ごとに一度供給され、λ
lおよびλ2からのパルス間を区別するために、(同時発生によって)増幅器で
可能にせしめる検出器16に提供される。実際、コントロールは、好ましくは、
該・やルスが、反応開始前に約同じマグニチュードであるようにセットする。次
で0時で分析される試料(AC溶液)を検体2のキュベツトに加え、緩衝液で迅
速に混合する(たとえば、示めされていない攪拌器またはガス泡沫器を用いて)
。λ1によるシグナルは、漸次に、検体のコアの出口で変化し始め、分析物AG
の分子がファイバーコアに結合する結果として(AB−AG複合体形成のため)
、該複合体は、AGの濃度に比例して、率でλlの一過性波エネルギーの一部を
吸収し、対応する変化は検出器12から対しする電子・ぐルスの形で、増幅器に
供給される。このように、ロック−イン増幅器13に関連して計算した回路は、
λ1/λ2シグナルの割合から得られたデータで計算し、表示システム14に結
果を提供し、たとえばチャートで記録した比率曲線の形(勿論、用いられる表示
の他のタイプには、所望ならば:デジタルまたはオンロスコープナト)カある。
得られた比率データは、従って既知濃度のAG溶液から得られた標準データと比
較され、未知濃度は、補間によって提供される。このような計算は、手動で行な
うかまたはメモリーにとどめられた参考データで、マイクロコンピュータ−によ
って行ない、反応の時間ill過中、適当な期間の選択によって、望ましい反応
率データを選択することができ、阻害する反応および望ましくない反応がおおか
れ少なかれ同時にしかし異なった速度ですすむことによる他の率データから区別
することができる。付加的にまたは任意に、平衡条件は、外挿法によって推論す
ることができ、これによって各々の測定するためにとられた時間は、通常平衡測
定との比較して減少する。
更にこの問題についての考察は、B、W、レノエらによる′°平衡に対する動力
学的分析法”、フライス:スペンサー共著゛′臨床化学における遠心分析”フレ
ーザー(1980)およびAnal、Chemistry 50102巻(19
80)、161 ]、 −1618ベーノに見られる。
この点で測定の精度が、ファイバーインプットに適用した光モードオーダーに依
存して、すなわち口径10輪状装置および幅を変えることで、変化しうろことを
記することは有益である。コアの内に全対重に反射した光束に関係するおよび該
コアの外側クラディングのみによる吸収現象は、該光束の一過性波成分に影響し
、すなわち電子成分はクラディングを透通ずることを記憶している場合、理解す
ることは容易である。選択されたモードの全反射角は、全反射を確実にするため
にファイバー軸に関しては十分に浅くしなければならないしく水溶液屈折インデ
ックスが、ファイバーコアをとりかこむコーティングの増大によってかすかに変
化する場合でさえも)、ファイバーにそって反射する位置の十分な密度を提供す
るために十分な急勾配にしなければならない(実際、−過性波は、複合体コーテ
ィングと相互作用するのはこのような位置である)。このように、テスト最大感
度は、正確に口径・Pラメ−ターを調整することによって達成され、これは各々
のコア、テスト溶液および複合体屈折インデックスに依存する。
このような調整は、測定の各々のタイプに関する当該分野における熟練者によっ
て決定され、フィールドオペレーターの意向を織り込んで計画することができる
。
口径10・ぐラメ−ターの装置を変えることによって、本器械は、異なった゛′
クラス″で操作させることができるということに注目することは興味深い。
たとえば、このような口径を正確に調整することによって、考えられる開始シス
テムに対する全反射の臨界角θ の付近に光モードで操作させることができる。
その上、テストの経過において差Δ””nl n2が複合体生成とともに減少し
、コアコーティング境界での全反射角が変rヒするので、モードのいくつか(ま
たは全部)、突然にファイバーの外で屈折し、シグナルの解明な遮断(中断)が
生ずる。このような配置は、従って、分析物分子の非常に少量に対して最大感度
を提供する。しかしながら量的測定にあ捷り良く適用されない。
ガラスクラッド光学ファイバーを用いるとき、このようなりラディングは、本用
法については、全く腐食し去ることば必要でないということは前述のようである
。実際、操作中に、−過性波が現実に数l Qnmクラディングを透通し、−過
性波が有意に反応物質と相互作用に必要なぞの下に厚い部分を有するコアのまわ
りの残留がラスクラディングは、腐食操作でのそれほど厳重でないコントロール
条件下に置かれる可能性があるからである。更に厚いファイバーは薄いものより
もろくない。
大きなファイ・ぐ−によるテストの感度を倍数化するファイバーホルダーの型は
、図11. aおよび1.1 bに図式的に示めす。このホルダーは、不活性プ
ラスチック(例として、フレックスガラスまたはポリエステル)からなる二つの
らせん状に、みそがほられたフランジからなり、光学ファイバーの一片は、曲げ
られ、クランプ33および34で締められる。ファイバーのフロントおよびパッ
クエンド、それぞれ35および36は、光注入レンズ(the lightin
jecting 1ens)および検出器12で用いられるように横に曲げられ
る。ファイバーの巻き(winding)37の中間の1つすぐな区画は、その
ま1であり、一方グローブの中にある残りの曲った区画38け、初めの保護用ク
ラディングを持っている。素面(そのまま)の部分のエツチングは、適切なシリ
コンゴムセメント溶液でホルダーのより低いフランツの最初のカバーによって、
行なわれ、その状態で乾燥させる。その後ホルダーは、上部のフランツのより低
い面に沿って、腐食溶液に浸され、その際、すべてのクラディングの中間区画は
除去され、より低いゴムで保護さねた7ランノが、そのままで残る。テストをす
るについて、ファイバーの素面の部分を、前述のようにAGまたけABでコーテ
ィングした後、ポルグーを器械の光路においてボーク39の助けで正確に位置を
定める。次めで、反応媒質の入ったキュベツトを下から持ち込み、試薬を加え、
前述のように測定する1)
本発明に関するすべての前述の議論は、水溶性ま/、−は11機媒質において使
用される光学ファイバーの使用に関するものであり、屈折インデックスは、水の
インデックスに近く(すなわち約13)、一方フアイバーのがラスコアのインデ
ックスnlは、むしろ15に近く、活性なコーディングのインデックスn2は菖
い換えれば15より少さく、シがし1.3より大きい間にある。この条件は、こ
こでは本質的であり、もし、n2が01 より大きいならば、光はクラディング
の方に屈折し、更にコアなどにもどる。
前に示めしたように、このような方法は、本来不可能でなく、たとえばバーディ
らによって、Nature257巻(1,975)に報告されており、彼らはガ
ラスロット導波管で行ない、はめこまれた、測定さ6
れるいくつかの試薬を含む、むしろ厚いポリマーコーティングを用いなければな
らない、しかし、本事例においては、実際的でなく、なぜなら、とりがこむ溶液
は、常に、ファイバーコアn1より小さい屈折インデックスであり、単に非常に
薄いコーティング(数1.0 nmについて数オングストロームの中位で)が含
まれる。対比すると、バーディらは空気中で操作し、反応率を測定できなかった
。
議論すべき他の重要な点は、単一モードファイバーの問題である。実際に、当該
分野で知られているごくわずかの変法で、そしてファイバーへの光注入に主に関
連する、単一モード光学ファイバーは、本方法においても、用いることができる
。一般的にこノヨウナファイバーは、相対的に厚いクラディングによってかこま
れた非常に薄いコア(数ミクロン)をもち、それらの透過は、非常に波長依存性
であり、たとえば850 nmでメートルにつき5%減衰だけであるファイバー
は、800および900 nmで約40係の減衰を示めす(、T、G、ギアロレ
ンツによる、Proceeding of the IEEE 66巻(197
8)、748ベーノ参照)。今のところ、波長λでファイバーにおける単一モー
ド伝導は、次の表示V=8.9aFロフクが、24以下の値でなければならない
(Δ。−n) n2でありaはミクロンでのファイバーの半径である)。V=2
.4より上では、ファイバーはもはや単一モードではない。■の値が小さい(た
とえば1以下)場合、ガイド用単一モードは、もっとゆるく結合し、すなわちフ
ィールドは、ファイバーの物理的コア以上にがなり拡がる(たとえば、コアの直
径の2もしくは3倍)。
このような時に単一モードファイバーの透過特性は、クラディングの屈折インデ
ックスにおけるごくわずかの変化(Δ。変化)に非常に敏感であり、すなわち、
有機コーティングの変化は本発明のテスト間に生ずる。実際に、この屈折インデ
ックスは、反応中増大する複合体層の厚さゆえに、単一モードファイバーで行な
われる本分析において含まれる可変的な手段;(キイ)である。一方多−モード
における内部反射は、各々の反射で、非常に短い距離間、反射境界の隣接した付
近で、−過性波をコアに平行に通過させ(マックスウェル方程式によって定義さ
れる)、単一モードファイバーは、ファイバーの全有効長さにそってコアに平行
なこの一過性波部分(7ラクシヨン)の通過をさせておく。本器械における単一
モードの使用は多−モードファイバーに比べれば感度における増加を促進する。
単一モードファイバーは、初めのクラディングを完全にエツチングすることなし
に用いることができ、なぜならばがイド用光場は、有意にクラディングにおよび
反応中生成した複合体層にものびるからである。単一モードファイバーを用いた
時、器械になされなければならない修正は、本質的には光学的性質すなわちファ
イバーへの光の注入およびシグナルを検出することである。このような光学的変
化(変位)は、ここでは述べないが当該分野での熟練者および文献には良く記載
されている(たとえば上述のノアロケンソ報告およびその中での引用文献参照)
。
・本器械は、本発明の方法を実施するのに用いられるのみならず、吸収または屈
折インデックス変化の代りに螢光効果を用いることもできる。これをするために
、更に次の修正がなされなければならない:a)螢光標識化抗原(AG勺を分析
物ACに加える。
そして、この中で議論したように″限定された試薬″イムノアッセイの条件下に
操作する(図5参照)。
b)フィルター5を測定される螢光の励起の特異的λ□について選択し、フィル
ター6はλlを遮断し、しかし螢光放射波長λ2を通過させるために選択する。
C)フィルター6と同一の光学的特徴のある付加的フィルターをファイバーパッ
クーエンドト検出器12の間に挿入する。
更に、緩衝媒質を有する検体およびABでコーティング(通常のように)光学フ
ァイバーを据えつけ、そして器械を図、】2aに図式的に示めしたように、応答
に対して調整する。この図では、検出器からの・2ルスの連続を示めしており、
記録されたパルスRは、フィルター6が、光束における時化じた参考(基準)・
ぞルステh I) ; /’ルスEは、ファイバーコアに形成された螢光複合体
AB、AG”分子によってファイバーの中に注入された放射された螢光・やルス
である。このように開始で、Eレベル(図、12 a )は、非−螢光から約O
かまたは残っている・ぐツク−グランドのノイズのみである。更に測定される抗
原を含む分析物干螢光標識されたAG”の既知量を加えて;螢光性コーティング
は、AG濃度に比例した率で、徐々に形成され、放射螢光シグナルがファイバー
に現われ、図、12bに示めしだように時間とともに漸次に増加する。この変化
(変位)が検出され、器械の増幅および計算区画に適用され、望ましい測定率と
して記録される。その上で、後、視覚化もしくはコンピューター化比較が記録さ
れたデータおよび上述で議論した″限定された試薬″′分析に、特異的な方法を
用いて得られた望ましい分析結果からの標準参考データに対してなされる。
本実施態様において、ファイバーコア外でコーティングによって生成された螢光
は、実質的に、ファイバーに再注入され、テストに対して用いられるシグナルを
提供する。関連した現象は、最近、報告されている( J、Ce11. Bio
l、 89巻、141−145に−)(1981)、ガラスブロックについて、
参照)。
光学ファイバーを用いる場合の好都合さけ、ファイバーの有効な長さは、非常に
小さい空間で制限されるけれども、十分有意であるので、非常に感度が良いこと
であり、そして、非常少量の溶液を用いることである。イムノアッセイにおける
螢光コーティングの測定は、すでに報告されていることも記述すべきである(M
、N、クロニックら、J、ImmunologicalMethods(197
5)235−240’ −・ゾ、参照)。
しかしながら、このような事例において、螢光は、抗体溶液を通じて測定され、
不十分な感度が得られる1つの内部反射位置のみ用いられ、なぜならば、全螢光
放射の非常に限られた部分のみが処理されるからである。本発明におけるような
光学ファイバーを用いる場合、とりあげられる横螢光も測定され、たとえば、フ
ァイバーのフラット−コイル化片ヲ用いて、ファイバーによって放射された螢光
のより大きい部分を集めるコイルに、軸の方向に検出器を置くことによって測定
される。
本実施態様は、当該分野で知られている装置および現在のテスト方法以上の多く
の有利点を提供する。
/ことえば、
a)浸したファイバー区画の長さに比例する感度、非常に感度の良い検体は、小
さい容積であるけれども作られうる。
b)測定は、可視、UVおよびIR帯で広範囲の波長についてできる。
C)広範囲の物質の種類(生物学的または非生物学的)は、薬剤、ハプテン、酵
素、被ゾチド、タン・ぐり質、ホルモン、バクテリア、ウィルスおよヒ細胞と例
証できる間でテストされうる。更に検出されうる分析物の完全なリストは、たと
えば、米国特許番号3,817,837および4,299,916に見い出すこ
とができる。受血者における可能な抗体に関連して、輸血に対する血液サンプル
をテストする場合、特に興味のある1つの事例である。たとえば、光学的ファイ
バー検体:は、該患者の血液構成分を含むフィルムで調製し、可能性のある供給
者の血液細胞に対し〜でテストする。交差−反応度の場合、細胞はファイバー上
に沈澱しくなぜならそれら自身AGの反応は、ファイバーのABとともに一点に
集まるからである)そして、この反応は、ヘモグロビンの典型的な吸収帯の1つ
によって、容易にモニターされうる(たとえば555 nmで)他の興味ある特
別な場合は、体から分泌したもしくは体内の分析物の定量もしくは定性分析をす
るためにイン・ビポで導波管知覚器(sensor)を用いる可能性もある。た
とえば、診断において、グルコース付加テストに応じて循環するインシュリンの
量の分析および注射されたホルモン治療において、イン・ビぎで知覚器は、循環
するホルモン濃度を検出する可能性がある。イン・ビボで知覚器を用いる可能性
は、ブックレスによって報告されているが、しかし、本発明は、イムノアッセイ
型における標識の不存在(多くの標識物は毒性もしくは発癌効果をもつ非常に活
性のある化合物である)ブックレスによって述べられているように知覚器から出
たりはいったりするシグナルを連結するだめの特別の伝導(送信)ファイバーの
必要性を除くような改善された光伝導(送信)の付加的な有利性がある。
図、13aおよび13bに図式的に示めされた器械を次の重要な成分を比較する
:
光学的検体は、プランケットによって支えられた傾斜した導波管プレート縁41
(示めされていない)および導波管41についての関連して面する正確に調整さ
れた平行を維持するカウンタープレート42からなる。プレート41は、正確に
カットされた高い質のフロートガラスまだは石英からなる。プレート42はマイ
クロスコープスライドである。プレート41と42との間の空間41aは咽フラ
ク/ヨンの位数である;分析物溶液を毛細Uカによって保持されるこの空間に容
易に導入せしめることを確実にする。この器械は、更に、光源43(この特別な
実施例において、光源はヘリウム−ネオンレーザ−供給偏光)、モーター45に
よって動がされるシヨ・ぐ−デスク44、焦点レンズ47および48、ミラー4
9、偏光板50、円筒状レンズ51および横にそれる光を最小限にする絞り52
からなる光学システムを通じて光学的険体に送られる・ぐルスされた光シグナル
を提供するだめのホール46が備わっているものを含んでなる。なぜ光シグナル
が・やルスされるかという理由は、検出されるシグナルの感度の良い増幅の最終
重相を提供するためである。
器械は、更に、高い電圧力供給54をもった光電倍率検出器5゛3、二方向スイ
ッチ56を通じてロック−イン増幅器55に連結するコンセットを含んでなる。
光電倍率器は、空間・11aを満たす分析物溶液と反応体との間に生ずる化学反
応の結果として空間・11aにおける導波管板上に生ずる生成物によって散乱し
た光を集めるために配置する。散乱光は、矢印57によって示めす。
器械は、更に、図に示めしたように、その中で多重の反射後、導波管コアのアウ
トプットで現われる光を集めるために検出器58を含んでなる。この検出器のア
ウトプットは、任意に、スイッチ56を通じてロック−イン増幅器55に供給さ
れる。器械に対する参考シグナルは、検出器60上で光源の小さな部分に由来す
る半一透明ミラー59によって提供され、後者は、類似分割器61に供給された
参考シグナル強度を提供し、測定中源の可能な変位を補正するだめである。パル
ス化ロッキング参考シグナルは、ミラー61、および検出器62、増幅器55に
よって供給された対応する電子シグナルによって提供される。器械は、結局、表
示構成分(先の実施例におけるように)およびアウトプットデータを記録するだ
めの記録器および任意に、測定されたデータを計算し、および検量実験からの蓄
積した参考デー実施において、本器械は、次のように操作する。
最初の段階は、空間41aを明りょうに示めす導波管41の表面で反応種のフィ
ルムを沈澱することによって光学検体全調製することである。これをいかにする
かに関する詳細は以下に述べる。次には、ガイド41およびプレート42を器械
に据えつけ、光学および電子システムを開始させる。数分のウオーミングアツプ
後、光増倍器53からO応答に対して調整する(または、任意に、検出器58が
ら透過率)。
次いで分析物溶液(数μt)を空間41aiCピペツトで入れ、それによって溶
液での分析物をガイド41上で反応フィルムと反応させ始める。分析物−反応体
物質を散乱位置に供給したとき(大きな分子、集合など)散乱シグナルは、ユニ
ット62において含まれる表示によって時間とともに表示され、処理され、増幅
される光増倍管53に達する。比率曲線における結果;勾配データは、記録され
、検量試料から得られた標準データに対して計算され、電子ユニット62のメモ
リーにおいてひき離される。この計算は、通常の手段による望ましい分析結果を
提供する(たとえば、分析物溶液における未知種の濃度)。
検出器58のアウトプットを用いないならば、ガイド41の縁41− bを後方
散乱光の生成を最小にするために遮蔽する。遮蔽は、たとえば黒い紙または被ン
キで行なうことができる。
前述の実施例への改善は、第14に示めす。導波管41に対して、完全に均一な
働表面を用いる代りに、提供される表面をそこで不連続にする処理を初めにでき
る。たとえば、ある型にもとづいて反応体への表面の固有の粘着性の物に変更で
きる(たとえば既知の写真石版術によって達成可能)。図、14に表わした場合
では、ガイド41の表面41cは、数字の41dによって示めされた領域で、か
すかにあらくなり、このような領域は、約1波長幅の平行な細長い片としてあり
、同じマグニチュード族の距離によって分けられている。このような格子状型は
、光−抵抗をもつ表面を初めにカバーし、格子の陰画像をもつ写真フィルムを通
じて該抵抗層を露光し、現像しくすなわち未露光部分を、適切な溶媒に溶解する
こと)、そしてたとえばHFで、露光後、その寸ま(露出した)の部分をかすか
にエツチングすることによって得られる。抵抗の最終的除去後、プレートは、よ
り高いおよびより低いタンパク質(抗原もしくは抗体)に対する交互の帯をもつ
細長い片の格子型である。このようにプレートを反応体(AB)と接触せしめる
時、後者は主として、文字ABによる図。
14に示めしたように腐食された領域に付着する。
この段階でこの型の厚さは、散乱を提供するに十分でなく、抗原の存在下に(散
乱光に対する特有の性質である)、後者は、そこで抗原をもつ細長い片に、すな
わち図上でAGによって示めされているように、結合する。層の不連続型は、散
乱シグナルの指向性および集合効率(光倍管を用いて)を改善する主なる実施例
の速入散乱モードに比較すると、回折散乱光の明らかな次数(位)を提供する。
図、14において、矢印65は回折の0位を示めし、矢印66は回折の最初の位
を示めす。光倍管54によるシグナルの集合の特別な順位(たとえば最初)を集
めることによって、それによって非常に増幅され、シグナルとノイズの比率は、
全散乱光の約10%である達人散乱光の集合と比較のように、本変法では増加す
る。
図、15に見られる他の改善において、導波管の完全に平らでそして普通の表面
41cは、抗体(AB)の微小飛沫でスジレイし、分析中、抗原A、Gを好捷し
い領域のみに付着せしめる。このような構造は、円錐体の形で、光を散乱する。
そのサイズと幾何的パラメーターは、飛沫の配分および大きさに依存する統計的
散乱するものを構成要素とする。更に、ここにも、シグナル集合の効率を増加す
ることに寄与する指向性効果がある。回折された光シグナルを提供する他の有利
点は、塵粒子またはよシ大きなサイズをもつガラスにおけるかき傷(次のより高
いマグニチュード族、すなわち10人もしくはそれ以上)のような事故的散乱の
重要性を最小にすることができ:回折の角度がより小さい場合、光倍管に達しな
い得られる回折された光、その存在は、無視されうる。
図、16に表示された器械は、一般的に、図、13に関連してすでに議論したも
のと同様であり、しかし散乱光測定のかわりに螢光測定に対して適用される。
この器械は、本質的に、図13の器械において用いられたシステムと実際に同一
であるブロック70によって表わされた光学システムを含んでなる。従って、詳
細は、簡易化のために繰り返さない。このシステム70ば・ぞルス化光源および
導波管71に適当に向けられた正しい励起波長のテストシグナル、および参考検
出器80参考シグナルを提供するだめの手段を含む。他の実施例におけるように
、分析物溶液を導入するための薄い空間71のガイド71で測定するプレート7
2、ガイド71の上部表面上でコーティングされた反応体層がある。器械は、副
−検出器(光倍管73およびその備品74)、コアアウトプット検出器78およ
び遮断フィルター76および77(これらの項は、先の実施例においては、欠け
ている)を含んでなる。器械の電子成分は、二つの表面積割増幅器8Iおよび8
2;多重器83、デジタル転換器への類似物8毛マイクロプロセッサ−85、お
よび表示レコーダー86を含んでなる。すべてのこれらの構成要素は慣例的であ
り、それらの操作は、当該分野における熟練者にとっては、ありふれたことであ
る。
サイド−ピックアップモードにおける器械操作は、散乱実施例について述べたも
のとまったく同様である。更に上部表面およびプレート72の上で反応体の層を
用いて導波管71を調製した後、分析物溶液を螢光性反応体−分析物生成物を提
供するために導入する。光学ユニット70は波長λ2の螢光を励起するために適
当な波長λlのテストシグナルを送る。
放射した螢光はスクリーン76を横切り(散乱励起光を含むすべての池の波長を
区切る)、螢光に比例したシグナル(反応の限度まで)が生成することによって
光培管73に適合する。このシグナルは、検出器80からの参考シグナルととも
に、先に述べられたものと同様な操作工程が起こることによって残余電子素子に
任意にそれらを供給する多重増幅器に供給する。
前述の操作とともに任意にまたは同時に、コアアウトニア°7トで生ずるおよび
検出器78で減衰するシグナルはモニターされる。いかにしてこれが可能である
かを理解するために、参考は、図、】7に記述されている。この図において、ガ
イド71の部分、プレート72および空間7 ]、 aと図式的に、AB −A
G生成物(テストにおいて測定される率の分析物AG)0ラス反応体ABの反応
の結果である生成物)の層との間に示めされる。
図は更に、螢光過程への励起において含まれるいろいるの光線を示めし、すなわ
ち、NはR1での入射光束であり、Rは波長λlの反射光束であり、R7は、生
成した前後螢光光束(R2)である。θは投射角であり、θ、は槁に対する臨界
投射角である。θ、。
C
はR2に対する臨界投射角である。今のところ、表わしたように励起光Nは、臨
界角θ1cよシ大きい角θ、で壁の内部表面に適合し、次いで反射する(R)。
しかしながら、一過性励起波の部分は、AB−AG層によって吸収され、エネル
ギーは、より短い波長λ2で再放射する。今のところ、相反原理の仮想(Vir
tue)によって(C,に、コルニゲリアらによって、J、O,S、A、 62
巻、4号、1972年、479−4864−ジ量的に確認された)励起し7た分
子は、入射一過性波光量子のように正確に挙動する一過性光量子を放射する。更
に稠密−と−稀中間面(AB−AG層)K接近して分子によって放射された螢光
は、R2に対する臨界角θ、Cより大きい角で稠密媒質へ伝わる。
現実に、θ がθ、に接近したときおよび、θ、。に近+ 10
い角度で、ピーク螢光が観察される(R,E、ブレンナーら、光学ファイバー、
Advances in R&D Providence 。
RI、USA; l 9−23波−ジ1978年6月、 ニイフレナムプレス(
1979)参照)。このように放射された螢光最大強度は、相対的に小さい角範
囲以内に集中させ、そして導波管にガイドされた場合、いくつかの相互位置での
アウトプットをコアのアウトプットでよシ高い強度シグナルを提供するためにつ
け加える。重要な第二の点であシ、なぜなら屈折インデックスは異なる波長に対
して異なっており、励起シ1
グナルおよび螢光シグナルは、ガイドにおける異なる屈折角をもつ次の経路であ
り、相互に異なる角をもつアウトプットから現われる。従って、コアのアウトプ
ットで励起光束からの放射光束の本来の光学分別であり、検出器78は、適当に
螢光シグナル(R2)の経路に配置され、一方、フィルター77の不在下ですら
残余励起光束(R1)を避ける。
図]、 8 aおよび18bで表わされた器械は、ファイバーの表面で生成物の
生成によって提供された光学ファイバー導波管において生ずる光学変化を測定す
る意向であり、この測定は、楕円偏光測定の手段によって実施される。生物検査
への楕円偏光測定の応用は、我々の関連したヨーロッパ特許EP8181025
5.0に詳細に開示されており、本判定係には、当該分野での一般的案察につい
てこの開示を引用さ第1うる。先の開示と本出願との根本的な相違は、一般的に
知られている平らな反射表面のかわりしく二、光学ファイバーを用いることであ
る。楕円偏光は、反射する表1fiに沈澱したフィルム物質の存在によってひき
おこされた光の楕円偏光の程度における変化の測定に基づく。特別な性質の点か
ら、平らな表面導波管と比較して光学ファイバーの幾何、付加的構造(特徴)は
考慮しなければならない。第1に、ファイバーにおいて直線的に偏光の光束を維
持するために、光モードの特別の一族を用いなければならない。これらのモード
は、m=1,2*3・・・nであるHE1□モードとして定義される(nは、考
慮されるファイバーのサイズおよび屈折イ/デ、クスによって限定される、E、
スニッサアーおよび旧オスターベルグ、J、 Opt、Soc、Am 51巻、
499波−ジ(1961)参照)。第二に、ファイ・ぐ−の表面で生ずる反応に
よってひきおこされたいくらでも偏光変位の限り測定するために、導波管にそっ
て同等に良く透過されるどんな偏光方向をもつシグナルも重要である。更に避け
るべきファイバー上の機械的ストレスによってひき起こされたような幾何学的摂
動、なぜなら、このような場合、1つの偏光の特別な方向は好゛ましい。結果と
して、本器械において、光学的検体(その主要な成分は光学ファイ・ぐ−である
)は、短く、望ましくない振動効果寸たけ他の可能な摂動を最小にするために、
堅く固定する。
光学ファイバーにおけるHE1mモードを好ましく励起するだめに輻射光強度は
、ガウス分布を有するべきであり、たとえば基本モードにおけるレザー輻射から
得られ、光束は、ファイ・ぐ−丁、ンドで軸方向におよび中央に向けられるべき
である。この連結は、顕微鏡対物レンズによって達成されうる。今のところパッ
クグランド摂動を最小にするために1つのモ−ドで操作するよりむしろ同時にい
くつかのモードで操作することが好ましい。本器械では、HEl、モード(最も
低い単一モード)は、簡易化のために選択される。原理では、多−モードファイ
バーは、単一モードシグナルで用いることができる。ファイバーコアの直径0.
65倍であるファイバーインプット表面で入射光束直径を通すことによって可能
にせしめることができ−る(すなわち、適当なガウス分布が選択されうる)。し
かしながら、これは実際には満足すべきものでなく、なぜならいろいろの偏光状
態をもつ他のモードもある程度励起され、そして部分的に消極化シグナルは、検
体アウトプットで得られる。
従って、この実施例において、単一モードファイバーを用いることが非常に好ま
しく、これは本質的に■■E1.の透過だけで、それによって、よシ高い次数モ
ードへの転換および分極(偏光)の程度において崩壊は、生じないからである。
結果として、より高いシグナル−と−ノイズの比は、多−モードファイバーを用
いての比較から得られる。
本実施例において、ファイバー長さは、前述の理由について、好1しくは、lQ
cm4たはそれより少ない。消極および複屈折特性について好ましくは、高質の
単一モードである。H,アウリッヒら、AppliedOptics、 19巻
、22.3735ページ(1980)に報告されているようなCVD方法によっ
て得られたファイバーが好捷しい。
図、18 aおよび18bで表わされた器械は、コア101aをもつ光学ファイ
バーの部分的にエツチングされた部分101および相称的に除去されたクラディ
ング101bを含んでなる。クラディングを除去するための手段は、この明細書
での他の光学ファイバー適用に対して開示されたものと同じである。
その両側の上で、その−7まの(素面)ファイバーコアからの非常に短い距離(
mm 7ラクシヨン)で、” U ”型ブランケット103をしっかシと維持す
るために二つのガラススプレー)102を配置する。
ファイバー導波管のクラットエンド部分は、示めされていない調整ラックで据え
つけられ、示めされていないクランプによって締め、後者は、ファイバーの位置
を横におよび上下に正確にコントロールせしめる。ファイバーコアとシレー)1
02との間の空間104は、反応位置であり、テストされる液体は、ファイバー
とプレートとの間の毛細管力によって維持される。
本器械は、更に、ファイバーをもつインプット入射光束と検出システムをもつア
ウトプット楕円偏光シグナルとの連結のために2つの顕微鏡対物レンズ105お
よび106を各々含んでなる。この入射光束は、光源107(この実施例ではヘ
リウム−ネオンレーザ−)偏光板1.08 i横切るアウトプット光およびモー
ター110によって動くショノ4−デスク109を回転することおよびシグナル
をショiE−するホール111を持つことによって生ずる。その上器械の検出/
ステムは、4分の1波プレート112、偏光分析器113および光検出器114
、それらの構成要素は、関連した出願EP 81810255.0に開示された
対応する構成要素と同様であり、同様に操作されることを含んでなる。結局、器
械は、ロック−イン増幅器II5、および関連要素、すなわちマイクロ−コンピ
ー−ター] ]、6およびレコーダー117、この明細書において初めにすでに
記載した対応する要素と本質的に同じであるこれらの電子素子機能(関数)を含
んでなる。更に参考目的のために用いられたシヨ・ぐ−された参考シグナルは、
ソヨ・ぐ−モーター1. I Oからの由来でありそしてライン118によって
増幅器115に透過されるとして図に表わされるということは、注目すべきであ
る。
器械の操作は、関連した出願番号、EP81810255.0に開示された器械
の操作と併用して先の> 、、−: 、”、において記載された場合と本質的に
同様である。次いで、テストヲするために、ファイバーのそのままの部分を、初
めにダッシーー型によって図の上に示めしたように適当な溶液で、空間を満たす
ことによって、図で、番号120によって示めしたように反応体で(たとえば抗
体)でコーティングする。次いで、通常のリンスそして乾燥段階後、ブランク緩
衝液の存在下に、適当に、任意に偏光素子112および113を回転することに
よって(出願番号EP 81810255.0における記載参照)、計器0にし
、そしてブランク溶液を除去し、テストされる溶液を抗原分析物および導波管コ
ア上で反応体−分析物層の増大において生ずる抗体コーティングとの間の反応開
始のために導入し、楕円偏光アウトプットの結果としての変更(変法)となる。
光検出器11.4からの対応する変化に1増幅され、電子関連成分116および
117でモニターされ、先の実施例におけるように正確に望ましいデータが提供
される。
導波管コア上で抗体フィルムの固定のために(もしくは勿論、測定されねばなら
ないものが抗体であるならば抗原)、当該分野で知られている多くの方法は、す
でに前記記載のように用いられることができる。本発明を実施するに免疫分析テ
ストと関連して、ガラスのたいていの型は、その疎水性もしくは水媒性領域を経
てタンパク質を強く吸着するという事実を有利点とすることが一般的に好ましい
。だから、このような場合に、エツチングしたファイバーは、最初に水溶性浄化
剤(たとえば2係浄化剤溶液\で洗浄する。次いで、水道水でリンスし、−皮製
硫酸に浸す。次に蒸留水で洗浄し、暖かい空気で乾燥させる。それは、溶液から
タンパク質、たとえば緩衝液におけるヒ) IgGに容易に結合する。
他の好ましい方法において、硫酸で洗浄し、上述のようにリンスした後、ガイド
の活性部分を1時間ブセトンもしくはボタノールのような無水有機溶媒における
1 5 % (w/V)塩化チタニウムに浸す。次いで蒸留水0.1 M リン
酸緩衝液PH7で洗浄し、その後、ヒトIgG溶液(2,!?/zo9%塩化ナ
トリウムもしくはO,]、 M リン酸緩衝液PH7)に接触せしめる。AGs
’に対するテスト用に準備されたファイバー(もしくはむしろ検体)は、適切な
緩衝液で湿らせて(′−または短期間は乾燥でも)保存される。
次の例は、本発明の詳細な説明するものである。
実施例1
図13角および13bに関連して記載された型の導へ管およびガラス・カウンタ
ー・プレートを含む光学検体は、次のように免疫化学分析をするために準備する
ニガラス物品は次の型のガラス(n=L523 )からなる:″7了−ブローセ
スブリレンローガラスB −260、DESAG”ははじめに暖かい洗浄剤溶液
で洗浄し、蒸留水でリンスし、空気乾燥する。次いで、95℃のもとて濃硫酸に
5分間浸し、蒸留水でリンスし、清浄なティッシーーで乾燥する。
引き続いて、巧妙な取シ扱いは、清浄なガラス表面に触れないように細心の注意
で行ない、検体は、縁(端)で取り扱う。プレートは、図133および13bに
図示したように器械上に据えつけ、それらの間に0.3 mmの空間を残す。コ
ーテングする目的のために、おおよそ(しかし、正確に測定する)11/を抗原
溶液を、0.9%塩化ナトIJウム浴液中に必要とする固体ヒトイムノグロブリ
ン(セルパ、バイオケミカル社、ハイデルベルグ、西ドイツ)を溶解することに
よって調製する。この溶液の約Q、 2mlを注射器によって検体のガラス素子
41および42の間に入れ、室温で2時間そのまま放置する。この期間中、試料
中の有効なAGの約1〜10%ば4−;s−wの表面に付着し始める(約2−2
0μm)。ついでセルを吸着物質で液体を吸着することによって空にし、セルを
蒸留水でリンスし、前述のようにリンスした水を除去する。次いで牛血清アルブ
ミン2g−/lおよび液体浄化剤(ソウィーン20)0.5ml/lを含むO,
]、 M リン酸緩衝液(pH7)をセルに入れ、そのままで1時間放置する。
抗原でコーテングした後、ガラス上でからの残った“ホール″を血清アルブミン
で満たす(すなわち抗原は、通常ガラス上のすべての有効な部分に付着しないし
、テストされる抗体はすでに、そのままの(無処理)ガラスに親和力があるから
であシ、導液管上の“ホール″、コーティングされていない部位の存在は、結果
として、測定における誤差となる)。抗体は、牛血清アルブミンに対して親和力
をもたないので、この処理は、ガラスの未使用であるそのままの部分を簡単に無
反応にせしめる。浄化剤は、実1際にこのような作用を補う。
再び凭浄、そしてリンス後、セルを純粋な暖空気流で乾燥せしめる。実験のため
の準備ができあがる。
すべての分析は室温で行なう。いろいろの光学的、電気的装置に、電子増倍管を
除いて、スイッチを入れ、平衡化し、抗体浴液の試料(2ml)を同じ操作によ
って、セルに導入する。選択された抗体は、ダコイムノケミカルズ、コペンハー
グン、デンマークからの09%塩化ナトリウム中のウサギ抗−ヒトイムノグロブ
リンである。標準として初めの溶液は、900m1の力価をもつタンノ母り溶液
1oy−7tであシ、すなわちこの数字は(製造者によって、提供されたり抗体
溶液の各々のmlが、実際抗原900μmを中和することを意味する(ここでの
中和は、両方の活性成分が反応した相互量の場合、溶液は、もはや感知できるほ
どのAGもしくはABは含まない)。このように検量の目的で、都合良く、希釈
した既知抗体溶液を、テストを行なうために用いる(表1参照)。
セルを標準溶液(n−約1.33)で満たしたらすぐ、部屋を電子増倍管の飽和
を避けるために暗くし、後者は、スイッチを入れる。電子増倍管によってとりあ
げられた散乱光シグナル刀)ら生にた比率曲線は、数秒間の平衡化後、現われ始
める(おそらくコーチイブのタン・ぐり質を適当に、湿らせるために要する時間
である)。反応は、約2−5分間、進行させ、比率曲線の勾配(はとんど直標的
)は、この期間を通じて平均される。
下記の表Iに、抗血清の試料の希釈値および対応する計算された力価同じく用い
られた器械で測定されたように対応する比率曲線の勾配を示めす結果がまとめら
れている。
表 1
11
1+20り i 4.5 ’ 61
J+100(110,89j 0.8
未知の試料の分析について、同様の操作が繰り返され、比率データは記録され、
後で表Iの標準データと比較、する。望址しb分析データは、表Iの該データに
よって与えられた対応する力価に対して得られた分析比率値をプロ、トすること
によって得られる。
実施例2゜
実施例1に記載の実、験の逆は、同じ器械を用いて、同じ条件下に行なわtた。
この場合、光学恢体における導汲管は、力価900/ml!の初めの溶液の02
m1による抗体(ウザギ抗−ヒトイムノグロブリン)のフィルムでコーティング
される。すべての他の操作は、実施例1に記載と同様に行なう。標準試料は、記
録された比率曲線の勾配をまとめである表■に示めすように抗原溶液の既知希釈
で調製される。
表 ■
抗原溶液 比率曲線の勾配
AGの未知試料分析するだめに、すでに実施例1(乞記載の方法で行なう、すな
わち、テスト下に対応する比率曲肩の勾配を測定し、得られた値は、表IIにま
とめた値から用意したグラフとの比較によって対応ず抗原濃度と相関する。
実施例3
この実施例において、1波管のバック−エンドからあられれ、検出器58にぶつ
かる光から得られ/こシグナルは、比率曲線を生ぜしめるために用いられる。光
学的検体は、実施例2で用いたと本質的に同じである( AB、ウザギ、抗−ヒ
トイムノグロブリンのコーテングによって)。抗原溶液の試料(実施例2におけ
るように)は、下記表3に示めす濃度を用いる。操作の残シの部分は、電子増倍
管53を用いず、シグナルが実際反応が進行すると減少する(これは、鼾及管の
アウトプットにとどかない光の割合が、反応の進行につれて増加するからである
)する違いを除いて、実施例1および2に説明したように、まったく同じように
行なう。試料に存在するACの量の関数として記録された比率曲線の勾配は、表
■に示めす。
抗原溶液 曲線化された比率の勾配
実施例・4
次の例は、図5に関して議論した型の親子分析法を説明する。これについては、
図16に関する開示された種類の器械の螢光測定型が用すられる。光学的検体は
、実施例1に記載の同じ操作によって、ヒトイムノグロブリンCAG)のフィル
ムで対応する導液管71をコーティングすることによって調製する。
用いられる抗体AB*は、フルオレスセインインチオンア不−1−(FITC)
で標識され、テストされる抗原に特異的である( FITC) (ダコイムノグ
ロブリンズ、コベンハーケ゛ンから得られる)。未標識化対応抗体ABも、同社
から得られる。次の実験において、導液管のアウトプット、フェース71bは、
散乱した入射光線を最小限にするために、黒いペイントでおおう。
各々の実験で、トレーサー抗体AB*の一定量を加える。この量は、0.1 M
l)ン酸緩衝液、PH7で1/200に希釈されたダコ社の欠品の100μt
であシ、表■に示めされた希釈での未標識化ABのテスト溶液100μtと混合
する。操作は、前述の実施例におけるように行ない、混合した200μを部分は
グレート71および72の間に注入される。結果は、表■で対応するJ−fS率
曲線の勾配によって、示め抗体の希釈 抗体力価 比率FM3勝の勾配(1ml
+ml緩衝液) (mV/m1n)1+20 4.2,9 11.6
1+100 8.9 57.7
1+200 4.5 90.3
1+1000 0.89 95.5
抗体の未知溶液の測定のために、同じ方法が用いられ(標識化抗体の100μt
の添加)、結果は、上記で示めした標準データに照応して得られる。
実施例5
ifJ述の実施例?、くり返すがしかし、この時間、搾シ腹管のパック−エンド
で検出器78からアウトプットをモニターする。表■で示めした同じテスト濃度
を用いて、対応する比率結果(増加の順序で)が得られる(mV/m1n):2
9;48;68;61;6、 6 。
実施例6
検体セルは、6クオルツ&シライスSA”タイゾPCSフイブ0 ’/ ルWS
F−UV ’iリーズ(直径380/1m、コア20. Ottm、 oス35
0nrn−c0.14 db/m 。
97襲(透過率)からのプラスチッククラドシリカファイバーの一片を用いて、
用意し、図)Oaおよびi−Obに描かれたように、pvcセルの溝の中にその
終端によって挿入する。クラディング(cladding)は、濃硫酸でセルを
満たすことによって食刻され、ぞの−よま1時間放置し、(未−クラドセクショ
ン約10 cmの長さ)、次いで、ファイバーは、実施例前の最後の節で記載さ
れた第一の好ましい方法によって活性化される。
°“セルハハイオケミカル社″、ハイデルベルク、ドイツから入手したヒトイム
ノグロブリンG (IgG)のフィルムは次のように、ファイバー上に沈着させ
る:セルにおけるリン酸緩衝液を除去し、0.9%塩化ナトリウム溶液のIgG
2P/lf4液(10ml)によって置き換える。2時r、z埃、抗体溶液は、
除去1〜、ファイバーは、O,iM!、lン酸緩衝液中に”ツウィーン20”(
浄化剤) 0.5 mlを含む牛血清アルブミンの2g−/を溶液を導入した後
、緩衝液でリンスし、そのままで1時間放置する。次いで、セルを再び緩衝液で
リンスし、新しい緩衝液(’10m/’)で満たす。
セルは、図9の器械のベンチ上に、λ1=280nm(タン・ぐり質吸収)のた
めに選択されたフィルター5およびλ2=340nm(非タンパク質吸収)を通
過するフィルター6に取シつけられ、次いで光線(光束)が中央になるように調
整し、電子ユニットの適当不応答、およびノイズの最少限度で平衡化するシステ
ムにする。次いで抗−血清の種々の希釈液50μt(ウサギで生じた抗−IgG
はゝ′ダコイムノケミカルズ″コベンハーグン、から入手した)を加え、十分に
空気をふきこむことによって混合する。記録機は、0時で開始し、λ+””28
0nmで変化する吸収は、約10分間モニターする。この吸収シグナルにおける
変化の平均比率はプロットされ、勾配は、任意ユニ、トで記録される。結果は、
AG礎度の関数として、表Vに示めす。
表 V
AC(抗IgG)濃度 比率曲線の勾配(μg−/”/’) (mV/m1n)
076 容易に測定されず
実施例7゜
方法は、本質上、対応する標識化抗血清によるウサギIgGに置き換えることを
除いて、前述の実施例において記載のようである。積降化化合物は、フルオレ・
スセインーイソチオシアネード′アイソマーL ” (FrTC)であシ、標識
化抗血清は″ダコ社″から得られる。くの物質は、492nmで(この波長は実
際にフルオレセインを活性化する)非常に吸収する。実験においては、吸収が起
こらないλ1−492 nmに対して、フィルター5、λ2−600nmに対し
てフィルター6が選択される。テストは、すてにFITC−標識化IgGの種々
の濃度で、そして、他の測定セットにおいて、活性な5c1nのみのファイバー
セクションを用いて、記載のように行なわれる。
結果を表■に示めす。
表 ■
0.568 1 G、8 ]、4.3
■
実施例8
フルオレセインの付いた誘導体は、タシ・Qり質の吸収スペクトルを変化させる
だめに用いることができ、結果として、未標識化種に関して、本発明のテストの
感度を増加せしめることが、前述の実施例に見られる。勿論、このシステムは、
付加的に、標識化ABの一定濃度を用いることによって、未標識化ヒ)IgGの
未知濃度を測定(競合型測定)するために用いることができ、標識fヒ種の一定
濃度以上の割合は、図6に示めした図式に基づく比率決定基である。
実験において、結果は、表■に示めされており、標識化IgGの一定濃度は、1
μjil−/mlである。初めの縦行で示めし、た値は、未標識化IgGの濃度
である。
未標識什TgG濃度 1を率曲線の勾配実施例9
図りの4扱は、螢光測定条件下に操作され、すなわち励起光に対するフィルター
5は、λ、=4.92nmに関してであり、フィルター6およびファイバー・ぐ
ツクーエンド後付加的励起光遮断フィルターに対する1直は、λ2 =518
nmK関してである。
実、験は、吸収現象におけるように減少のかわQにシグナルの増加を測定(放射
した螢光)を除いて、実施例8におけるように、実際に、まったく同じく行なう
。実施例8におけるように、分析物は、螢光IgG lμf−/ml+表の左縦
行に示めしたように未標識1− ) IgGのいろいろの濃度を含む。
表 N・■
未標識化IgG濃度 比率曲称の勾配
(μP/mi ) (任意 ユニ、ト)実施例1から9までに表わした結果は、
未知濃度の同様の試料と比較の目的のために標準として用いられることを読者に
明らかにしておくべきである。
比較および計算は、開示された器械に付属するマイクロコンピー−ターで電子的
操作によってもしくは通常視覚的に行なうことができる。
0 20 40 60 80 θ
FIG、 9
FIG、 1oa
FIG、 job
FIG、 /Ia FIG、 l1b
FIG、 12a FIG、 12b
FIG、 13a
FIG、 jab
国、際調査報告
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 分析物−反応体生成物の層が、多重に、全体的に反射した光波シグナルを伝 えるリット導波管コアの表面で作られ、該波シグナルを変位させるようにその光 学的性質を変化する効果、および測定されそして該測定に用いられる該変位をも つこの層の生成、該分析物溶液の屈折インデックス(n2)よりも大きい屈折イ ンデックス(nl)をもつ導波管としてコアを用いることおよびコアにおける該 シグナルと関連したライトコンポネントの溶液において透過の深さが、実際該分 析物−反応体生成物の厚さを越えるかまたは匹敵するような値の率n l /n 2を含んでなる溶液における分析物測定方法。 2、分析物に特異反応体の薄いフィルムでコーティングされたリット非−有孔導 波管コアの区画と該分析物溶液と接触せしめ、それによって該フィルムの反応体 と該分析物を反応せしめ、反応体−分析物層を生成せしめ、該生成物層生成の結 果として、該コアのアウトプットでコアを通過進行する光波シグナルに対応する 時間とともに生ずる光学変化および該分析物の検量試料から同様の操作で得られ た対応する標準参考率データと実際得られた率データを相関することを含んでな る請求の範囲第1項記載の方法。 3、非−有孔導波管コアの区画を、測定される分析物の参考量でコーティングし 、該区画のインプットに光波シグナルを注入し、該す、ト区画を分析物溶液と接 触させ、−男前もってもしくは同時に、後者が競争的に溶液における分析物およ びコア上の該参考量と反応せしめるように反応体の参考量を加え、該反応体と該 参考量との該反応の結果として、該コア区画のアウトプットで、該波シグナルに 対応する時間とともに生ずる光学変化を観察し、該分析物の検量試料溶液から同 様の操作で得られた標準参考率データと実際得られた率データを比較することを 含んでなる請求の範囲第1項記載の方法。 4、標識化型で精製した分析物の痕跡量を分析物溶液に加え、コアを通過進行す る光波シグナルに該光学変化をひきおこす導波管コア上で反応体分析物生成物層 における該標識の存在、溶液における分析物への標識化分析物の割合と直接に関 連する該変化のマグニチュードである請求の範囲第2項記載の方法。 5 測定される溶液における分析物と化学量論的に結合するに要する過剰の反応 体でコーティングしたコアを用いること、測定される該分析物と全体的に結合す るために分析物溶液と該コーティングしたコアと接触せしめること、精製した標 識化型における参考分析物量が、未使用の反応体の過剰と反応するように分析物 溶液を加えること、波シグナルに生ずる該光学変化をひきおこす反応体分析物生 成物における該標識の存在、初めから溶液における分析物への標識化分析物の割 合に直接比例する該変化のマグニチュードを含んでなる請求の範囲第2項記載の 方法。 6 分析物が、反応体の一種以上の特に結合に対する1つの結合位置以上を所有 し、第一の反応体でコーティングされた該コアを該分析物溶液と接触せしめるこ と、該分析物の第二結合位置に結合する該第二反応体を有する第二反応体の参考 量を加えること、コアの該第−反応体でのその第一結合位置によって結合した分 析物の該第二結合位置上で該第二反応体の結合の結果である該光学変化を含んで なる請求の範囲第2項記載の方法。 7 該率データが、テスト下に反応に関係する比率曲線の勾配によって説明され または比率データは平衡条件を決めるために外挿法によって推定される請求の範 囲第2項記載の方法。 8 がイドコアの光学性質における該変化は、波シグナルの吸収、該コアのアウ トプットで測定された光シグナルの時間とともに減少となる該変位に関する請求 の範囲第1項から第7項まで記載の方法。 9、 ガイドコアの光学性質の変化は、螢光シグナルの生成、該コアのアウトプ ットでもしくはその横で測定されたように時間とともに増加する該/グナルに関 する請求の範囲第1項から第6項まで記載の10、ガイドコアの光学性質の変化 は、該波シグナルの散乱、時間とともに増加するこのような散乱の程度および散 乱領域への部分的に横で、およびコアのアウトプットで部分的に測定されうろこ とに関する請求の範囲第1項から第6項まで記載の方法。 11、偏光シグナルが用いられ、ガイドの光学性質における該変化は、該シグナ ルの楕円偏光・ぐラメ−ター、該コアのアウトプットで測定される該・ぐラメ− ターに関する請求の範囲第1項から第6項まで記載の方法。 12、コアが、少なくても屈折インデックス14をもつ光透明プレート、ロッド またはファイバ一様品目から選択される請求の範囲第1項から第10項寸で記載 の方法。 13、コアが単一モードもしくは多−モード光学ファイバーコアである請求の範 囲第1・1項記載の方法。 14多−モードファイバーが用いられ、ファイバー軸に関して、十分に浅いモー ドを用いること、全反射を確保するためにおよび光/グナルコーティング相互作 用位置の高度な直線的密度を確保するために十分な急勾配を含んでなる請求の範 囲第12項記載の方法。 15 コアは多−モードファイバーでチシ、モードは臨界角に接近した初期の反 射角で選択され、それによって反応過程で分析物−反応体生成物の増大によって 生ずる稀媒質の屈折インデックスn2のかすかな変化が、コアの外側で光の部分 もしくは全屈折の結果となる請求の範囲第12項記載の方法。 16、特異反応体と分析物の反応において、その該反応が導波管の表面で生じ、 その光学性質への検出されうる変化をひきおこし、光源、光源からシグナルを該 導波管のインプットへ注入するだめの手段、それを通して進行しそして、そこか ら現われる場合、変化しつつある光シグナルを検出するだめの検出手段、および それを電子シグナルに変換すること、および該反応に関係する有用なデータに該 シグナルを処理するための手段を含んでなる運動パラメーター測定用器械。 17 導波管が、反応媒質の屈折インデックスより高い物質から選択される請求 の範囲第16項記載の器械。 18 導波管が、約14から約3.5の範囲内にある屈折インデックスのファイ バーまたはプレートの型であり、光シグナルが多重全反射による該ガイドを通じ て透過されることを確保するために構成される請求の範囲第17項記載の器械。 19、変化した光シグナルが、散乱光、螢光または部分的に吸収された光シグナ ルとして、現われる請求の範囲第16項記載の器械。 20、導波管が、らせん状に巻終した光学ファイバーの型である請求の範囲第1 6項記載の器械。 21、導波管プレートと非−接触である密接な平行関係で配置されるカウンター −プレート、該グレート間に提供された空間で生ずる反応、毛細管力によって、 場に保持される反応媒質を含んでなる請求の範囲第18項記載の器械。
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